一种多肽及其载体在心肌缺血再灌注损伤中的应用的制作方法

1.本发明属于生物领域，具体涉及一种多肽及其载体在心肌缺血再灌注损伤中的应用。


背景技术：

2.急性心肌梗死（acute myocardial infarction, ami）是一种发病率及致死率高的心血管病急症，目前呈现年轻化趋势，在世界范围内给人类造成沉重的健康与经济负担1。ami后迅速开通闭塞的冠状动脉，再灌注受危害的心肌被认为是限制梗死范围及维持心脏功能最有效的方法。然而恢复血流则易导致心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury, miri）。miri是一个由多种分子机制及信号通路参与的病理生理过程，如铁死亡、细胞焦亡、细胞死亡及细胞凋亡等
2, 3
。临床多表现为无复流、心肌顿抑及再灌注心律失常4。如何减轻miri是心血管病领域的重点和热点。
3.nrf2为碱性-亮氨酸拉链家族中最强的转录激活因子，参与铁代谢、氧化损伤及细胞凋亡相关的多个基因，调控细胞防御反应。nrf2参与凋亡的调控已有较多相关研究，生理条件下，nrf2与keap1结合后受到keap1的负向调控，keap1与cullin3结合能促使nrf2泛素化降解，维持细胞内nrf2处于较低水平
5, 6
。当细胞处于应激状态，ros生成增多时，keap1作为氧分压变化感受器能够迅速感知细胞内ros水平，促使keap1构象改变，nrf2与keap1解离并快速进入细胞核，与其下游多个基因启动子区域的抗氧化反应元件（antioxidant response element，are）结合，诱导血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，ho-1）、ⅱ相解毒酶及抗氧化蛋白等基因转录和表达以抵抗内外界的有害刺激
7, 8
。nrf2-are-ho-1信号通路的激活可以清除ros，维持细胞内氧自由基的动态平衡，抑制细胞凋亡。
4.nrf2-are-ho-1信号通路不仅在抗凋亡过程中发挥重要作用，还具有抑制铁死亡的作用9。nrf2对铁死亡主要调控机制如下，第一：nrf2可以调节活性铁的储存和释放。第二：nrf2还能通过调节细胞内血红素的合成和代谢，从而调节细胞内亚铁离子水平。第三：nrf2通过作用于细胞膜铁转运体，调控出入细胞的铁。第四：nrf2与过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1相互作用，减轻线粒体损伤
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。综上所诉，nrf2能够同时抑制心肌细胞的铁死亡及细胞凋亡，从而发挥双重心肌保护作用。nrf2-are-ho-1信号通路存在两种主要的调控机制，一种是通过影响keap1来调节nrf2-are-ho-1信号通路作用。tian
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等在膀胱癌细胞中发现，pkc亚型iota可与nrf2竞争性结合keap1，使nrf2与keap1结合减少，导致keap1泛素化降解nrf2水平减低，促进nrf2聚集和入核，发挥抗氧化应激及心肌保护作用。此外，另一种方式是直接通过与nrf2的相互作用，影响nrf2与keap1的结合。chen w
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等研究表明，在hct116结肠癌细胞中，p21在氧化应激状态时表达上调，直接与keap1竞争性结合nrf2，抑制keap1对nrf2的泛素化降解，稳定nrf2水平，促进nrf2-are-ho-1信号通路的激活，发挥抗氧化应激及心肌保护作用。
5.pkc是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程，目前发现了12种亚型，根据结构域类型、组织表达等不同可分为经典型pkc、新型pkc及非经典型
pkc。pkc在心脏发育过程中介导信号转导，同时调控多种心脏疾病的病理生理过程，在心脏疾病中具有重要的作用
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。pkcθ属于新型pkc，广泛分布于骨骼肌细胞中。pkcθ在细胞质膜上与磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, ps）和二脂酰甘油（diacylglyerol, dag）结合后激活、转位后参与信号传导
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。然而pkcθ能否调控nrf2目前尚不明确。
6.近年来，多肽类药物在临床上的应用越来越广泛，是一个极具有发展前景的崭新领域，多肽以其安全、有效、特异性强等特点，逐步应用于各种疾病的预防和治疗。然而基于nrf2与pkcθ之间的相互作用，用于抑制心肌缺血再灌注损伤的多肽药物还鲜有报道。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于发明一种新的可用于治疗心肌缺血再灌注损伤的多肽。
8.具体的，本发明的技术方案如下：本发明第一个方面公开了一种用于制备心肌缺血再灌注损伤药物的mrna，所述mrna的核苷酸序列如seq id no：1所示。
9.本发明第二个方面公开了一种多肽，所述多肽由上述的mrna翻译得到。
10.优选的，所述多肽的氨基酸序列如seq id no：2所示。
11.本发明第三个方面公开了上述的多肽在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。
12.本发明第四个方面公开了一种用于治疗心肌缺血再灌注损伤的药物，所述药物包括上述的mrna或上述的多肽。
13.本发明第五个方面公开了一种制备上述多肽的方法，包括：将pkcθ
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多肽真核表达载体转染到细胞中，细胞扩增后收集细胞，对细胞裂解后提取蛋白质，得到多肽。
14.优选的，所述细胞为hek293细胞。
15.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
16.本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：本发明发现心肌细胞内过表达pkcθ或nrf2能显著减少心肌细胞铁死亡和细胞凋亡，基于此机理，发明了一种新的可用于治疗心肌缺血再灌注损伤的多肽，并进行了实验验证，发现该多肽能够显著缓解细胞铁死亡和细胞凋亡的发生，为急性心肌梗死患者带来了福音。
附图说明
17.图1为实施例1中免疫共沉淀反应示意图，显示pkcθ与nrf2具有相互作用；图2为wb显示pkcθ，nrf2，细胞铁死亡及细胞凋亡指标示意图；图3为原代心肌细胞过表达pkcθ或nrf2对铁代谢影响示意图；图4为pkcθ与nrf2共定位及入核过程示意图；图5为wb分析干预nrf2及pkcθ后两者表达水平；图6为pkcθ
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多肽真核表达载体的结构示意图；图7为外源性转染pkcθ及pkcθ
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后wb示两者表达水平示意图；图8为转染pkcθ
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质粒后对铁死亡相关指标表达水平的影响。
具体实施方式
18.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
19.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
20.实施例1研究表明，铁死亡及细胞凋亡是miri发生发展过程中重要的机制。nrf2在调控细胞凋亡中扮演着十分重要的角色。积极探索影响nrf2的关键靶点，对于miri的防治具有重大的临床意义。因此发明人针对miri进行免疫共沉淀试验，在大鼠miri及原代心肌细胞h/r模型中确定pkcθ与nrf2具有相互作用。实验分为a组和b组，从图1a中可以看出，大鼠miri模型中，nrf2与pkcθ能够相互作用；从图1b中可以看出，原代心肌细胞h/r模型中，nrf2与pkcθ能够相互作用。
21.miri中，wb试验明确pkcθ与nrf2表达水平变化，且表达时相同凋亡相关分子（cleaved caspase-3及bcl-2）及铁死亡相关分子（gpx4）具有相关性。结果如图2所示，再灌注不同时间点nrf2、pkcθ、cleaved caspase-3、gpx4具有先升高后下降的趋势，bcl-2具有先下降后升高趋势。nrf2、pkcθ表达趋势与cleaved caspase-3、gpx4具有正相关，与bcl-2具有负相关。
22.实施例2本实施例研究原代心肌细胞h/r中，过表达pkcθ或nrf2对fe
2
水平及mda水平影响。试验明确h/r能够明显增加心肌细胞铁死亡，心肌细胞内过表达pkcθ或nrf2能显著减少心肌细胞铁死亡，结果如图3所示。图3a中原代心肌细胞h/r后fe
2
水平升高，过表达pkcθ或nrf2显著降低fe
2
水平；图3b中原代心肌细胞h/r后mda水平升高，过表达pkcθ显著降低mda水平。
23.实施例3miri中，发明人明确了pkcθ与nrf2具有相互作用。紧接着，发明人通过免疫荧光试验揭示pkcθ与nrf2在对照组及miri组中表达水平及表达部位。结果如图4所示，图4a-d显示对照组nrf2与pkcθ表达水平较低，具有共定位；图e-h显示原代心肌细胞h/r模型组，nrf2和pkcθ表达上调，且具有协同入核的趋势。
24.实施例4为了深入研究两者具有相互作用后，两者上下游关系，发明人分别应用pkcθ与nrf2的小干扰序列，干预pkcθ表达后，nrf2表达水平下降，而干预nrf2后对pkcθ表达无影响。因此，发明人明确，pkcθ能够作为nrf2的上游分子，调控nrf2的表达，结果如图5所示，干预nrf2后对pkcθ表达无影响，干预pkcθ后，nrf2表达下降。所述pkcθ的小干扰序列如下所示：5
’‑3’
方向：ccucaaggccgaaugcuaatt（seq id no：3）；3
’‑5’
方向：uuagcauucggccuugaggtt（ seq id no：4）；所述nrf2的小干扰序列如下所示：5
’‑3’
方向：ugcccacauucccaaacaatt（seq id no：5）；3
’‑5’
方向：uuguuugggaaugugggcatt（ seq id no：6）；
实施例5本实施例构建一种新的多肽。具体方法包括：1.根据相互作用结合位点，提取人mrna，逆转录为cdna，应用pcr技术扩增出对应的mrna序列。该mrna序列如下所示：gagctgaaacctcaaggccgaatgctaatgaatgcaagatactttctggaaatgagtgacacaaaggacatgaatgaatttgagacggaaggcttctttgctttgcatcagcgccggggtgccatcaagcaggcaaaggtccaccacgtcaagtgccacgagttcactgccaccttcttcccacagcccacattttgctctgtctgccacgagtttgtctggggcctgaacaaacagggctaccagtgccgacaatgcaatgcagcaattcacaagaagtgtattgataaagttatagcaaagtgcacaggatcagctatcaatagccgagaaaccatgttccacaaggagagattcaaaattgacatgccacacagatttaaagtctacaattacaagagcccgaccttctgtgaacactgtgggaccctgctgtggggactggcacggcaaggactcaagtgtgatgcatgtggcatgaatgtgcatcatagatgccagacaaaggtggccaacctttgtggcataaaccagaagctaatggctgaagcgctggccatgattgagagcactcaacaggctcgctgcttaagagatactgaacagatcttcagagaaggtccggttgaaattggtctcccatgctccatcaaaaatgaagcaaggccgccatgtttaccgacaccgggaaaaagagagcctcagggcatttcctgggagtctccgttggatgaggtggataaaatgtgccatcttccagaacctgaactgaacaaagaaagaccatctctgcagattaaactaaaaattgaggattga（seq id no：1）。
25.2.根据mrna翻译得到一种新的多肽，该多肽所对应的氨基酸序列如下所示：mdykdhdgdykdhdidykddddklelkpqgrmlmnaryflemsdtkdmnefetegffalhqrrgaikqakvhhvkcheftatffpqptfcsvchefvwglnkqgyqcrqcnaaihkkcidkviakctgsainsretmfhkerfkidmphrfkvynyksptfcehcgtllwglarqglkcdacgmnvhhrcqtkvanlcginqklmaealamiestqqarclrdteqifregpveiglpcsiknearppclptpgkrepqgiswespldevdkmchlpepelnkerpslqiklkied（seq id no：2）。
26.构建pkcθ
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多肽真核表达载体，其构建方法如下：一、根据pkcθ
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的序列（seq id no：1）使用primer5.0软件，设计引物，上游引物：attacaaggatgacgatgacaagcttgagctgaaacctcaaggccg（seq id no：7），下游引物：gatatcagatctatcgatgaattcttatcaatcctcaatttttagtttaatctgcag（seq id no：8）。
27.二、将pkcθ
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的序列构建于载体puc57中，含有ecor i和hind iii酶切位点，引物由上海权阳生物科技有限公司合成。
28.三、以hek293t细胞中提取出的rna反转录出的cdna为模板，扩增pkcθ
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目的基因。pcr产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后利用切胶回收纯化。对质粒进行hind iii和ecor i双酶切，纯化所得片段在ce连接酶作用下37℃连接30min。连接产物通过热休克法转化至e.coli xl1-blue感受态细菌中，转化菌涂布于lb固体培养基（含氨苄青霉素，100mg/l）37℃培养过夜，进行菌落pcr验证，挑取克隆，提质粒测序。将正确连接的pkcθ
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多肽真核表达载体应用lipofectamine 2000转染至hek293细胞，48小时后收集细胞样品，将细胞裂解后得到细胞裂解样本，进一步提取细胞蛋白进行wb检测，孵育flag一抗，兔来源二抗，后应用bio-rad成像系统成像，wb结果证明此多肽的表达，如图7所示。该pkcθ
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多肽真核表达载体的结构示意图如图6所示。
29.实施例6 重组肽抑制铁死亡功能检测本实施例中通过elisa证实重组肽在h9c2的缺氧复氧（hr）模型中发挥抑制铁死亡
a ray of hope in cardiovascular diseases. cardiol res pract 2020: 5695723.10. kerins mj, ooi a(2018). the roles of nrf2 in modulating cellular iron homeostasis. antioxid redox signal 29(17): 1756-1773.11. tian l, lu y, yang t, et al.(2019). apkciota promotes gallbladder cancer tumorigenesis and gemcitabine resistance by competing with nrf2 for binding to keap1. redox biol 22: 101149.12. chen w, sun z, wang xj, et al.(2009). direct interaction between nrf2 and p21(cip1/waf1) upregulates the nrf2-mediated antioxidant response. mol cell 34(6): 663-673.13. schunke kj, walton cb, veal dr, et al.(2019). protein kinase c binding protein 1 inhibits hypoxia-inducible factor-1 in the heart. cardiovasc res 115(8): 1332-1342.14. gutcher i, webb pr, anderson ng(2003). the isoform-specific regulation of apoptosis by protein kinase c. cell mol life sci 60(6): 1061-1070.