生物标记物在治疗纤维化病症中的用途的制作方法

1.本发明涉及抗纤维化剂，所述抗纤维化剂选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，以单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合，用于在用于治疗有需要的患者的选自进行性纤维化间质性肺疾病的纤维化障碍的方法中使用，所述方法包括监测患者对治疗的反应、检测有益反应的存在或不存在或确定治疗的开始，各自包括这样的步骤：测量来自患者的生物样品中一种或多种生物标记物的表达水平，所述一种或多种生物标记物选自基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合。
2.此外，本发明涉及一种或多种所述生物标记物用于选择患有所述纤维化障碍的患者用抗纤维化剂治疗的用途、用于预测患者的所述纤维化障碍的进展的用途、或用于确定抗纤维化剂在治疗需要治疗的患者的所述纤维化障碍中是否有效的用途。


背景技术：

3.进行性纤维化ild(pf-ild)描述了在不同的间质性肺疾病(ild)的一些患者中观察到的疾病行为。ild是这样一组不同的疾病，其影响肺部肺泡周围的网状网络的组织和空间(间质组织)。在患有ild的一些患者中，在肺中存在疤痕组织的积累，这会持续恶化。肺逐渐变为疤痕性的、增厚和僵硬，导致肺功能恶化、呼吸症状和健康相关的生活质量恶化。特发性肺纤维化(ipf)被认为是pf-ild的最典型的例子。
4.特发性肺纤维化(ipf)是一种病因未知的罕见疾病，其特征在于肺的间质的进行性纤维化，导致肺容积减小和进行性肺功能不全。个别患者的病程是可变的：一些患者快速进展，其他患者的相对稳定性周期会因急性加重而打断，以及其他患者的进展则相对缓慢。ipf的急性加重是每年在5％-10％患者中发生并且与非常差的结局相关的不明原因的呼吸恶化事件。ipf在中年和老年患者中最普遍，并且通常存在于40岁与70岁之间的人中。诊断后ipf患者的中位期望寿命为2至3年。美国胸科学会(ats)、欧洲呼吸学会(ers)、日本呼吸学会(jrs)和拉丁美洲胸科协会(alat)于2015年共同发布的关于ipf治疗的临床实践指南的最新更新提供了对于大多数ipf患者用尼达尼布或吡非尼酮治疗的条件性建议(考虑到了个体患者的价值和偏好)。诸如n-乙酰半胱氨酸(nac)、皮质类固醇、环磷酰胺、环孢菌素和硫唑嘌呤的常规ipf治疗不是批准的ipf治疗，并且它们的功效是存疑的，或者它们甚至是有害的。建议某些患者使用诸如肺康复和长期氧疗法的非药物疗法，但是尚未确定其在ipf患者中的功效。肺移植已经显示出对ipf患者的存活的积极影响。尽管在过去几年中，由于ipf而移植的患者人数稳步增加，但是供体器官的稀缺性以及共病和高龄年龄排除了转诊到肺移植的许多患者。
5.除ipf外，pf-ild还涵盖与硬皮病或系统性硬化症(ssc-ild)相关或与结缔组织疾病(ctd-ild)或类风湿性关节炎(ra-ild)相关的那些疾病形式。尼达尼布已经显示提供了对于ssc-ild-ild和ra-ild也有效的治疗。pf-ild还包括慢性纤维化超敏性肺炎(hp)、特发性非特异性间质性肺炎(insip)、无法分类的特发性间质性肺炎(iip)、环境/职业性纤维化
肺疾病、具有自身免疫性特征的特发性肺炎(ipaf)和结节病。
6.已经考虑用尼达尼布和/或吡非尼酮治疗的另外的纤维化障碍包括肌营养不良(如杜氏肌营养不良(duchenne muscular dystrophy))、纤维瘤病(如杜普伊特伦挛缩(dupuytren
′
s contracture))和骨髓纤维化(如原发性骨髓纤维化(pmf))。
7.尼达尼布(3-z-[1-(4-(n-((4-甲基-哌嗪-1-基)-甲基羰基)-n-甲基-氨基)-苯胺基)-1-苯基-亚甲基]-6-甲氧基羰基-2-吲哚酮)，即式a的化合物，
[0008][0009]
是一种高度有效、口服生物可利用的小分子细胞内酪氨酸激酶抑制剂。它抑制血管内皮生长因子受体(vegfr)、血小板源性生长因子受体(pdgfr)和成纤维细胞生长因子受体(fgfr)。它竞争性地结合至这些受体的三磷酸腺苷(atp)结合口袋并阻断细胞内信号传导。此外，尼达尼布抑制fms样酪氨酸蛋白激酶3(flt 3)、淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶(lck)、酪氨酸蛋白激酶lyn(lyn)和原癌基因酪氨酸蛋白激酶src(src)(hilberg等人,cancer res.2008,68,4774-4782)。因此，它具有有价值的药理学特性，例如用于治疗肿瘤疾病、免疫疾病或涉及免疫学组分的病理性病症或纤维化疾病。
[0010]
尼达尼布描述于wo 01/27081中。wo 2004/013099披露了其单乙磺酸盐，尤其适用于开发为药剂；其他盐形式呈现于wo 2007/141283中。
[0011]
包含尼达尼布的药物剂型披露于wo 2009/147212和wo 2009/147220中。
[0012]
尼达尼布用于治疗涉及免疫组分的免疫疾病或病理性病症的用途描述于wo 2004/017948中，用于治疗肿瘤疾病的用途描述于wo 2004/096224中，并且用于治疗纤维化疾病的用途描述于wo 2006/067165中。
[0013]
尼达尼布在临床前模型中展现出抗纤维化和抗炎活性：
[0014]
在一系列临床前研究中，已经评价了用尼达尼布的vegfr、pdgfr和fgfr抑制的抗纤维化潜力。示出尼达尼布的激酶特异性特征的数据已经公布于hilberg等人,cancer res.2008；68:4774-82，即关于血管生成和纤维化相关激酶(如vegfr、pdgfr和fgfr)、关于与炎症和增生相关的src家族激酶(如src、lck和lyn)、以及其他激酶(例如flt-3、igf1r、insr、egfr、her2、cdk1、cdk2和cdk4)。显示尼达尼布在体外抑制正常人肺成纤维细胞的pdgfr-α和-β激活和增殖，并且抑制来自患有ipf的患者和对照供体的人肺成纤维细胞的由pdgf-bb、fgf-2和vegf诱导的增殖。尼达尼布减弱了来自患有ipf的患者的肺成纤维细胞的pdgf或fgf-2刺激的迁移，并且抑制了转化生长因子(tgf)-β诱导的来自ipf患者的原代人肺成纤维细胞的成纤维细胞向成肌纤维细胞的转化(hostettler等人,respir.res.2014；15:157；wollin等人,j.pharmacol.exp.ther.2014；349:209-20)。尼达尼布的多药理学由l.wollin等人,eur.respir.j.2015；45:1434-1445描述。在两种不同的ipf小鼠模型中，尼
达尼布发挥了抗炎作用，如由支气管肺泡灌洗液中淋巴细胞和嗜中性粒细胞计数的显著降低、炎症细胞因子的降低以及肺组织的组织学分析中炎症和肉芽肿形成的降低所展示。ipf小鼠模型还揭示了尼达尼布相关的抗纤维化作用，如由总肺胶原的显著降低以及由在组织学分析中鉴定的纤维化降低所展示。
[0015]
来自临床前研究的积极发现也转化到临床环境：在多次临床试验中，展现出尼达尼布减少ipf患者的每年肺功能损失的能力(尤其是inpulsis、tomorrow试验)。因此，尼达尼布已经在许多国家被批准用于治疗ipf。类似地，在患有除ipf以外的进行性肺纤维化(inbuild研究)或患有系统性硬皮病相关的间质性肺疾病(ssc-ild)(senscis研究)的患者中可能会减慢疾病进展。
[0016]
尼达尼布以品牌名称市售用于ipf。它的推荐剂量为150mg尼达尼布，每天两次。在不耐受150mg每天两次剂量的患者中或在患有轻度肝损害(child pugh a)的患者中推荐使用100mg每天两次剂量的较低剂量。
[0017]
吡非尼酮(5-甲基-1-苯基-2(1h)-吡啶酮)，即式b的化合物，
[0018][0019]
在非临床模型中展示出抗纤维化活性并且在临床试验中展示出在降低用力肺活量(fvc)肺功能下降方面的功效(尤其是capacity和ascend试验)。吡非尼酮以267mg吡非尼酮的胶囊以市售用于治疗ipf。用于ipf患者的推荐每天剂量是三颗胶囊每天三次，随餐服用，总共2403mg/天。
[0020]
开始治疗后，如下经14天的时间段将剂量逐步调整至每天九颗胶囊的推荐的每天剂量：
[0021]
·
第1天至第7天：一颗胶囊，一天三次(801mg/天)
[0022]
·
第8天至第14天：两颗胶囊，一天三次(1602mg/天)
[0023]
·
第15天以后：三颗胶囊，一天三次(2403mg/天)
[0024]
尽管可以将尼达尼布和吡非尼酮视为诊断为患有ipf的患者的护理标准，但是预测、检测和监测对抗纤维化剂的有益治疗反应仍然很重要，以尽可能提供最有效的治疗。因此，需要改善的手段以追踪针对纤维化疾病的治疗选项的功效，鉴定将从这些治疗中受益最大的患者并且确定和调整疗法。鉴定合适的生物标记物以预测纤维化障碍的临床历程和治疗的益处，并且因此在病程的早期优化对于给定患者的治疗可能有助于填补这一空白，并且仍然是患者管理中最相关的挑战之一。
[0025]
全转录组基因表达分析代表了一种针对生物标记物发现的强大方法，因为它有可能鉴定相对易于获得的全血患者样品的微妙治疗依赖性变化或疾病依赖性变化。为了表征与ipf的存在和程度相关的转录变化，许多研究使用人或鼠起源的血液、外周血单个核细胞或肺组织样品进行基于微阵列或基于rna测序的分析(综述于vukmirovic和kaminski,front med(lausanne),2018年4月4日；5:87中)。这些研究通常鉴定与健康状态相比，在患病(ipf)者中改变的数百至数千个基因。例如，yang等人证明了与对照相比，1428种基因在轻度ipf患者的血液中差异性表达(一氧化碳弥散量(d
l
co)》65％)，并且与对照相比，2790
种转录物在重度ipf中差异性表达(d
l
co》35％)(yang等人,plos one,2012；7(6):e37708)。类似地，当将ipf患者的肺组织转录组与对照的肺组织转录组进行比较时，bauer等人鉴定了总共1,696种差异性表达的基因(bauer等人,am j respir cell mol biol.2015年2月；52(2):217-31.)。目前为止，在不同的患者群组中只有一个基因集被验证是52个基因的集合，其通过测试差异性表达的基因的预测无移植存活的潜力来鉴定(herazo-maya等人,sci transl med.2013年10月2日；5(205):205ra136.)。发现此基因特征富集与t细胞功能相关的基因。在ipf患者中预测结局(存活)的值已经在六个不同的患者群组中得到验证(herazo-maya等人,lancet respir med.2017年11月；5(11):857-868.)。然而，通常，不同研究中鉴定的基因之间的重叠很差，并且尚不清楚任何这些基因表达的变化是否可以指示有效的治疗性治疗。
附图说明
[0026]
图1：箱形图，其描绘了在ipf患者中在访视2(v2，基线)和治疗后12周(v5)，与安慰剂相比，14种所选尼达尼布响应性基因中的8种基因的基因表达水平(cpm，每百万计数)的各组变化。
[0027]
图2：箱形图，其描绘了在ipf患者中在访视2(v2，基线)和治疗后12周(v5)，与安慰剂相比，14种所选尼达尼布响应性基因中的另外6种基因的基因表达水平(cpm，每百万计数)的各组变化。
[0028]
图3：箱形图，其描绘了在ipf患者中在访视2(v2，基线)和治疗后12周(v5)，与安慰剂相比，14种所选尼达尼布响应性基因的基因表达的患者特异性倍数变化。(trt＝治疗)
[0029]
图4：应用途径富集分析以将14种尼达尼布响应性基因进行功能性分类。基因本体(go)生物学途径和reactome途径关系由每个矩阵内的灰色标记指示。
[0030]
图5：对于14种尼达尼布响应性基因的无监督基因集变异分析(gsva)。箱形图示出了在ipf患者中用尼达尼布(n150mg_bid)或安慰剂治疗前(v2)和治疗后(v5，12周)的gsva得分。
[0031]
图6：箱形图，其描绘了在ssc-ild患者中在访视2(v20，基线)、治疗后24周(v70)和治疗后52周(v90)，与安慰剂相比，14种所选尼达尼布响应性基因中的8种基因的基因表达水平(cpm，每百万计数)的各组变化。
[0032]
图7：箱形图，其描绘了在ssc-ild患者中在访视2(v20，基线)、治疗后24周(v70)和治疗后52周(v90)，与安慰剂相比，14种所选尼达尼布响应性基因中的另外6种基因的基因表达水平(cpm，每百万计数)的各组变化。
[0033]
图8：箱形图，其描绘了在ssc-ild患者中在访视2(v2，基线)和治疗后24周(v7)，与安慰剂相比，14种所选尼达尼布响应性基因的基因表达的患者特异性倍数变化。(trt＝治疗)
[0034]
图9：对于14种尼达尼布响应性基因的无监督基因集变异分析(gsva)。箱形图示出了在ssc-ild患者中用尼达尼布(nint)或安慰剂(pbo)治疗前(v20)和治疗后(v70，24周；v90，52周)的gsva得分。


技术实现要素：

[0035]
在第一方面，本发明涉及一种抗纤维化剂，所述抗纤维化剂特别选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合，用于在用于治疗有需要的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的方法中使用，所述方法包括监测患者对所述治疗的反应，包括以下步骤：
[0036]
a)在开始施用所述抗纤维化剂之前获得或使得获得来自所述患者的第一生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0037]
b)向所述患者施用所述抗纤维化剂或使得将所述抗纤维化剂施用于所述患者；
[0038]
c)在施用所述抗纤维化剂之后，获得或使得获得来自所述患者的第二生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0039]
d)在所述第一样品和所述第二样品中测量特别是选自以下基因的一种或多种生物标记物的表达水平：ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合，或使得测量所述水平；以及
[0040]
e)任选地考虑对照值，将获自第一生物样品和第二生物样品的所述一种或多种生物标记物的表达水平进行比较，或使得比较所述水平。
[0041]
在第二方面，本发明涉及一种抗纤维化剂，所述抗纤维化剂特别选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合，用于在用于治疗有需要的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的方法中使用，所述方法包括检测有益反应的存在或不存在，包括以下步骤：
[0042]
b)向所述患者施用所述抗纤维化剂或使得将所述抗纤维化剂施用于所述患者；
[0043]
c)在施用所述抗纤维化剂之后，获得或使得获得来自所述患者的生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0044]
d)在所述样品中测量特别是选自以下基因的一种或多种生物标记物的表达水平：ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合，或使得测量所述水平；
[0045]
e)将所述一种或多种生物标记物的表达水平与对照值进行比较或使得将所述表达水平与对照值进行比较；以及
[0046]
f)确定或使得确定所述样品与所述对照之间的水平差异是否反映了所述患者的有益反应。
[0047]
在第三方面，本发明涉及一种抗纤维化剂，所述抗纤维化剂特别选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合，用于在用于治疗有需要的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的方法中使用，所述方法包括确定开始所述治疗，包括以下步骤：
[0048]
a)在开始施用所述抗纤维化剂之前获得或使得获得来自所述患者的生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0049]
d)在所述样品中测量特别是选自以下基因的一种或多种生物标记物的表达水平：ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合，或使得测量所述水平；
[0050]
e)将所述一种或多种生物标记物的表达水平与对照值进行比较或使得将所述表
达水平与对照值进行比较；
[0051]
h)确定或使得确定所述样品中的表达水平与对照值之间的差异是否反映了需要开始对所述纤维化障碍的治疗；以及
[0052]
i)如果已经确定需要开始对所述纤维化障碍的治疗，则向所述患者施用所述抗纤维化剂或使得将所述抗纤维化剂施用于所述患者。
[0053]
在第四方面，本发明涉及特别是选自基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合的一种或多种生物标记物用于选择患有特别是选自pf-ild的纤维化障碍的患者用抗纤维化剂治疗的用途，包括
[0054]
a)在开始施用所述抗纤维化剂之前获得或使得获得来自所述患者的生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0055]
d)测量所述样品中所述一种或多种生物标记物的表达水平或使得测量所述水平；
[0056]
e)将所述一种或多种生物标记物的表达水平与对照值进行比较或使得将所述表达水平与对照值进行比较；
[0057]
j)基于所述比较的结果确定或使得确定所述患者是否有资格用抗纤维化剂治疗。
[0058]
在第五方面，本发明涉及特别是选自基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合的一种或多种生物标记物用于预测患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的进展的用途，包括
[0059]
a)和/或c)在开始施用抗纤维化剂之前和/或施用抗纤维化剂之后，获得或使得获得来自所述患者的生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0060]
d)测量所述样品中所述一种或多种生物标记物的表达水平或使得测量所述水平；
[0061]
e)将所述一种或多种生物标记物的表达水平与对照值进行比较或使得将所述表达水平与对照值进行比较；
[0062]
k)基于所述比较的结果预测或使得预测所述疾病的进展。
[0063]
在第六方面，本发明涉及特别是选自基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合的一种或多种生物标记物用于确定抗纤维化剂在治疗需要治疗的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍中是否有效的用途，包括
[0064]
a)在开始施用所述抗纤维化剂之前获得或使得获得来自所述患者的第一生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0065]
b)向所述患者施用所述抗纤维化剂或使得将所述抗纤维化剂施用于所述患者；
[0066]
c)在施用所述抗纤维化剂之后，获得或使得获得来自所述患者的第二生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0067]
d)测量所述第一样品和所述第二样品中所述一种或多种生物标记物的表达水平，或使得测量所述水平；以及
[0068]
e)任选地考虑对照值，将获自第一生物样品和第二生物样品的所述一种或多种生物标记物的表达水平进行比较，或使得比较所述水平。
[0069]
对于本领域技术人员而言，本发明的其他方面将直接从前述和以下描述和实施例中变得清楚。
[0070]
通用术语和定义
[0071]
在本文中没有明确定义的术语应当被赋予本领域技术人员根据本公开文本和上下文而给出的含义。然而，如本说明书所用，除非有相反的规定，否则以下术语具有所指示的含义并且遵守以下约定。
[0072]
术语“一种或多种根据本发明的化合物”、“一种或多种式(i)的化合物”、“一种或多种本发明的化合物”等表示根据本发明的式(i)的化合物，包括它们的互变异构体、立体异构体及其混合物及其盐(特别是其药学上可接受的盐)、以及此类化合物的溶剂化物和水合物(包括此类互变异构体、立体异构体及其盐的溶剂化物和水合物)。
[0073]
同样，除非明确指示，否则贯穿整个说明书和所附权利要求，给定的化学式或名称应当涵盖互变异构体和所有立体异构体、光学异构体和几何异构体(例如对映异构体、非对映异构体、e/z异构体等
……
)及其外消旋体以及处于不同比例的单独对映异构体的混合物、非对映异构体的混合物、或任何前述形式的混合物(其中存在此类异构体和对映异构体)以及盐(包括其药学上可接受的盐)及其溶剂化物(例如像水合物，包括游离化合物的溶剂化物或化合物的盐的溶剂化物)。
[0074]
短语“药学上可接受的”在本文中用于指代在合理的医学判断范围内适用于与人和动物组织接触而没有过多的毒性、刺激性、过敏反应、或其他问题或并发症，并且与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0075]
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其有机或无机酸盐或有机或无机碱盐而被修饰。药学上可接受的盐的例子包括但不限于诸如胺等碱性残基的矿物酸盐或有机酸盐；诸如羧酸等酸性残基的碱盐或有机盐；等等。
[0076]
除上文所提及那些之外的其他酸的盐(其例如可用于纯化或分离本发明的化合物，例如三氟乙酸盐)也构成本发明的一部分。
[0077]
如本文所用，术语“治疗”(“treatment”和“treating”)包括治疗性(即治愈性和/或姑息性)和预防性(preventive，即prophylactic)治疗。
[0078]
治疗性治疗(“疗法”)是指对已经以明显、急性或慢性形式发展了一种或多种所述病症的患者进行的治疗。治疗性治疗可以是对症治疗，以便减轻特定适应症的症状，或因果治疗，以便逆转或部分逆转适应症的状况或者停止或减缓疾病的进展。
[0079]
预防性治疗(“预防(prevention)”、“预防(prophylaxis)”)是指对在疾病临床发作之前处于发展所述病症中的一种或多种的风险中的患者进行以便降低所述风险的治疗。
[0080]
术语“治疗”(“treatment”和“treating”)包括施用一种或多种活性化合物，特别是其治疗有效量，以便预防或延迟所述症状或并发症的发作，以及预防或延迟所述疾病、病症或障碍的发展，和/或以便消除或控制所述疾病、病症或障碍以及减轻与所述疾病、病症或障碍相关的症状或并发症。
[0081]
当本发明提及需要治疗的患者时，其主要涉及哺乳动物(特别是人)中的治疗。
[0082]
术语“治疗有效量”意指本发明化合物的这样的量，所述量的本发明化合物(i)治疗或预防特定疾病或病症，(ii)减弱、改善或消除特定疾病或病症的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述特定疾病或病症的一种或多种症状的发作。
[0083]
术语“生物标记物”指定了单个基因或蛋白质以及基因(例如“基因集”，“基因特征”)和/或蛋白质的组合，其表达的变化指示对医学治疗的生物学、病理学或药理学反应。
[0084]
应了解，本文所述方法的所有步骤都可以仅由一个单个个体或实体进行或由多于一个的个体或实体进行。因此，每当一种方法包括进行特定方法步骤时，这可等同涉及使得进行所述方法步骤。
具体实施方式
[0085]
本发明解决了上述在纤维化障碍治疗方面的需求，并且提供了可用于此目的的生物标记物。因此，它允许通过施用抗纤维化剂来有效治疗患有纤维化障碍的患者。
[0086]
对于潜在的实验发现，参考实施例和实验数据部分。
[0087]
在本发明的第一方面，发现生物标记物可用于监测患有纤维化障碍的患者对抗纤维化治疗的反应。
[0088]
因此，本发明涉及一种抗纤维化剂，所述抗纤维化剂特别选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合，用于在用于治疗有需要的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的方法中使用，所述方法包括监测患者对所述治疗的反应，包括以下步骤：
[0089]
a)在开始施用所述抗纤维化剂之前获得或使得获得来自所述患者的第一生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0090]
b)向所述患者施用所述抗纤维化剂或使得将所述抗纤维化剂施用于所述患者；
[0091]
c)在施用所述抗纤维化剂之后，获得或使得获得来自所述患者的第二生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0092]
d)在所述第一样品和所述第二样品中测量特别是选自以下基因的一种或多种生物标记物的表达水平：ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合，或使得测量所述水平；以及
[0093]
e)任选地考虑对照值，将获自第一生物样品和第二生物样品的所述一种或多种生物标记物的表达水平进行比较，或使得比较所述水平。
[0094]
所述方法同样适用于检测患者中的有益反应的存在或不存在。
[0095]
当然，如对于本领域技术人员明显的，如步骤d)所定义的在第一样品中生物标记物表达水平的测量不一定必须在步骤b)和c)之后进行，而是可以在步骤a)之后和步骤e)之前的任何时间进行。因此，在这一方面，上述方法步骤的顺序不应被解释为严格的时间顺序。
[0096]
任选地，步骤c)、d)和e)可以在治疗过程中在以后的多个时间点上重复以获得或提供另外的样品，测量其生物标记物表达水平，并且将它们与先前获得的水平进行比较，以便可以进行对患者反应的继续监测。
[0097]
因此，所述方法可以同样适用于监测患者对药物治疗方案的依从性。
[0098]
同样，本发明涉及一种用于治疗有需要的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的方法，所述方法包括监测患者对所述治疗的反应，包括所述步骤a)、b)、c)、d)和e)，其中在步骤b)中，向所述患者施用一种或多种抗纤维化剂，所述抗纤维化剂特别选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合。
[0099]
同样，本发明涉及一种或多种抗纤维化剂在制造用于治疗有需要的患者的特别是
选自pf-ild的纤维化障碍的药剂中的用途，所述抗纤维化剂特别选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合，所述方法包括监测患者对所述治疗的反应，包括所述步骤a)、b)、c)、d)和e)。
[0100]
在本发明的第二方面，发现生物标记物可用于检测患有纤维化障碍的患者中对抗纤维化治疗的有益反应的存在或不存在。
[0101]
因此，本发明涉及一种抗纤维化剂，所述抗纤维化剂特别选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合，用于在用于治疗有需要的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的方法中使用，所述方法包括检测有益反应的存在或不存在，包括以下步骤：
[0102]
b)向所述患者施用所述抗纤维化剂或使得将所述抗纤维化剂施用于所述患者；
[0103]
c)在施用所述抗纤维化剂之后，获得或使得获得来自所述患者的生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0104]
d)在所述样品中测量特别是选自以下基因的一种或多种生物标记物的表达水平：ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合，或使得测量所述水平；
[0105]
e)将所述一种或多种生物标记物的表达水平与对照值进行比较或使得将所述表达水平与对照值进行比较；以及
[0106]
f)确定或使得确定所述样品与所述对照之间的水平差异是否反映了所述患者的有益反应。
[0107]
在所述方法涉及检测有益反应的存在的情况下，可以同样应用所述方法以监测患者对药物治疗方案的依从性。
[0108]
同样，本发明涉及一种用于治疗有需要的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的方法，所述方法包括检测有益反应的存在或不存在，包括所述步骤b)、c)、d)、e)和f)，其中在步骤b)中，向所述患者施用一种或多种抗纤维化剂，所述抗纤维化剂特别选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合。
[0109]
同样，本发明涉及一种或多种抗纤维化剂在制造用于治疗有需要的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的药剂中的用途，所述抗纤维化剂特别选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合，所述方法包括检测有益反应的存在或不存在，包括所述步骤b)、c)、d)、e)和f)。
[0110]
在本发明的第三方面，发现生物标记物可用于确定开始对患有纤维化障碍的患者进行抗纤维化治疗。
[0111]
因此，本发明涉及一种抗纤维化剂，所述抗纤维化剂特别选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合，用于在用于治疗有需要的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的方法中使用，所述方法包括确定开始所述治疗，包括以下步骤：
[0112]
a)在开始施用所述抗纤维化剂之前获得或使得获得来自所述患者的生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0113]
d)在所述样品中测量特别是选自以下基因的一种或多种生物标记物的表达水平：
ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合，或使得测量所述水平；
[0114]
e)将所述一种或多种生物标记物的表达水平与对照值进行比较或使得将所述表达水平与对照值进行比较；
[0115]
h)确定或使得确定所述样品中的表达水平与对照值之间的差异是否反映了需要开始对所述纤维化障碍的治疗；以及
[0116]
i)如果已经确定需要开始对所述纤维化障碍的治疗，则向所述患者施用所述抗纤维化剂或使得将所述抗纤维化剂施用于所述患者。
[0117]
同样，本发明涉及一种用于治疗有需要的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的方法，所述方法包括确定开始所述治疗，包括所述步骤a)、d)、e)、h)和i)，其中在步骤i)中，向所述患者施用一种或多种抗纤维化剂，所述抗纤维化剂特别选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合。
[0118]
同样，本发明涉及一种或多种抗纤维化剂在制造用于治疗有需要的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的药剂中的用途，所述抗纤维化剂特别选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合，所述方法包括确定开始所述治疗，包括所述步骤a)、d)、e)、h)和i)。
[0119]
在本发明的第四方面，发现生物标记物可用于选择患有纤维化障碍的患者用抗纤维化剂治疗。
[0120]
因此，本发明涉及特别是选自基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合的一种或多种生物标记物用于选择患有特别是选自pf-ild的纤维化障碍的患者用抗纤维化剂治疗的用途，包括
[0121]
a)在开始施用所述抗纤维化剂之前获得或使得获得来自所述患者的生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0122]
d)测量所述样品中所述一种或多种生物标记物的表达水平或使得测量所述水平；
[0123]
e)将所述一种或多种生物标记物的表达水平与对照值进行比较或使得将所述表达水平与对照值进行比较；
[0124]
j)基于所述比较的结果确定或使得确定所述患者是否有资格用抗纤维化剂治疗。
[0125]
例如，可以将生物标记物用于患者选择的所述用途应用于这样的一种方法中，所述方法富集在用抗纤维化剂治疗后预期示出有益反应或在所述治疗后预期未示出有益反应的患者的患者群体。
[0126]
在本发明的第五方面，发现生物标记物可用于预测患者的纤维化障碍的进展。
[0127]
因此，本发明涉及特别是选自基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合的一种或多种生物标记物用于预测患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍的进展的用途，包括
[0128]
a)和/或c)在开始施用抗纤维化剂之前和/或施用抗纤维化剂之后，获得或使得获得来自所述患者的生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0129]
d)测量所述样品中所述一种或多种生物标记物的表达水平或使得测量所述水平；
[0130]
e)将所述一种或多种生物标记物的表达水平与对照值进行比较或使得将所述表
达水平与对照值进行比较；
[0131]
k)基于所述比较的结果预测或使得预测所述疾病的进展。
[0132]
在本发明的第六方面，发现生物标记物可用于评估患有纤维化障碍的患者的抗纤维化治疗的功效。
[0133]
因此，本发明涉及特别是选自基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合的一种或多种生物标记物用于确定抗纤维化剂在治疗需要治疗的患者的特别是选自pf-ild的纤维化障碍中是否有效的用途，包括
[0134]
a)在开始施用所述抗纤维化剂之前获得或使得获得来自所述患者的第一生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0135]
b)向所述患者施用所述抗纤维化剂或使得将所述抗纤维化剂施用于所述患者；
[0136]
c)在施用所述抗纤维化剂之后，获得或使得获得来自所述患者的第二生物样品，或提供或使得提供所述样品；
[0137]
d)测量所述第一样品和所述第二样品中所述一种或多种生物标记物的表达水平，或使得测量所述水平；以及
[0138]
e)任选地考虑对照值，将获自第一生物样品和第二生物样品的所述一种或多种生物标记物的表达水平进行比较，或使得比较所述水平。
[0139]
当然，如对于本领域技术人员明显的，如步骤d)所定义的在第一样品中生物标记物表达水平的测量不一定必须在步骤b)和c)之后进行，而是可以在步骤a)之后和步骤e)之前的任何时间进行。因此，在这一方面，上述方法步骤的顺序不应被解释为严格的时间顺序。
[0140]
根据本发明的任一前述方面的一个实施方案，所述抗纤维化剂选自尼达尼布、其药学上可接受的盐和吡非尼酮，作为单一疗法或彼此组合或与西地那非或其药学上可接受的盐组合；优选选自尼达尼布及其药学上可接受的盐，任选地与西地那非或西地那非柠檬酸盐组合；最优选它是尼达尼布或尼达尼布单乙磺酸盐，任选地与西地那非柠檬酸盐组合。
[0141]
用于施用本发明的活性药物成分的合适制剂对于本领域普通技术人员将是清楚的，并且包括例如片剂、丸剂、胶囊、栓剂、锭剂、糖锭、溶液、糖浆、酏剂、小药囊、注射剂、吸入剂和散剂等。合适的片剂可例如通过将一种或多种上述活性药物成分与已知的赋形剂混合来获得，所述赋形剂例如惰性稀释剂、载体、崩解剂、佐剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂。
[0142]
特别地，包含尼达尼布的用于口服施用的药物剂型披露于wo 2009/147212和wo 2009/147220中。用于施用吡非尼酮的合适的制剂例如由wo 2007/038315和wo 2017/172602提供。
[0143]
例如，在口服施加至有需要的患者时，尼达尼布的治疗有效剂量可以在每天100mg至300mg范围内，优选每天两次施加50mg、100mg或150mg，相隔大约12小时。
[0144]
当然，实际治疗有效量或治疗剂量将取决于本领域技术人员已知的因素，如患者的年龄和体重、施用途径和疾病的严重程度。在任何情况下，将按允许基于患者的独特病症递送治疗有效量的剂量和方式施用所述活性化合物。同样地，确定例如由于对活性药物成分的不良反应而进行剂量调整的必要性和将剂量调整付诸实践将是本领域技术人员已知
的。
[0145]
因此，根据一个实施方案，将所述抗纤维化剂以包含抗纤维化剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的形式施用。
[0146]
根据另一个实施方案，所述药物组合物选自用于口服施用的组合物，优选选自胶囊和片剂，最优选选自胶囊。
[0147]
根据一个实施方案，所述纤维化障碍选自进行性纤维化间质性肺疾病(pf-ild)，特别是具有肺纤维化表现的疾病，如特发性肺纤维化(ipf)、系统性硬化症相关ild(ssc-ild)、结缔组织病相关ild(ctd-ild)、类风湿性关节炎相关ild(ra-ild)、慢性纤维化超敏性肺炎(hp)、特发性非特异性间质性肺炎(insip)、无法分类的特发性间质性肺炎(iip)、环境/职业性纤维化肺疾病、具有自身免疫性特征的特发性肺炎(ipaf)和结节病；
[0148]
优选选自ipf、ssc-ild和ra-ild。
[0149]
根据另一个实施方案，所述纤维化障碍选自肌营养不良、纤维瘤病和骨髓纤维化，优选选自杜氏肌营养不良、杜普伊特伦挛缩和原发性骨髓纤维化(pmf)。
[0150]
根据一个实施方案，在开始施用抗纤维化剂时，所述患者示出了占预计正常值不大于约40％、占预计正常值约40％至约50％、占预计正常值约50％至约60％、占预计正常值约60％至约80％、或占预计正常值不小于约80％的用力肺活量(fvc)。
[0151]
根据另一个实施方案，在开始施用抗纤维化剂时，所述患者示出了占预计正常值不大于约40％、占预计正常值约40％至约60％、占预计正常值约60％至约80％、或占预计正常值不小于约80％的肺一氧化碳弥散量(d
l
co)。
[0152]
根据一个实施方案，在不早于步骤b)开始后约1周，例如，在步骤b)开始后约1周至约52周的时间范围内，优选在约1周至约24周的时间范围内，
[0153]
更优选在步骤b)开始后约1、2、3、4、6、8、10、12、16、20或24周后，
[0154]
最优选在步骤b)开始后约1、2、4、8或12周后，获得或已经获得步骤c)中的生物样品。
[0155]
根据另一个实施方案，所述生物样品是血液、外周血单个核细胞(pbmc)或皮肤样品，优选血液或pbmc样品。
[0156]
根据另一个实施方案，通过血液采集或活检，
[0157]
优选通过血液采集，获得或已经获得所述生物样品。
[0158]
根据一个实施方案，所述一种或多种生物标记物是与嗜中性粒细胞、细胞外基质和免疫应答相关的基因，
[0159]
特别地选自基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo、prtn3及其组合，
[0160]
优选选自ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、lmod1、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4及其组合，更优选选自ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1及其组合或选自ceacam6、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4及其组合，最优选选自ceacam6、ctsg、defa4、ltf、olfm4及其组合。
[0161]
根据另一个实施方案，在上文所述的方法和用途的步骤d)和e)中，采用仅单个生物标记物，所述生物标记物是选自上述组的基因中的任一种的单基因。
[0162]
根据另一个实施方案，在上文所述的方法和用途的步骤d)和e)中，采用两种或更
多种生物标记物，所述生物标记物是选自上述组的基因中的任一种的单基因，
[0163]
特别是其2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种基因，更特别是其2、3、5、6、8、10或14种基因，
[0164]
优选采用5种基因ceacam6、ctsg、defa4、ltf、olfm4或
[0165]
6种基因ceacam6、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4或
[0166]
采用8种基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4和olr1，或
[0167]
10种基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、lmod1、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4或
[0168]
14种基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo和prtn3。
[0169]
根据另一个实施方案，在上文所述的方法和用途的步骤d)和e)中，所述一种或多种生物标记物是选自上述组的基因中的任一种的一种或多种基因的组合，
[0170]
特别是其2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种基因的组合，更特别是其2、3、5、6、8、10或14种基因的组合，
[0171]
优选采用5种基因ceacam6、ctsg、defa4、ltf、olfm4的组合或
[0172]
6种基因ceacam6、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4的组合或
[0173]
采用8种基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4和olr1的组合，或10种基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、lmod1、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4的组合或
[0174]
14种基因ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo和prtn3的组合。
[0175]
根据另一个实施方案，通过以下确定生物标记物的水平：rna测序或定量实时pcr(如但不限于taqman基因表达测定或低密度阵列(tlda)卡)或nanostring ncounter技术(geiss等人,nat biotechnol.2008年3月；26(3):317-25)或另一种基于rna或cdna的测定，优选通过rna测序或通过定量实时pcr，更优选通过定量实时pcr。
[0176]
根据一个实施方案，使用在开始施用抗纤维化剂前从患者取得的样品、从用安慰剂治疗的患者取得的样品或从用另一种抗纤维化药物(例如，除尼达尼布之外)治疗的患者取得的样品，优选使用在开始施用抗纤维化剂前从患者取得的样品确定对照值，特别是根据本发明的第一、第二和第六方面的对照值。
[0177]
根据另一个实施方案，使用从未患有纤维化障碍的受试者取得的样品或从已知患有纤维化障碍的受试者取得的样品确定对照值，特别是根据本发明的第三、第四、第五和第六方面的对照值。
[0178]
根据另一个实施方案，使用从患有具有进行性病程的纤维化障碍的受试者取得的样品或从患有具有稳定病程的纤维化障碍的受试者取得的样品确定对照值，特别是根据本发明的任一方面的对照值。
[0179]
进行性病程和稳定病程的分类可取决于每种单独情况的境况，但是对于所述领域经验丰富的从业者来说，这将是常规方法的一部分。例如，pf-ild的进展可以定义为在6或12个月内的系列肺功能测试期间，多于10％的fvc和/或多于15％的d
l
co的绝对减少。
[0180]
根据一个实施方案，如果测量的生物标记物表达水平与对照值的差异是相对于对照值至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，优选如果它们的差异是至少约20％、30％、40％或
50％，则所述测量的生物标记物表达水平被认为，在根据步骤e)的比较内，与对照值不同，即高于或低于对照值。
[0181]
根据另一个实施方案，患者中有益反应的存在是通过测量的在样品中的生物标记物表达水平低于对照值指示的，并且因此患者中有益反应的不存在是通过测量的在样品中的生物标记物表达水平不低于对照值指示的，例如，当使用在开始施用抗纤维化剂前从患者取得的样品、从用安慰剂治疗的患者取得的样品或从患有具有进行性病程的纤维化障碍的受试者取得的样品确定对照值时。
[0182]
根据另一个实施方案，基于测量的在样品中的生物标记物表达水平高于对照值，指示开始抗纤维化治疗或选择患有纤维化障碍的患者用于抗纤维化治疗，
[0183]
例如，当使用从未患有纤维化障碍的受试者取得的样品、或从患有具有稳定病程的纤维化障碍的受试者取得的样品确定对照值时。
[0184]
根据另一个实施方案，基于测量的在样品中的生物标记物表达水平不低于对照值，指示开始抗纤维化治疗或选择患有纤维化障碍的患者用于抗纤维化治疗，
[0185]
例如，当使用从已知患有纤维化障碍的受试者取得的样品或从患有具有进行性病程的纤维化障碍的受试者取得的样品确定对照值时。
[0186]
根据另一个实施方案，通过测量的在样品中的生物标记物表达水平低于对照值指示抗纤维化治疗的功效，例如，当使用在开始施用抗纤维化剂前从患者取得的样品、从用安慰剂治疗的患者取得的样品或从患有具有进行性病程的纤维化障碍的受试者取得的样品确定对照值时。
[0187]
根据另一个实施方案，通过测量的在样品中的生物标记物表达水平不高于对照值指示抗纤维化治疗的功效，例如，当使用从未患有纤维化障碍的受试者取得的样品、从患有具有稳定病程的纤维化障碍的受试者取得的样品或从用另一种抗纤维化药物治疗的患者取得的样品确定对照值时。
[0188]
当然，根据步骤e)以及随后的方法步骤f)至k)生物标记物的表达水平与对照值的比较或彼此比较(如适用)可以包括使用适当的统计学考虑因素。此类方法(例如假设检验、置信区间等的使用)及其应用是本领域技术人员熟知的。
[0189]
进一步发现，上述生物标记物的使用提供了用以确定对于修改用抗纤维化剂治疗纤维化障碍的需求的选项。例如，根据本发明的第二方面，患者中的有益反应的检测提供了进一步的治疗选项：如果未观察到不可耐受的副作用，则可以在不改变剂量方案的情况下继续施用抗纤维化剂。可替代地，尽管存在有益反应，如果抗纤维化治疗的副作用被认为是不可耐受的，则可以降低剂量或剂量频率，旨在最小化副作用同时维持有益的治疗反应。
[0190]
因此，根据一个实施方案，如果在所述患者中已经检测到有益反应，则所述方法进一步包括以下步骤：
[0191]
g1)继续或使得继续向所述患者施用所述抗纤维化剂。
[0192]
根据另一个实施方案，如果在所述患者中已经检测到有益反应，则所述方法进一步包括以下步骤：
[0193]
g2)减少或使得减少剂量或给药频率。
[0194]
在另一方面，如果无法检测到有益反应且没有发生不可耐受的副作用，则可以考虑中止施用抗纤维化剂，或者可以增加抗纤维化剂的剂量或剂量频率，旨在实现有益反应
腺苷酸化和索引衔接子连接后，将cdna产物纯化并且通过pcr富集以创建最终cdna文库。使用quant-it pico green dsdna试剂确定文库量，并且通过使用agilent bioanalyzer 2100设备分析cdna片段大小来检查质量。将文库稀释至5nm后，将样品汇集以生成簇。在illumina hiseq-3000测序仪上进行rna测序。
[0216]
计算分析
[0217]
质量对照：使用fastqc v0.11.2评估针对每个样品获得的原始数据(捕获的cdna片段的单端读段序列)的质量。对于样品的成功基因表达分析，需要大约5000万个读段。将读段使用star v2.5.2a映射到人类参考基因组hg38(grch38 ensembl v.84)。使用rna-seqc v1.1.8评估映射的读段，借此映射统计数据(例如唯一的映射率、检测到的基因数、映射到蛋白质编码基因的读段的比例)提供了决定数据可用性的最终标准。
[0218]
将基因表达强度表示为读段计数或tpm值，并且分别使用subread featurecounts和rsem1.2.31版根据ensembl v84基因注释进行计算。进一步的步骤包括使用bamutil 1.0.11版和samtools 1.1版用于中间计算，如索引化bam文件和二重读段标记。最终，使用pca和分层聚类分析来鉴定异常值。
[0219]
差异表达分析：在随后的分析中仅使用了至少一个样品的基因，所述基因显示每百万计数(cpm)≥1。使用edger’s calcnormfactors函数(robinson和oshlack,genome biol.2010；11(3):r25.)的默认参数，使用m值的加权修削平均值(tmm)方法，计算基于原始文库大小来扩展样品的归一化因子。在这些预处理步骤之后，然后使用limma’s voom函数(law等人,genome biol.2014年2月3日；15(2):r29.)，基于来自先前步骤的归一化文库大小计算每个观察结果的log2每百万计数连同相关权重。通过duplicatecorrelation函数估计每名患者配对的测量结果之间的相关性。对于每种基因，利用重复测量线性回归模型，其中以治疗(尼达尼布或安慰剂)、访视和治疗-访视相互作用为固定效应，并且以患者为分块因子(blocking factor)。特此，考虑每个观察结果的权重。所有线性模型均使用limma软件包的lmfit函数实现。在每个治疗组中在第12周(wk12)与基线(bl)的随访之间的平均log2倍数变化的估计值如下计算：
[0220]
log2 fcnint
w12
vs nint
bl
＝(log2 nint
w12-log2 nint
bl
)
[0221]
log2 fcpbo
w12
vs pbo
bl
＝(log2 pbo
w12-log2 pbo
bl
)
[0222]
根据benjamini-hochberg，通过log2倍数变化和相关的错误发现率(fdr)调整p值来量化变化。
[0223]
基因集方差分析(gsva)：应用bioconductor软件包gene set variance analysis 1.3.2版，以单独地针对14种基因(ltf、ceacam6、ctsg、olfm4、mmp8、ceacam8、defa4、olr1、shisa4、abca13、emid1、lmod1、mpo和prtn3)的活性对每个样品进行评分。用log2每百万转录物(tpm)的表达矩阵执行gsva函数，其中添加到每个值(14种基因的列表)的伪计数为0.01，并且参数mx.diff设置为真。使用简单的线性模型测试不同治疗组之间的gsva得分之间的统计学差异，并且使用经验贝叶斯收缩方法通过limma软件包计算了经调节的t统计量(law等人,genome biol.2014年2月3日；15(2):r29)。
[0224]
在患有ipf的患者中尼达尼布治疗后对改变的基因的鉴定
[0225]
在inmark研究中，已经评估了尼达尼布对几种生物标记物的影响。在此研究中，在基线和用安慰剂或尼达尼布(口服施用，150mg b.i.d.)治疗后12周时，从ipf患者前瞻性地
收集全血样品：分别从安慰剂和活性治疗群组获得230和116个样品。将总rna从这些血液样品中分离，进行质量控制(qc)，并且通过全转录组rna测序分析，以鉴定每个治疗组中在基线与第12周随访之间以及每次访视时安慰剂治疗与尼达尼布治疗之间差异表达的基因(deg)。qc后，来自尼达尼布治疗组的110个样品和来自安慰剂组的217个样品有资格用于分析。当在尼达尼布治疗前和尼达尼布治疗后比较基因表达时，19种编码蛋白质的基因显示出显著的差异(调整p值《0.05)。这些基因中有18种被下调，并且一种基因被上调。最初选择了前十种下调的基因(ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、lmod1、ltf、mmp8、olfm4、olr1、shisa4)，以用于进一步表征。在剩余八种下调的基因中，基于其倍数变化和提出的生物学作用选择了四种另外的基因(abca13、emid1、mpo、prtn3)，如根据文献和途径关联工具明显的(参见下文)。
[0226]
对于这些所选的14种基因，表1总结了在访视2(v2，基线)与访视5(v5，12周)之间在尼达尼布与安慰剂治疗下基因表达的线性倍数变化和benjamini-hochberg调整p值。
[0227]
表1：
[0228][0229]
defa4：防御素α4；lmod1：平滑肌蛋白1；olfm4：嗅质蛋白4；ctsg：组织蛋白酶g；prtn3：蛋白酶3；ltf：乳运铁蛋白；mmp8：基质金属蛋白酶8；ceacam6/8：癌胚抗原相关的细胞粘附分子6/8；shisa4：shisa家族成员4；olr1：氧化型低密度脂蛋白受体1；emid1：含emi结构域的蛋白1；abca13：atp结合盒亚家族a成员13；mpo：髓过氧化物酶
[0230]
与安慰剂治疗相比，所有14种所选基因在尼达尼布后展现出更强的降低，所述安慰剂治疗仅导致基因表达的微小变化或没有变化(图1和图2)。计算的按患者倍数变化(图3)示出相似的并且在一些情况下更强的效果的发现指示所观察到的分组变化(图1和图2)是稳健的，而不是由异常值驱动。
[0231]
发现所有14种基因都示出了与ild相关途径的高度显著相关，例如，14种基因中的11种(abca13、ceacam6、ceacam8、ctsg、defa4、ltf、mmp8、mpo、olfm4、olr1、prtn3)与基因本体论(go)生物过程术语“嗜中性粒细胞介导的免疫(go:0002446)”相关(调整p值9.25e-13)，并且14种基因中的4种与reactome途径“细胞外基质(ecm)组织智人r-hsa-1474244”相关(调整p值0.02687)(图4)。ceacam6和ceacam8还与reactome途径“纤连蛋白基质形成智人r-hsa-1566977”相关(调整p值0.01043)。lmod1先前示出了相比于对照在ipf组织中上调(selman等人,am j respir crit care med.2006年1月15日；173(2):188-98.)，并且emid1
是ecm/基质组相关蛋白。对于shisa4没有发现的已知的生物学作用。然而，小鼠中的shisa直向同源物被描述为wnt和fgf信号传导拮抗剂(furushima等人,dev biol.2007年6月15日；306(2):480-92.)。此外，14种基因中的四种(ceacam6、ctsg、defa4、olfm4)与上调的全血13基因集重叠，后者在先前发现用于区分通过一氧化碳弥散量(dlco)值的差异定义的重度与轻度ipf(yang等人,plos one.2012；7(6):e37708.)。ctsg、olfm4、defa4、ceacam8和ltf进一步包含在20种基因的列表中，所述列表区分重度ipf与健康对照(yang等人,plos one.2012；7(6):e37708.)。defa4、olfm4和ctsg是全血5基因集的另一部分，所述基因集示出了原发性骨髓纤维化(pmf)与对照之间的差异性表达(hasselbalch等人,plos one.2014年1月13日；9(1):e85567.)。ceacam6、ceacam8、mpo和mmp8是全血7基因集的另一部分，所述基因集区分纤维化前期的骨髓纤维化(prepmf)与原发性血小板增多症(et)(skov等人,plos one.2016年8月31日；11(8):e0161570.)。
[0232]
为了评估尼达尼布相比于安慰剂治疗对鉴定的14基因集的差异性影响，进行了非参数、无监督基因集变异分析(gsva)(等人,bmc bioinformatics.2013年1月16日；14:7.)。结果表明，在尼达尼布治疗后gsva得分高度显著降低(p＝1.35e-05)，而在用安慰剂治疗后未观察到显著的变化(图5)。
[0233]
在非ipf ild中尼达尼布诱导的表达变化的验证
[0234]
在ipf的背景下，在inmark试验中鉴定了14种尼达尼布响应性基因后，在另外两项临床试验中评估了这些基因的表达。senscis试验研究了在52周的时间范围内，尼达尼布相比于安慰剂治疗在580名患有ssc-ild的患者的群组中的效果。pf-ild试验inbuild研究了在52周的时间范围内，尼达尼布相比于安慰剂治疗在662名患有进行性纤维化ild的患者的群组中的效果，所述进行性纤维化ild包括结缔组织疾病(ctd)相关ild、类风湿性关节炎相关ild(ra-ild)、慢性纤维化超敏性肺炎(hp)、特发性非特异性间质性肺炎(insip)、无法分类的特发性间质性肺炎(iip)、环境/职业性肺疾病或结节病。在这两个试验中，前瞻性地收集全血样品，并且通过全转录组rna测序回顾性地分析了14种所述基因的表达。与inmark试验中的发现一致，在治疗后的24周(v70)，并且在一些情况下，在治疗后的52周(v90)，在尼达尼布治疗后在senscis研究中，14种基因中的大多数被下调，但是在安慰剂治疗后没有出现下调(图6和图7)。当以按患者的方式计算表达的倍数变化时，观察到了相似的效果(图8)。gsva分析进一步示出了在两次访视时，尼达尼布治疗后gsva得分显著降低，而用安慰剂治疗后未观察到显著变化(图9)。
[0235]
c)含有尼达尼布的用于口服施用的配制品
[0236]
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含有150mg尼达尼布的软明胶胶囊
[0237][0238]
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包含尼达尼布的用于口服施用的其他药物剂型披露于wo 2009/147212和wo 2009/147220中。