PBLD或其激动剂作为抗RNA病毒活性成分的应用

pbld或其激动剂作为抗rna病毒活性成分的应用
技术领域
1.本发明属于抗rna病毒技术领域，具体涉及吩嗪生物合成样结构域蛋白 (pbld)或其激动剂作为抗rna病毒活性成分的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus，befv)为单股负链rna病毒，属于弹状病毒科暂时热病毒属，可通过呼吸道方式传播，能够引发牛流行热(又名三日热)。该病具有流行面广、传播迅速、发病率高等特点，以高热、呼吸困难、畏光流泪、运动机能障碍等临床症状为主要特征，引起奶牛的产奶量明显下降，而且部分病牛常因瘫痪而淘汰，对养牛业具有严重的威胁。
4.水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，vsv)属于弹状病毒科水疱病毒属，是有囊膜的单股负链rna病毒，能够感染猪、牛、马、骡、鹿等多种动物，引发人兽共患病-水疱性口炎。该病以发病动物的口腔粘膜、乳头和蹄冠部的皮肤出现水疱及糜烂为特征，会出现发热、厌食和精神沉郁等症状，使感染动物的生产能力下降而造成严重的经济损失，并对国际贸易产生严重影响，具有重要的社会经济和公共卫生意义，被世界动物卫生组织列为二类传染病。
5.目前对上述疫病的研究主要集中在流行病学调查、毒株的遗传进化分析、诊断方法的建立及免疫疫苗的初步探究，尚待深入开展病毒与宿主间的作用的分子机制研究。因此，研究病毒与宿主间的相互作用机制，尤其是发现调控病毒复制的关键基因，可为抗病毒药物的研发和治疗提供理论基础，也将为传染病的防控提供新思路。
6.吩嗪生物合成样结构域蛋白(phenazine biosynthesis like protein domaincontaining，pbld)，是一种丝氨酸-苏氨酸激酶受体相关异构酶蛋白，具有高度的亲和力。研究发现，pbld具有抗肿瘤活性，可抑制与肿瘤进展相关的tgf
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β、mapk等多种信号通路。相关组织的基因组和蛋白组学的筛选研究发现，pbld在肿瘤组织中表达变化明显，并确定为胃癌、肝癌和乳腺癌的肿瘤抑制因子。pbld在胃癌组织中表达下调，在胃癌细胞中联合过表达pbld和mawd，可通过减弱smad3的磷酸化和减少smad3核移位来抑制tgf-β诱导的emt，即pbld通过抑制tgf-β诱导的emt负调控胃癌细胞的生长和侵袭，从而发挥抗肿瘤作用。过表达pbld后，mapk信号通路关键分子p-erk、p-p38及 p-jnk的表达均被显著抑制，从而抑制肝癌细胞的增殖与侵袭、迁移。溃疡性结肠炎的研究表明，pbld的表达与mapk之间负相关，而血管内皮生长因子依赖的血管生成需要mapk激活，表明pbld可能通过mapk通路和vegf成为肿瘤治疗的靶点。目前为止，pbld在病毒中的表达模式、临床意义和生物学功能尚缺乏系统的研究，其调控ifn-i信号通路及参与病毒复制的研究未见报道。


技术实现要素：

7.pbld是一种异构酶蛋白，广泛分布在各种细胞中，参与调控抗肿瘤作用，尚未有研究发现pbld与病毒之间的关系。本发明通过过表达和沉默pbld后分别感染befv，发现过表达pbld之后i-ifn的mrna和isgs的蛋白水平显著上调，沉默pbld之后则显著下调，首次提供了pbld参与调控befv诱导的天然免疫并影响病毒复制的新功能。
8.进一步的，本发明设计实验验证了pbld调控i-ifn和isgs表达的节点蛋白：mavs作为信号传导级联的一个关键调节分子，参与宿主的抗病毒天然免疫反应。rna病毒感染后，模式识别受体rig-i或mda-5可以识别病毒的rna 并与其结合，随后，rig-i或mda-5自身的构象发生改变与mavs结合，使 mavs形成朊病毒样聚集体与traf3结合后，进一步活化tbk1(tank-binding kinase 1)和ikkε(i kappab kinase)激酶形成复合体，磷酸化irf-3和irf-7，形成具有活性的irf-3和irf-7同二聚体和/或异二聚体后进入细胞核，启动干扰素等分子的表达。本发明进一步研究发现，分别经befv和vsv感染细胞，过表达pbld可显著促进mavs的蛋白表达及其下游p-tbk1和p-irf3的表达，而沉默pbld之后则显著下调。因而，pbld通过靶向mavs调控i-ifn和isgs 表达。
9.基于上述研究，本发明首先证实了pbld通过促进mavs的表达而激活 i-ifn信号通路，从而抑制befv和vsv的复制。为了验证pbld是否对其它rna病毒具有同样的作用。本发明使用瞬时过表达/沉默pbld细胞分别转染 poly i:c，poly i:c是双链rna的类似物可以模拟rna病毒在rlrs信号通路的激活功能。结果发现，在转染poly i:c的情况下，过表达pbld促进mavs的表达，从而促进p-tbk1、p-irf3及ifn-β、isg15的表达；而pbld沉默则抑制mavs、p-tbk1、p-irf3的表达，抑制ifn-β及isg15的表达。因此，pbld 具有通过调控mavs促进ifn-β抑制rna病毒复制的新功能。
10.本发明的研究证实了pbld过表达能够抑制befv和vsv的复制，并提供了明确的调控机制，根据上述研究结果，本领域技术人员可以预期提高牛体内 pbld的剂量或通过刺激手段增加牛机体内pbld的表达可以有效抑制befv或 vsv病毒的复制，控制病毒感染程度，抑制疾病进程。由于上述befv或vsv 病毒均为单股负链病毒，本发明以poly i:c作为研究对象，证实了pbld能够对双链病毒感染过程中的关键节点实现抑制作用，启示pbld对双链形式的rna 病毒也有望实现抑制效果。
11.因此，基于上述研究结论，本发明主要的技术目的如下：
12.第一方面：提供了吩嗪生物合成样结构域蛋白(pbld)或其激动剂作为抗 rna病毒活性成分的应用。
13.第二方面：提供了吩嗪生物合成样结构域蛋白(pbld)、其激动剂或其组合物形式在抗rna病毒制剂方面的应用。
附图说明
14.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
15.图1：沉默pbld基因sirna的表达鉴定；
16.图2：pbld对befv复制的影响；
17.其中，左图为过表达pbld抑制befv复制的结果，右图为沉默pbld促进befv复制的
结果；
18.图3：befv感染后pbld对ifn-βmrna表达的影响；
19.其中，左图为过表达pbld促进ifn-βmrna表达的结果，右图为沉默pbld 抑制ifn-βmrna表达的结果；
20.图4：befv感染后pbld对isg15表达的影响；
21.其中，左图为过表达pbld对下游ifn-β及干扰素刺激基因isg15蛋白水平的影响；
22.右图为沉默pbld对下游ifn-β及干扰素刺激基因isg15蛋白水平的影响；
23.图5：befv感染后pbld对i-ifn上游关键调控分子表达的影响；
24.其中，左图为过表达pbld对mavs、p-tbk1、p-irf3的促进结果；
25.右图为沉默pbld对mavs、p-tbk1、p-irf3的抑制结果；
26.图6：vsv感染后pbld对i-ifn信号通路关键基因表达的影响；
27.其中，左图为过表达pbld对vsv感染所介导的mavs及其下游信号的促进结果；
28.右图为沉默pbld对vsv感染所介导的mavs及其下游信号的抑制结果；
29.图7：vsv感染后pbld对β-ifn表达的影响；
30.其中，左图为过表达pbld对β-ifn表达的促进结果，右图为沉默pbld 对β-ifn表达的抑制结果；
31.图8：在poly i:c作用下pbld对i-ifn信号通路关键基因表达的影响；
32.其中，左图为过表达pbld对mavs及其下游信号的促进结果，右图为沉默pbld对mavs及其下游信号的抑制结果；
33.图9：在poly i:c作用下pbld对β-ifn基因表达的影响；
34.其中，左图为过表达pbld对β-ifn表达的促进结果，右图为沉默pbld 对β-ifn表达抑制结果。
具体实施方式
35.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
36.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
37.本发明首次揭示了pbld参与调控befv及vsv病毒复制的功能，并且有望通过抑制双链rna病毒激活过程中的关键蛋白实现对不同类型rna病毒的抑制作用，基于上述研究成果，本发明具体提供以下技术方案：
38.本发明第一方面，提供pbld或其激动剂作为抗rna病毒活性成分的应用。
39.上述第一方面中所述pbld可采用市售的重组pbld蛋白制剂，优选的纯度范围为95％及以上；所述重组pbld蛋白制剂的来源不限于大肠杆菌等工程菌株表达或液相合成、固相合成等方式。
40.所述pbld的激动剂包括但不限于能够刺激受试者机体内pbld表达含量升高的化
合物实体、聚合物、多肽或核酸物质，还包括基于基因工程方式对受试者机体中pbld进行过表达的相关试剂，如质粒、慢病毒等。
41.优选的，所述rna病毒包括双链rna及单链rna；进一步优选的，所述 rna病毒为单股负链rna病毒，具体的实例为牛流行热病毒(befv)、水疱性口炎病毒(vsv)。
42.优选的，所述pbld或其激动剂作为抗rna病毒活性成分的应用，其应用方式包括但不限于以下任意一种：
43.(1)用于制备抗rna病毒制剂；
44.(2)施用于有治疗需求的个体，以抑制病毒感染症状；
45.(3)用于牛饲料的制备或饲料添加剂的制备。
46.上述(1)方面的应用中，所述抗rna病毒制剂为用于防治牛感染牛流行热病毒(befv)、水疱性口炎病毒(vsv)的药物、疫苗、模型药剂中的一种；进一步的，所述模型药剂适用于哺乳动物、组织或细胞，用于构建一种牛流行热病毒(befv)、水疱性口炎病毒(vsv)抑制模型，构建目的包括用于活性治疗药物的筛选等。
47.上述(2)方面的应用中，所述施用方式包括但不限于通过饮食、饮水、口服、注射或介入手段将pbld或其激动剂递送至病毒感染部位。
48.上述(3)方面中，所述牛饲料的一种实例如预混料。
49.本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中，包括活性剂量的pbld或其激动剂，还包括药学上所必须的载体。
50.上述药物组合物中pbld或其激动剂的添加剂量属于本领域技术人员依据药物组合物的施用目的、受试对象、给药方式等因素可以常规确定的技术内容。所述药物组合物的施用目的包括预防、改善或抑制由于rna病毒感染导致的疾病症状；受试对象优选为牛，进一步的，为奶牛。
51.所述药物组合物的剂型没有特别的限制，优选的方式为固体制剂或液体制剂；固体制剂的情形下，所述载体包括但不限于赋形剂，润滑剂，粘合剂，崩解剂等；液体制剂的情形下，所述载体包括范不限于溶剂，增溶剂，悬浮剂，等渗剂，缓冲剂，舒缓剂等，还可以根据需要可以适当地加入防腐剂，抗氧化剂，着色剂，甜味剂和其他制剂添加剂。
52.作为赋形剂的优选实例，例如，可以使用乳糖，蔗糖，d-甘露糖醇，淀粉，结晶纤维素，轻质无水硅酸等。
53.作为润滑剂的优选实例，例如，可以使用硬脂酸镁，硬脂酸钙，滑石粉，胶体二氧化硅等。
54.作为粘合剂的优选实例，例如，可以使用结晶纤维素，蔗糖，d-甘露糖醇，糊精，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等。
55.作为崩解剂的优选实例，例如，可以使用淀粉，羧甲基纤维素，羧甲基纤维素钙，交联羧甲基纤维素钠，羧甲基淀粉钠等。
56.作为溶剂的优选实例，可以使用注射用水，醇，丙二醇，聚乙二醇，芝麻油，玉米油等。
57.作为增溶剂的优选实例，例如，使用聚乙二醇，丙二醇，d-甘露醇，苯甲酸苄酯，乙醇，三氨基甲烷，胆固醇，三乙醇胺，碳酸钠，柠檬酸钠等。
58.悬浮剂的合适实例包括，例如，表面活性剂(硬脂基三乙醇胺，月桂基硫酸钠，月桂
基氨基丙酸，卵磷脂，苯扎氯铵，苄索氯铵，单硬脂酸甘油酯等)，可以使用亲水性聚合物(聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素等)。
59.作为张度剂的合适实例，例如，可以使用氯化钠，甘油，d-甘露醇等。
60.作为缓冲剂的优选实例，例如，可以使用磷酸盐，乙酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐等的缓冲溶液。
61.作为舒缓剂的优选实例，例如，可以使用苯甲醇等。
62.作为防腐剂的优选实例，例如，可以使用对氧苯甲酸酯，氯丁醇，苯甲醇，苯乙醇，脱氢乙酸，山梨酸等。
63.作为抗氧化剂的优选实例，例如，可以使用亚硫酸盐，抗坏血酸等。
64.优选的，所述药物组合物中，还包括其他抗病毒活性成分或辅助抗病毒成分，所述抗病毒活性成分优选为rna聚合酶抑制剂，如瑞德西韦、法匹拉韦；所述辅助抗病毒成分包括但不限于免疫调节药物、抗生素、解热、缓解呼吸急迫类药物，具体的实例如复方氨基比林、安痛定、青霉素、链霉素、尼可杀米、氨茶碱等。
65.本发明第三方面，提供一种牛流行热防治药物，所述药物中包括活性剂量的吩嗪生物合成样结构域蛋白、其激动剂或第二方面所述药物组合物。
66.本发明第四方面，提供一种水疱性口炎防治药物，所述药物中包括活性剂量的吩嗪生物合成样结构域蛋白、其激动剂或第二方面所述药物组合物。
67.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
68.实施例1
69.1.材料
70.bhk-21、hela、293t细胞和牛流行热病毒(befv)、水疱性口炎病毒(vsv)均由山东师范大学反刍动物疾病研究中心保存。rtaq酶、primestargxldna聚合酶、dntps、dnamarkerdl2000、t4dna连接酶、primescript
tm
rtmastermix反转录试剂盒、premixextaq
tmⅱ(tlirnasehplus)和限制性内切酶等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；dh5α感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司；细胞总rna提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自北京全式金公司；β-actin、pbld、rig-i、mavs、tbk1、p-tbk1、irf3、p-irf-3、isg15等一抗及hrp标记二抗购自美国santacruz公司；pvdf膜、ecl显影发光液购自索莱宝公司。
71.2.方法与结果
72.2.1pbld基因过表达载体的构建及其表达检测
73.根据genbank公布的pbld基因序列(geneid:64081)，利用primerpremier5.0软件设计cds区扩增引物，
74.plvx-flag-pbld-ecori-f：
[0075]5′‑
cggaattccgatgaagcttcctattttcatag-3
′
；
[0076]
plvx-flag-pbld-kpni-r:
[0077][0078]
其中，下划线标记为限制性酶酶切位点序列，斜体为flag标签序列。按照细胞总rna提取试剂盒说明书提取hela细胞的总rna，进行反转录，获得的 cdna。进行pcr扩增，扩增体系为20μl：rtaq i 0.5μl，上游引物和下游引物各1μl，dntps 8μl，10
×
buffer 2μl，ddh2o 7.5μl。反应条件为预变性95℃5min，然后按照95℃变性20s、55℃20s、72℃1min进行30个循环；72℃7min，4℃ 10min结束反应。
[0079]
将pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得与预期大小一致的目的片段。将pcr产物与plvx-ires-puro载体分别经限制性内切酶ecor i和kpn i双酶切，胶回收，经t4dna连接酶连接，转化大肠杆菌dh5α，经amp筛选，挑取白色菌落，经pcr鉴定及双酶切鉴定的阳性重组菌进行dna测序，将测序正确的重组载体命名为plvx-flag-pbld。
[0080]
应用无内毒素质粒小提试剂盒提取plvx-flag-pbld质粒，测浓度。将 plvx-flag-pbld质粒与空载plvx-ires-puro分别转染293t细胞，48h后收集细胞，利用western blot技术鉴定pbld的表达情况，pbld的瞬时表达细胞为pbld-flag，对照细胞为nc。
[0081]
2.2沉默pbld基因的sirna筛选
[0082]
使用block-ittrnai designer设计并合成3对pbld基因的sirna引物序列(见表1)，与对照sinc分别转染至293t细胞24h后收取样本，western blot鉴定细胞中pbld基因的蛋白表达情况。结果表明，与对照组相比， sipbld-1、sipbld-2、sipbld-3的蛋白表达均下调，其中sipbld-3的沉默效果较好(图1)，并选取该沉默载体命名为sipbld进行后续的实验。
[0083]
表1 sipbld序列
[0084][0085][0086]
2.3 pbld对befv复制的影响
[0087]
将plvx-flag-pbld质粒与空载plvx-ires-puro、sipbld与对照sinc两组分别转染bhk-21细胞，24h后接种0.1moi的befv，分别于12h和24h后收获病毒，反复冻融3次，离心取上清，分别测定病毒的tcid
50
。该试验重复3 次。结果表明，过表达pbld抑制befv的复制，而
沉默pbld促进befv的复制(图2)。
[0088]
2.4 pbld对i-ifn及干扰素刺激基因表达的影响
[0089]
为探讨pbld影响befv复制的分子机制，本发明检测了pbld对i型干扰素(i-ifn)表达的影响。将bhk-21细胞分别培养于6孔细胞培养板，待其长满单层。将plvx-flag-pbld质粒与空载plvx-ires-puro、sipbld与对照sinc 两组分别转染bhk-21细胞，24h后接种0.1moi的befv，接毒12h、24h后，弃上清，用细胞刮子刮取、收获细胞，pbs洗涤，分成两份，离心取细胞沉淀。一份细胞沉淀用于总rna的提取，反转录cdna，进行荧光定量pcr分析，检测ifn-β基因的mrna表达，另一份细胞使用ripa试剂裂解，检测i-ifn上游关键调控基因的蛋白表达。
[0090]
荧光定量pcr检测ifn-β基因的mrna表达。
[0091]
genbank公布的金仓鼠ifn-β和内参基因gapdh的基因序列，利用primer5 软件，设计引物：
[0092]
ifn-β-f：5
’‑
agatgcctatggaggtgaa-3’；
[0093]
ifn-β-r：5
’‑
agtgctggagaaagtgttg-3’。
[0094]
gapdh-f：5
’‑
tcatgaccacagtccatgcc-3’；
[0095]
gapdh-r：5
’‑
ggatgaccttgcccacagcc-3’。
[0096]
配制pcr反应体系20μl：2
×
sybr premix ex taq ii 10μl，cdna2μl，上游引物和下游引物ifn-β-f/r各0.5μl，rnase free ddh2o 7μl，加至96孔板中，每个样品进行三次重复。利用罗氏lightcycler 96实时荧光定量pcr仪扩增，反应条件为预变性95℃30s，然后按照95℃变性5s、60℃退火延伸30s进行40 个循环；溶解曲线为95℃10s、60℃60s、95℃continuous；最后50℃30s 结束反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。将数据用graphpad prism 8.0软件进行作图。结果表明，感染befv后，过表达 pbld促进ifn-β的mrna表达，而沉默pbld则结果相反，抑制ifn-β的mrna 表达(图3)。
[0097]
western blot分析ifn-β信号下游干扰素刺激基因isg15的蛋白表达检测。
[0098]
蛋白样本加入6
×
sds loading buffer于沸水煮沸10min，经sds-page凝胶电泳。转膜后5％的脱脂奶粉封闭，将膜置于装有含5％的脱脂奶粉封闭液的孵育盒中，于摇床上室温封闭2h；封闭结束后弃掉原封闭液，加入新封闭液至孵育盒内，防腐剂以1:100加入比例，并将相应的一抗以1:2000的比例进行稀释， 4℃条件下在摇床上孵育过夜；孵育结束后回收一抗，然后用1
×
tbst缓冲液洗膜，于摇床洗三遍，每次5min；洗膜结束后加入新的封闭液至孵育盒内，加入对应1:2000稀释的二抗，于摇床上室温条件避光孵育1h，结束后将膜用1
×
tbst 缓冲液清洗三遍，每次5min；配制ecl显影发光液，将等量的发光显影a、b 液混合，于全自动化学发光图像分析系统5200下进行显影。结果表明，感染befv 后，过表达pbld促进ifn-β下游干扰素刺激基因isg15的蛋白水平表达，而沉默pbld则结果相反，抑制isg15蛋白水平的表达(图4)。
[0099]
2.5 pbld对i-ifn上游调控关键基因表达的影响
[0100]
为探索pbld影响i-ifn表达的关键调控分子，本发明对pbld调控i-ifn 表达的关键分子进行了筛选、验证。将bhk-21细胞分别培养于6孔细胞培养板，待其长满单层。将plvx-flag-n-pbld质粒与空载plvx-ires-puro、sipbld与对照sinc两组分别转染bhk-21细胞，24h后接种0.1moi的befv，分别于接毒12h、24h后，弃上清，用细胞刮子刮取、收获细胞，
pbs洗涤，离心取细胞沉淀，ripa试剂裂解细胞，western blot检测i-ifn上游关键调控基因的蛋白表达。结果表明，在感染befv后，过表达pbld促进mavs、磷酸化tbk1(p-tbk1) 的表达，进而促进磷酸化irf3(p-irf3)的表达；沉默pbld后的结果相反， pbld沉默抑制p-tbk1的表达，进而抑制p-irf3的表达(图5)。
[0101]
2.6 pbld抑制vsv所介导的i-ifn信号通路
[0102]
为了探讨pbld激活i-ifn信号通路抑制befv复制的新功能是否在其他病毒中具有类似的功能，本发明通过vsv感染，检测pbld所介导的i-ifn信号通路关键分子的表达。将hela细胞分别培养于6孔细胞培养板，待其长满单层。将plvx-flag-n-pbld质粒与空载plvx-ires-puro、sipbld与对照sinc两组分别转染hela细胞，24h后分别接种0.1moi的vsv及收获未接种病毒的转染细胞，接毒12h后弃上清，分别收获用细胞刮子刮取、收获细胞，离心取细胞沉淀。一部分沉淀用于总rna提取，利用表2引物进行荧光定量pcr检测，分析 ifn-β的mrna表达。另一部分沉淀经ripa裂解细胞，western blot检测rig-i、 mavs、tbk1、p-tbk1、irf3、p-irf3、isg15的蛋白表达。结果表明，过表达pbld促进vsv感染所介导的mavs及其下游p-tbk1、p-irf3的表达(图 6)，从而促进β-ifn的表达(图7)，促进isg15的表达(图6)；沉默pbld 后的结果相反，pbld沉默后抑制vsv感染所介导的mavs及其下游p-tbk1、 p-irf3的表达(图6)及β-ifn的表达(图7)，抑制isg15的表达(图6)。
[0103]
表2 hela细胞ifn-β基因及内参基因gapdh的荧光定量pcr检测引物序列
[0104][0105]
2.7 pbld抑制rna病毒所介导的i-ifn信号通路
[0106]
为了探讨pbld激活i-ifn信号通路抑制befv复制的新功能是否在rna 病毒复制中具有广泛性。将hela细胞分别培养于6孔细胞培养板，待其长满单层。将pcmv-flag-n-pbld质粒与空载plvx-ires-puro、sipbld与对照sinc 两组分别转染hela细胞，24h后分别接种转染rna病毒模拟物poly i:c，4h后弃上清，用细胞刮子刮取、收获细胞，离心取细胞沉淀。一部分沉淀用于总rna 提取，通过荧光定量pcr检测ifn-β的mrna表达；另一部分沉淀经ripa裂解细胞，westernblot检测rig-i、mavs、tbk1、p-tbk1、irf3、p-irf3、isg15 的蛋白表达。结果表明，在转染rna病毒模拟物poly i:c的情况下，过表达pbld 促进mavs及其下游p-tbk1、p-irf3的表达(图8)，从而促进β-ifn的表达 (图9)，促进isg15的表达(图8)；沉默pbld后的结果相反，pbld沉默后抑制mavs及其下游p-tbk1、p-irf3的表达(图8)，从而抑制β-ifn的表达(图9)，抑制isg15的表达(图8)。
[0107]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。