一种低盐双菌接菌发酵制备泡椒的方法

1.本发明属于应用微生物技术领域，具体涉及一种低盐双菌接菌发酵的泡椒，及其制备方法和风味特性。


背景技术：

2.辣椒作为最有价值的蔬菜之一，是多种健康化合物的良好来源，例如类黄酮、类胡萝卜素、维生素c和辣椒素。传统发酵辣椒（泡椒）是通过辣椒表面微生物、辣椒内生菌以及环境中微生物在高盐条件下自然发酵而成。高浓度盐能有效抑制有害微生物生长，但不可避免影响有益微生物生长，加上自然发酵很容易受外界环境影响，造成不同批次产品之间的感官质量不稳定，影响产品销售；在传统泡椒发酵过程中，前期杂菌较多，需较长时间发酵才能使益生菌（例如乳酸菌、酵母菌）占优势，使泡椒的制备时间较长，增加企业成本。另外，高盐食物意味着高钠摄入；高盐摄入可能会导致高血压、心血管、脑卒中等疾病，还可能增加患胃癌、肾损伤、超重肥胖等风险。所以低盐发酵是传统发酵食品发展的方向和趋势。
3.研究发现，传统辣椒自然发酵过程中存在着大量乳酸菌和酵母菌，且在发酵后期（即成品成型期），乳酸菌和酵母菌占据优势。接种乳酸菌发酵一方面可以使乳酸菌在发酵体系中快速占据生长优势，缩短产品发酵时间；另一方面，乳酸菌会抑制有害微生物的生长，从而提高发酵食品安全性。另外，酵母菌广泛用于葡萄酒、可可豆等的接菌发酵。在发酵过程中，酵母菌通过产生风味活性酯和高级醇直接影响发酵制品的风味。所以，在低盐条件下，接种食源性乳酸菌和酵母菌制备泡椒，在提高其安全性同时，还可以保留或改善其风味。


技术实现要素：

4.本发明目的是提供一种具有健康特性和良好风味的辣椒发酵制品的制备方法，即在低盐条件下，接种食源性戊糖片球菌和罗丹塞伯林德纳氏酵母菌进行辣椒发酵，能使泡椒的健康特性和风味特性提升，并且酯香气增加、无腐败现象发生，泡椒的品质显著提升。
5.本发明低盐双菌接菌发酵制备泡椒的方法是将用清水洗净的辣椒切成段，利用38-40度白酒浸泡40-60 min进行减菌处理，再用无菌水冲洗2-3次，然后将处理好的25-35g小米辣接入到65-75ml生产液中，并向生产液中接种戊糖片球菌（pediococcus pentosaceus）发酵菌剂和罗丹塞伯林德纳氏酵母菌（cyberlindnera rhodanensis）发酵菌剂各1ml，置于恒温恒湿培养箱中30℃静置发酵60-72 h，即得成品。
6.本发明方法中发酵泡椒的原料主要包括在市场上购买的小米辣和食源性戊糖片球菌和罗丹塞伯林德纳氏酵母菌。
7.利用38-40度白酒浸泡40-60 min对辣椒进行减菌处理，有效减少了辣椒表面细菌和内生菌的数量。
8.所述生产液为含有质量体积比1%葡萄糖和质量体积比1%食盐的灭菌水溶液；总发酵体系中的食盐浓度《1%（m/v），属于低盐发酵，避免消费者高盐摄入。
9.发酵菌剂制备：戊糖片球菌和罗丹塞伯林德纳氏酵母菌分别在mrs液体培养基和ypd液体培养基中活化12-14 h，然后按4-8
‰
（v/v）接菌量分别接种于mrs液体培养基和ypd液体培养基中，戊糖片球菌在37℃静置培养12-14 h，罗丹塞伯林德纳氏酵母菌在30℃、200 rpm培养12-14h后，8000-10000rpm离心15min沉淀菌体，菌体采用无菌水洗涤菌体2-3次后，加入无菌水制成浓度为10
6-10
7 cfu/ml的菌悬液，即得戊糖片球菌发酵菌剂和罗丹塞伯林德纳氏酵母菌发酵菌剂。
10.与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明采用戊糖片球菌和罗丹塞伯林德纳氏酵母菌发酵辣椒后，泡椒酯香味提升，杂味、刺激性气味减弱，无腐败现象，致病菌显著减少，且本发明方法简单易操作，适用于工业化生产和市场推广应用。
附图说明
11.图1为不同条件下发酵制备的发酵辣椒制品图，其中a为罗丹塞伯林德纳氏酵母菌发酵辣椒制品；b为戊糖片球菌和罗丹塞伯林德纳氏酵母菌混合发酵辣椒制品；c为戊糖片球菌发酵辣椒制品；d为对照组。
具体实施方式
12.下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所述实验结果，如无特殊说明，均为3次重复的平均值。
13.下述实施例中mrs液体培养基（g/l）为：蛋白胨10 g/l、牛肉粉8 g/l、酵母粉4 g/l、葡萄糖20 g/l、吐温80 1 g/l、k2hpo
4 2 g/l、mgso
4 0.2 g/l、naac 5 g/l、mnso
4 0.05 g/l、柠檬酸三铵2 g/l，115℃灭菌20 min；ypd液体培养基（g/l）为：蛋白胨20 g/l、葡萄糖20 g/l、酵母粉10 g/l，115℃灭菌20 min。
14.实施例1：戊糖片球菌低盐发酵制备泡椒制品1、发酵菌剂的制备将戊糖片球菌在mrs液体培养基中活化12h，然后按体积百分比为6
‰
的接菌量接种于50ml mrs液体培养基中，37℃静置培养12h，8000rpm离心15min沉淀菌体，菌体利用无菌水洗涤2次后，再用无菌水悬浮菌体制成浓度为3.2
×
10
6 cfu/ml菌悬液，即得到戊糖片球菌发酵菌剂。
15.2、辣椒减菌处理用清水洗净小米辣，切成两段，利用40度白酒浸泡40min，然后用无菌水冲洗2次。
16.3、发酵辣椒的制备将1ml戊糖片球菌发酵菌剂接至含70ml生产液（含1%葡萄糖和1%食盐的灭菌水溶液）的广口锥形瓶中，再向其中添加30g经过减菌处理的小米辣和1ml灭菌水，封口膜封口，置于恒温恒湿培养箱中30℃发酵60h；同时设置对照组，对照组样品不加发酵菌剂，用1ml灭菌水代替发酵菌剂，其他条件与接菌发酵辣椒条件一致。
17.4、感官品质判定
通过对发酵后辣椒的香气、色泽以及是否出现腐败现象3个方面评定泡椒的感官品质；结果表明：接种戊糖片球菌发酵体系没有出现腐败现象、泡椒的颜色偏黄，用水洗净泡椒后，泡椒酸香浓郁、没有褐变发生，而对照样品具有明显的刺激性臭味。
18.5、微生物群落结构分析从发酵好的锥形瓶中取出1g泡椒和10ml发酵液，研磨匀浆后，提取基因组dna，利用细菌通用引物（338f: 5'-actcctacgggaggcagca-3'，806r: 5'-ggactachvgggtwtctaat-3'）和真菌通用引物（its3: 5'-gcatcgatgaagaacgcagc-3'，its4: 5'-tcctccgcttattgatatgc-3'）分别pcr扩增细菌的16s rna基因和真菌的its基因。纯化后的扩增子送上海美吉生物公司进行illumina miseq测序，得到的pe reads首先按照overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行控制和过滤。区分样本后，参考silva138/16s_bacteria数据库和unite8.0/its_fungi数据库进行操作分类单位（otu）聚类分析和物种分类分析。otu序列相似度为0.97，分类置信度为0.7。
19.结果如表1所示，在接菌发酵辣椒制品中，戊糖片球菌占据了细菌群落99%以上，说明接种的戊糖片球菌在发酵过程中占据了主要优势，另外，酪黄肠球菌、克雷伯氏菌属等条件致病菌的含量在发酵后显著降低，说明戊糖片球菌在泡椒发酵体系中对这些条件致病菌具有较好抑制效果，提高了泡椒的安全性。
20.表1 发酵辣椒的微生物群落结构变化
注：表中只列出了细菌丰度前十和真菌丰度前四的微生物，相对丰度是指泡椒产品中单一微生物数量占总微生物数量的比例。—：未检测到；**：相比于对照，在0.05水平具有显著性差异（p 《 0.05）；***：相比于对照，在0.01水平具有显著性差异（p 《 0.01）。
21.实施例2：罗丹塞伯林德纳氏酵母菌低盐发酵制备辣椒制品1、发酵菌剂的制备将罗丹塞伯林德纳氏酵母菌在ypd液体培养基中活化12 h，按照体积百分比为4
‰
的接菌量接种于50ml ypd液体培养基中，30℃、200 rpm培养12 h，10000 rpm离心15 min沉淀菌体，菌体用无菌水洗涤3次后，再用无菌水悬浮菌体制成浓度为3.3
×
10
6 cfu/ml菌悬液，即得到罗丹塞伯林德纳氏酵母菌的发酵菌剂。
22.2、辣椒减菌处理用清水洗净小米辣，切成两段，利用38度白酒浸泡60 min，然后用无菌水冲洗2次。
23.3、发酵辣椒的制备除接种的菌株替换为罗丹塞伯林德纳氏酵母菌外，发酵辣椒的制备流程与实施例1相同，对照组与实施例1为同一个。
24.4、感官品质判定接种罗丹塞伯林德纳氏酵母菌发酵过后的泡椒酯香味明显、泡椒的颜色偏黄，没有褐变发生，对照样品具有明显的刺激性臭味。
25.5、致香成分变化分析利用顶空-固相微萃取联合气相色谱-质谱技术（gc-ms）进行挥发性化合物的分离和检测。从发酵好的锥形瓶中取出1g泡椒和10ml发酵液，研磨匀浆后，取5ml样品与4μl内标（100 μg/ml 1,2-二氯苯的甲醇溶液）在20ml萃取瓶中充分混合。瓶中挥发性化合物用50/30μm dvb/car pdms纤维在50℃下萃取30分钟，之后将纤维插入加热的gc-ms注射器中，250℃脱附5 min。然后用以下条件进行分离：进样量：1μl；载气：纯氦气；流速：1 ml/min；柱温：初始温度40℃，保持5 min，然后5℃/min升至220℃，保持1 min，再以20℃/min升至250℃，保持2.5 min；电离源温度：230℃；电子电离模式：70ev；四极杆温度：150℃。最后，在20-400 m/z范围内进行全扫描ms采集，通过将质谱和保留时间与nist2014库中的化合物进行比较来鉴定化合物身份。为量化挥发性化合物，将每种代谢物的峰面积归一化，通过内标浓度
×
化合物峰面积/内标峰面积的公式计算挥发性化合物浓度。
26.由表2可知，发酵泡椒的致香成分主要包括酸、醇、酚、酯、醛等，而酯是最主要的香气来源。相比于对照样品，经过罗丹塞伯林德纳氏酵母菌发酵泡椒的酯的含量明显上升，比如乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸戊酯、异戊酸乙酯、乙酸苄酯、丁酸乙酯等都显著上升，这些化合物改变可能是罗丹塞伯林德纳氏酵母菌改善泡椒风味品质的主要原因。
27.表2 发酵辣椒的致香成分变化
注：—：未检测到；**和***：相比于对照，在0.05和0.01水平具有显著性差异。
28.实施例3：戊糖片球菌和罗丹塞伯林德纳氏酵母菌低盐共发酵制备辣椒制品1、发酵菌剂的制备戊糖片球菌和罗丹塞伯林德纳氏酵母菌的发酵菌剂制备方法同实施例1和2。
29.2、辣椒减菌处理制备流程与实施例1相同。
30.3、发酵辣椒的制备将1ml戊糖片球菌发酵菌剂和1ml罗丹塞伯林德纳氏酵母菌发酵菌剂接至含70ml生产液（1%葡萄糖和1%食盐的灭菌水溶液）的广口锥形瓶中，再向其中添加30g经过减菌处理的小米辣，封口膜封口，置于恒温恒湿培养箱中30℃发酵60h；对照组与实施例1为同一个。
31.4、感官品质判定
双菌接菌发酵泡椒的酯香和酸香非常浓郁、没有出现腐败现象、泡椒的颜色偏黄，没有褐变发生，对照样品具有明显的刺激性臭味。
32.5、微生物群落结构分析发酵辣椒制品的微生物群落分析方法与实施例1相同。结果如表3所示，在发酵辣椒制品中，戊糖片球菌占据了细菌群落99%以上，罗丹塞伯林德纳氏酵母菌占据了真菌群落72%以上，说明接种的戊糖片球菌和罗丹塞伯林德纳氏酵母菌在发酵过程中占据了主要优势，另外，与实施例1相比，在接种发酵中酪黄肠球菌的丰度更低，说明双菌混合发酵抑菌效果更好。
33.表3 双菌混合发酵辣椒微生物群落变化注：表中只列出了细菌丰度前十和真菌丰度前四的微生物，相对丰度是指泡椒产品中单一微生物数量占总微生物数量的比例。—：未检测到；**：相比于对照，在0.05水平具有显著性差异（p 《 0.05）；***：相比于对照，在0.01水平具有显著性差异（p 《 0.01）。
34.6、致香成分分析致香成分的检测方法与实施例2相同。由表4可知，发酵辣椒制品的致香成分主要包括酸、醇、酚、酯、醛等，而酯是最主要的香气来源。相比于对照组，双菌接菌发酵辣椒的酯
含量明显上升，比如乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯、乙酸戊酯、异戊酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸苄酯、丁酸乙酯、乙酸甲酯等都显著上升，比实施例2中罗丹塞伯林德纳氏酵母菌单独发酵的更多，说明双菌混合发酵比单菌株发酵的风味更好。
35.表4 双菌混合发酵辣椒致香成分变化双菌混合发酵辣椒致香成分变化
注：—：未检测到；**和***：相比于对照，在0.05和0.01水平具有显著性差异。