一种基于可见光诱导接枝聚合的碳酸酐酶固定化方法

1.本发明属于酶固定工艺技术领域，具体涉及一种基于可见光诱导接枝聚合的碳酸酐酶固定化方法。


背景技术：

2.目前，从工业烟气中捕获二氧化碳的技术已有许多，包括使用光电催化、化学/物理溶剂吸收、固体吸附、膜分离、低温分离等技术，虽然这些技术都具有较高的捕碳能力，但在实际应用过程中往往需要很高的能量和压力，进而会产生额外的能源消耗及环境污染问题，增加工业捕碳的成本。而自然界已经进化出了多种用来运输和转化二氧化碳的生物酶。其中，碳酸酐酶(ca)能够高效催化二氧化碳的水合作用，对co2的高选择性(区域/立体/对映体特异性)，在温和反应条件下的高转换活性以及可生物降解和无毒等特性，为co2的高效利用提供一个广阔发展。
3.然而，游离的ca成本高且稳定性弱，实际应用时，需要通过ca固定化来提高其稳定性，并实现酶的循环再利用，节约生物催化成本。目前，科研人员已通过吸附、封装、交联和共价连接的策略将ca固定在各类有机聚合物基材、无机材料以及有机-无机复合材料的表面或内部。经固定后的ca稳定性大大提高，但由于固定化基材与ca之间的相互作用，使得ca的活性中心受到了极大的传质限制，无法与co2进行充分接触，也不能充分发挥ca的催化活性。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种基于可见光诱导接枝聚合的碳酸酐酶固定化方法，提高了碳酸酐酶的储藏稳定性及循环稳定性。
5.本发明所采用的技术方案是，一种基于可见光诱导接枝聚合的碳酸酐酶固定化方法，具体按照以下步骤实施：
6.步骤1，将itx丙酮饱和液均匀滴加在ldpe膜的两面，将ldpe膜夹在两片石英板中间，置于紫外汞灯下室温照射，之后浸泡在丙酮中，用丙酮洗涤表面，真空干燥，得到ldpe-itxsp膜；
7.步骤2，将pegda、ε-pll和去离子水混合均匀，形成混合液，之后浇铸在ldpe-itxsp膜两面，放置在两块石英板间，并用夹子固定，在可见光下照射聚合，然后置于去离子水中浸泡，用去离子水洗涤，真空干燥，即可得到ldpe-g-pegda/ε-pll膜；
8.步骤3，将ldpe-g-pegda-ε-pll膜完全浸没在戊二醛水溶液中，在恒温振荡箱中震荡，洗涤，去除膜表面多余的戊二醛；
9.步骤4，将pbs缓冲液和碳酸酐酶混合均匀，得到碳酸酐酶/pbs缓冲液，然后再将步骤3中的膜浸没在该溶液中，恒温振荡，使戊二醛另一端的醛基与ca上的氨基发生缩合反应，并将ca共价固定在聚赖氨酸刷上，即可完成碳酸酐酶的固定。
10.本发明的特点还在于，
11.步骤1中，照射时间为3-6min，紫外汞灯的波长为254nm，光强为9mw/cm2；浸泡时间为12-24h。
12.步骤1中，itx丙酮饱和液的具体制备过程为：将异丙基硫杂蒽酮itx溶于丙酮中，振荡至itx有微量晶体析出，即可。
13.步骤2中，照射聚合时间为60-120min；可见光的波长为420nm，光强为3mw/cm2；浸泡时间为12-24h。
14.步骤2中，pegda、ε-pll和去离子水的质量比为1-2：0.04-0.28：3-4。
15.步骤3中，振荡时间为4-6h。
16.步骤4中，振荡温度为35℃，时间为6-12h。
17.步骤4中，pbs缓冲液的浓度为0.05mol/l，ph为8。
18.本发明的有益效果是：本发明方法能够将碳酸酐酶(ca)通过具有长分子链结构的柔性聚合物刷固定在聚乙烯膜上，利用聚合物刷的柔性使得经固定后的ca仍具备灵活位移的能力，从而提高固定化ca对co2的捕获效率。此外，该固定化体系能够很方便的实现ca的回收再利用，提高ca的工业应用价值。
附图说明
19.图1是本发明方法的合成机理图；
20.图2是是游离酶与固定化酶催化捕获co2时缓冲溶液ph值随时间的变化趋势对比图；
21.图3固定化酶的相对活性随循环利用次数的变化曲线图。
具体实施方式
22.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
23.本发明一种基于可见光诱导接枝聚合的碳酸酐酶固定化方法，具体按照以下步骤实施：
24.步骤1，将异丙基硫杂蒽酮itx溶于丙酮中，振荡至itx有微量晶体析出，形成itx丙酮饱和液；将itx丙酮饱和液均匀滴加在低密度聚乙烯(ldpe)膜的两面，将ldpe膜夹在两片石英板中间，形成“三明治”结构，置于紫外汞灯下室温照射，之后浸泡在丙酮中12-24h，并用丙酮洗涤表面3次，以去除残留的itx，真空干燥，得到接枝有itx半频哪醇自由基休眠种的ldpe(ldpe-itxsp)膜；
25.照射时间为3-6min，紫外汞灯的波长为254nm，光强为9mw/cm2；
26.步骤2，将聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)、ε-聚赖氨酸(ε-pll)和去离子水混合均匀，形成混合液，之后浇铸在接有itx的ldpe膜两面，放置在两块石英板间，并用夹子固定，放置在可见光下照射聚合，然后置于去离子水中浸泡12-24h，并用去离子水洗涤，去除未固定化的物质，最后，真空干燥，即可得到ldpe-g-pegda/ε-pll膜；
27.照射聚合时间为60-120min；
28.可见光的波长为420nm，光强为3mw/cm2；
29.pegda、ε-pll和去离子水的质量比为1-2g：0.04-0.28g：3-4g；
30.步骤3，配置体积分数为3％-5％的戊二醛水溶液，之后将ldpe-g-pegda-ε-pll膜
完全浸没在上述溶液中，在恒温振荡箱中震荡4-6h，再用去离子水清洗3遍，去除膜表面多余的戊二醛。
31.步骤4，配置pbs缓冲液，取pbs缓冲液于离心管中，加入碳酸酐酶，得到碳酸酐酶/pbs缓冲液，然后再将上述膜浸没在该溶液中，恒温振荡(35℃，270rpm)6-12h，使戊二醛另一端的醛基与ca上的氨基发生缩合反应，将ca共价固定在聚赖氨酸刷上，即可完成碳酸酐酶的固定；
32.pbs缓冲液的浓度为0.05mol/l，ph为8；碳酸酐酶/pbs缓冲液的浓度为1mg/ml；
33.本发明所制得的接枝有半嵌入式聚合物刷结构的聚乙烯膜体系，通过有机聚合物高分子链结构对ca进行固定化，对ca具有良好的酶载效率，固定化ca还具有更佳的储藏稳定性及循环稳定性。
34.实施例1
35.取6ml的丙酮溶液，缓慢加入itx振荡至itx几乎完全溶解(有微小晶粒析出)，得itx-丙酮饱和液。移液枪取上述溶液滴加在ldpe膜两面，随后将其加入两块石英板间构建三明治结构，按压石英板至无气泡，将其置于紫外汞灯(波长254nm，光强9mw/cm2)下室温照射6分钟，得到接枝有itx半频哪醇自由基休眠种的ldpe膜(ldpe-itxsp)。将膜置于丙酮溶液中浸泡洗涤，去除残留的itx；
36.将1.2g的pegda、0.28g的ε-pll和3.32g的去离子水混合，振荡10min后静置，使用移液枪将其均匀涂覆在ldpe-itxsp两面，置于两块石英板中间构建三明治结构，用可见光源(氙灯加滤光器，通光波段为420nm，光强3mw/cm2，λ＝420nm)照射该夹层结构2h，之后用去离子水提取该膜12h，以除去残留的pegda：ε-pll，制备ldpe-g-pegda/ε-pll膜；
37.配置体积比为5％的戊二醛水溶液，取30ml置于离心管中，将ldpe-g-pegda/ε-pll膜置于戊二醛水溶液中35℃，270rpm震荡反应6h，使戊二醛与ε-pll进行充分反应；配置1mg/ml的游离ca酶溶液，向离心管中分别加入30ml缓冲液与1.2ml的游离ca酶溶液，置于恒温振荡箱中(270rpm，35℃)反应6h，即可完成碳酸酐酶的固定。
38.实施例2
39.将异丙基硫杂蒽酮itx溶于丙酮中，振荡至itx完全溶解，形成itx丙酮饱和液；将itx丙酮饱和液均匀滴加在低密度聚乙烯(ldpe)膜的两面，将ldpe膜夹在两片石英板中间，置于紫外汞灯下室温照射，之后浸泡在丙酮中20h，并用丙酮洗涤表面3次，真空干燥，得到ldpe-itxsp膜；
40.照射时间为5min，紫外汞灯的波长为254nm，光强为9mw/cm2；
41.将聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)、ε-聚赖氨酸(ε-pll)和去离子水混合均匀，形成混合液，之后浇铸在接有itx的ldpe膜两面，放置在两块石英板间，并用夹子固定，放置在可见光下照射聚合，然后置于去离子水中浸泡15h，并用去离子水洗涤，真空干燥，即可得到ldpe-g-pegda/ε-pll膜；
42.照射聚合时间为100min；可见光的波长为420nm，光强为3mw/cm2；pegda、ε-pll和去离子水的质量比为1.5：0.01：3g；
43.配置体积分数为4％的戊二醛水溶液，之后将ldpe-g-pegda-ε-pll膜完全浸没在上述溶液中，在恒温振荡箱中震荡5h，再用去离子水清洗3遍；
44.配置pbs缓冲液，取pbs缓冲液于离心管中，加入碳酸酐酶，得到碳酸酐酶/pbs缓冲
液，然后再将上述膜浸没在该溶液中，恒温振荡(35℃，270rpm)10h，使戊二醛另一端的醛基与ca上的氨基发生缩合反应，将ca共价固定在聚赖氨酸刷上，即可完成碳酸酐酶的固定。
45.实施例3
46.将异丙基硫杂蒽酮itx溶于丙酮中，振荡至itx完全溶解，形成itx丙酮饱和液；将itx丙酮饱和液均匀滴加在低密度聚乙烯(ldpe)膜的两面，将ldpe膜夹在两片石英板中间，形成“三明治”结构，置于紫外汞灯下室温照射，之后浸泡在丙酮中20h，并用丙酮洗涤表面3次，以去除残留的itx，真空干燥，得到ldpe-itxsp膜；
47.照射时间为3min，紫外汞灯的波长为254nm，光强为9mw/cm2；
48.将聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)、ε-聚赖氨酸(ε-pll)和去离子水混合均匀，形成混合液，之后浇铸在接有itx的ldpe膜两面，放置在两块石英板间，并用夹子固定，放置在可见光下照射聚合，然后置于去离子水中浸泡18h，并用去离子水洗涤，真空干燥，即可得到ldpe-g-pegda/ε-pll膜；
49.照射聚合时间为110min；可见光的波长为420nm，光强为3mw/cm2；pegda、ε-pll和去离子水的质量比为2：0.28：3；
50.配置体积分数为3％的戊二醛水溶液，之后将ldpe-g-pegda-ε-pll膜完全浸没在上述溶液中，在恒温振荡箱中震荡4h，再用去离子水清洗3遍，去除膜表面多余的戊二醛。
51.配置pbs缓冲液，取pbs缓冲液于离心管中，加入碳酸酐酶，得到碳酸酐酶/pbs缓冲液，然后再将上述膜浸没在该溶液中，恒温振荡(35℃，270rpm)12h，使戊二醛另一端的醛基与ca上的氨基发生缩合反应，将ca共价固定在聚赖氨酸刷上，即可完成碳酸酐酶的固定；
52.图1是本发明聚合物刷固定ca酶膜的合成机理图，从可见光活性接枝聚合技术出发，以一种反应条件简单且温和的方法固定化碳酸酐酶。首先通过紫外光照在ldpe表面种植itx自由基休眠种，之后种植itxsp的泡沫板在可见光下可引发pegda/ε-pll的活性接枝聚合，最后通过戊二醛共价作用将ca固定在ε-pll刷上，得到完整的co2酶膜催化体系。
53.图2是游离酶与固定化酶催化捕获co2时缓冲溶液ph值随时间的变化趋势对比图。图2表明，在0～10s，游离ca对co2的捕获速率略高于固定化ca，在10～20s，随着缓冲溶液ph值的变化，固定化酶的捕获效率略高于游离酶，随后二者对co2的捕获能力几乎一致，由此可见，经聚合物刷固定化ca具有和游离ca相当的co2捕获效率。
54.图3是固定化ca酶膜循环稳定性的结果图，从图中可以看出，经过10个批次循环催化后，ca酶活仍保留在85％以上。由此可见，该酶膜具有良好的循环稳定性，能大大降低ca在实际工业应用中的捕碳成本。