一种提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法

1.本发明属于生物修复领域，涉及一种提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法。


背景技术：

2.氯酚是一类在自然界广泛分布的持久性有机污染物，其毒性随着氯取代基数量的增加而增强，而通过微生物还原脱氯来减少氯取代基的数量，从而降低其毒性是目前比较主流且经济的处理工艺。例如，脱亚硫酸菌是一类具有广泛脱氯活性的厌氧微生物，它们能利用脱氯呼吸作用，将多氯酚还原为毒性较低的低氯酚，从而降低氯酚污染物对环境安全和人类健康的威胁。虽然通过微生物还原作用能够降低氯酚的毒性，但是在本技术发明人的实际研究过程中发现：利用微生物还原氯酚的体系中，微生物会优先攻击邻位和间位的氯取代基，结果是由此获得还原产物中主要是氯取代基位于间位、对位的低氯酚，即相比邻位的低氯酚，氯取代基位于间位、对位的低氯酚在还原产物中的占比更高，与此同时，相比邻位的低氯酚，氯取代基位于间位、对位的低氯酚具有更强的毒性，因而现有微生物还原氯酚体系中还原产物的整体毒性仍然较高。另外，本技术发明人还发现：现有微生物还原氯酚体系均不能有效调控氯酚的还原路径，即难以有效避免微生物对邻位化学键的优先攻击，从而难以有效地将氯酚还原成毒性更低的氯酚(如邻位氯酚)，这是导致微生物还原氯酚体系还原产物中低毒氯酚的占比/含量仍然较低的根本原因，也是现有微生物还原氯酚体系中还原产物的整体毒性仍然较高的重要原因。至今为止，尚未见到如何有效调控氯酚的还原路径以及如何提高还原产物中低毒氯酚占比/含量等相关报道。因此，如何有效调控微生物还原氯酚的路径并进一步提高还原产物中低毒氯酚的含量，这对于有效降低还原产物的整体毒性并有效解决氯酚污染物对环境安全和人类健康的威胁具有十分重要意义。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法。
4.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。
5.一种提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，所述方法是利用电气石提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物的含量；所述微生物还原氯酚体系中电气石的浓度≥0.8g/l。
6.上述的提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，进一步改进的，所述微生物还原氯酚体系中电气石的浓度≥1.2g/l。
7.上述的提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，进一步改进的，所述微生物还原氯酚体系中电气石的浓度≥1.6g/l。
8.上述的提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，进一步改进的，所述微生物还原氯酚体系中电气石的浓度≤8.0g/l；所述电气石的纯度为99％以上；所述电
气石的平均粒度为400nm～500nm。
9.上述的提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，进一步改进的，所述微生物还原氯酚体系中微生物的接种量为体系总体积的1％～5％；所述微生物为脱亚硫酸菌菌株dcb-2。
10.上述的提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，进一步改进的，利用电气石提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物的含量时，包括以下步骤：
11.s1、将电气石、微生物、氯酚与培养基中混合，得到混合物；
12.s2、对步骤s1得到的混合物中的微生物进行培养，完成对混合物中氯酚的还原脱氯处理。
13.上述的提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，进一步改进的，步骤s1中，所述混合物中氯酚的初始浓度为100μm～200μm；所述氯酚为2,3-二氯酚；所述培养基为改良后的dmsz 720培养基。
14.上述的提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，进一步改进的，步骤s1中，所述微生物在使用之前还包括以下处理：将微生物接种到培养基中进行培养，直至od
600
值保持相对稳定；所述培养在温度为25℃～40℃下进行；所述培养的时间为3天～7天；所述培养基为改良后的dmsz 720培养基。
15.上述的提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，进一步改进的，步骤s2中，所述培养在厌氧条件下进行；所述培养过程中通入氮气和二氧化碳的混合气体，使体系保持厌氧状态；所述氮气和二氧化碳的混合气体中氮气和二氧化碳的体积比为4：1；所述培养在温度为25℃～40℃下进行；所述培养时间单次为54h～120h。
16.与现有技术相比，本发明的优点在于：
17.(1)针对现有微生物还原氯酚体系不能调控氯酚的还原路径以及由此导致微生物还原氯酚体系中还原产物毒性高等缺陷，本发明创造性地提出了一种提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，利用电气石提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物的含量，其中微生物还原氯酚体系中电气石的浓度≥0.8g/l。本发明中，在微生物还原氯酚体系中加入适量的电气石，以电气石为功能材料，能够改变氯酚的电荷分布，具体来说：在电气石的作用下，氯酚上各个原子的电荷会发生不同程度的转移，此时邻位氯取代基化学键上分布的电荷较少，其稳定性更高，更难被进攻，因而在微生物还原氯酚的体系中，由于邻位上的氯取代基进攻难度的增加，由此能够将氯酚还原成毒性更低的邻位低毒氯酚，从而使得还原产物中低毒氯酚的占比显著提高，进而有利于降低还原产物的整体毒性；同时，电气石还具有自动调节溶液ph至中性、释放微量元素和产生自发电场等特性，因而在电气石的作用下，能够为微生物提供一个稳定且适宜的中性环境，并通过产生的弱电场刺激并加速微生物的活化过程，有利于减少脱氯过程所需的总时长以及提高脱氯效率，进而有利于实现高效还原氯酚的目的。本发明提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，通过在微生物还原氯酚体系中添加适量的电气石，不仅能够有效提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量，从而有利于进一步降低低毒还原产物的整体毒性，而且能够实现氯酚的快速还原，从而有利于提升生物修复氯酚体系的整体降解效率，使用价值高，应用前景好，对于有效解决氯酚污染物对环境安全和人类健康的威胁具有十分重要意义。
18.(2)本发明中，采用的电气石作为一种天然矿石，具有来源广、成本低廉、不会产生
二次污染和环境威胁等优势，并且由于其具有良好的结构稳定性和长效性，能在投加后持续产生作用，因而在将其作为生物修复的功能材料时，有利于降低修复成本，不会对环境造成二次污染。
附图说明
19.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
20.图1为本发明实施例1中不同电气石添加量对微生物还原2,3-二氯酚体系中2-氯酚含量的影响图。
21.图2为本发明实施例1中不同电气石添加量对微生物还原2,3-二氯酚体系中3-氯酚含量的影响图。
22.图3为本发明实施例1中不同电气石添加量对微生物还原2,3-二氯酚体系中2,3-二氯酚去除率的影响图。
23.图4为本发明实施例2中不同电气石添加量对微生物还原2,3-二氯酚体系中2-氯酚含量的影响图。
24.图5为本发明实施例2中不同电气石添加量添加到微生物还原2,3-二氯酚体系中时对应的2,3-二氯酚的循环处理效果图。
25.图6为本发明实施例1中完成脱氯处理后体系的sem图。
26.图7为本发明实施例2中电气石促进脱亚硫酸菌还原2,3-二氯酚前后的ftir图。
27.图8为本发明实施例2中电气石促进脱亚硫酸菌还原2,3-二氯酚前后的xrd图。
28.图9为本发明利用电气石提高微生物还原2,3-二氯酚体系中2-氯酚含量的原理示意图。
具体实施方式
29.以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
30.以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
31.本发明中采用的改良后的dmsz 720培养基，其组成成分如表1所示。
32.表1改良后的dmsz 720培养基的配方
33.基础溶液86.8ml辅助溶液7.2ml组成浓度组成浓度氯化钠1.0595g/l微量元素sl90.1ml/l氯化镁0.5298g/lse-wo溶液0.2ml/l磷酸二氢钾0.2119g/lwolin维生素0.1ml/l氯化铵0.3179g/l乳酸盐500mmol/l氯化钾0.3179g/l碳酸氢钠750mmol/l氯化钙0.0159g/ll-半胱氨酸30mmol/l
‑‑
二硫苏糖醇50mmol/l
‑‑
硫化钠200mmol/l
ꢀꢀ
酵母膏溶液40g/l
34.表1中，微量元素sl9的组成：12.8g/l的氨三乙酸，2.0g/l的四水氯化亚铁，190mg/l的六水氯化钴，100mg/l的二水氯化锰，70mg/l的氯化锌，6mg/l的硼酸，24mg/l的六水氯化镍，2mg/l的二水氯化铜，36mg/l的二水钼酸钠，26.4g/l的碳酸钠。该微量元素sl9溶液需要通入氮气以保证厌氧状态，并在使用前过滤灭菌。
35.表1中，se-wo溶液的组成：3mg/l的五水亚硒酸钠，4mg/l的一水钨酸钠，500mg/l的氢氧化钠。该se-wo溶液需要通入氮气以保证厌氧状态，并在使用前过滤灭菌。
36.表1中，wolin维生素的组成：20mg/l的生物素，20mg/l的叶酸，100mg/l的盐酸吡哆辛，50mg/l的核黄素，50mg/l的硫胺素，50mg/l的烟酸，50mg/l的泛酸，50mg/l的维生素b12，50mg/l的对氨基苯甲酸，50mg/l的硫锌酸。该wolin维生素溶液需要在使用前过滤灭菌。
37.实施例1：
38.一种提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，具体为利用电气石提高微生物还原2,3-二氯酚体系中低毒还原产物(2-氯酚)的含量，包括以下步骤：
39.s1、按照添加量为0g/l、1.0g/l、2.5g/l、5.0g/l、8.0g/l，分别将纯度为99％、平均粒度为430nm的电气石(市购)添加到100ml改良后的dmsz 720培养基中，按照接种量为培养基体积的2％，分别接种脱亚硫酸菌菌株dcb-2，同时分别添加2,3-二氯酚，并控制各个体系中2,3-二氯酚的浓度200μm，得到混合物。
40.s2、将步骤s1得到的混合物置于35℃的恒温培养箱中，在厌氧条件下对混合物中的微生物进行培养5天，其中培养过程中通入氮气和二氧化碳的混合气体(氮气和二氧化碳的体积比为4:1)，使体系保持厌氧状态，完成对混合物中氯酚的还原脱氯处理。
41.本实施例中，采用的脱亚硫酸菌菌株dcb-2在接种之前，还包括以下处理：将脱亚硫酸菌菌株dcb-2接种到改良的dsmz 720培养基中，在35℃的恒温培养箱中进行活化，持续5天，培养期间，定期测定其od
600
值，直至od
600
值保持相对稳定。
42.利用高效液相色谱仪测定2,3-二氯酚及其脱氯产物(2-氯酚、3-氯酚)的浓度，结果如图1、2和3所示。
43.图1为本发明实施例1中不同电气石添加量对微生物还原2,3-二氯酚体系中2-氯酚含量的影响图。
44.表2不同电气石添加量在不同处理时间条件下对还原体系中2-氯酚含量的影响
[0045][0046]
由图1和表2可知，在相同的处理时间内，2-氯酚的占比随着电气石添加量的增加而升高，其中电气石的添加量≥2.5g/l时，2-氯酚占比显著提高，且高于其他组别，这说明添加适量的电气石能显著提高2-氯酚在还原产物中的占比；同时，由图1和表2中的结果可
知，在微生物接种量相对较低的条件下，通过提高电气石的添加量，更有利于提高2-氯酚在还原产物中的占比，特别的，电气石的最佳投加量为2.5g/l。
[0047]
图2为本发明实施例1中不同电气石添加量对微生物还原2,3-二氯酚体系中3-氯酚含量的影响图。
[0048]
表3不同电气石添加量在不同处理时间条件下对还原体系中3-氯酚含量的影响
[0049][0050][0051]
由图2和表3可知，还原产物中3-氯酚的占比情况与2-氯酚的结果相反，在相同时间内，3-氯酚在还原产物中的占比随着电气石投加量的增加而减小，符合还原产物总量守恒的事实。同时，由于单氯酚的毒性大小依次为：4-氯酚＞3-氯酚＞2-氯酚，这也进一步证实了本发明方法能够提高低毒还原产物的含量，而且通过提高低毒还原产物的占比，有利于降低还原产物的整体毒性。
[0052]
图3为本发明实施例1中不同电气石添加量对微生物还原2,3-二氯酚体系中2,3-二氯酚去除率的影响图。图3中，空白对照为不添加电气石和脱亚硫酸菌菌株dcb-2，其他条件相同；电气石对照为仅添加电气石，其他条件相同；dcb-2对照为仅添加脱亚硫酸菌菌株dcb-2，其他条件相同。由图3可知，添加电气石后，能够加速脱亚硫酸菌还原2,3-二氯酚，特别的，当电气石的添加量≥2.5g/l时，脱亚硫酸菌能更加快速的完成对2,3-二氯酚的还原，且完全还原2,3-二氯酚的时长从96h减少到72h，即能够大幅提高2,3-二氯酚的还原脱氯效率；同时电气石的加入，能够将活化脱亚硫酸菌所需的时长从36h缩短至18h，这也有利于大幅缩短完全还原2,3-二氯酚所需时间，有利于进一步提高2,3-二氯酚的还原脱氯效率。
[0053]
综上述图1-3中的结果可知，在电气石浓度小于2.5g/l时，还原脱氯产物中低毒2-cp占比仅为15％左右，当电气石浓度超过2.5g/l后，该比例提高至20％以上，这说明添加适量的电气石能为脱亚硫酸菌提供一个适宜且稳定的生存环境，同时能影响2,3-二氯酚的电荷分布，稳定该污染物分子的邻位化学键，进而使得2-氯酚的占比上升，降低了还原产物的总体毒性，同时，还能加速该菌的活化过程，减少脱氯所需的总时长，提高脱氯效率。
[0054]
实施例2
[0055]
一种提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，具体为利用电气石提高微生物还原2,3-二氯酚体系中低毒还原产物(2-氯酚)的含量，包括以下步骤：
[0056]
s1、按照添加量为0g/l、0.5g/l、1.0g/l、1.5g/l，分别将纯度为99％、平均粒度为430nm的电气石(市购)添加到100ml改良后的dmsz 720培养基中，按照接种量为培养基体积的4％，分别接种实施例1中驯化后的脱亚硫酸菌dcb-2，同时分别添加2,3-二氯酚，并控制各个体系中2,3-二氯酚的浓度100μm，得到混合物。
[0057]
s2、将步骤s1得到的混合物置于35℃的恒温培养箱中，在厌氧条件下对混合物中的微生物进行培养96h-120h，其中培养过程中通入氮气和二氧化碳的混合气体(氮气和二氧化碳的体积比为4:1)，使体系保持厌氧状态，完成对混合物中氯酚的还原脱氯处理。
[0058]
s3、当所有含菌体系中的2,3-二氯酚均被消耗殆尽时，重新补加2,3-二氯酚至体系中使其浓度恢复至100μm，按照步骤s2中的方法，共重复3个循环。
[0059]
利用高效液相色谱仪测定2,3-二氯酚及其脱氯产物(2-氯酚)的浓度，结果如图4和5所示。
[0060]
图4为本发明实施例2中不同电气石添加量对微生物还原2,3-二氯酚体系中2-氯酚含量的影响图。
[0061]
表4不同电气石添加量在不同处理时间条件下对还原体系中2-氯酚含量的影响
[0062][0063]
由图4和表4可知，在各次循环中，电气石的添加量为1.0g/l和1.5g/l时，体系中2-氯酚的占比始终比另外两组更高，并且在随着循环次数的增加，2-氯酚的占比也在逐步提升，以上结果表明：电气石的添加量较低时，也能促进微生物还原低浓度的氯酚，并且展现出良好的提高低毒还原产物含量的能力。
[0064]
图5为本发明实施例2中不同电气石添加量添加到微生物还原2,3-二氯酚体系中时对应的2,3-二氯酚的循环处理效果图。由图5可知，当电气石的添加量为1.0和1.5g/l时，脱亚硫酸菌能在96h完成对2,3-二氯酚的完全还原；当电气石含量为0和0.5g/l时，2,3-二氯酚完全还原所需的时间增加，这是因为当体系中微生物含量较高时，低浓度的电气石对微生物的刺激活化作用较弱，因而会增加完全还原所需的时间。同时，由图5中的结果可知，还原体系中的电气石，具有表现出非常优异的稳定性，能够持续促进微生物还原氯酚，以及持续将更多的氯酚还原成毒性更低的2-氯酚。
[0065]
综上述图4-5中的结果可知，添加适量的电气石能提升低毒2-氯酚的占比，并且在持续污染中提升效果更佳明显，该比例最终提高至了30％以上，这进一步验证了适量的电气石能够改变2,3-二氯酚的电荷分布，且能提高邻位化学键的稳定性和被进攻的难度，进而有利于提高还原脱氯产物中低毒氯酚(2-氯酚)的占比，降低总体的生物毒性的能力。
[0066]
图6为本发明实施例1中完成脱氯处理后体系的sem图。由图6可知，电气石和脱亚
硫酸菌菌株dcb-2在共同完成还原脱氯后，依然能保持原有状态，说明电气石和脱亚硫酸菌之间有良好的相容性。
[0067]
图7为本发明实施例2中电气石促进脱亚硫酸菌还原2,3-二氯酚前后的ftir图。
[0068]
图8为本发明实施例2中电气石促进脱亚硫酸菌还原2,3-二氯酚前后的xrd图。
[0069]
由图7和图8可知，三次循环处理后，电气石的特征峰和吸收峰未发生明显改变，说明电气石在还原脱氯过程中具有良好的稳定性和长效性，可多次循环使用，有利于实现连续污染的处理。
[0070]
图9为本发明利用电气石提高微生物还原2,3-二氯酚体系中2-氯酚含量的原理示意图。由图9可知，在微生物还原2,3-二氯酚体系中加入适量的电气石，以电气石为功能材料，能够改变2,3-二氯酚的电荷分布，具体来说：在电气石的作用下，2,3-二氯酚上各个原子的电荷会发生不同程度的转移，此时邻位氯取代基化学键上分布的电荷较少，其稳定性更高，更难被进攻，因而在微生物还原2,3-二氯酚的体系中，由于邻位上的氯取代基进攻难度的增加，体系将2,3-二氯酚还原成毒性更低的邻位低毒氯酚(2-氯酚)，从而使得还原产物中低毒氯酚的占比显著提高，有利于降低还原产物的整体毒性。
[0071]
综合上述结果可知，本发明中，在微生物还原氯酚体系中加入适量的电气石，以电气石为功能材料，能够改变氯酚的电荷分布，具体来说：在电气石的作用下，氯酚上各个原子的电荷会发生不同程度的转移，此时邻位氯取代基化学键上分布的电荷较少，其稳定性更高，更难被进攻，因而在微生物还原氯酚的体系中，由于邻位上的氯取代基进攻难度的增加，体系将氯酚还原成毒性更低的邻位低毒氯酚，从而使得还原产物中低毒氯酚的占比显著提高，有利于降低还原产物的整体毒性；同时，电气石还具有自动调节溶液ph至中性、释放微量元素和产生自发电场等特性，因而在电气石的作用下，能够为微生物提供一个稳定且适宜的中性环境，并通过产生的弱电场刺激并加速微生物的活化过程，有利于减少脱氯所需的总时长，以及提高脱氯效率，进而有利于实现高效还原氯酚的目的。本发明提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量的方法，通过在微生物还原氯酚体系中添加适量的电气石，不仅能够有效提高微生物还原氯酚体系中低毒还原产物含量，从而有利于进一步降低低毒还原产物的整体毒性，而且能够实现氯酚的快速还原，从而有利于提升生物修复氯酚体系的整体降解效率，使用价值高，应用前景好，对于有效解决氯酚污染物对环境安全和人类健康的威胁具有十分重要意义。
[0072]
以上实施例仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。