一种提高肥大细胞外泌体及其膜表面FcεRI的表达量的方法及其应用

一种提高肥大细胞外泌体及其膜表面fc
ε
ri的表达量的方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物细胞技术领域，具体涉及一种提高肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量的方法及其应用。


背景技术：

2.过敏性哮喘(allergic asthma,aa)是所有类型的哮喘中最常见的临床表型，由血清免疫球蛋白e(immunoglobulin e,ige)介导的鼻粘膜慢性炎症疾病，严重影响了患者的日常生活与工作。目前临床上较为普及的治疗哮喘药物主要为抗炎药物和支气管扩张剂，但目前这些药物的疗效只能缓解症状，不能从源头上解决哮喘患者体内炎症的发生发展，因此对过敏性哮喘的研究显得迫切且重要。
3.哮喘的发生发展取决于众多因素，ige作为过敏反应中的主要介质，尽管在血液中的ige的含量较低，但在过敏性哮喘持续状态中衔接先天性和适应性免疫起着关键作用，并参与各个阶段的哮喘发病。ige的主要是通过与肥大细胞膜表面的ige高亲和力受体(fcεri)结合使之致敏来实现的。致敏的肥大细胞再次遇到外界中特异性抗原即可被激活，释放化学介质，触发过敏反应。治疗抗炎和抗组胺药物仅仅能抑制哮喘发作时的临床症状；脱敏治疗的周期长，费用高，有效率仅为40％；抗ige抗体的价格昂贵，使用剂量大、可能会进一步引发过敏反应，且仅限于中重度过敏患者的治疗。研究报道在肥大细胞外泌体中存在肥大细胞特异性表达的蛋白fcεri，小鼠骨髓细胞来源的肥大细胞外泌体中的fcεri可结合游离ige，竞争性抑制肥大细胞与ige结合，从而发生肥大细胞脱颗粒、分泌组胺减少，血清ige水平降低，出现肥大细胞外泌体抗ige效应。因此，发现一种促进肥大细胞外泌体分泌的方式显得至关重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量的方法及其应用。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种提高肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量的方法，所述方法包括以下步骤：
6.(1)在培养皿中接种肥大细胞，并置于37℃、5％co2的完全培养基中培养，当细胞密度达到75～85％后更换培养基；
7.(2)将步骤(1)的细胞置于29～41℃的温度下培养；
8.(3)收集步骤(2)的细胞上清进行梯度离心提取外泌体。
9.本技术发明人经大量的实验发现，在肥大细胞分泌外泌体的基础上，通过改变培养温度，能够刺激肥大细胞，提高肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达。
10.作为本发明所述的提高肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中的培养温度为41℃。
11.本技术发明人研究发现，在肥大细胞分泌外泌体的基础上，当采用41℃对其进行继续培养，肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量更高。
12.作为本发明所述的提高肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中的培养时间为2小时。
13.本技术发明人研究发现，采用本发明的方法对肥大细胞进行培养，在肥大细胞分泌外泌体的基础上，采用41℃对其进行继续培养2小时，肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量高于培养时间低于和高于2小时的表达量。
14.作为本发明所述的提高肥大细胞外泌体及其膜表面fcεr的表达量的方法的优选实施方式，所述步骤(1)中更换的培养基为无外泌体的完全培养基。
15.作为本发明所述的提高肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量的方法的优选实施方式，所述步骤(3)的梯度离心为：300g离心10min，2000g离心10min，10000g离心30min，100000g离心70min，110000g离心70min。
16.本发明还提供所述提高肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量的方法制备的肥大细胞外泌体。
17.本发明还提供所述肥大细胞外泌体在制备用于治疗过敏性哮喘的药物中的应用。
18.作为本发明所述应用的优选实施方式，所制备的药物的给药方式为静脉注射。
19.本发明的有益效果：本发明提供了一种提高肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量的方法。本技术发明人经过大量的实验筛选，发现在肥大细胞分泌外泌体的基础上，通过改变温度刺激肥大细胞，能够有效提高肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量，且当采用温度为41℃，刺激时间为2小时时，肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量最高；本发明采用温度刺激肥大细胞，实验条件容易实现，操作简单，适合外泌体的大量提取。
附图说明
20.图1：a为不同浓度外泌体治疗哮喘小鼠的实验步骤；b为不同治疗小组治疗后小鼠的气道高反应指数；c为不同治疗小组治疗后小鼠体内的ige水平。
21.图2：不同治疗小组治疗后肺组织切片he染色图。
具体实施方式
22.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
23.实施例1
24.本实施例提供一种提高肥大细胞外泌体及其膜表面fcεri的表达量的方法，具体实验方法如下：
25.将在t175培养瓶中生长至密度为90％的肥大细胞按1：3铺板后，置于37℃、5％co2条件下培养24h，当细胞生长至80％时，将细胞培养基更换成无外泌体的完全培养基，将细胞分成三组，分别置于29℃、37℃、41℃条件下培养2h。培养结束后，通过超速离心法：300g离心10min，2000g离心10min，10000g离心30min，100000g离心70min，110000g离心70min。离心结束后，小心吸弃上清后，使用200μl的无菌pbs重悬沉淀转移至无菌ep管中保存。
26.实施例2
27.本实施例采用实施例1制备得到的外泌体对过敏性哮喘小鼠进行输注，并通过penh检测小鼠的气道高反应(ahr)，elisa法检测血清ige含量。采用he染色观察小鼠肺泡及肺泡灌洗液中的肺泡组织病理形态改变及肺泡中炎症细胞浸润程度、炎症细胞比例。
28.具体实验方法为：
29.(1)采用卵清蛋白(ova)致敏小鼠建立小鼠的过敏性哮喘模型，将小鼠随机分成4组，分别为(b)ova组：过敏性哮喘组；(c)ova 29℃-exo组：采用29℃刺激下分泌的外泌体治疗过敏性哮喘组；(d)ova 37℃-exo组：采用37℃刺激下分泌的外泌体治疗过敏性哮喘组；(e)ova 41℃-exo组：采用41℃刺激下分泌的外泌体治疗过敏性哮喘组；另设(a)ctrl组：阴性对照组。治疗后进行气道高反应性检测后24h处死小鼠，收集肺泡灌洗液、血清和肺组织。
30.(2)penh检测小鼠的气道高反应(ahr)检测：在治疗后24小时，称量小鼠体重并检查仪器运行正常后进行小鼠肺功能检测。将小鼠放置于扫描箱中后，连接检测装置，运行程序。填入小鼠体重后，设置程序为记录1分钟的小鼠的气道阻力的基础值，雾化1分钟，记录3分钟。按照pbs、4mg/ml、8mg/ml、16mg/ml、32mg/ml、64mg/ml乙酰胆碱进行雾化激发，记录每次实验的平均penh值。
31.(3)elisa法检测血清ige含量：往试剂盒中的96孔板中加入样品各标准品各100μl后，37℃下孵育120分钟；将每个孔的液体倒出，直接加入100μl的生物素抗体(1x)后，37℃下孵育60分钟；吸弃每孔的液体后，使用200μl的洗涤液清洗，重复3次，每次2分钟；随后每孔加入hrp-avidin(1x)后，37℃下孵育60分钟；重复上述洗涤步骤5次；每孔加入90μl tmb底物。37℃孵育20分钟；随后每孔加入50μl停止液后，迅速在酶标仪450nm波长下读取吸光度，并计算。
32.(4)he染色：将各实验组小鼠肺组织切片后，将玻片置于65℃烘箱内加热2小时使玻片水分完全蒸干后，置于二甲苯中静置10分钟，重复3次脱蜡。随后再依次经过100％、90％、80％、70％的乙醇浓度进行水化，每个浓度的时间均为2分钟。自来水下冲洗。将玻片上滴入苏木精染料10分钟后，自来水下冲洗3分钟，滴入1％盐酸乙醇分化5秒后，自来水下冲洗3分钟后，再滴入伊红染液2分钟后，自来水下冲洗3分钟。使用中性树脂封片后，在全自动扫片仪中进行自动扫片。
33.实验结果如图1和图2所示。由图1b可知，与29℃刺激产生的外泌体和37℃刺激产生的外泌体相比，注射41℃刺激产生的外泌体，小鼠的气道高反应性指数下降。由图1c可知，注射41℃刺激产生的外泌体，哮喘小鼠体内的ige水平也明显下降。由图2可知，与29℃刺激产生的外泌体和37℃刺激产生的外泌体相比，注射41℃刺激产生的外泌体，小鼠肺泡炎症细胞浸润程度明显下降。
34.最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。