一种鳕鱼DNA提取的方法

一种鳕鱼dna提取的方法
技术领域
1.本发明涉及一种食品科学技术领域，尤其涉及一种鳕鱼dna提取的方法。


背景技术：

2.随着水产品贸易量增加，加工方式多样化，采用低值品种冒充高值品种的行为时有发生，不仅破坏了水产品贸易的公平性，也损害了消费者的合法权益，甚至带来食品安全问题。因此建立快速、简便的水产品种类鉴定方法，对于规范水产品市场、保护消费者权益至关重要，对于维护水产品产业的健康发展具有重要的意义。
3.随着现代分子生物学技术的发展，dna已经被证实几乎是所有生物最主要的遗传物质，基于dna技术的分子生物学方法在鉴定食品真伪方面发挥越来越重要的作用。我国市场常见鳕形目鱼类品种及其他常见鱼类品种的dna条形码数据库的构建：鱼类标准品的采集主要包括冷冻和新鲜样品的形态学鉴定以及市售鱼肉制品的dna条形码鉴定。结果表明，共收集到76个常见鱼类物种的标准品，它们分别属于14个目，43个科。
4.传统鱼类物种识别的方法主要是基于形态学（如外形、颜色等）进行，但是对于加工过的鱼制品或近缘鱼类物种，想要进行有效的物种识别就变得尤为困难。随着社会的发展和科技的进步，关于鱼类物种识别的分子生物学方法大多数是基于蛋白质和dna的方法。然而，基于蛋白质的方法存在一定的局限性，特别是在那些经过高温处理过的鱼产品中，高温作用破坏蛋白质的结构，使蛋白质发生变性。
5.dna是生命最基本的遗传物质之一，存在于大多数细胞中，具有良好的物种特异性。与基于蛋白质的方法相比，基于dna的检测方法具有很多的优势，如高特异性、高灵敏性、热稳定性等。在加工过程中，dna分子会发生降解，但是它们对热有更高的耐受程度，有报道表明，在经过高温处理的样品中，也能成功获得约300 bp的dna片段。另外，由于遗传密码的简并性和非编码区的存在，基于dna的方法可以拥有更高的潜力和价值为此，我们提出一种鳕鱼dna提取的方法。


技术实现要素：

6.本发明为了解决上述技术问题，提供一种鳕鱼dna提取的方法。
7.本发明采用的技术方案如下：一种鳕鱼dna提取的方法，包括以下步骤：步骤s1：从市场采集鳕鱼样品，并对鳗鱼样品拍照，标记，记录标签信息，并根据形态学特征对鳕鱼样品进行物种初步鉴定；步骤s2：随机抽取鳗鱼样品，并用蒸馏水洗涤预处理；步骤s3：对与处理后的鳗鱼样品抽取血液，并加入红细胞裂解液混合均匀，得到混合液，并静置；步骤s4：将静置后的混合液离心，除去上清液，留下沉淀，在沉淀物中加入缓冲液，无水乙醇，并离心分离，得到dna提取物。
8.进一步地，所述步骤s1中鳕鱼样品选自至少一种以上的样品：大西洋鳕、狭鳕、太平洋鳕、绿青鳕、黑线鳕、澳洲无须鳕、欧洲无须鳕或细鳞状鳕。
9.进一步地，所述步骤s2中蒸馏水洗涤反复浸泡，并使用振荡器振荡。
10.进一步地，所述步骤s4在沉淀物中加入缓冲液后需要在70℃放置10min，待溶液变清亮后去除内壁的水珠。
11.进一步地，所述步骤s4得到dna提取物前通过nanodrop one超微量分光光度计测定dna浓度和纯度。
12.进一步地，所述步骤s4中所述缓冲液包括ga缓冲液、gb缓冲液和gd缓冲液。
13.进一步地，所述步骤s4重复至少三次以上。
14.本发明还提供一种鳕鱼dna提取的方法在鉴别鳕鱼品种中的应用。
15.本发明的有益效果是：本发明获得的dna浓度和纯度高，过程简单，能够为后续的大规模提取做基础，对提取的dna作标记建立与生物体之间的联系，方便实现物种的快速鉴定。
附图说明
16.图1为本发明一种鳕鱼dna提取的方法的工作流程图。
具体实施方式
17.以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.见图1一种鳕鱼dna提取的方法，包括以下步骤：步骤s1：从市场采集鳕鱼样品，并对鳗鱼样品拍照，标记，记录标签信息，并根据形态学特征对鳕鱼样品进行物种初步鉴定；所述步骤s1中鳕鱼样品选自至少一种以上的样品：大西洋鳕、狭鳕、太平洋鳕、绿青鳕、黑线鳕、澳洲无须鳕、欧洲无须鳕或细鳞状鳕。
19.步骤s2：随机抽取鳗鱼样品，并用蒸馏水洗涤预处理；所述步骤s2中蒸馏水洗涤反复浸泡，并使用振荡器振荡。
20.步骤s3：对与处理后的鳗鱼样品抽取血液，并加入红细胞裂解液混合均匀，得到混合液，并静置；步骤s4：将静置后的混合液离心，除去上清液，留下沉淀，在沉淀物中加入缓冲液，无水乙醇，并离心分离，得到dna提取物；所述步骤s4在沉淀物中加入缓冲液后需要在70℃放置10min，待溶液变清亮后去除内壁的水珠；得到dna提取物前通过nanodrop one超微量分光光度计测定dna浓度和纯度；所述缓冲液包括ga缓冲液、gb缓冲液和gd缓冲液；所述步骤s4重复至少三次以上。
21.实施例1步骤s1：从市场采集大西洋鳕样品，并对大西洋鳕样品拍照，标记，记录标签信息；步骤s2：随机抽取大西洋鳕样品202份，并用蒸馏水洗涤反复浸泡，并使用振荡器
振荡；步骤s3：对与处理后的大西洋鳕样品抽取血液，并加入红细胞裂解液混合均匀，得到混合液，并静置；步骤s4：将静置后的混合液离心，除去上清液，留下沉淀，在沉淀物中加入ga缓冲液、gb缓冲液和gd缓冲液在70℃放置10min，待溶液变清亮后去除内壁的水珠，无水乙醇，并离心分离，重复三次，通过nanodrop one超微量分光光度计测定dna浓度和纯度，得到dna提取物，成功获取了198份样品的总dna（浓度为117.8 至 5278 ng/μl，a260/280为1.8-2.0）。剩余的4份样品（jx67.1-jx67.4）的dna浓度低于15 ng/μl，a260/280低于1.2，无法用于后续实验；步骤s5：在198份基因组dna中，177份扩增出长度约650 bp的fdb。对于剩下的21份基因组dna，只有5份（jx14.1、jx14.2、jx22.1、jx16.1和jx16.2）扩增出226 bp的mdb1。其他的16份样品无法扩增出任何fdb和mdb1。
22.步骤s6：182个pcr产物都成功获得可供识别的序列。经过修剪，fdb的平均长度为645 bp（长度范围为639-654 bp），mdb1的平均长度为213 bp（长度范围为195-221 bp）。
23.步骤s7：序列比对结果显示，有154个fdb和3个mdb1最大相似度≥98%。其余的23个fdb最大相似度在83.70%至97.76%之间，剩下的2个mdb1的相似度在92.65%至94.57%之间。
24.实施例2步骤s1：从市场采集澳洲无须鳕样品，并对澳洲无须鳕样品拍照，标记，记录标签信息；步骤s2：随机抽取澳洲无须鳕样品118份，并用蒸馏水洗涤反复浸泡，并使用振荡器振荡；步骤s3：对与处理后的澳洲无须鳕样品抽取血液，并加入红细胞裂解液混合均匀，得到混合液，并静置；步骤s4：将静置后的混合液离心，除去上清液，留下沉淀，在沉淀物中加入ga缓冲液、gb缓冲液和gd缓冲液在70℃放置10min，待溶液变清亮后去除内壁的水珠，无水乙醇，并离心分离，重复三次，通过nanodrop one超微量分光光度计测定dna浓度和纯度，得到dna提取物，成功获取了118份样品的总dna， dna的浓度范围从73.19~1320.55ng/μl，均值为479.20 ng/μl。所有dna样品的a260/a280为1.8~2.0。
25.步骤s5：在118份基因组dna中，电泳结果显示，所有样品均能扩增出长度约为655 bp的fdb。
26.步骤s6：118个pcr产物均成功测序。去除正反向引物和低质量的序列后，片段长度为646~653 bp，平均长度为648 bp。
27.步骤s7：序列比对结果显示，所有样品扩增出的片段的最大相似度≥98%，表明所有样品均可以成功鉴定。
28.实施例3步骤s1：从市场采集细鳞状鳕样品，并对细鳞状鳕样品拍照，标记，记录标签信息；步骤s2：随机抽取细鳞状鳕样品33份，并用蒸馏水洗涤反复浸泡，并使用振荡器振荡；步骤s3：对与处理后的细鳞状鳕样品抽取血液，并加入红细胞裂解液混合均匀，得
到混合液，并静置；步骤s4：将静置后的混合液离心，除去上清液，留下沉淀，在沉淀物中加入ga缓冲液、gb缓冲液和gd缓冲液在70℃放置10min，待溶液变清亮后去除内壁的水珠，无水乙醇，并离心分离，重复三次，通过nanodrop one超微量分光光度计测定dna浓度和纯度，得到dna提取物，成功获取了118份样品的总dna， dna浓度范围为49.33-881.49 ng/μl（平均浓度为166.24 ng/μl）。
29.步骤s5：电泳结果显示，33份样品成功扩增出mdb2，而只有16份样品可以扩增出fdb。
30.步骤s6：16个pcr产物均成功测序获得了可供识别的序列。
31.步骤s7：序列比对结果显示，所有样品扩增出的片段的最大相似度≥98%，表明所有样品均可以成功鉴定。
32.本发明通过对鳕鱼样品进行检测，基于dna提取进行物种认证。结果条形码测序的鉴定结果保持一致，再次确保了物种的真实性，便于本研究后续实验的进行，也为中国鱼类的 dna 条形码数据库建设起到了一定的促进作用。
33.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。