用于检测病毒的方法和组合物

用于检测病毒的方法和组合物
1.对相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 u.s.c.119(e)要求2020年3月25日提交的美国申请号62/994,724的优先权。
技术领域
3.本公开一般涉及用于病毒检测的方法和组合物。


背景技术：

4.感染性疾病(诸如hiv)的早期和快速诊断以及及时开始适当的治疗是促进积极临床结果和一般公共卫生的关键决定因素。当前的hiv诊断基于病毒载量、cd4细胞计数和抗hiv抗体的测量。疾病控制和预防中心(cdc)的hiv诊断逐步算法包括hiv-1/2抗原/抗体和抗体分化免疫测定法，以及核酸检测(cdc推荐的血清或血浆标本的实验室hiv检测算法(2018)))，所有这些均需要专门的设备和训练有素的人员。
5.这些诊断方法依赖于在感染后两到三周检测分析物的病毒血症或血清学事件(图1)。仅50％的受感染患者在感染后12天具有可检测的血浆rna或p24表达，导致仅小部分病例在感染后约3周内被检测到。至关重要的是，没有诊断工具能够在隐蔽期(感染后约10天)期间进行检测。此外，常规的体外hiv rna和基于抗体的诊断是耗时的，并且需要集中的实验室、经验丰富的人员和笨重的设备。
6.鉴于此，cdc和世界卫生组织(who)分别建议开发改进的方法，诸如护理点(poc)或在家测试，其可以支持自我测试的实施。便携式、用户友好的测试以其简单、匿名和快速检测而闻名，其有可能增加患者更快收到关键结果的可能性。虽然目前fda批准的poc测试具有出色的性能，但其灵敏性，特别是在最近感染后，相对于基于实验室的方法而言是不够的。
7.例如，经fda批准的唯一“在家”hiv测试通过检测针对hiv的抗体发挥作用，并且因此当hiv抗体在循环中时不捕捉病毒血症或病毒反弹的初始阶段。在此，我们建议通过开发以用户为中心的侧向流测试来解决这一关键缺陷以有意义地告知治疗，改善患者预后，并防止hiv以及其他糖基化包膜病毒的传播，该测试具有在感染的急性阶段期间通过手指刺入检测整个病毒的能力。
8.发明概述
9.本公开提供了模块的基于蛋白质的平台，该平台使得能够进行早期、直接和高灵敏性的病毒检测，而提供便携性和易于在家使用以显著影响病毒感染和病毒反弹的预后、监测和治疗。该创新平台在本文中使用hiv进行举例说明，但其可以很容易地适应于使用适当的病毒特异性抗体(例如，单克隆抗体)检测(例如，单独地或同时地)任何糖基化包膜病毒(例如，sars-cov-1、sars-cov-2、hcv、hsv-2、ebola、jev、nipah、狂犬病)。
10.在一方面，提供了缺乏赖氨酸的工程化grft多肽(
“‑
k grft”)。
11.在另一方面，提供了缺乏赖氨酸并且具有m78k取代的工程化gfrt多肽。
12.在又一方面，提供了缺乏赖氨酸并且具有nk或ck取代的工程化grft多肽。
13.在又一方面，本文所述的工程化grft多肽与纳米颗粒缀合。在一些实施方案中，纳米颗粒是plga纳米颗粒或金纳米颗粒。
14.在另一方面，提供了固体基质，其包含如本文所述的工程化grft多肽。在一些实施方案中，固体基质是侧向流测试条。在一些实施方案中，侧向流测试条包括纤维素、硝酸纤维素或其组合。
15.在又一方面，提供了用于检测病毒的存在或缺乏的制品。此类制品可以包含本文所述的抗病毒抗体和工程化grft多肽。
16.在一些实施方案中，制品进一步包括固体基质。示例性固体基质是侧向流测试条。在一些实施方案中，抗病毒抗体与固体基质结合；在一些实施方案中，如本文所述的工程化grft多肽与固体基质结合。在一些实施方案中，测定法被配置为夹心elisa。在一些实施方案中，抗病毒抗体与纳米颗粒缀合。可以施用此类制品来检测的代表性病毒包括但不限于hiv、sars-cov-1、sars-cov-2、hcv、hsv-2、ebola、jev、nipah、狂犬病和其他糖基化病毒。
17.在又一方面，提供了检测病毒存在或缺乏的方法。此类方法通常包括使固体基质与生物样品接触，其中固体基质包含与其缀合的抗病毒抗体以生成捕捉复合物；使捕捉复合物与本文所述的工程化grft多肽接触，以生成检测复合物；并检测检测复合物。
18.在一些实施方案中，病毒选自hiv、sars-cov-1、sars-cov-2、hcv、hsv-2、ebola、jev、nipah、狂犬病和其他糖基化病毒。在一些实施方案中，固体基质是侧向流测试条。在一些实施方案中，检测步骤在生成捕捉复合物的接触步骤的30分钟内进行。代表性的生物样品包括但不限于血液、唾液、尿液、鼻分泌物、粪便、精液或泪液。
19.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与物质的方法和组成所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可以用于物质的方法和组成的实践或测试，但合适的方法和材料在下文描述。此外，材料、方法和实例仅是说明性的而不是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入。
附图说明
20.图1是显示使用可用诊断工具检测到感染后的病毒血症和血清学事件的图。早期病毒血症可以通过病毒rna或p24抗原诊断。改编自hurt等人。(2017,sex.transm.dis.,44:739-46)。
21.图2是显示使用组装到测试线的grft np和对靶病毒具有特异性的抗体的组合的原型病毒夹心测定法的示意图。
22.图3是显示经表达和纯化并且已经历选择性赖氨酸取代的grft变体的图。随后的胺偶联缀合效率通过荧光团标记进行评估。
23.图4是显示经由表面等离子体共振评估的与2kda或20kda mpeg聚合物缀合的griffithsin变体的活性的图。当与两个20kda mpeg缀合时，鉴定出两种grft变体，其维持对hiv糖蛋白gp120的pm亲和力。
24.图5是显示grft变体针对hos-cd4-ccr5 细胞中的env-假型化q769.h5病毒的抗hiv-1活性的图。通过将样品孔的发光除以仅病毒对照孔的发光计算百分比中和。通过非线
性回归分析测定每个变体的ic50。在graphpad prism 5.0中绘制的图代表两项独立实验，每项实验一式三份完成。每个数据点代表一式三份实验的平均抑制百分比
±
sem。
25.图6是显示elisa结果的图。将vrc01包被在板上并用bsa封闭，添加gp120(bal)的连续稀释物并与-k grft m78k一起温育，并用抗grft ab进行检测。各种曲线代表vrc01(1、5和10μg/ml)和-k grft m78k(0.5和5μg/ml)的不同组合。
26.图7a是显示用于将grft与聚合物缀合的一种类型的表面修饰化学的示意图。
27.图7b是显示经由萤光素酶活性测量的在暴露于渐减浓度的hiv-1后tzm-bl细胞中grft修饰的纤维的抗病毒活性的图。观察到剂量依赖性作为grft表面修饰和病毒浓度的函数。也参见grooms et al.,2016,antimicrob.agents chemother.,60:6518-31。
28.图8是显示grft缀合的和未缀合的np对固定化病毒糖蛋白的spr稳态响应的图。
29.图9是显示hiv假病毒的vrc01捕捉和grft检测的图。
30.发明详述
31.本文描述了首创夹心侧向流测定法，该测定法利用广谱抗病毒凝集素grft检测来自糖基化病毒(例如hiv、hcv、hsv-2、sars-cov-1、sars-cov-2、hcv、hsv-2、ebola、jev、nipah、狂犬病)的完整病毒或病毒蛋白，该grft与聚合物或金纳米颗粒(np)和适当的单克隆抗体(mab)缀合以赋予病毒选择性。开发基于蛋白质的诊断剂需要抗原的选择性结合连同强输出信号的生成，本文所述的组合物和方法满足这些特征。本公开提供了一个平台，其解决了对广泛可用的工具的迫切医疗需求，以快速诊断病毒感染以告知治疗并改善患者预后。
32.grft是有力的抗病毒凝集素，其结合病毒包膜上的甘露糖残基，并已显示出针对hiv、单纯疱疹病毒2(hsv-2)、丙型肝炎病毒(hcv)、ebola、冠状病毒和nipahkf的中和活性(lusvarghi&bewley,griffithsin:an antiviral lectin with outstanding therapeutic potential,viruses,8,2016)。grft以皮摩尔浓度中和一大批hiv毒株，并且在符合glp的毒性研究中耐受良好。此外，grft非常稳定，具有》2年的室温稳定性，并且对极端的ph和温度以及蛋白酶降解有抗性(moncla et al.,2011,adv.biosci.biotechnol.,2:404-8)。grft的抗氧化变体q-grft目前正处于i期临床开发阶段，作为病毒防治剂。
33.本文件描述了新的方法，该方法为检测和鉴定其包膜上具有聚糖的病毒提供了新的途径；grft的广谱结合活性使得能够检测基本上任何糖基化包膜病毒，本文以hiv检测举例说明。在提议的方法中，grft将与病毒和/或病毒片段结合，与聚合物和金np一起提供视觉输出(图2)。特异性，每个靶定病毒或病毒蛋白由单个mab检测，赋予模块性。因此，通过改变单克隆抗体，可以单独或同时区分多种病毒类型。
34.np已显示具有光学和荧光特性，能够实现快速且高效的临床诊断(draz&shafiee,2018,theranostics,8:1985-2017)。此外，np探针已显示出在大小、表面积、特异性、信号灵敏性和稳定性方面的优势，此外还简单、快速、高灵敏性、无标记检测众多靶分子。在此，聚合物和金np的已知属性与grft相结合，所述grft已显示出与许多不同病毒(例如hiv、hcv、hsv-2)的强结合相互作用，其经过专门定制以提高稳定性和易于缀合。这是第一项研究，其研究使用多价grft np来最大化抗原覆盖，以便在侧向流装置中进行快速病毒检测。
35.除了由单独的hiv-1感染引起的流行病外，5至10百分比的hiv阳性患者共感染有hcv，已知这增加心血管风险和死亡率。此外，hsv-2和hiv共感染是已知的疾病负担，其增加
hiv感染的风险。除hiv外，grft还具有针对hcv和hsv-2两者的抗病毒活性，为共感染患者的双重诊断提供了独特的机会。mab组分的特异性允许模块性和从hiv扩展到具有糖基化包膜的一种或多种其他病毒。例如，本文描述了用于检测hiv-1的hiv特异性mab，然而，添加对hcv和/或hsv-2具有特异性的mab实现本文描述的基于grft的平台同时诊断共感染的可调性。
36.本文所述的新的基于蛋白质的病毒诊断平台可以容易地部署在家用装载中(例如，侧向流测试条)，该装载可以提供快速、以患者为中心和具有成本效益的早期病毒感染或复发检测；使得能够早期治疗；改善患者预后并减少后续传播。
37.与无赖氨酸(-k)grft缀合的聚合物和金纳米颗粒(np)
38.本文描述了两种不同的基于纳米颗粒(np)的无赖氨酸(-k)grft递送平台，其可以灵敏且特异性地检测和放大病毒结合。可以生成具有不同grft密度的plga和金np，以确定实现与病毒体和/或一种或多种病毒蛋白的最大结合所需的plga和金np上grft的有效浓度。
39.(i)确定-k grft的密度以使plga和金np表面饱和
40.用-k grft进行np表面修饰：羧基封端的plga np可以如前所述合成(参见例如mahmoud et al.,2019,j.control release,297:3-13)，以允许在制造过程期间或之后添加表面配体。激活用于胺缀合的金np和纳米壳(例如，150nm)可以商业获得(例如，nanocomposix)或使用已知方法生产(参见，例如，在万维网上的thermofisher.com/content/dam/lifetech/images/integration/1602163_crosslinkinghb_lores.pdf)。聚合物和金np可以使用例如edc-nhs化学在存在一系列-kgrft浓度的情况下进行反应，以确定使plga和金np表面饱和时的密度。np表面上的-k grft浓度可以使用互补方法确定，包括-k grft的elisa定量；荧光光谱术；表面等离子共振(spr)；和/或尺寸排阻色谱hplc(参见，例如，grooms et al.,2016,antimicrob.agents chemother.,60:6518-31；kramzer et al.,2021,aaps pharmscitech,22:83；fuqua et al.,2015,plant biotechnol.,13:1160-8)。
41.为了确定表面吸附的相对于共价结合的grft的量和持续时间，可以在温育后的固定时间点评估表面介导的-k grft释放，并使用elisa定量。对于物理表征，plga和金np的未水合np形态、直径和尺寸分布可以使用扫描或透射电子显微术进行评估，而动态光散射和zeta电位分析可以用于表征水合np的流体动力学直径和表面电荷。
42.(ii)确定-k grft修饰的np对病毒体或病毒蛋白的亲和力/亲合力
43.可以评估-k grft修饰的np与病毒体或一种或多种病毒蛋白(在本实施例中，三种gp120蛋白，一种来自hiv-1进化枝a、b和c)的结合，以确定实现最大病毒结合所需的表面密度。靶目标是实现粘附在-k grft np上的足够数量的病毒体或病毒蛋白，用于在短时间内(例如，自最初暴露于病毒体或病毒蛋白起30分钟、20分钟、15分钟、10分钟)发生检测。grft np与病毒体或病毒蛋白的结合可以通过施用与不同(低、中和高)表面密度的-k grft配制的等份plga或金np以增加病毒体或病毒蛋白的量(～1ng/ml至1mg/ml)来确定。-k grft修饰的plga np可以被合成以包囊保留在np内的荧光染料(例如香豆素6)，实现其可视化和量化，而金np具有固有的光吸收特性。未结合的gp120可以通过离心去除并且结合的np的量可以通过相对于上清液中剩余的未结合的np，测量残留的荧光或光吸收来确定。
44.结合亲和力可以表示为对于给定-k grft密度与给定浓度的病毒体或病毒蛋白结合的np的荧光或吸光度。非糖基化病毒糖蛋白(例如，在大肠杆菌中制成)可充当评估非特异性结合的对照，而未修饰的np可用于评估-k grftnp对病毒蛋白的粘附性的特异性。结合实验可以在多种缓冲溶液和含血清培养基中进行。类似的组可用于表面等离子共振(spr)实验，以确定表面修饰的np和病毒体/病毒蛋白相互作用的k
on
/k
off
速率和kd。可以测试表现出与病毒体和病毒蛋白的强结合的np制剂与病毒特异性mab结合的能力，并在侧向流测定中进行转运。可以使用单向anova(p《0.05)确定组间的统计分析。鉴定在存在grft和grft np的情况下能够捕捉病毒糖蛋白和假病毒体的抗病毒抗体
45.免疫色谱测试的一个重要优势是抗原-抗体相互作用提供的特异性。可以用elisa和/或表面等离子共振(spr)格式筛选针对期望病毒或病毒蛋白的单克隆抗体，以确定使该平台的广度和选择性最大化的抗体。此外，假病毒可以用于在存在grft的情况下筛选mab对病毒体的广度和选择性。可以选择至少一种(例如，至少两种、至少三种)抗体来捕捉病毒体和病毒蛋白以用于侧向流原型开发。通常基于低交叉反应性、高亲和力结合和干扰-k grft/-kgrft np结合的缺乏来选择抗体。
46.(i)筛选在-k grft和-k grft np存在下捕捉或检测病毒蛋白的单克隆抗体
47.可以购买或生产针对病毒体或病毒蛋白的mab。生产mab的方法是本领域已知的。例如，全长igg mab可以使用如本文所述的magnicon载体(例如，对于vrc01，针对hiv的mab)在本氏烟草(n.benthamiana)中表达，并通过fplc使用蛋白a和(如果需要)额外的色谱步骤(例如，陶瓷羟基磷灰石)进行纯化。
48.关于用于检测hiv的方法和组合物，有10种抗hiv mab(表1；另见dashti et al.,2019,trends mol.med.,25:228-40)，其具有比vrc01更高的中和广度百分比，vrc01提供》88％的hiv株覆盖率。其中8种mab对cd4结合位点具有特异性，2种mab对gp41表位具有特异性；因此，预期这些mab不干扰-k grft结合。如本文所述，可以筛选这十种hiv ab以评估对hiv的亲和力、广度和特异性。
49.表1.示例性抗hiv单克隆抗体
50.mab表位％广度n49p6cd4bs100n49p7cd4bs100n49p11cd4bs100n6cd4bs98vrc07cd4bs9212a12cd4bs923bnc117cd4bs90n49p9cd4bs89vrc01cd4bs88dh511-2gp419810e8gp4197
51.cd4特异性mab可以以elisa格式进行测试，以确保mab和grft可以协同作用。可以分析mab和-k grft或-k grft修饰的np。例如，在pbs中稀释的mab可以包被在微量滴定板
上，可以封闭板，可以以连续稀释添加病毒体或病毒蛋白，然后与-k grft和-k grft np一起温育。结合的-kgrft和-k grft np可以用抗grft抗体检测。elisa方法可以从传统的1小时温育修改为与病毒体或病毒蛋白温育15分钟，这更适合侧向流设计。
52.在存在grft或grft np的情况下能够结合病毒体或病毒蛋白的cd4特异性mab可以在存在假病毒的情况下进一步筛选。在相同的格式中，假病毒可以与mab和grft夹心，以选择在grft存在时结合的mab。假病毒是gp41表位特异性mab的主要筛选机制。mab选择的标准是，在有和没有-k grft或-k grft np的情况下，mab的效力变化≤20％。
53.表面等离子共振(spr)还可以用于确定mab对病毒体或病毒蛋白的动力学参数，以及-k grft和-k grft np对mab捕捉的病毒体或病毒蛋白的动力学参数。每个mab蛋白均可以通过igg1同种型的抗人igg(fc)抗体捕捉在传感器芯片上，并且可以使用各种浓度的重组病毒体或病毒蛋白作为分析物。每个mab测定可以一式三份进行。可以根据1:1结合动力学拟合曲线以确定动力学参数。此外，病毒体或病毒蛋白/-k grft和病毒体或病毒蛋白/-kgrft-np复合物可以作为分析物注射，以确定mab复合物的动力学参数。可以选择不破坏mab与各自病毒体或病毒蛋白的结合亲和力超过20％并且具有快速结合动力学的复合物作为潜在的候选物。
54.(ii)在存在干扰物和生物体液的情况下确定mab和-k grft np特性
55.所有选定的mab均可以通过夹心elisa(mab作为捕捉；grft作为检测)在添加了潜在干扰病毒蛋白(例如，在hiv、hcv和hsv-2抗原的情况下)的生物体液中进行筛选，以评估这些干扰物的影响。对于每种病毒蛋白，可以设计四种剂量曲线(例如，一种在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中，一种在90％血浆中，一种在90％血浆加1μg/ml糖基化hcve2抗原中，以及一种在90％血浆加1μg/ml糖基化hsv-2抗原中)。大肠杆菌产生的病毒蛋白可以用作阴性对照。分析可以一式三份进行，并且可以使用graphpad prism中的anova比较半最大有效浓度(ec
50
)值。为了提供稳健性和进一步的可行性，可以分析-k grft np与病毒蛋白的共温育。曲线可以如上设计，除了-k grft和-kgrft np可以在与mab温育之前与病毒蛋白的连续稀释物一起温育。然后可以使用假病毒代替病毒蛋白重复这些步骤。选择性mab选择的可接受标准可以是存在血浆时结合变化小于2％和存在干扰蛋白时与病毒蛋白结合减少《20％的mab。
56.侧向流测定法能够通过ph变化、缓冲液组合物或表面活性剂来破坏干扰性血浆抗体。因此，血浆中抗病毒抗体的影响可以通过向靶病毒加标具有多克隆ab的血浆来评估。使用elisa格式，对于每种病毒蛋白，可以设计四种剂量曲线(例如，一种在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中，一种在90％血浆中，一种在90％血浆加多克隆抗病毒蛋白中，以及一种在90％血浆加多克隆抗病毒蛋白)转移至ph 2.0。大肠杆菌产生的病毒蛋白可以用作阴性对照。如果多克隆抗体的存在使结合饱和并因此抑制grft和mab结合，可以修改elisa方法。分析可以一式三份进行，并且可以使用graphpad prism中的anova比较半最大有效浓度(ec
50
)值。
57.以侧向流格式评估grft np和mab
[0058]-k grft np和能够捕捉病毒蛋白和假病毒的mab被整合到基于硝酸纤维素的侧向流测定法中。可以使用固定化抗体候选物和初步的-k grft np制剂以确定侧向流基线条件。可以原型化对具有所选mab和聚合物和金np的条，以最大化与病毒蛋白和假病毒(或减毒病毒)的结合。
[0059]
(i)选择亲和试剂
[0060]
mab可以与np缀合并分配到硝酸纤维素膜上作为测试线。对于每个靶物，可以评估3种不同的假病毒和病毒抗原。-k grft np可以分配到硝酸纤维素膜上，并且mab(即缀合物和测试线)可以针对互补的-k grft np进行测试，以建立针对整个病毒或病毒片段的分析物捕捉夹心(参见，例如，图2)。可以组装标准原型侧向流测试条，包括例如用于低体积保留的玻璃纤维样品垫、用于最大灵敏性的慢芯吸硝酸纤维素和纤维素吸收垫。溶液中的
–
k grftnp可以与假病毒或纯化的病毒蛋白混合，然后应用于侧向流测试条。测试线的相对强度可以通过肉眼进行定性评估，也可以经由比色变化进行定量测量。可以选择抗体/-k grft np组合，在存在加标到缓冲液中的分析物的情况下提供最强的测试线信号，而在阴性样品中没有非特异性结合，可以被选择用于进一步优化。
[0061]
(ii)特异性
[0062]
为了评估测定对靶分析物(例如病毒体或病毒蛋白)的特异性，可以针对常见的干扰抗体和已知的共循环病毒测试最佳的聚合物和金-k grft np，以及在用人为样品测试时具有最高特异性信号的抗体。可以使用由其他病毒进化枝制备的人为样品或使用根据当前医疗实践在测试前已判定的病毒阳性患者样品进行测试。可以选择在存在交叉反应性种类的情况下几乎没有信号的对进行进一步优化。
[0063]
(iii)优化
[0064]
优化的初始重点可以是mab或-k grft与np缀合的条件。可以评估mab或
–
k grft与np、np封闭试剂、温育时间和其他反应参数的比率，以提高缀合物的性能。在这个阶段，测试可以从通过将分析物加标到缓冲液中制备的人为样品过渡到将分析物加标到代表性样品基质中。可以评估每个测试条组件的材料，并优化相关的化学成分(例如，样品垫预处理)，以实现样品基质的一致标准化。可以根据灵敏性和特异性选择最佳运行条件。在使用湿-k grft np选择了一组运行条件后，可以优化将-k grft np干燥到样品垫上的过程。可以测试一系列化学物质，以便在用样品重悬浮后从缀合垫中获得最佳的np释放。此外，还可以检查样品体积、运行缓冲液和测定运行时间。
[0065]
(iv)侧向流测试条的初步生产
[0066]
一旦获得功能性干燥的缀合物垫，就可以生成一组测试条(例如，2x100个测试条)用于进一步评估。侧向流装置的功能和特异性可以用在血液中稀释的假病毒和病毒蛋白以及存在其他糖基化病毒蛋白的情况下进行测试。改进和优化基于grft的侧向流分析的功能
[0067]
在设计了初始侧向流测定法(lfa)分析后，可以优化各种因素以实现最大检测能力。例如：
[0068]
稳定性：可以优化的一个重要因素是聚合物或金np制剂在溶液中和不同储存条件下的稳定性，因为这些是影响侧向流装置中的流动和检测灵敏性的控制参数。首先，可以评估不同np制剂的稳定性，以减少聚集并确保单分散性，特别是在高盐条件下。在评估最大缀合密度的同时，可以改变mab/grft表面修饰的量以减少聚集，同时确保mab/grft有足够的修饰密度来覆盖和稳定np。降低修饰密度的好处之一是降低生产成本和减少非特异性结合。此外，使用已鉴定的最佳mab，可以使用不同的缀合策略，例如用于随后的硫醇反应性的柠檬酸盐偶联、抗生物素蛋白-生物素或peg化来制备np制剂，以提高稳定性、最小化空间位阻或连接缀合物。此外，虽然nanocomposix已建立150nm羧基金纳米壳在快速诊断测试中表
现出高灵敏性，但使用40或80nm羧基金纳米颗粒可能有助于提高稳定性、降低ab成本并实现更多可重现的缀合物。
[0069]
用这些变化产生的纳米颗粒制剂可以用类似于本文所述的uv-vis分光光度法、dls和ζ电位测量进行评估，并且可以表征为ph、最小mab缀合、添加稳定剂(诸如不同浓度的bsa、peg等)的影响和其他缀合策略的函数。此外，可以评估选定的金和聚合物np制剂在类似条件下一段时间(例如，6个月、9个月、1年)内的稳定性并作为贮存温度(室温(rt)、4℃和-20℃)和湿度(0、40、65、90％)的函数。
[0070]
lfa内的物理流动：为了优化np流动，可能有必要减少对缀合垫的粘附或将np在垫上聚集(即阻塞)的可能性降至最低。在这种情况下，可以重新优化缀合条件以增强稳定性，如本文所讨论。此外，如果样品没有到达缀合垫，则可以在每组中选择和确认较小的颗粒。这可以使用对聚合物np的增强离心和过滤测量以及对金np的过滤来实现。此外，如本文所述，可以购买尺寸范围为40、80或100nm或120nm的纳米壳的金np，以减轻通过侧向流测定的传输。最后，可以将不同浓度的np施用到垫上，因为已知稀释因子会影响流量和检测能力(稀释样品较少时影响较小)，此外还有成本。
[0071]
增加结合信号：根据纳米颗粒流经侧向流装置所需的优化，利用金或聚合物纳米颗粒或纳米壳配置有助于建立最佳结合特性、流过特性和导致的结合信号的差异。因此，本文学习的信息可以用于改变这些不同基团的生物受体缀合密度，以最大化结合信号。
[0072]
特异性/灵敏性：由于需要在生物学相关和复杂的环境(例如人血)中进行检测，因此可以通过将修饰密度完全表征为表面覆盖的比率、添加或增加bsa或peg的量，或考虑可能有助于电荷和疏水性特征而这些特征可以反过来有助于非特异性结合的不同缀合策略来解决grft np或mab np的非特异性结合。在这些情况下，可以进一步细化np特征，以在侧向流测定中达到最高的特异性水平。在灵敏性不足且无法区分两个接近的浓度值的情况下，可以改变np大小、类型、修饰密度和设计以最大化灵敏性。
[0073]
对照和测试线优化：多种因素可能导致对照和/或测试线的可视化不充分，这表明mab np和grft np缀合可以针对稳定性或结合亲和力进行优化。在此，缀合策略或条件可以改变。此外，如果对照线难以可视化但测试线明显，则可以调整或增加生物受体-np缀合物的浓度。可替代地，可以使用对对照线特异的不同np，或者可以将np更改为不同的捕捉生物受体。
[0074]
检测能力的扩展：除了病毒体和/或初级病毒蛋白之外，可能需要快速检测来自相关病毒的次级病毒蛋白。例如，在hiv-1中，gp41能够实现二次检测方法，可以单独使用或与gp120检测结合使用以增强检测能力。同样，在由血液或唾液呈现的更复杂环境中检测np的能力对于实现灵敏性和特异性检测是不可或缺的。健康患者血液样品中具有不同颗粒组的数据集可以用于验证、确认和比较组间的变化。
[0075]
验证和确认侧向流测试条
[0076]
可行的侧向流产品需要展示可重复和可再现的结果，同时以高诊断灵敏性和特异性区分阴性和阳性响应。grft-侧向流测试条可以批量制造，以在存在其他干扰物的情况下测试人生物体液的诊断灵敏性和特异性。
[0077]
可以使用阳性和阴性样品队列评估多个因素，以确定侧向流测试条的整体可行性和获得可重复结果的能力。可以完成多个大规模原型制造运行，以优化设计并持续改进侧
向流性能。
[0078]
例如，可以制造500个如本文所述的侧向流测试条用于测试。对于诊断灵敏性、特异性和精确性，可以如下文概述进行测试。
[0079]
(i)诊断灵敏性和特异性：
[0080]
可以获得和/或生成病毒阴性和病毒阳性患者样品队列，以测试每种设计的灵敏性、特异性和精确性。简单举例来说，阴性队列可以具有40个hiv阴性血清，包括至少5个hcv和5个hsv-2阳性样品，以及阳性队列可以具有40个hiv阳性血清，通过控制病毒载量在《200拷贝/ml分层，在200-1000拷贝/ml时反弹hiv阳性，在1000-100,000拷贝/ml时出现未确诊的hiv阳性。阳性队列可以含有至少5个hcv或hsv-2阳性的血清。可以使用rt-pcr确认阳性样品中的病毒载量。靶物应具有少于10％的假阳性或假阴性。
[0081]
(ii)可重复性和再现性：
[0082]
本文概述的诊断灵敏性和特异性的规程可以由一名技术人员重复总共3次以确定可重复性。另一个实验室的第二名技术人员也可以运行样品总共3次。六次运行可以合并以确定实验室之间的精确性。协作精确性可以通过6次个体测试之间的阳性和阴性一致性的方差来确定。
[0083]
根据本发明，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学、生物化学和重组dna技术。这些技术在文献中有充分的解释。本发明将在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求中描述的方法和物质组合物的范围。
实施例
[0084]
本文描述了一种新的且广泛适用的方法，该方法可以多样化以诊断许多糖基化包膜病毒。鉴于grft是稳定的广谱凝集素，可以使用该平台检测与grft结合的任何糖基化包膜病毒，并且可以调整本文所述的方法和组合物以检测特定的糖基化病毒组以用于临床应用。虽然下面的实施例侧重于能够检测hiv整个病毒的平台，但可以使用该平台以生成新的基于蛋白质的诊断工具家族，允许以快速、以用户为中心、灵敏、准确、选择性和廉价的方式检测多种病毒。该描述是朝向开发用于检测早期感染、实现知情治疗、从而改善患者预后和随后的传播风险的家用技术的第一步。
[0085]
实施例1——grft经结构优化用于胺偶联以提高效率和维持活性
[0086]
由于缺乏游离赖氨酸，野生型grft和q-grft(m78q)均表现出通过胺偶联反应的较差缀合。为了解决这点，从q-grft氨基酸结构中去除了赖氨酸(在氨基酸位置6和99)，在每个精氨酸(氨基酸位置5、24、64、80或81)、甲硫氨酸(氨基酸位置61或78)，或在每个末端(n-或c-)将单个赖氨酸系统地取代回到grft中，并评估变体在缀合至2或20kda甲氧基聚乙二醇(mpeg)聚合物时的标记效率(图3)和活性(图4)。根据所评估的变体，-k grft m78k和-k grft nk(统称为-k grft)由于其增强的标记效率和对gp120的高亲和力而被选择用于进一步表征。-k grft m78k的k
on
和k
off
率分别为7.18x106m-1
s-1
和6.23x10-4
s-1
。类似地，-knk具有1.04x 107m-1
s-1
的k
on
速率和6.83x 10-4
s-1
的k
off
速率。这两种变体均具有相似的hiv中和能力(图5)，表明这些修饰不影响grft效力。这些-k grft变体用于np修饰。
[0087]
实施例2——-k grft m78k可以检测结合至hiv特异性单克隆抗体的gp120
[0088]
为了对此诊断剂赋予特异性，使用了对hiv特异性的mab。vrc01是cd4结合位点特
异性广泛中和mab，从感染hiv-1的供体中分离出来，已在随机化临床试验中证明了安全且可耐受的输注(riddler et al.,2018,open forum infect.dis.,5:ofy242)。vrc01具有约90％的遗传多样性异源hiv-1(wu et al.,2010,science,329:856-61)和hiv-2株(kumar et al.,2017,front immunol.,8:1568)的中和覆盖率。使用单一烟草病毒复制子载体为本氏烟草(nicotiana benthamiana)植物中的vrc01开发了新的生产系统。植物制备的vrc01表现出与grft的hiv中和协同作用(hamorsky et al.,2013,antimicrob.agents chemother.,57:2076-86)，这是由于通过grft-hiv gp120结合的cd4结合位点的暴露(alexandre et al.,2011,j.virol.,85:9039-50)。因此，在此开发过程中，vrc01被用作测定中的基线对照。
[0089]
使用酶联免疫吸附测定(elisa)(图6)，分别使用不同浓度的vrc01和-kgrft m78k以捕捉和检测gp120(bal-1)。这些实验表明，grft和vrc01均以剂量依赖性方式(ec
50
～0.2μg/ml)同时与gp120结合，初步检测下限为1ng/ml gp120。总之，这些数据为使用vrc01作为内部标准的初始mab提供了强基本原理，因为它具有互补结合、对hiv的特异性以及与不同hiv进化枝和株的广谱结合。
[0090]
实施例3——grft和其他蛋白质修饰的递送媒介物有力抑制病毒和细菌感染
[0091]
我们之前的工作已经开发出用grft或其他蛋白质进行表面修饰的聚合物纳米颗粒和纤维，以分别抑制hiv和hsv-2感染或细菌感染。与此处提出的用grft的类似修饰方案(图7a)，证明了作为grft修饰密度和病毒浓度的函数的强抗hiv活性(图7b)。类似的表面修饰策略也用于设计用粘附到其他病原体的蛋白质或肽修饰的np。机制结合和体内效力研究表明，由于np表面上的肽多价性，相对于游离肽，np效力显著增加。这些结果进一步证明了grft修饰的媒介物结合和固定化病毒和细菌病原体的能力。
[0092]
实施例4——与np缀合的-k grft m78k的活性
[0093]
作为概念验证，将plga np与-k grft m78k缀合，初步结果表明grft修饰的np具有与gp120和其他病毒糖蛋白结合的能力。当通过表面等离子体共振(spr)进行评估时，-k grft m78k np对固定化sars-cov-2刺突糖蛋白有响应，而未缀合的np没有表现出结合相互作用(图8)。因此，grft修饰的np针对包膜病毒蛋白有活性，并且mab针对特定病毒赋予病毒选择性。
[0094]
实施例5——hiv假病毒的vrc01捕捉和用grft检测
[0095]
用10μg/ml的单克隆抗体vrco1包被96孔微量滴定板。将hiv假病毒q769.h5添加到未稀释的第1列中，在dulbecco改良eagle培养基(gibco10569-010)中在板间滴定2倍，然后在37℃下温育1小时。以10μg/ml添加生物素化-k-q-griffithsin，并使用链霉亲合素-hrp以1:15000进行检测。od值减去空白。使用graphpad prism中的对数(激动剂)与响应-可变斜率(四个参数)用于拟合曲线。这些实验的数据表明使用mab捕捉和grft检测以夹心格式捕捉假病毒的能力。参见图9。
[0096]
实施例6——实验的严谨性和稳健性
[0097]
所有的分析均是重复并且具有适当能力(powered)以允许通过合适的统计方法(例如，t检验、anova与bonferroni的事后检验等)进行数据分析。以p值《0.05确定显著性。
[0098]
实施例7——grft序列
[0099][0100]
实施例8——基于griffithsin的微生物检测
[0101]
见附录a
[0102]
应当理解，虽然本文已经结合多个不同方面描述了方法和物质组合物，但是前面对各个方面的描述旨在说明而不是限制方法和物质组合物的范围。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
[0103]
公开了可以用于、可以结合使用、可以用于制备的方法和组合物，或者是所公开的方法和组合物的产物。本文了公开这些和其他材料，并且理解公开了这些方法和组合物的组合、子集、相互作用、组等。也就是说，虽然可能未明确公开对这些组合物和方法的各种单独和集体组合和排列的具体提及，但在本文中具体考虑和描述了每一个。例如，如果公开和讨论了特定的物质组合物或特定方法，并且讨论了许多组合物或方法，则特别考虑组合物和方法的每一种组合和排列，除非有相反的特别指示。同样，这些的任何子集或组合也被具体考虑和公开。
[0104]
附录aa部分
[0105]
griffithsin(grft)是具有抗病毒活性的凝集素。它可以与糖基化病毒的包膜结合并抑制其活性。目前，它正在开发用于多种病毒的防治性和治疗性应用。
[0106]
griffithsin具有用于诊断平台的潜力。
[0107]
b部分
[0108]
早期准确诊断hiv对于预防传播和改善治疗至关重要。通过hiv病毒载量测试、cd4细胞计数和抗hiv抗体来诊断hiv。hiv检测的cdc算法是hiv1/2抗原/抗体免疫测定法、hiv1/2抗体分化免疫测定法和核酸检测(ref)。这些实验室化验需要专门的设备和训练有素的人员。现代快速护理点(poc)测试已开发并获得fda批准，但它们不如传统方法灵敏。直接检测hiv病毒是一种有前途的快速、实时和灵敏鉴定hiv感染(ref)的方法。根据世界卫生组织(who)，对付感染性疾病控制的poc测试，尤其是用于发展中国家的测试，应遵循“assured”标准：(1)可负担的，(2)灵敏性的，(3)特异性的，(4)用户友好的，(5)快速和稳健的，(6)无需设备和(7)可交付给最终用户(ref)。对符合诊断hiv感染的assured标准的poc技术存在巨大的医疗需求。
[0109]
grft是一种凝集素，它以纳摩尔亲和力结合hiv gp120包膜刺突蛋白上的甘露糖残基，并具有在皮摩尔浓度下中和hiv-1的能力[1,2]。grft针对包括hsv-2和hcv在内的性共同传播病毒具有广泛的中和活性[3,4]，并且细胞毒性最小[5-8]。一种grft变体，经工程化改造用于氧化抗性(m78q，q-grft)，已经历严格的临床前功效和安全性评估。路易斯维尔大学的研究人员，现在是grow biomedicine,llc的成员，最近指导q-grft进行了一项首次人体i期临床研究，作为niaid支持的prevent u19计划项目中基于灌肠的局部防治剂。
[0110]
我们的长期目标是开发一种基于q-grft的poc测试，该测试符合assured标准并能够早期诊断hiv感染。为了获得我们的长期目标，我们计划开发具有以下目标的免疫色谱测试：(i)确定最佳grft-比色酶缀合物，(ii)用各种抗hiv抗体阐明免疫色谱测试的特异性，以及(iii)测试免疫色谱测试的分析参数。我们假设酶缀合的q-grft将成为直接检测与单
克隆抗hiv抗体结合的hiv假病毒的平台。生成的初步数据显示。该数据为确定基于q-grft的免疫色谱测试对hiv感染进行简单、特异性、快速和灵敏测定的可行性提供了重要依据。提出了三个具体目标。
[0111]
目标1：与q-grft缀合的比色酶。基于初步数据，hrp可以与q-grft的独特赖氨酸变体缀合，并且该分子维持gp120结合活性。生物传感平台中发生的生物识别事件必须含有检测方式：光学、电气、机械等。光学检测以其在快速侧向流poc设备中使用的能力而闻名。工作假设是优化的hrp-q-grft将用作免疫色谱测试的生物传感组分。
[0112]
目标2：确定能够捕捉与hrp-q-grft结合的gp120的抗hiv抗体。免疫色谱测试的一个重要优势是抗原抗体相互作用提供的特异性。发现正确的抗体q-grft对提供了选择性系统。
[0113]
目标3：评估免疫色谱测试的分析参数。对assured标准的可行性将通过测量gp120结合的广度和灵敏性来确定。展示广泛的gp120结合和高度灵敏的系统为进一步开发提供了合理的依据。
[0114]
如果成功，这项研究将为hiv诊断提供新的诊断平台。预计q-grft将用于poc设备中，用于快速、简单且具有成本效益的早期感染检测。这些传感系统将解决对广泛可用的快速诊断病毒感染工具的迫切医疗需求。早期和准确的诊断将为治疗提供信息，从而改善患者的预后。此外，这项研究为利用开发的平台用于其他糖基化包膜病毒(诸如hcv和冠状病毒)以及多重分析开辟了新途径。
[0115]
c部分
[0116]
冠状病毒是重大的健康问题，自2003年以来出现三种不同的大流行威胁，sars、mers和sars-2。此外，至少有四种地方性冠状病毒，hku1、oc43、nl63和229e，其在发展为病毒性肺炎时增加死亡风险。目前所有的冠状病毒筛查均使用基于pcr的检测方法，这可能延迟患者护理和临床风险管理。我们提出开发一种筛查工具，以允许对冠状病毒进行即时诊断，并期望从当前的流行病中开发出能够在短期内将允许治疗冠状病毒的疗法。我们提出一种检测血液或口咽分泌物中的病毒颗粒的测定系统。将通过固定化的单克隆抗体赋予对病毒颗粒的选择性，并且将通过用与报告分子缀合的凝集素griffithsin包被病毒颗粒来完成检测。我们正在筛选提供最佳灵敏性和最小结合干扰的报告基因，并正在考虑荧光、纳米颗粒和比色报告基因。
[0117]
我们将griffithsin与针对比色底物(诸如辣根过氧化物酶)具有活性的酶缀合，并筛选与冠状病毒蛋白的结合亲和力。此外，将筛选抗体对病毒蛋白的选择性。一旦优化检测方法，学员将使用检测系统检测灭活的冠状病毒。
[0118]
我们将利用许多蛋白质表达、纯化和分析技术，包括蛋白质凝胶、fplc、hplc、elisa和表面等离子共振。我们将收集数据证明使用被提出平台检测冠状病毒颗粒的可行性，该平台应提供开发临床重点原型所需的证据。
[0119]
d部分
[0120]
冠状病毒是重大的健康问题，自2003年以来出现三种不同的大流行威胁，sars、mers和sars-2。此外，至少有四种地方性冠状病毒，hku1、oc43、nl63和229e，其在发展为病毒性肺炎时增加死亡风险。目前所有的冠状病毒筛查均使用基于实时聚合酶链反应(rt-pcr)的检测方法，这可能延迟患者护理和临床风险管理。冠状病毒的早期和准确诊断对于
预防传播和实现治疗至关重要。根据世界卫生组织(who)，对付传染病控制的定点照护(point ofcare，poc)测试，特别是用于发展中国家的测试，应以“assured”标准为目标，因为它们是：(1)可负担的，(2)灵敏性的，(3)特异性的，(4)用户友好的，(5)快速和稳健的，(6)无需设备和(7)可交付给最终用户。由于当前检测方法在可用性和快速性方面的缺陷，迫切需要符合assured标准的poc技术来诊断并潜在实现冠状病毒感染的及时治疗。此外，灵活且作用广泛的poc测定可能很容易适应未来出现的冠状病毒。
[0121]
在这里，我们提出开发一种基于纳米颗粒(np)的侧向流装置，以提供对血液或口咽分泌物中冠状病毒的poc诊断。将通过固定化的单克隆抗体赋予对患者分泌物中病毒颗粒的选择性，并通过将病毒颗粒与缀合至np报告分子的凝集素griffithsin(grft)结合来完成检测。以下任务将最终形成基于grft-np的侧向流测定法原型，以实现开发泛冠状病毒poc诊断的长期愿景：
[0122]
任务1.开发用grft进行表面修饰的聚合物纳米颗粒，作为侧流poc测定的基础。
[0123]
任务2.鉴定能够捕捉与grft纳米颗粒结合的刺突蛋白的抗冠状病毒抗体。
[0124]
任务3.开发一种基于grft纳米颗粒的夹心格式侧向流测定法，该测定法针对sars-cov-1和sars-cov-2的靶分析物进行了优化。
[0125]
初步数据：griffithsin活性和纳米颗粒缀合
[0126]
grft是一种凝集素，其结合病毒包膜上地方性病毒的防治性活性和中和亲和力2。我们使用表面等离子共振(spr)评估了grft对mers、sars-cov-1和sars-cov-2刺突蛋白的亲和力(图1)。grft对mers和sars-cov-2刺突蛋白具有最高的亲和力，但对包括sars-cov-1的所有冠状病毒刺突蛋白具
甲氧基聚乙二醇(mpeg)聚合物时的标记效率和活性。我们确定了三种变体，-k grft m78k、-k grft nk和-k grft ck(统称为-kgrft)，它们在缀合至大聚合物时维持活性，并选择这些用于后续的np修饰。作为概念验证，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)np与-k grft m78k缀合，并且初步结果表明grft修饰的np具有与sars-cov-2刺突蛋白结合的能力。当通过spr进行评估时，grft-np对固定化sars-cov-2刺突糖蛋白有响应，而未缀合的np没有表现出结合相互作用(图2)。
[0127]
在其他工作中，我们已经展示了将grft掺入各种递送媒介物制剂以满足不同环境和时间递送需求的能力。我们制造了ph响应的mpeg-聚乳酸-羟基乙酸共聚物:丙烯酸丁酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物(mpeg-plga：pba-co-paa)纤维，它们在暴露于不同的环境ph时释放grft。在其他工作中，我们配制grft plga和mpeg-plga np3，它们展示了高grft加载效率(例如，70％或70μg grft/mg np)。随后在体外针对hiv-1感染评估了负载最高的mpeg-plga np，并显示出与游离grft相似的抑制(图3)。在这些制剂的基础上，我们最近将grft np整合到单层疏水(plga或聚己内酯(pcl))和多层pcl-聚环氧乙烷(peo)-pcl纤维中。纳米颗粒-纤维复合材料表现出长达90天的延长grft释放和针对hsv-2感染的体内功效3。
[0128]
这些数据共同突出了我们我们假设grft-np可以用作结合冠状病毒和灵敏检测病毒的平台。据我们所知，这是第一项
探索grft和grft-np作为新的冠状病毒快速筛查策略的潜力的研究，我们最初的概念验证将侧重于区分sars-cov-1和sars-cov-2，长期目标是开发泛冠状病毒poc设备。
[0129]
任务和可递送物
[0130]
任务1.开发用grft进行表面修饰的聚合物纳米颗粒，作为侧向流测定的基础。在这里，我们寻求利用我们在grft递送方面的专业知识，探索基于纳米颗粒的-kgrft递送平台，该平台可以有力地检测和放大冠状病毒刺突蛋白结合。我们将首先合成具有不同浓度-kgrft的np，以确定在np表面上饱和并获得-kgrft的功能性密度所需的-kgrft的输入浓度。将使用互补方法确定np表面上grft的浓度，该互补方法包括-kgrft的elisa定量；荧光光谱；spr；和尺寸排阻色谱hplc。对于-kgrft-np-冠状病毒刺突结合亲和力研究，将评估低、中和高密度(化合价)np制剂与一系列冠状病毒浓度结合的能力。
[0131]
可递送物：鉴定相对于未缀合的np提供最高水平sars-cov-1和/或sars-cov-2结合和检测的制剂。
[0132]
任务2.鉴定能够捕捉与kgrft纳米颗粒结合的刺突蛋白的抗冠状病毒抗体。免疫色谱测试的一个重要优势是抗原-抗体相互作用提供的特异性。可用的单克隆冠状病毒抗体将使用elisa和/或spr格式进行筛选，以确定使该平台的选择性最大化的抗体。选定的抗体随后将用于包被微量滴定板或在金芯片上固定化。将以不同浓度添加sars-cov-1和sars-cov-2刺突蛋白，并用-kgrft-np进行检测。
[0133]
可递送物：选择至少一种抗体来捕捉sars-cov-1和sars-cov-2刺突蛋白。将基于交叉反应性、高亲和力结合和不干扰-kgrft-np结合来选择抗体。
[0134]
任务3：开发一种基于-kgrft纳米颗粒的夹心格式侧向流测定法，该测定法针对sars-cov-2的靶分析物进行了优化。游离-kgrft和kgrft-np将被整合到基于纤维素的侧向流测定的设计中，该测定结合了已鉴定的能够捕捉sars-cov-2刺突蛋白的抗体。我们将与专门从事用于快速诊断应用的侧向流测定法的设计和原型设计的分包商合作。简而言之，将优化物理参数，包括条几何形状、纸孔隙度和作为np尺寸和样本类型/等分试样的函数的侧向流体积和速率。此外，将优化抗体固定化方法、np稳定性、抗体交叉反应性和抗体/np浓度，以最大限度地提高灵敏性(在存在时检测cov-2)，同时维持特异性(避免假阳性)。在y1期间，我们将使用游离-kgrft、固定化抗体候选物和初步的np制剂来鉴定测试的基线。在y2中，将制作该设备的原型用于抗体与游离cov-2结合、-kgrft-np与cov-2结合以及cov-2-kgrft-np-ab结合以进行检测。
[0135]
可递送物：用于检测sars-cov-2的原型grft-np侧向流装置。
[0136]
新颖性和影响
[0137]
这项研究将为冠状病毒诊断提供新的诊断平台。预计-kgrft将用于poc设备中，用于快速、简单且具有成本效益的为治疗提供信息的早期感染检测，从而改善患者预后。此外，这项工作是开发poc技术以在临床环境中多路复用各种病毒的第一步，并且可以通过利用不同的捕捉抗体轻松调整以靶向新兴的新型冠状病毒。