hnRNPA1在胰腺癌诊断、预后、治疗中的应用的制作方法

hnrnpa1在胰腺癌诊断、预后、治疗中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种hnrnpa1在胰腺癌诊断、预后、治疗中的应用。


背景技术：

2.胰腺癌是实体肿瘤中恶性程度最高的肿瘤之一，具有发病隐匿、手术切除率低、局部侵袭性强、早期容易发生转移、术后易复发、总体预后极差等特点。近年来，随着居民饮食结构和生活方式的改变以及临床检出率的提高，胰腺癌发病率逐年升高，严重威胁居民的生命健康。据估计，2020年全球胰腺癌新增患者数达42万例，死亡患者数达41万例。胰腺癌具有很强的侵袭、转移和复发特性，其中淋巴转移是影响胰腺癌患者预后的最重要因素之一。研究表明，胰腺癌根治性手术患者中发生淋巴结转移的患者比例高达70%，且淋巴结转移阳性患者的术后5年生存率仅为12.5%。因此，探索胰腺癌淋巴转移的生物标志物和治疗靶点成为亟待解决的临床问题。目前，越来越多的基础研究成果让我们对胰腺癌淋巴转移的分子机制有了深入的了解，但是在胰腺癌淋巴转移患者的诊断及治疗方面仍缺乏高效的生物标志物及临床治疗靶点。
3.外泌体是多种细胞分泌的一种30~150nm的由磷脂双层膜包裹的微囊体，其组成主要包括脂质体、蛋白质、dna及mirna等。研究表明，外泌体通过携带生物活性物质参与了机体许多重要的生理及病理过程, 尤其是在肿瘤的侵袭及转移方面。外泌体在胰腺癌肿瘤微环境中通过诱导上皮间质转化使肿瘤细胞获得高侵袭性并通过调控淋巴管生成促进肿瘤淋巴转移，外泌体还参与诱导有利于转移瘤生长的转移前微环境，并通过生物活性分子抑制机体的抗肿瘤免疫反应进而影响胰腺癌的淋巴转移。因此，阻断或抑制肿瘤源性外泌体的生成有望成为胰腺癌淋巴转移治疗的潜在靶点。此外，由于外泌体广泛存在于多种体液样本中, 易于获取，外泌体检测可能成为一种真正的无创诊断方法, 因此在肿瘤诊断方面亦具有很大的应用潜力。
4.核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein， hnrnp）家族是一组核内rna结合蛋白，它们在许多方面参与肿瘤的发生、发展，其中hnrnpa1的研究最为广泛。目前认为，hnrnpa1主要通过表观遗传调控基因转录、参与前体mrna合成等方式在肿瘤的转移中扮演关键角色。研究表明，肿瘤细胞可通过外泌体靶向转运hnrnpa1至肿瘤微环境中的间质细胞，进而调控其表型改变，促进肿瘤的侵袭转移。因此，肿瘤细胞源性外泌体hnrnpa1有望成为肿瘤早期诊断及治疗的新型标志物及潜在靶点，探索其在胰腺癌淋巴转移患者中的诊断效能及靶向治疗效果具有重要的临床意义，从而有利于改善胰腺癌患者的预后。


技术实现要素：

5.本发明提供一种hnrnpa1在胰腺癌诊断、预后、治疗中的应用，可作为胰腺癌诊断和预后的分子标志物以及胰腺癌治疗的新靶点。
6.本发明解决其技术问题采用以下技术方案：hnrnpa1作为分子标志物在制备用于诊断胰腺癌、预测胰腺癌患者预后产品中的应用。
7.本发明还提供了一种检测hnrnpa1表达量的试剂，用于诊断胰腺癌或预测胰腺癌患者预后。
8.作为一种方案，所述试剂包括hnrnpa1抗体。
9.作为一种方案，所述hnrnpa1高表达的受试者患有胰腺癌，所述hnrnpa1低表达的受试者为正常人。
10.作为一种方案，所述hnrnpa1高表达的受试者预后相对较差，所述hnrnpa1低表达的受试者预后相对较好。
11.作为一种方案，所述hnrnpa1高表达的受试者比hnrnpa1低表达的受试者具有更短的总生存期。
12.作为一种方案，所述hnrnpa1高表达的受试者比hnrnpa1低表达的受试者具有更短的无病生存期。
13.本发明还提供一种试剂盒，包括：hnrnpa1表达量检测系统，所述用于hnrnpa1表达量检测系统包括检测hnrnpa1表达量的试剂；标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于胰腺癌诊断和/或预后效果检测。
14.所述检测hnrnpa1表达量的试剂包括hnrnpa1抗体。
15.所述试剂盒还包括ca19-9检测系统，所述ca19-9检测系统包括用于检测血清中ca19-9含量的试剂。
16.本发明还提供了一种治疗胰腺癌的药物，所述药物包含抑制hnrnpa1表达的抑制剂和药物学可接受的载体。
17.本发明的有益效果：（1）本发明发现 hnrnpa1在胰腺癌患者血液外泌体中高表达，所述hnrnpa1高表达的受试者比hnrnpa1低表达的受试者具有更短的总生存期，所述hnrnpa1高表达的受试者比hnrnpa1低表达的受试者具有更短的无病生存率；（2）通过实验发现，hnrnpa1能显著促进胰腺癌的淋巴管新生及淋巴转移，且研究了其机制，可作为胰腺癌诊断和预后的分子标志物以及胰腺癌治疗的新靶点。
附图说明
18.图1为外泌体扫描电镜图；图2为qrt-pcr检测胰腺癌细胞中外泌体hnrnpa1表达图；图3为蛋白质电泳检测胰腺癌细胞中外泌体hnrnpa1表达图；图4为血清外泌体hnrnpa1表达量与患者无病生存率的关系图；图5为血清外泌体hnrnpa1表达量与患者总生存率的关系图；图6为血清外泌体hnrnpa1对胰腺癌诊断效能图；图7为ca19-9与外泌体hnrnpa1联合应用对胰腺癌的诊断效能图；图8为血清外泌体hnrnpa1对胰腺癌是否发生淋巴结转移效能图；
图9为是显微镜下拍摄的淋巴管内皮细胞成管和transwell的代表图，图10为统计学分析在不同组别的transwell实验中淋巴管内皮细胞穿过去细胞数的差异图；图11为不同处理组别中裸鼠活体成像图；图12为不同组别间裸鼠腘窝淋巴结活体成像荧光值的统计分析图；图13为间裸鼠腘窝淋巴结活体成像的荧光值的统计分析图；图14为统计学表格分析不同组别间发生腘窝淋巴结转移的裸鼠的数量图；图15为共聚焦显微镜观察荧光标记的外泌体被淋巴管内皮细胞的摄取情况图；图16为蛋白质电泳检测图；
具体实施方式
19.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例1hnrnpa1在胰腺癌患者血清外泌体中高表达发明人首先，收集5个胰腺癌患者和5个正常健康志愿者的血清样本，通过超速离心法（2000g x 20 min离心后将上清转移到新的离心管，然后10000g x 40 min离心后将上清转移到新的离心管，然后120000g x 70 min离心，最后弃去上清，并用pbs重悬管底的外泌体）提取并纯化血清中的外泌体，随后通过蛋白组学分析筛选出在胰腺癌患者血清外泌体中高表达的蛋白hnrnpa1。
21.发明人扩大临床样本，收集186例胰腺癌患者血清和186例健康志愿者的血清标本，并提取其中的血清外泌体后，通过扫描电镜、nta粒径分析和蛋白质电泳分析鉴定所提取的囊泡是外泌体（图1：扫描电镜图）；通过qrt-pcr检测hnrnpa1的表达情况，发现胰腺癌患者血清外泌体hnrnpa1的表达水平显著高于正常健康志愿者中的表达水平。
22.进一步通过收集胰腺癌细胞capan-2、aspc-1、panc-1和正常胰腺细胞（hpde）的培养上清液并提取其中的外泌体总rna和总蛋白质，通过qrt-pcr及蛋白质电泳检测hnrnpa1的表达情况，发现胰腺癌细胞中外泌体hnrnpa1的表达情况显著高于正常胰腺细胞（图2、图3）。
23.上述结果表明，血清外泌体hnrnpa1可作为区分胰腺癌患者和正常人的分子标记物。
24.实施例2外泌体hnrnpa1表达量与胰腺癌患者无病生存期和总生存期的关系：收集所有胰腺癌患者的临床信息，并结合上述qrt-pcr的检测结果进行统计学分析，发现淋巴结转移的胰腺患者的血清外泌体hnrnpa1的表达显著高于未发生淋巴转移的患者。且血清外泌体hnrnpa1高表达的患者无病生存期和总生存期更短（图4，分析方法：kaplan
–
meier生存曲线分析，外泌体hnrnpa1表达在中位数以上定义为外泌体hnrnpa1高表达，以下定义为外泌体hnrnpa1低表达）。
25.上述结果表明，所述外泌体hnrnpa1高表达的受试者比外泌体hnrnpa1低表达的受试者具有更短的总生存期；所述外泌体hnrnpa1高表达的受试者比外泌体hnrnpa1低表达的受试者具有更短的无病生存期，且外泌体hnrnpa1能够促进胰腺患者淋巴结转移。
26.外泌体hnrnpa1的表达量可作为诊断胰腺癌、判断胰腺癌进展和预后的分子标志物。
27.实施例3外泌体hnrnpa1对于胰腺癌的诊断效能：通过检测血清外泌体hnrnpa1中的表达，结合受试者工作特征(roc)分析，发现：血清外泌体hnrnpa1对胰腺癌具有良好的诊断效能，曲线下面积(auc)为0.85(95%可信区间：0.81-0.89)，显著高于cea(auc：0.77；95%ci：0.72-0.82)或ca72-4(auc：0.68；95%ci：0.63-0.73)，与ca19-9(auc：0.90；95%可信区间：0.87-0.94)基本相同，见图5。
28.ca19-9与外泌体hnrnpa1联合应用对胰腺癌的诊断效能与单独应用ca19-9更好，联合使用的auc为0.9419 (95%ci：0.92-0.96)，单独应用ca19-9的auc为0.90 (95%ci：0.87-0.94)，见图6。
29.实施例4外泌体hnrnpa1能显著促进胰腺癌的淋巴管新生及淋巴转移：通过转染hnrnpa1过表达质粒上调胰腺癌细胞系中hnrnpa1的表达，并收集其细胞培养上清；通过超速离心法提取其上清中的外泌体，并通过bca法对提取的外泌体浓度进行测定。将淋巴管内皮细胞种到六孔板种，每孔1
×
105个细胞；随后将提取的外泌体按每孔20ug的量加入提取的外泌体进行诱导，分别为pbs、ev
vector
、ev
hnrnpa1
三组。将细胞放置于培养箱中培养24h后，将六孔板取出，用胰酶将细胞消化后离心，弃去培养基。
30.对于成管实验，用正常的含5%血清的完全培养基重悬细胞，并计数。取2
×
105个细胞/孔，轻柔加入到提前铺好基质胶的24孔板中，轻柔晃匀，铺平细胞。放置于细胞培养箱中培养，每隔2h观察细胞的成管情况，待细胞成管后在倒置显微镜下拍照，并用image j软件测量成管长度，通过统计学分析，对比不同外泌体诱导组别之间成管情况的差异，发现与对照组相比，过表达外泌体hnrnpa1后，胰腺癌细胞外泌体诱导淋巴管细胞成管能力显著增强。其中24孔板铺胶的实验流程如下：提前预冷24孔板和离心管等，按基质胶：无血清培养基=1：2的比例配制并混匀，按每孔700ul加入稀释混匀好的基质胶至24孔板中，晃动并铺平，然后将24孔板放置于培养箱中，待基质胶凝固即可使用。
31.对于transwell实验，将诱导后消化离心好的细胞用新鲜的无血清的培养基重悬细胞并计数，取5
×
104个细胞并用无血清的培养基稀释至总体积300ul，然后将细胞悬液加入到transwell小室的上室中，下室则加入700ul含5%血清的培养基，将整个体系放置于培养箱中培养8h后，将小室取出，用4%的多聚甲醛固定细胞15min，然后用pbs轻柔洗三遍，然后再用结晶紫染液染细胞15min，用pbs洗去多余的结晶紫染液。用棉签轻柔拭去小室内面的细胞，然后在显微镜下观察拍照，取随机的视野用image j进行计数，统计学分析不同外泌体诱导组别间细胞迁移能力的差异。结果发现与对照组相比，过表达外泌体hnrnpa1后，胰腺癌细胞外泌体诱导淋巴管细胞的迁移能力明显增强。
32.体外的成管实验和transwell实验（表明外泌体hnrnpa1促进淋巴管内皮细胞的成管和迁移能力，其中图7是显微镜下拍摄的淋巴管内皮细胞成管和transwell的代表图，图8
是统计学分析在不同组别中淋巴管内皮细胞成管宽度的差异，三个点代表实验重复三次，统计学方法是one-way anova followed by dunnett’s tests；图9是统计学分析在不同组别中淋巴管内皮细胞transwell穿透细胞数的差异，三个点代表实验重复三次，统计学方法是one-way anova followed by dunnett’s tests；其中两个**代表组别间比较统计学分析p值小于0.01。
33.体内实验证实外泌体hnrnpa1能显著促进胰腺癌的淋巴转移（构建带有gfp荧光标记的panc-1胰腺癌细胞系；构建hnrnpa1稳定过表达的panc-1胰腺癌细胞系，收集其培养上清，超速离心法提取上清中的外泌体，并用bca法检测外泌体的浓度，将外泌体保存于-80度冰箱中备用；购买4-5周龄的健康雌性裸鼠24只，随机分成两组，每组12只，在其右足垫处注射提取的外泌体，一组注射ev
vector
、一组注射ev
hnrnpa1
，每次注射20ug，每3天一次；同时注射gfp标记的panc-1细胞5x105个/只，以构建肿瘤足垫腘窝淋巴结转移模型。然后每周行一次活体成像观察裸鼠足垫腘窝淋巴结的转移情况，直至裸鼠足垫肿瘤体积大于200mm3或裸鼠死亡。分离裸鼠腘窝淋巴结，测量其体积，记录并分析不同外泌体诱导组别间裸鼠腘窝淋巴结转移率的差异（转移结果以病理结果为准）。结果发现过表达hnrnpa1的胰腺癌细胞外泌体能显著促进胰腺癌的淋巴转移，其中图10：是不同组别间裸鼠腘窝淋巴结活体成像的荧光值的统计分析图，统计方法是two-tailed student’s t test；图11：统计学表格分析不同组别间发生腘窝淋巴结转移的裸鼠的数量，并用卡方检验进行差异显著性分析，其中一个*代表统计学p值小于0.05。
34.机制部分：外泌体hnrnpa1能被淋巴管内皮细胞(hlecs)所摄取并上调prox1的表达：将胰腺癌细胞panc-1和aspc-1细胞培养上清的外泌体提取后用pkh67荧光染料标记后与hlecs共培养后，通过共聚焦显微镜观察荧光标记的外泌体被hlecs的摄取情况（图12）；通过过表达胰腺癌细胞aspc-1中的hnrnpa1并提取其细胞上清中的外泌体后，与hlecs共培养2天后，通过提取hlecs中的总rna和总蛋白，并分别通过qrt-pcr和蛋白质电泳检测发现，过表达hnrnpa1的aspc-1细胞外泌体显著促进hlecs 中prox1的表达（图13）。
35.以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。