一种昌都锦鸡儿中甘草素的HPLC检测方法

一种昌都锦鸡儿中甘草素的hplc检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种昌都锦鸡儿中甘草素的hplc检测方法。


背景技术：

2.藏锦鸡儿(lignum caraganae)，又名“佐摸兴”，是青藏高原地区出产的多种豆科(leguminosae)锦鸡儿属植物的红色木部心材，是一种重要的破血化瘀藏药。鬼箭锦鸡儿(caraganajubata(pall.)poir.)和昌都锦鸡儿(c.changduensis liou f.)是藏锦鸡儿的两种主要基原植物。藏锦鸡儿具有活血化瘀的功效，常用于治疗高血压、多血症、月经不调等疾病。现代药物化学研究表明，藏锦鸡儿的主要化学成分是以异黄酮类和紫檀素类为代表的黄酮类化合物。目前，有关藏锦鸡儿定性定量及质量评估的研究报道较少，主要集中于鬼箭锦鸡儿中黄酮类成分的研究。
3.魏永生等，hplc测定藏药鬼箭锦鸡儿中黄酮类化合物的含量[j],中国药学杂志，2015，40(1)中公开了鬼箭锦鸡儿中黄酮类化合物含量测定方法，但研究报道鬼箭锦鸡儿和昌都锦鸡儿的hplc指纹图谱相差较大，两者中物质成分并不相同，通过其公开的方法无法检测出昌都锦鸡儿中重要组成成分甘草素。


技术实现要素：

[0004]
为解决上述问题，本发明提供了一种昌都锦鸡儿中甘草素的hplc检测方法，它包括如下步骤：
[0005]
1)对照品溶液制备：取甘草素对照品，加甲醇溶解，即得对照品溶液；
[0006]
2)供试品溶液制备：取待检样品，加甲醇提取，提取液过滤，取滤液作为供试品溶液；
[0007]
3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪；色谱条件如下：
[0008]
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：体积比68：32的0.1％甲酸水和甲醇。
[0009]
进一步地，步骤1)所述对照品与甲醇溶液的质量体积比为20～100μg：1ml。
[0010]
进一步地，步骤2)所述待检样品和甲醇的体积比为1ml：50～150ml。
[0011]
进一步地，步骤2)所述提取为超声提取，时间60min。
[0012]
进一步地，步骤3)所述色谱条件中色谱柱：kromasil c18柱，4.6mm
×
250mm，5μm，柱温20～40℃，进样量10～50μl，流速为0.8～1.2ml/min，检测波长：230或278nm。
[0013]
更进一步地，所述柱温40℃，进样量10μl，流速为1ml/min，检测波长：278nm。
[0014]
进一步地，所待检样品中甘草素的含量按外标法以峰面积计算。
[0015]
进一步地，所待检样品为昌都锦鸡儿的粉末。
[0016]
本发明昌都锦鸡儿中甘草素的hplc检测方法，通过特定的样品前处理方法和色谱条件，实现了昌都锦鸡儿中重要组成成分甘草素的完全分离，最终建立了昌都锦鸡儿中甘草素的含量测定方法，其能够满足准确、灵敏、简便、快速的测定原则，完善了昌都锦鸡儿的
质量控制方法。
[0017]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0018]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0019]
图1不同料液比的昌都锦鸡儿hplc图(
①
料液比1:20
②
料液比1:40
③
料液比1:50
④
料液比1:100)
[0020]
图2甘草素全波长扫描图
[0021]
图3不同比例0.1％甲酸水溶液(a)-甲醇(b)的hplc图(
①
0.1％甲酸水溶液(a)-32％甲醇(b)
②
0.1％甲酸水溶液(a)-35％甲醇(b)
③
0.1％甲酸水溶液(a)-38％甲醇(b))
[0022]
图4不同流速的昌都锦鸡儿hplc图(
①
0.8ml/min流速
②
1ml/min流速
③
1.2ml/min流速)
[0023]
图5不同柱温的昌都锦鸡儿hplc图(
①
20℃柱温
②
30℃柱温
③
40℃柱温)
[0024]
图6对照品、昌都锦鸡儿样品及阴性对照的高效液相色谱图
[0025]
图7甘草素标准曲线
具体实施方式
[0026]
本发明具体实施方式中使用的试剂、试药、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0027]
实施例1本发明昌都锦鸡儿中甘草素的检测
[0028]
1)对照品溶液的制备
[0029]
取甘草素对照品，精密称定，加甲醇配置成每1ml含51μg的溶液，取溶液再用甲醇稀释配制成系列浓度的对照品溶液；
[0030]
2)供试品溶液的制备
[0031]
取昌都锦鸡儿粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声提取60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过0.45μl微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液；
[0032]
3)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱条件如下：
[0033]
色谱柱：kromasil c18柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相为0.1％甲酸水溶液(a)-甲醇(b)＝68：32；柱温：40℃；检测波长：278nm；流速：1ml
·
min-1
。
[0034]
4)以对照品溶液中甘草素的质量浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，分别绘制标准曲线，根据标准曲线计算昌都锦鸡儿中甘草素的含量。
[0035]
以下通过实验例来说明本发明的有益效果：
[0036]
试验例1
[0037]
1.实验仪器与材料
[0038]
1.1仪器
[0039]
主要实验仪器见表1
[0040]
表1主要实验仪器
[0041][0042]
1.2试剂
[0043]
主要实验试剂见表2。
[0044]
表2主要实验试剂
[0045][0046]
1.3样品
[0047]
本次实验共收集了25批药材，编号从1到25。所有药品样品经成都中医药大学蒋桂华教授鉴定为豆科锦鸡儿属植物昌都锦鸡儿(caragana changduensis y.x.liou)的红色木部心材，并经四川省中医科学院周毅教授对原植物进行复核。昌都锦鸡儿样品收集信息见表3。
[0048]
表3样品采集信息表
[0049][0050][0051]
2.供试品溶液制备方法的考察
[0052]
现已知的文献里面，锦鸡儿属的藏药材最主要含有的化学成分是黄酮类，甘草素也属于黄酮类化合物。参考相关文献并无昌都锦鸡中儿甘草素的分离检测方法，故对藏药昌都锦鸡儿甘草素含量测定供试品的提取溶剂、提取方法、料液比进行考察，构建昌都锦鸡儿甘草素hplc检测方法。
[0053]
2.1提取溶剂考察
[0054]
本次提取溶剂考察包括了50％甲醇、乙醇、50％乙醇、甲醇。分别取昌都锦鸡儿粉末1g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇、乙醇、50％乙醇、甲醇，密塞，
称定重量，40℃超声(功率100w，频率45khz)处理60min，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过微孔滤膜，即得。照“3.5”项下色谱条件进行含量测定，结果见表4。
[0055]
表4提取溶剂考察结果
[0056][0057]
由表可知，甲醇提取的甘草素含量最高，故选甲醇为提取溶剂。
[0058]
2.2提取方法考察
[0059]
本次实验考察了超声30min、60min、90min、回流30min、60min五种不同的提取方法和提取时间。取昌都锦鸡儿粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，分别超声(功率100w，频率45khz)处理30min、60min、90min，回流30min、60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。照“3.5”项下色谱条件进行含量测定，结果见表5。
[0060]
表5提取方法考察结果
[0061][0062]
由表可知，超声、回流提取60min甘草素的提取效果接近。随着超声提取时间延长，提取效果甘草素少量增加。故选择超声提取60min。
[0063]
2.3料液比考察
[0064]
本次实验考察了昌都锦鸡儿样品粉末与甲醇提取溶剂的比为1:20、1:40、1:50、1:100四种不同的料液比。取昌都锦鸡儿粉末0.5g四份，精密称定，分别置于50ml具塞锥形瓶中，标记为1、2、3、4号，1号精密加入10ml甲醇，2号精密加入20ml甲醇，3号精密加入25ml甲醇，4号精密加入50ml甲醇，密塞，称定重量，40℃超声(功率100w，频率45khz)处理60min，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过微孔滤膜，即得。按照“3.5”项下色谱条件进行含量测定，结果见表6，图1。
[0065]
表6料液比考察结果
[0066][0067]
由图表可知，后两种料液比的的含量较高，考虑材料成本，选择1:50为最佳料液比。
[0068]
2.4供试品溶液制备方法的确定
[0069]
根据上述3种因素的考察结果，确定了供试品的制备方法为：取昌都锦鸡儿粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声提取60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，既得。
[0070]
3.色谱条件的考察
[0071]
目前尚未见到对昌都锦鸡儿中甘草素含量测定的报道，故对昌都锦鸡儿甘草素含量测定的检测波长、流动相、流速、柱温进行了筛选考察。
[0072]
3.1检测波长的选择
[0073]
取甘草素对照品10.61mg，精密称定，加甲醇溶解，转移到25ml容量瓶中，加甲醇定容，制成每1ml甲醇含51μg甘草素的溶液。
[0074]
选用kromasil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱，在相同流动相，流速、柱温条件下进行了检测波长的考察，设置检测器在190～400nm波长下进行全波长扫描。结果如图2所示。
[0075]
结果表明，甘草素对照品在230nm、278nm处有最大吸收峰，这与相关文献报道的甘草素的吸收峰符合，故选择检测波长为278nm。
[0076]
3.2流动相的选择
[0077]
选用kromasil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱，在相同流速、柱温、检测波长条件下，本次实验分别考察了多种流动相及不同比例：
①
0.1％甲酸水溶液(a)-乙腈(b)(18％b，20％b，22％b，23％b，24％b，25％b)；
②
0.1％甲酸水溶液(a)-甲醇(b)(22％b，25％b，30％b，32％b，35％b，38％b)；
③
水(a)-32％甲醇(b)。在不同流动相系统下，检测同一批样品。部分结果如图3。
[0078]
结果表明，以流动相0.1％甲酸水溶液(a)-甲醇(b)＝68：32的效果最好，基线平稳，色谱图中的各个吸收峰分离度较好，保留时间合适，故选择体积比68：32的0.1％甲酸水溶液(a)-甲醇(b)作为含量测定的流动相。
[0079]
3.3流速的选择
[0080]
选用kromasil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱，在相同流动相、柱温、检测波长条件下，本次分别考察了3种流速：
①
0.8ml/min、
②
1.0ml/min、
③
1.2ml/min。在不同流速下，检测同一批样品。结果如图4所示。
[0081]
结果表明，3种流速的基线平稳，各峰分离度好，考虑流速1ml/min时柱压较为理想，且保留时间较为合适。故以1ml/min为最佳流速。
[0082]
3.4柱温的选择
[0083]
根据文献，选用kromasil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱，在相同流速、柱温、检测波长条件下，本次分别考察了3种柱温：
①
20℃、
②
30℃、
③
40℃，在不同柱温下，检测同一批样品。结果如图5所示。
[0084]
结果表明，在20℃的条件下，70min内没有出峰，在40℃下，甘草素与相邻峰分离度好，且时间较快，故以40℃为最佳柱温。
[0085]
3.5色谱条件的确定
[0086]
通过对上述4种条件的考察，确定了昌都锦鸡儿以甘草素作为指标进行含量测定的色谱条件。如下：色谱柱：kromasil c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(a)-32％甲醇(b)；检测波长：278nm；流速：1ml/min；柱温：40℃；进样量：10μl。
[0087]
4.方法学考察
[0088]
方法学考察主要是对建立的分析方法进行一个评估，包括了系统适用性实验、线性关系考察、精密度、稳定性、重复性、加样回收率、耐用性等。本实验对上述项目进行考察，对建立的昌都锦鸡儿甘草素含量测定方法进行评估。
[0089]
4.1系统适用性试验
[0090]
取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液(甲醇)，分别照“2.5”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图6。甘草素与相邻峰之间的分离度＞1.5，理论塔板数按甘草素计不低于3000，阴性对照表明无干扰。
[0091]
4.2线性关系考察
[0092]
对照品溶液的制备取甘草对照品10.61mg，精密称定，用甲醇先稀释50倍，再稀释4倍，分别制成浓度为212.2μg
·
ml-1
、53.05μg
·
ml-1
的贮备液
①
、贮备液
②
。精密量取贮备液
②
0.5ml、1ml、2ml、5ml，贮备液
①
3.75、5ml，分别置于10ml容量瓶中，加甲醇溶液定容至刻度，得到系列浓度的对照品溶液。照“2.5”项下色谱条件进样测定，以质量浓度(μg
·
ml-1
)为横坐标(x)，峰面积(mau*min)为纵坐标(y)进行线性回归，结果见表6，图7。
[0093]
4.3精密度试验
[0094]
取“3.4.2”项下对照品溶液5，照“2.5”项下色谱条件连续测定6次，记录峰面积，见表7。结果甘草素峰面积的rsd值＜3.00％，表明仪器精密度良好。
[0095]
4.4稳定性试验
[0096]
取供试品溶液，照“2.5”项下色谱条件分别于不同时间0、4、8、12、16、24h进样测定，记录峰面积，见表10。结果表明甘草素峰面积的rsd值＜3.00％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
[0097]
4.5重复性试验
[0098]
取同一批昌都锦鸡儿样品6份，照“3.3”项下制备供试品溶液，照“2.5”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算甘草素含量，见表10。结果表明甘草素含量rsd值均＜3.00％，表明该方法重复性良好。
[0099]
表10重复性试验结果
[0100][0101][0102]
4.6加样回收率试验
[0103]
取同一批昌都锦鸡儿样品0.5g，平行6份，精密称定，去分别加入对照品储备液
①
5ml，照“3.3”项下制备供试品溶液，照“2.5”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算甘草素的回收率，见表12。结果表明甘草素的加样回收率均在95％～110％，说明该方法准确度良好。
[0104]
表11加样回收率试验结果
[0105][0106]
4.7耐用性考察
[0107]
取同一批昌都锦鸡儿样品，照“3.3”项下制备供试品溶液，照“2.5”项下色谱条件，使用仪器
①
分别考察3种不同型号色谱柱{
①
welchultimatelp-c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)、
②
watersxterrarrp18(250mm
×
4.6mm，5μm)、
③
kromasilc
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)}；使用色谱柱
③
考察3种不同型号高效液相色谱仪{
①
agilent1290高效液相色谱仪(安捷伦公司)；
②
pe-a10高效液相色谱仪(珀金埃尔默公司)；
③
agilent1100高效液相色谱仪(安捷伦公司)}对甘草素含量测定的影响。结果见表13，不同色谱柱、不同仪器检测甘草素含量的rsd值均＜3.00％，表明耐用性良好。
[0108]
表12耐用性考察结果(不同色谱柱)
[0109][0110][0111]
5.样品含量测定
[0112]
5.1水分测定
[0113]
参照《中华人民共和国药典》中对于烘干法的操作规定，取供试品2-5g，精密称定，在100-105℃干燥5小时，移至干燥器，放冷30min，精密称定，再在上述温度中干燥1h，放冷，称重，直到连续两次称重的差异不超过5mg为止。计算含水量，见表13。
[0114]
5.2样品含量测定
[0115]
取昌都锦鸡儿样品，照“3.4”项下制备供试品溶液，照“2.5”项下色谱条件进样测定，记录甘草素的色谱峰峰面积并计算含量，见表13。
[0116]
表13样品含量和水分测定结果
[0117][0118]
6.结论与讨论
[0119]
含量测定是中药材质量标准中重要的组成部分。在参考文献的基础上，本发明对昌都锦鸡儿含量测定方法进行了系统的考察构建，确定了hplc色谱条件和供试品溶液的配置方法，最终建立了昌都锦鸡儿的含量测定方法。能够满足准确、灵敏、简便、快速的测定原则。
[0120]
色谱条件：使用kromasil c18(4.6mm
×
250mm，5μm)柱；通过体积比68：32的0.1％甲酸水溶液(a)-甲醇(b)组成的流动相进行等度洗脱，检测波长278nm，流速为1ml/min，40℃柱温。
[0121]
对照品溶液的配置：取甘草素对照品适量，精密称定，加甲醇溶液配置成每1ml含51μg的溶液，即得
[0122]
供试品溶液的配置：取昌都锦鸡儿粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声提取60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过0.45μl微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。
[0123]
测定方法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱，测定，即得。
[0124]
方法学考察中考察了系统适用性、线性关系、精密度、稳定性、重复性、加样回收率、耐用性。标准曲线显示出良好的线性关系，精密度、稳定性、重复性的相对偏差都小于3％，加样回收率均在95～110％，准确度好。结果都在可靠范围内，说明本次实验得到的昌都锦鸡儿的含量测定方法可行。
[0125]
综上，本发明通过特定的样品前处理方法和色谱条件，实现了昌都锦鸡儿中重要组成成分甘草素的完全分离，最终建立了昌都锦鸡儿中甘草素的含量测定方法，其能够满足准确、灵敏、简便、快速的测定原则，完善了昌都锦鸡儿的质量控制方法。