改善鸡肉品质的复合活性微生物制剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及活性微生物饲料添加剂领域，具体涉及一种改善鸡肉品质的复合活性微生物制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着人口的增长，对禽肉的需求量不断增加，促进了集约化肉鸡生产。但集约化肉鸡养殖中，过度追求生长速度造成了鸡肉品质下降，如肉质粗硬、弹性降低、缺少风味等。随着生活水平不断提高、健康意识增强和肉类产品不断丰富，消费者在选择鸡肉产品时从单一地追求肉量转向肉质肉量双追求，从而对鸡肉品质提出了更高的要求。如何在保证肉鸡快速生长的同时，仍保持优良的鸡肉品质，是集约化肉鸡生产中的瓶颈问题，也是肉质研究中的重点难点，寻找行之有效方法提升鸡肉品质对于肉鸡生产意义重大。骨骼肌是肉品质性状形成的物质基础，其能量代谢状态可对肉品质的多项参数，如肉色、质地、ph值、系水力、风味等造成显著影响。而肠道微生物在动物骨骼肌能量代谢中的多个环节中起到作用，因此调节肠道微生物可对鸡肉品质起到一定的改善作用。
3.目前，已有采用活性微生物制来改善鸡肉品质的报道。但多采用单一微生物制剂，微生物存在作用方式单一、肉品质改善功能不显著等问题。从而在一定程度上限制了单一微生物制剂的推广与应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种改善鸡肉品质的复合活性微生物制剂及其制备方法和应用。该复合活性微生物制剂由两种鸡源性肠道乳杆菌组成，本发明通过肉鸡饲喂等试验证实这两种活性微生物以及他们的复合物可调节鸡骨骼肌能量代谢以及促进骨骼肌中风味物质的产生，从而改善鸡肉品质；由l.plantarum和l.salivarius制备得到复合活性微生物制剂用于改善鸡肉品质。
5.为实现上述目的，本发明所设计一种改善鸡肉品质的复合活性微生物制剂，所述复合活性微生物制剂包括两种活性微生物，分别为l. plantarum和l.salivarius。
6.l.plantarum在分类上属于乳杆菌科、乳杆菌属；其为圆端直杆菌，通常呈现0.9～1.2μm
×
3.0～8.0μm的单个、成对或短链状。缺乏鞭毛，但能运动。为革兰氏阳性，不生芽孢。兼性厌氧，广泛地存在于人和动物的肠道，终产物中85％以上是乳酸。现有研究表明，植物乳杆菌具有抑菌活性、免疫调节功能、抗氧化、产生功能性代谢物、可以改善家畜和家禽的生产性能等作用。但尚未有其可以改善鸡肉品质的报道。
7.l.salivarius在微生物分类上属于乳杆菌科、乳杆菌属；其为圆端直杆菌，呈大小为0.6～0.9μm
×
1.5～5μm的单个、成对或短链状，无鞭毛，不运动。革兰阳性，不生芽胞。唾液乳杆菌广泛地存在于人和动物的肠道，能产乳酸。现有研究表明，该微生物可以改善家畜和家禽的生产性能，提高血清抗氧化能力和免疫性能，改善肠道健康，同时维持肠道内菌群的平衡。
8.l.plantarum和l.salivarius均尚未有其可以改善鸡肉品质的报道；本发明中，l.plantarum和l.salivarius为鸡源性l.plantarum和鸡源性 l.salivarius；是由静原鸡盲肠中分离得到。本发明利用多组学研究，结合体外培养、测序及肉鸡饲喂等技术证实l.plantarum和l.salivarius起有效改善鸡肉品质的作用，且两者复合后对于改善鸡肉品质的效果优于单菌使用。
9.进一步地，所述复合活性微生物制剂中，总活性微生物浓度为10
8 cfu/ml。
10.再进一步地，所述复合活性微生物制剂中，其冻存液总活性微生物浓度为109cfu/ml。
11.再进一步地，所述复合活性微生物制剂中，l.plantarum和l.salivarius 的活菌数量比为1:1～3。
12.再进一步地，所述复合活性微生物制剂中，l.plantarum和l.salivarius 的活菌数量比为1:1。
13.再进一步地，所述复合活性微生物制剂为总活性微生物浓度为10
8 cfu/ml的微生物制剂
14.或者，由冻存液稀释的总活性微生物浓度为108cfu/ml的微生物制剂。之后使用。
15.本发明还提供了一种改善鸡肉品质的复合活性微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
16.1)分别挑取l.plantarum和l.salivarius的特征菌落接种到新鲜的 mrs液态培养基中进行培养，得到两种活性微生物悬液；
17.2)将制得的两种活性微生物悬液分别离心获取微生物沉淀，pbs重悬沉淀，将两种活性微生物悬液混合均匀，得到复合活性微生物制剂，冷冻保存；其中，复合活性微生物制剂中活菌浓度为108cfu/ml。
18.进一步地，所述复合活性微生物制剂中，l.plantarum和l.salivarius 的活菌数量比为1:1～3。
19.再进一步地，所述复合活性微生物制剂中活菌浓度为108cfu/ml，且l.plantarum和l.salivarius的活菌数量比为1:1。
20.本发明还提供了一种上述复合活性微生物制剂在肉鸡生产中的应用。
21.进一步地，所述应用的方法如下：
22.将复合活性微生物制剂经灭菌pbs稀释至浓度为108cfu/ml，经口腔灌服至22～42日龄aa肉鸡，灌服剂量为1.0ml/次/只，日服一次。
23.或者，将复合活性微生物制剂按照1.0ml/只/日剂量进行喷洒，喷洒至22～42日龄肉鸡分隔饲喂栏料槽中的饲料表面。
24.如需保存或运输，为了保持该制剂中微生物的活性，可以使用以下方法：
25.1)向浓度为109cfu/ml活性微生物制剂中加入体积分数为10％的甘油，即得到活性微生物冻存液。
26.2)将冻存液置于液氮或-80℃冰箱保存，使用前通过37℃水浴，使冻存的微生物冻存液快速解冻，然后用灭菌的pbs将微生物悬液稀释至 108cfu/ml。
27.本发明的有益效果：
28.本发明的复合活性微生物制剂的制作过程简单，生产成本较低，可改善鸡肉的肉
色、提高肌鸡肉的紧实度，提升鸡肉风味等。
附图说明
29.图1为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡骨骼肌能量代谢的影响图；
30.图中，a为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡体重的影响图；
31.b为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡胸肌/体重比的影响图；
32.c为静原鸡肠道微生物移植前后aa肉鸡胸肌he染色图片；
33.d为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡胸肌纤维直径的影响图；
34.e为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡胸肌纤维密度的影响图；
35.f为静原鸡肠道微生物移植前后aa肉鸡胸肌透射电镜(tem)图片；
36.g为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡胸肌线粒体数量的影响图；
37.h为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡胸肌生长和代谢类型相关基因表达的影响图；
38.i为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡胸肌线粒体功能相关基因表达的影响图；
39.j为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡胸肌支链氨基酸代谢类型相关基因表达的影响图；
40.k为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡胸肌糖代谢相关基因表达的影响图；
41.l为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡胸肌脂肪代谢相关基因表达的影响图；
42.m为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡胸肌糖原含量的影响图；
43.图2为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡血清和骨骼肌代谢物含量的影响图；
44.图中，a为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡血清代谢物丰度的影响图；
45.b为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡胸肌代谢物丰度的影响图；
46.c为静原鸡肠道微生物对胸肌肌红蛋白含量的影响图；
47.图3为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡肠道微生物组成和功能的影响图；
48.a为静原鸡盲肠微生物移植前后肠道微生物种水平主成分分析图 (pca图)；
49.b为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡肠道微生物的影响图；
50.c为静原鸡盲肠微生物对aa肉鸡肠道微生物功能的影响图；
51.d为接受静原鸡肠道微生物移植的aa肉鸡，肠道差异微生物与差异微生物功能途径的相关性分析；
52.e为接受静原鸡肠道微生物移植的aa肉鸡，肠道差异微生物种与差异微生物功能途径的相关性分析；
53.图4为胸肌表型相关代谢物与差异微生物的相关性分析图；
54.图中，a为胸肌表型相关血清代谢物与差异微生物的相关性热图；
55.b为胸肌表型相关肌肉代谢物与差异微生物的相关性热图。
56.图5为添加活性微生物制剂对肉鸡的生长性能及其肌纤维的影响图图中，a为添加活性微生物制剂对42日龄aa肉鸡体重的影响图；
57.b为添加活性微生物制剂对42日龄aa肉鸡胸肌体重比的影响图；
58.c为aa胸肌he染色图片；
59.d为添加活性微生物制剂对42日龄aa肉鸡胸肌纤维直径的影响图；
60.e为添加活性微生物制剂对42日龄aa肉鸡胸肌纤维密度的影响图；
61.注：图中不同的因为字母表示差异显著p＜0.05；相同的表示差异不显著p＞0.05；
62.图6为添加复合活性微生物制剂对鸡骨骼肌基因表达的影响图；
63.图中，a-j分别为myhc sm、myhc frm、tfam、cox va、pf、 pfk、pdh、idh、sdh和mb基因表达的影响图；不同的因为字母表示差异显著p＜0.05；相同的表示差异不显著p＞0.05；
64.图7为添加活性微生物制剂对鸡骨骼肌代谢物含量的影响图；
65.图中，a为aa肉鸡胸肌中糖原含量图；
66.b为aa肉鸡胸肌红蛋白含量图；
67.c为aa肉鸡胸肌中肌苷酸的含量图；
68.注：图中不同的因为字母表示差异显著p＜0.05；相同的表示差异不显著p＞0.05。
具体实施方式
[0069][0070]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
[0071]
实施例1可改善鸡肉品质活性肠道微生物的筛选：
[0072]
1)盲肠微生物移植可改变受体鸡骨骼肌表型和糖代谢水平
[0073]
将静原鸡盲肠微生物移植至aa肉鸡，试验结果显示接受了浓度为 108cfu/ml盲肠微生物悬液的aa肉鸡(aat组)与对照组(aa组) 相比体重和胸肌重/体重比值无差异(p＞0.05；图1a和1b)；但胸肌纤维直径和密度显著增加(p＜0.05；图1c-1e)，胸肌中线粒体数目显著增加(图1f和1g)，胸肌氧化型肌纤维基因、线粒体功能相关基因、糖代谢相关基因表达量显著上升(p＜0.05；图1h-1k)，而支链氨基酸和脂肪酸代谢相关基因的表达并无显著差异(p＜0.05；图1j和1l)。另外，胸肌糖原含量显著下降(p＜0.05；图1m)。
[0074]
以上研究结果说明：静原鸡盲肠微生物移植对aa肉鸡骨骼肌能量代谢造成显著影响，骨骼肌能量代谢的变化源于糖代谢的变化。这部分研究为接下来筛选、鉴定和分离培养可影响鸡肉品质的关键肠道微生物奠定了基础。
[0075]
2)静原鸡盲肠微生物移植显著改变受体鸡血清和骨骼肌代谢物丰度
[0076]
通过非靶向代谢组学分析，在血清中检测到了原卟啉ix，且该代谢物在aat组血清中的丰度显著高于其在aa组血清中的丰度(p＜0.05；图2a)。在骨骼肌中，检测到三磷酸腺苷(atp)和肌苷酸(imp)，且这两种代谢物在aat组胸肌中丰度显著高于其在aa组胸肌中的丰度 (p＜0.05；图2b)。肌红蛋白的含量在aat组胸肌中显著高于其在aa 组胸肌中含量(p＜0.05；图2c)。另外，aat组血清和骨骼肌中琥珀酸的丰度显著高于其在aat血清和骨骼肌中的丰度(p＜0.05；图2a和2b)，这有可能是由于微生物移植后糖代谢加强造成的结果。
[0077]
3)肠道微生物移植显著改变受体鸡肠道微生物组成和功能：
[0078]
对接受灭菌pbs(aa组)和静原鸡盲肠微生物灌服组(108cfu/ml 浓度，aat组)的aa肉鸡盲肠内容物进行宏基因组学测序分析。pca 图显示，两组盲肠微生物组成差异显著(p＜0.05；图3a)；进一步分析表明，盲肠微生物在门和种水平组成上存在显著差异(p＜0.05；图3b 和3c)；差异微生物参与到的某些营养代谢途径，可能会影响到宿主的肌肉营养物质代谢(p＜0.05；图3d)；差异肠道微生物与差异代谢通路的相关性分析显示，有两种乳酸杆菌l.plantarum和l.salivarius与微生物代谢途径“porphyrin and chlorophyll metabolism”高度相关(p＜0.05； r＞0.75，图3e)，肠道微生物通过该途径产生原卟啉ix。
这从微生物的角度支撑了代谢组学的结果，即肠道关键微生物产生原卟啉ix释放入血，造成了血清中原卟啉ix含量的变化。进一步，原卟啉ix是肌红蛋白合成所必需的原料，其含量的增加有可能是骨骼肌中肌红蛋白含量增加的重要影响因素。因此，筛选得到l.plantarum和l.salivarius可通过加强骨骼肌中糖代谢产生更多的atp并使骨骼肌纤维密度增加，并促进了鸡骨骼肌中imp的沉积。
[0079]
4)差异微生物与差异代谢物相关性分析
[0080]
将胸肌纤维直径和密度参数与血清、肌肉差异代谢物相关联，得到表型相关差异代谢物。将这些表型相关代谢物与种水平差异肠道微生物进行相关性分析，得到高度相关微生物种。胸肌表型与血清及肌肉的相关性分析见表1和2；表型相关代谢物与差异微生物的相关性分析见附图4。相关性分析显示l.plantarum和l.salivarius与胸肌中atp含量以及风味物质肌苷酸含量高度正相关，且与胸肌中糖代谢相关的代谢产物琥珀酸高度相关(r＞0.75，p＜0.05)。
[0081]
因此，可将这两种肠道微生物筛选为可改善鸡肉品质的候选肠道微生物。
[0082]
表1胸肌表型与血清代谢物相关性分析
[0083]
[0084][0085]
表2胸肌表型与骨骼肌代谢物相关性分析
[0086]
[0087][0088]
实施例2
[0089]
改善鸡肉品质的复合活性微生物制剂1的制备方法，包括以下步骤：
[0090]
1)将l.plantarum和l.salivarius两种活性微生物分别接种到新鲜的mrs液态培养基中进行培养，得到两种活性微生物悬液；
[0091]
2)将制得的两种活性微生物悬液分别离心获取微生物沉淀，pbs重悬沉淀，将两种活性微生物悬液混合均匀，得到复合活性微生物制剂，冷冻保存；其中，复合活性微生物制剂中活菌浓度为109cfu/ml，且l. plantarum和l.salivarius的活菌数量比为1:1。
[0092]
实施例3
[0093]
本实施例制备的复合活性微生物制剂2与复合活性微生物制剂1的制备方法基本相同，不同之处在于：
[0094]
l.plantarum和l.salivarius复合微生物制剂浓度为108cfu/ml，且两种微生物活菌数量比为1:1。
[0095]
实施例4
[0096]
本实施例制备的复合活性微生物制剂3与复合活性微生物制剂1的制备方法基本
相同，不同之处在于：
[0097]
l.plantarum和l.salivarius复合微生物制剂浓度为107cfu/ml，且两种微生物活菌数量比为1:1。
[0098]
实施例5
[0099]
本实施例制备的复合活性微生物制剂4与复合活性微生物制剂1的制备方法基本相同，不同之处在于：
[0100]
l.plantarum和l.salivarius复合微生物制剂浓度为108cfu/ml，且两种微生物活菌数量比为1:2。
[0101]
实施例6
[0102]
本实施例制备的复合活性微生物制剂5与复合活性微生物制剂1的制备方法基本相同，不同之处在于：
[0103]
l.plantarum和l.salivarius复合微生物制剂浓度为108cfu/ml，且两种微生物活菌数量比为1:3。
[0104]
实施例7复合活性微生物制剂的最佳添加浓度验证试验
[0105]
为了确定复合活性微生物制剂的最佳添加浓度，将上述活性微生物制剂1～3(三个浓度梯度)进行aa肉鸡灌喂试验：
[0106]
将96只22日龄aa肉鸡，平均分为四组，对照组(cg)灌喂灭菌pbs，实验组分别灌喂浓度为109(活性微生物制剂1)、108(活性微生物制剂2)、107(活性微生物制剂3)cfu/ml的复合微生物制剂，分别按照1.0ml/日/只进行灌喂至42日龄。灌喂试验结束后，采集胸肌进行相关检测。
[0107]
灌喂浓度为109和107cfu/ml的复合活性微生物制剂的aa肉鸡组分别于灌喂后5天和7天出现腹泻反应，随着灌喂的持续，腹泻加重且精神逐渐萎靡。而灌喂浓度为108cfu/ml的aa肉鸡未见不良反应。
[0108]
因此，后续研究仅在灌喂浓度为108cfu/ml的活性微生物制剂2添加组进行。
[0109]
实施例8l.plantarum和l.salivarius对鸡肉品质的影响研究
[0110]
将96只22日龄aa肉鸡随机分为4组，每组24只，对照组灌喂灭菌 pbs，实验组分别灌喂l.plantarum(plan)、l.salivarius(sal)、以及两种微生物的混合物(mix)，活性微生物菌液的灌喂浓度均为10
8 cfu/ml的，均按照1.0ml/日/只从22日龄灌喂至42日龄。饲喂试验结束后，采集胸肌样品进行相关检测。
[0111]
1)对肉鸡生长性能及肌纤维的影响：
[0112]
结果表明：与对照组(cg)相比，l.plantarum(plan)、l.salivarius (sal)以及活性微生物制剂2(mix)42日龄aa肉鸡体重显著增 加(p＜0.05，图5a)，但各添加组肉鸡体重无显著差异(p＞0.05，图 5a)；与对照组(cg)相比，各活性微生物添加组42日龄aa肉鸡 胸肌体重比显著增加(p＜0.05，图5b)，但各添加组肉鸡体重无显著 差异(p＞0.05，图5b)。通过对aa肉鸡胸肌的he染色图片观察发 现(图5c)，各活性微生物添加组42日龄aa肉鸡胸肌纤维直径和 密度显著增加(p＜0.05，图5d和5e)，这些变化在mix组显得尤为 突出。而胸肌纤维密度显著增加(p＜0.05，图5c)。
[0113]
2)对骨骼肌能量代谢相关基因表达的影响：
[0114]
结果表明：与cg相比，各活性微生物添加组与骨骼肌纤维类型 相关的基因，即慢
肌肌球蛋白重链(myhc sm)和快红肌肌球蛋白重 链(myhc frm)基因表达量显著增加(p＜0.05，图6a和6b)；与 线粒体功能相关的基因，即线粒体转录因子a(tfam)及线粒体呼吸 链中的coxva表达量显著增加(p＜0.05，图6c和6d)；与骨骼肌糖 代谢相关基因，包括丙酮酸激酶(pk)、磷酸果糖激酶(pfk)、丙酮 酸脱氢酶(pdh)、异柠檬酸脱氢酶(idh)和琥珀酸脱氢酶(sdh) 基因表达量显著增加(p＜0.05，图6e-6i)；与肌红蛋白产生量相关的 肌红蛋白基因(mb)表达量显著增加(p＜0.05，图6j)。在所有的差 异基因中，mix组中基因表达量上升尤为显著(图6)。
[0115]
3)对骨骼肌代谢物的影响：
[0116]
结果表明，与cg相比，胸肌中各活性微生物添加组糖原含量显著降低(p＜0.05，图6a)；胸肌中肌红蛋白含量显著上升(p＜0.05，图7b)，胸肌中肌苷酸含量显著上升(p＜0.05，图7c)，这些变化，在mix组显得尤为突出(图7)。
[0117]
综上所述：通过体外培养的方法可以获得来源于静原鸡盲肠的l. plantarum和l.salivarius并可制备成活性复合微生物制剂用于改善鸡肉品质。可使鸡肉色变得红润(使鸡肉中肌红蛋白含量增加)、肉质变得紧实(肌纤维密度增肌)且鸡肉风味浓郁(提高了鸡肉中氧化型肌纤维比例和提高风味物质肌苷酸含量)。
[0118]
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。