一种与苹果属植物根皮苷有无性状相关的分子标记及应用

1.本技术属于生物分子检测及育种领域，具体涉及一种与苹果属植物根皮苷有无性状相关的分子标记及应用。


背景技术：

2.根皮苷属于类黄酮中的二氢查尔酮类化合物，由根皮素a环2'位葡萄糖基化生成。根皮苷主要存在于蔷薇科苹果属大部分植物中。根皮苷味苦，但其同分异构体三叶苷(由根皮素a环4'位葡萄糖基化生成)则是天然的甜味剂，在食品加工领域应用前景广泛。目前，在大多数含有三叶苷的苹果属种质资源的叶片、花瓣、果实等组织器官中，经常伴随含有大量的根皮苷。在利用这些种质资源进行三叶苷分离提纯过程中，根皮苷作为杂质，不容易被有效分离去除，极大的影响了三叶苷分离纯化效率。因此，如果选育高三叶苷含量而根皮苷含量极低的苹果新品种或新种质，则有利于在较低的成本下进行三叶苷的分离纯化。然而，由于根皮苷普遍存在于大部分苹果属植物中，如果利用传统的杂交育种选育不含根皮苷的苹果新品种或新种质，亲本及杂交后代筛选方式时间长，占地面积大，育种周期很长。
3.分子标记辅助选择育种(marker assisted selection,mas)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记来鉴定不同个体的基因型，进而辅助选择育种，加快育种效率。因此，该技术被广泛应用于作物遗传改良和品种选育中。如果利用dna分子标记对根皮苷有无这一性状进行早期选择，对于苹果属植物根皮苷育种而言，可以大幅提高亲本和杂交后代的筛选效率，进而提高育种效率，意义重大。
4.有鉴于此，提出本发明。


技术实现要素：

5.本技术拟解决的技术问题是；现有技术存在的苹果属根皮苷育种亲本及杂交后代筛选方式时间长，占地面积大，育种周期长的等问题。为解决上述问题，本技术提供一种与苹果属植物根皮苷有无性状相关的大片段插入缺失(indel)分子标记。
6.在前期研究结果表明，调控苹果属植物根皮素发生a环2’位糖基化生成根皮苷的基因是pgt1(genebank登录号nm_001328723.1)；并且，pgt1的氨基酸序列在有无根皮苷的苹果属种质资源中没有明显区别。这表明，苹果属植物根皮苷的合成即根皮苷有无这一性状与pgt1基因的编码区不相关。本技术研究结果表明，苹果属植物根皮苷的合成即根皮苷有无这一性状受单基因调控，且是受pgt1顺式作用原件即启动子区域的调控。
7.因此，本发明具体提供如下技术方案：
8.本发明首先提供一种与苹果属植物根皮苷有无性状相关的indel分子标记，所述indel分子标记位于寒富苹果参考基因组(hfth1.genome)15号染色体上51836264处，对应pgt1起始密码子atg上游158bp至上游基因lea之间的pgt1启动子区域3555bp的大片段缺失，具体序列为如下任一：
9.1)如seq id no.4所示dna序列；
10.2)包含seq id no.4所示dna序列；
11.3)与seq id no.4具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％同源性的dna序列，且序列来源于苹果属植物。
12.本发明还提供一种与苹果属植物根皮苷有无性状相关的indel分子标记的应用：
13.1)鉴定苹果属植物根皮苷性状；
14.2)预测苹果属植物根皮苷性状；
15.3)在苹果属根皮苷分子标记辅助育种中的应用。
16.本发明还提供一种检测上述的indel分子标记的试剂在鉴定或预测苹果属植物根皮苷性状中的应用，或在苹果属根皮苷分子标记辅助育种中的应用。
17.进一步的，试剂种类包括但不限于pcr类试剂、基因芯片类试剂或测序试剂。
18.在一些实施方式中，所述试剂包含seq id no.5和6所示引物对。
19.本发明还提供一种用于扩增检测上述indel分子标记的引物对,所述分子标记的正向引物位于寒富苹果参考基因组(hfth1.genome)15号染色体上51836264(即pgt1基因起始密码子atg(51836106)上游158bp)的上游，反向引物位于参考基因组(hfth1.genome)15号染色体上51836264的下游；
20.优选的，所述分子标记的正向引物位于参考基因组(hfth1.genome)15号染色体的51842406-51841914，位于基因pgt1起始密码子atg上游5808-6300bp；反向引物位于参考基因组15号染色体的51836264-51834654，位于基因pgt1起始密码子上游158bp-下游1452bp；
21.更优选的，所述分子标记的正向引物位于参考基因组(hfth1.genome.)15号染色体的51841991-51841961，位于基因pgt1起始密码子atg上游5855-5885bp；反向引物位于参考基因组15号染色体的51835648-51835618，位于基因pgt1起始密码子下游458-488bp.所述引物对序列如seq id no.4和5所示。
22.上述引物对均用于验证pgt1起始密码子atg上游158bp至上游基因lea(胚胎发育晚期丰富蛋白)之间的pgt1启动子区域3555bp的大片段缺失。
23.本发明还提供一种苹果属植物根皮苷性状检测试剂盒，包含上述任一所述的引物对。
24.本发明还提供一种预测苹果属植物根皮苷性状有无的方法，利用上述引物对或试剂盒对苹果属植物进行检测。
25.本发明还提供一种预测苹果属植物根皮苷性状有无的方法，以苹果属植物的基因组dna为模板，以上述引物对为扩增引物，进行pcr扩增，对扩增产物进行电泳检测，若能够扩增出上述indel分子标记，则待测苹果属植物含有根皮苷；
26.在一些实施方式中，采用seq id no.4和5所述引物对进行扩增，鉴于其扩增片段包含了部分pgt1和lea等序列片段，实践中若在6000-8000bp之间出现扩增条带，则待测苹果属植物含有根皮苷；或在1000-1500bp左右出现条带则待测苹果属植物不含有根皮苷；在一些具体针对特定苹果属品种的实施方式中，若单独出现6374bp或同时出现6374bp和1139bp两个条带，则待测苹果属植物含有根皮苷；若只出现1139bp一个条带，则待测苹果属植物不含有根皮苷。
27.与现有技术相比，本发明至少具有如下优势：
28.1)本发明发现一种全新的苹果属根皮根分子标记，可应用在苹果属根皮苷分子标
记辅助育种中。
29.2)本发明公开的苹果属植物根皮苷有无性状相关的pgt1顺式作用原件区域的标记，为苹果属植物根皮苷特异种质或品种选育过程中的分子标记辅助选择提供一个新的分子标记，选择携带这种pgt1顺式作用原件区域突变标记的苹果属植物作为亲本进行杂交育种，然后获得杂交后代，克隆获得杂交后代中的pgt1顺式作用原件区域，研究其多态性；研究pgt1顺式作用原件区域标记与苹果属植物根皮苷有无性状的关系，从中筛选出含pgt1顺式作用原件区域的标记。基于pgt1顺式作用原件区域的分子标记可以很好地解决苹果属植物根皮苷育种过程中的生产占地面积大、选育周期长等上述问题，大幅提高育种选择效率及准确性，适于产业推广。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1：利用indel分子标记在山定子(含有根皮苷)和变叶海棠(不含有根皮苷)中进行包括pgt1启动子在内的大片段基因序列多态性克隆。
32.图2：利用indel分子标记在山定子，变叶海棠中克隆包括pgt1启动子在内的大片段基因序列与寒富参考基因组(含有根皮苷)中该indel分子标记间的基因序列比对结果。图中，黑色线条标记的序列为pgt1的cds区域，黑色双线条标记的为pgt1起始密码子atg的位置，灰色线条标记的为变叶海棠与参考基因组相比，共有的158bp的序列。
33.图3：利用indel分子标记对25个苹果原生种资源的鉴定结果。图中1-3为不含有根皮苷的苹果原生种，m为dna marker,4-25为含有根皮苷的苹果原生种。
34.图4：利用indel分子标记对杂交后代的鉴定结果。图中1-14为不含有根皮苷的杂交后代；15-20为含有根皮苷的杂交后代；21为母本，冬红海棠，含有根皮苷；22为父本，绚丽海棠，含有根皮苷；m为dna marker。
具体实施方式
35.下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
37.除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
38.如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由
…
组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方
案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
39.在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
40.本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的
±
10％，优选
±
5％。
41.此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
42.本发明通过研究发现，苹果属植物根皮苷的合成即根皮苷有无这一性状受单基因调控，且是受pgt1顺式作用原件即启动子区域的调控。
43.本发明所述的indel分子标记是通过通过比较山定子(含有根皮苷)和变叶海棠(不含有根皮苷)的幼嫩叶片中的pgt1顺式作用原件启动子区域的基因差异获得。
44.经与参考基因组比较分析，本发明所述的与苹果属植物根皮苷有无性状相关的indel分子标记位于寒富苹果参考基因组(hfth1.genome)15号染色体上51836264处，对应pgt1起始密码子atg上游158bp至上游基因lea之间的pgt1启动子区域3555bp的大片段缺失，其核心序列为如下任一：1)如seq id no.4所示dna序列；2)包含seq id no.4所示dna序列；3)与seq id no.4具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％同源性的dna序列。可以理解，但凡来源于苹果属植物，大体包含了seq id no.4的序列理论上都属于本发明的范畴。比如，鉴于物种序列差异，即便同属于苹果树的物种，其在seq id no.4两端或序列4内部都有可能存在个别碱基差异(我们定义为seq id no.4衍生序列，简称衍生序列)，在本发明证实其为与苹果属植物根皮苷有无性状的indel分子标记情况下，本领域可以预期，这些衍生序列同样可以用于苹果属植物根皮苷性状鉴定。
45.本发明的与苹果属植物根皮苷有无性状相关的indel分子标记的应用，包括但不限于：1)鉴定苹果属植物根皮苷性状；2)预测苹果属植物根皮苷性状；3)在苹果属根皮苷分子标记辅助育种中的应用；4)调控苹果树植物的pgt1基因表达等。
46.本发明的检测上述的indel分子标记的试剂在鉴定或预测苹果属植物根皮苷性状中的应用，或在苹果属根皮苷分子标记辅助育种中的应用。可以理解，但凡能够用于检测上述分子标记的试剂种类都属于本发明范畴，包括但不限于pcr类试剂、基因芯片类试剂或测序试剂等。
47.而本发明的用于扩增检测上述indel分子标记的引物对可以是任意能够扩增出上述核心indel分子标记的引物对，只要其满足能够用于验证pgt1起始密码子atg上游158bp至上游基因lea(胚胎发育晚期丰富蛋白)之间的pgt1启动子区域3555bp的大片段缺失的都属于本发明范畴。因为，本发明的引物对可以是如下任一：所述分子标记的正向引物位于寒富苹果参考基因组(hfth1.genome)15号染色体上51836264(即pgt1基因起始密码子atg(51836106)上游158bp)的上游，反向引物位于参考基因组(hfth1.genome)15号染色体上51836264的下游。而考虑到引物设计的难以性问题，本发明的所述分子标记的正向引物位于参考基因组(hfth1.genome)15号染色体的51842406-51841914，位于基因pgt1起始密码子atg上游5808-6300bp；反向引物位于参考基因组15号染色体的51836264-51834654，位于
基因pgt1起始密码子上游158bp-下游1452bp；在一些更优选的，如本发明的具体实施例中提及，所述分子标记的正向引物位于参考基因组(hfth1.genome.)15号染色体的51841991-51841961，位于基因pgt1起始密码子atg上游5855-5885bp；反向引物位于参考基因组15号染色体的51835648-51835618，位于基因pgt1起始密码子下游458-488bp，具体序列如seq id no.5和6所示。
48.本领域可以理解，在确定了相应的分子标记位置和序列的情况下，设计并合成相应能够扩增的引物对本领域技术人员来说并不困难。
49.本发明的预测苹果属植物根皮苷性状有无的方法，可以是任意通过检测上述indel分子标记有无的生物学方法。比如，这种方法可以是pcr方法：是以苹果属植物的基因组dna为模板，以上述引物对为扩增引物，进行pcr扩增，对扩增产物进行电泳检测，若能够扩增出上述indel分子标记，则待测苹果属植物含有根皮苷；在一些具体实施方式中，采用seq id no.4和5所述引物对进行扩增，鉴于其扩增片段包含了部分pgt1和lea等序列片段，实践中若在6000-8000bp之间出现扩增条带，则待测苹果属植物含有根皮苷；或在1000-1500bp左右出现条带则待测苹果属植物不含有根皮苷；在一些特定苹果属比如包括寒富苹果属在内的的实施例中，若单独出现6374bp或同时出现6374bp和1139bp两个条带，则待测苹果属植物含有根皮苷；若只出现1139bp一个条带，则待测苹果属植物不含有根皮苷。
50.下面为具体的实施例。实施例以苹果属植物根皮苷有无性状相关的pgt1基因标记及其辅助育种技术的建立为例，对本发明的技术内容进行详细说明。
51.实施例1苹果属植物pgt1启动子序列多态性分析
52.本实施例具体步骤如下：
53.1、基因组dna提取：
54.选取两个苹果原生种品种：山定子(含有根皮苷)和变叶海棠(不含有根皮苷)的幼嫩叶片，利用植物基因组提取试剂盒(tiangen)提取基因组dna。
55.2、pgt1启动子克隆：
56.利用设计合成的正向引物利用设计合成的正向引物和反向引物pgt1pro-indel-r；5'-ctcggtggttttggtttgctcatcgatcttg-3'(seq id no.6)进行包括pgt1启动子在内的大片段基因序列的克隆。
57.pcr反应体系为20ul:
[0058][0059]
pcr扩增程序如下：
[0060][0061]
pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，用dna纯化试剂盒(tiangel midi purification kit，天根生物)回收目的片段。将回收目的片段连接到pmd19-t载体上(pmd19-t vector cloning kit,takara),并转化到dh5α大肠杆菌感受态细胞中，在氨苄青霉素的平板上过夜培养并挑取单克隆，进行菌液pcr筛选鉴定。对筛选出来的阳性克隆进行测序。
[0062]
通过琼脂糖凝胶电泳，发现在山定子中克隆得到的包括pgt1启动子在内的片段大小与参考基因组大小一致，在6000-8000bp之间，但在变叶海棠中克隆得到的包括pgt1启动子在内的片段大小只有1000-1500bp(图1)。
[0063]
测序结果发现在山定子中克隆得到的包括pgt1启动子在内的基因序列大小为7450bp(seq id no.1)；而在变叶海棠中克隆得到的包括pgt1启动子在内的基因序列大小为1139bp(seq id no.2)，具体参见图2。
[0064]
经分析，与如下寒富参考基因组序列seq id no.3比较可以看出，上述序列仅cds区域及atg上游158bp基因序列一致，随后的序列则完全比对不上。因该引物对克隆的序列中包括2172bp的lea基因序列(seq id no.3中斜体部分)，完整的3713bp pgt1启动子序列(seq id no.3中阴影部分)以及pgt1 488bp的cds区域(seq id no.3阴影之后的序列)。因而，对于pgt1启动子区域，变叶海棠与参考基因组相比，除atg上游158bp序列相同，其上游出现了一个3555bp的大片段缺失；该大片段缺失即为可以用于区分两种启动子的核心结构区域(对应seq id no.3中用阴影加粗的部分)，该3555bp的大片段缺失即定义为本发明的indel序列seq id no.4。
[0065]
寒富参考基因组中引物pgt1pro-indel-f/r之间的基因序列seq id no.3(6374bp)
[0066]
[0067]
[0068]
[0069][0070]
实施例2苹果属植物根皮苷有无与pgt1启动子多态性关联性分析
[0071]
为进一步确定苹果属植物中根皮苷有无的性状与pgt1启动子序列多态性的关系，收集国内外25个苹果属原生种(表1)，采取幼嫩叶片，进行基因组dna提取。利用该引物对在25个材料中克隆包括pgt1启动子在内的大片段并进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图2，发现在含有根皮苷的原生种(4-25)中，克隆得到的pgt1启动子大小均与参考基因组(含有根皮苷)大小一致。由于品种的差异性，不同品种中的包括pgt1启动子在内的该大片段大小有一定差异，但都能得到大小均位于6000-8000bp之间的条带。而在不含有根皮苷的原生种(1-3)中，克隆只能得到包括pgt1启动子在内的大小位于1000-1500bp之间的条带，无大小位于6000-8000bp之间的条带。因此该结果表明，苹果属植物野生种质资源含有根皮苷这一性状与具有正常的pgt1启动子(能够克隆得到大小位于6000-8000bp之间的条带)密切相关，而不含有根皮苷的性状与pgt1启动子中大片段缺失(克隆只能得到包括pgt1启动子在内的大小位于1000-1500bp之间的条带)密切相关。
[0072]
表1：25个苹果原生种的名称及根皮苷有无性状的具体信息
[0073]
[0074][0075]
实施例3利用pgt1启动子多态性进行杂交后代有无根皮苷的性状筛查
[0076]
为进一步明确pgt1启动子序列多态性是否在遗传群体中与根皮苷有无紧密连锁，利用冬红海棠(含有根皮苷)和绚丽海棠(含有根皮苷)进行杂交后，构建f1代遗传群体。对650个杂交后代进行幼嫩叶片的采集，利用高效液相色谱仪对每个单株进行根皮苷有无性状鉴定，发现在遗传群体中共有324个单株含有根皮苷，326个单株不含有根皮苷。根皮苷性状分离比为1:1，符合孟德尔遗传规律。
[0077]
利用实施例1中的分子标记引物对seq id no.4和5对两个父母本和随机选择的22个杂交后代进行基因型分析。研究发现在父母本和6个含有根皮苷的后代中均克隆得到6000-8000bp和1000-1500bp两种大小的片段(杂合基因型)，而在14个不含有根皮苷的后代中仅克隆得到1000-1500bp的片段(图3)。说明在遗传群体中pgt1启动子序列多态性与根皮苷有紧密连锁。
[0078]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。