利用特异性酶切位点的多亚基蛋白共表达方法与流程

1.本发明属于蛋白质工程技术领域，特别涉及一种利用特异性酶切位点的多亚基蛋白共表达方法。


背景技术：

2.为了得到更好、产量更高、成本更低的功能蛋白，蛋白表达系统分为：原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统和植物表达系统。原核蛋白表达系统以大肠杆菌为代表，其具有遗传信息清楚、成本低、产量高等特点；酵母蛋白表达系统则以酿酒酵母和甲醇酵母为代表，其具有表达量高、其糖基化机制接近于高等真核生物等特点；昆虫细胞表达系统采用杆状病毒表达系统，其组蛋白具有完整的生物学功能可进行正确的蛋白折叠、可容纳大分子的片段插入等特点；哺乳动物细胞表达系统利用质粒转染和病毒载体的感染进行外源蛋白的重组，由于哺乳动物细胞在起始信号、加工、糖基化等方面具有独特优势，适合表达完整的大分子蛋白的特点；植物表达系统可以表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质，其具有安全性高、易于大规模培养等特点。
3.在上述蛋白表达系统中，常见的多亚基、多蛋白共同表达方式一共有四种：1)多载体表达：采用不同抗性筛选的多个载体对不同蛋白进行单独表达，该方法可以做到独立的表达每一个蛋白，同时缺陷也很明显，如存在载体表达量差异导致蛋白之间的表达量存在巨大差异，以及当多个载体分别表达蛋白的多个亚基时，由于表达量的差异以及表达的蛋白的空间位置差异导致最终的融合多个亚基完整的生物分子功能活性的蛋白效率低下。因此该方法不利于多亚基蛋白的组装或多蛋白统一表达量的表达；2)同一载体，不同表达框：在同一载体上使用多个启动子进行多个蛋白的表达，相较于1)多载体表达方式具有质粒拷贝数一致的优点，但具有启动子强弱差异所带来的基因表达量差异的问题，以及在多亚基蛋白的组装上仍不具有优势，仍具有空间位置差异导致的融合多个亚基完整的生物分子功能活性的蛋白效率低下的问题；3)多顺反子表达：在一条mrna中表达多个蛋白，其模式为“启动子-rbs-蛋白1-rbs-蛋白2-rbs-蛋白3-···-终止子”，由于使用同一个启动子，在转录时具有同一性，但在进行蛋白翻译时由于多个rbs与基因距离较近，导致在空间位置上出现竞争，即核糖体相互竞争在mrna中的空间位置，导致蛋白与蛋白之间出现表达差异，且在多亚基蛋白的组装上仍不具有优势，仍具有空间位置差异导致的融合多个亚基完整的生物分子功能活性的蛋白效率低下的问题；4)融合表达：该方式将多个蛋白或多个功能域融合成一个蛋白，共同行驶功能。该方式在不同蛋白分子的表达量上大致相同，由于构建在同一质粒表达载体上，其培养表达过程相对稳定。相较于1)～3)的蛋白表达方式，该方法的不同蛋白表达后空间位置相对较近，其融合效率相对较高，但融合的蛋白分子由于空间位阻效应导致组装后的融合蛋白的空间结构错误，从而影响融合蛋白的生物功能活性。
4.目前针对具有多亚基蛋白共表达的组装效率低的缺点：1)多个蛋白之间的表达量差异大；
5.2)多个亚基之间或多个蛋白之间组装融合效率低；3)组装后存在空间结构错误，
需要开发一种新的多亚基蛋白表达方法，可以克服上述缺点。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种利用特异性酶切位点的多亚基蛋白共表达方法。
7.为了达到上述目的，所采取的技术解决方案如下：
8.一种利用特异性酶切位点的多亚基蛋白共表达方法，其特征在于其步骤包括：
9.(1)构建第一表达质粒载体和第二表达质粒载体，第一质粒载体中含有启动子-rbs-蛋白1-蛋白酶切割位点-蛋白2
‑……‑
蛋白酶切割位点-蛋白n-终止子的基因，其中n为2-5，其中的蛋白1～蛋白n即为该多亚基蛋白复合物的各蛋白亚基，在上述融合蛋白的编码基因中，存在蛋白酶切割位点-蛋白的重复单元，例如n为3时，则基因序列为启动子-rbs-蛋白1-蛋白酶切割位点-蛋白2-蛋白酶切割位点-蛋白3-终止子，第二表达质粒载体表达特异性切割蛋白酶切割位点的特异性蛋白酶；
10.(2)将第一表达质粒载体和第二表达质粒载体质粒转入宿主细胞中，诱导表达展示融合蛋白以及特异性蛋白酶，特异性蛋白酶切割融合蛋白中的蛋白酶切割位点，使得各蛋白亚基组装成多蛋白复合物；
11.(3)离心去除宿主细胞，收集上清中的多蛋白复合物。
12.优选的，所述蛋白酶切割位点为dddk，所述特异性蛋白酶是指肠激酶。
13.优选的，所述特异性蛋白酶是凝血酶、factor xa蛋白酶、tev蛋白酶、prescission蛋白酶、hrv 3c蛋白酶或sumo蛋白酶，凝血酶的切割位点为：p4-p3-p2-arg
↓‑
p1
′‑
p2
′
p4、p3为疏水氨基酸，p1
′‑
p2
′
为非疏水氨基酸；factor xa蛋白酶切割位点为：ile-glu/asp-gly-arg
↓
；tev蛋白酶切割位点为：glu-asn-leu-tyr-phe-gln
↓‑
gly/ser，prescission蛋白酶切割位点为：leu-phe-gln
↓‑
gly-pro或leu-glu-val-leu-phe-gln
↓‑
gly-pro；hrv 3c蛋白酶切割位点为：leu-glu-val-leu-phe-gln
↓‑
gly-pro；sumo蛋白酶切割位点为：sumo序列末尾的gln-ile-gly-gly
↓
；
↓
为酶切位点。
14.优选的，所述启动子为t7启动子、lac启动子、tac启动子、cmv启动子或h1启动子。
15.优选的，所述质粒载体为pet28a或者pgex。
16.优选的，所述宿主细胞为细菌、古细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
17.优选的，所述宿主细胞为含t7 rna聚合酶基因的大肠杆菌，所述启动子为t7启动子。
18.本发明公开了一种利用特异性酶切位点的多亚基蛋白共表达方法，在多个蛋白亚基之间使用特异性酶切位点进行连接，最终形成一个融合蛋白进行表达，融合蛋白的各蛋白亚基通过分子内相互作用组成复合物前体，然后利用特异性蛋白酶对特异性酶切位点进行切割，完整融合蛋白被切割成等分子数的各蛋白亚基，除去了空间位阻效应，组装成更高效的多蛋白复合物。利用此方法表达多亚基蛋白具有三大优点：1)各蛋白表达高效稳定，表达量差异小；
19.2)蛋白组装方便；3)组装后不存在空间位阻，可以获得活性更高的多蛋白复合物。本方法适用于多蛋白等量表达，或者合成通路多基因共同表达，在物质发酵和催化合成领域具有重要的应用价值。
附图说明
20.图1 pet28a-rekl质粒表达载体示意图。
21.图2 pgex-cabg载质粒表达载体示意图，图中a指nhha，b指nhhb，g指nhhg。
22.图3利用特异性酶切位点的多亚基蛋白共表达的原理示意图。
23.图4 western blotting检测蛋白表达效果比较。
24.图5 hplc检测在合成烟酰胺产物上的效果比较。
具体实施方式
25.本发明的原理如图3所示。下面通过对腈水合酶复合物nhha/nhhb/nhhg(来自于rhodococcus rhodochrous nbrc 16069)使用肠激酶进行融合表达进行应用，使用肠激酶及其特异性识别位点ddddk作为蛋白酶切体系，对本发明做进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.实施例1
27.特异性蛋白水解酶质粒表达载体构建
28.通过无缝克隆的方法，将pet28a(addgene，#50386)外骨架与肠激酶轻链(rekl)片段(来自于enterokinase light chain,partial[bos taurus])混匀，转入大肠杆菌bl21感受态中，进行筛选，包括如下步骤：
[0029]
以质粒pet28a为模板，扩增pet28a外骨架并使其操纵子由laci更换为tet(pet28a-sk)；基因合成片段rekl，并使用特异性引物进行扩增；使用无缝克隆试剂盒，将pet28a-sk与rekl片段按照摩尔比1：3比例混匀，在50℃处理20min，得到pet28a-rekl，如图1所示，转入bl21(de3)感受态，37℃培养1h，1200rpm离心，去上清，使用100ul lb重悬细胞，得到bl21-pet28a-rekl,重选后涂布于lb(kana抗性)平板,挑取阳性单克隆进行验证及测序。
[0030]
实施例2
[0031]
蛋白表达质粒构建
[0032]
通过无缝克隆的方法，将pgex(addgene，#52274)外骨架与片段6
×
his-nhha-dddk-6
×
his-nhhb-dddk-6
×
his-nhhg混匀，转入大肠杆菌bl21-pet28a-rekl感受态中，进行筛选，包括如下步骤：
[0033]
以质粒pgex为模板，扩增pgex外骨架(pgex-sk)；合成表达6
×
his-nhha-dddk-6
×
his-nhhb-dddk-6
×
his-nhhg(cabg，cut enzymea-enzymeb-enzymeg)的基因片段，并使用特异性引物进行扩增；使用无缝克隆试剂盒，将pgex-sk片段与cabg片段按照摩尔比1：3比例混匀，在50℃处理20min，得到pgex-cabg，如图2所示，转入bl21感受态，37℃培养1h，1200rpm离心，去上清，使用100ul lb重悬细胞，得到bl21-pet28a-rek-pgex-cabg,重选后涂布于lb(amp抗性)平板,挑取阳性单克隆进行验证及测序。
[0034]
其他条件：上下引物各10pmol。pcr反应条件为98℃2min；(98℃10s；55℃30s；72℃3min；)30cycles；72℃5min；4℃hold。
[0035]
实施例3
[0036]
目的蛋白表达及特异性切割
[0037]
通过测序无误后，挑取bl21-pet28a-rek-pgex-cabg接种于5ml lb(amp抗性)液体培养基，按照1％的比例加入50ml lb液体，37℃培养，od600达到0.6～0.8时，加入终浓度1mm的iptg与终浓度10ng/ml的tet，使用bl21为对照，放入摇床37℃220rpm诱导表达腈水合酶复合物nhha/nhhb/nhhg及肠激酶，表达4h。表达完成后加入终浓度为10ng/ml的tet进行肠激酶表达，使表达的融合蛋白切割完全。
[0038]
对比例
[0039]
传统蛋白表达方式测试
[0040]
使用1)多载体表达、2)同一载体，不同表达框、3)多顺反子表达、4)融合表达进行腈水合酶复合物nhha/nhhb/nhhg进行对照表达。1)多载体表达：腈水合酶复合物nhha/nhhb/nhhg分别植入三个不同抗性标记的载体，分别为nhha质粒表达载体、nhhb质粒表达载体、nhhg质粒表达载体；2)同一载体，不同表达框：将腈水合酶复合物nhha/nhhb/nhhg放入同一质粒表达载体，但使用两个不同启动子、rbs与终止子，形成“启动子1-rbs-nhha-终止子1-启动子2-rbs-nhhb-终止子2-启动子2-rbs-nhhg-终止子2”；3)多顺反子表达：将腈水合酶复合物nhha/nhhb/nhhg放入同一启动子与终止子区域、不同rbs区域，形成“启动子-rbs-nhhb-rbs-nhhb
‑‑
rbs-nhhg-终止子”；4)融合表达：将腈水合酶复合物nhha/nhhb/nhhg放入同一启动子与终止子、rbs区域，形成“启动子-rbs-nhha-nhhb-nhhg-终止子”；使用实施例2～实施例3进行1)～4)质粒表达载体构建以及目标蛋白表达。
[0041]
结果检验
[0042]
蛋白表达检测
[0043]
对上述实施例1～4中的1)多载体表达、2)同一载体，不同表达框、3)多顺反子表达、4)融合表达；5)特异性酶切位点的多亚基蛋白共表达法所表达出来的复合蛋白腈水合酶进行
①
蛋白表达量检测：使用his标签抗体进行不同方法表达出的腈水合酶进行western blotting检测，如图4所示；
②
使用hplc进行腈水合酶酶活鉴定：用10mm kpb(ph 7.4)溶液重悬诱导表达的菌株，取10μl至1.5ml离心管中，置于25℃金属浴上。向离心管中加入450μl底物(200mm烟腈溶液)，充分涡旋混匀，25℃下反应10min后离心去除菌体，采用hplc检测上清中烟酰胺的含量，结果如图5所示。