一种甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法及其应用

1.本发明涉及微生物培养技术领域，更具体地，涉及一种甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法及其应用。


背景技术：

2.甘蔗是重要的经济作物之一，其种植面积占总糖料作物种植面积的90％以上。甘蔗病害尤其是真菌性病害严重影响甘蔗的田间产量，其中以甘蔗鞭黑穗病造成的危害最严重。经鉴定，甘蔗鞭黑穗病病原菌为担子菌亚门黑粉菌属甘蔗鞭黑粉菌(sporisorium scitamineum，ss)。甘蔗鞭黑粉菌的生活史分生活史可分为3个不同的阶段：单倍体酵母样担孢子、双核菌丝和二倍体冬孢子。其中单倍体担孢子不具备侵染甘蔗的能力，而由不同交配型单倍体进行有性配合后形成的双核菌丝体具有致病性，能穿透植物组织进行侵染。侵染菌丝吸取寄主体内的营养物质并随着蔗株生长点向上生长而逐渐向上蔓延，最终在蔗稍抽出黑鞭，黑鞭中充满大量的冬孢子。病菌冬孢子可随气流、雨水等媒介进行远距离传播，亦可落入土壤长期存活。冬孢子在适宜的环境条件下萌发出长短不一的担子，每个担子细胞又可以产生1至数个单倍体担孢子，异型担孢子经有性配合后形成菌丝可再次侵染蔗株完成再侵染。
3.由于甘蔗鞭黑粉菌担孢子为单倍体，不具有致病性，而其经有性配合后形成具有侵染能力的双核菌丝。因此，有性配合是甘蔗鞭黑粉菌致病性的关键过程之一。近年来，其复杂的有性配合分子调控机制被逐渐解析，为依赖camp和mapk途径的信号通路。具体的：交配型等位基因a位点编码信息素被其相对性别受体蛋白pra1/2识别，经由受体蛋白将信号传递至胞内。由camp和mapk途径逐级传递至全局调控因子prf1，进而影响交配型等位基因b位点表达从而完成有性配合。由于甘蔗鞭黑粉菌从侵染甘蔗到发病有着较长的潜伏期且发病前病状不容易被察觉使得甘蔗黑粉病不容易被有效的防治。因此深入研究其致病机理，可以为有效防治甘蔗黑粉病提供理论基础。例如中国专利cn108552205a公开了法尼醇在防治黑粉病中的用途、中国专利cn106942230a公开了法尼醇在防治黑粉病中的用途、中国专利cn105925498a公开了假单胞菌属菌株st4及其在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用，目前现有技术中针对甘蔗鞭黑粉菌的研究主要是研究其担孢子及二态型转变。由于缺乏甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法，使得甘蔗鞭黑粉菌菌丝侵染作为侵染甘蔗的直接途径的相关研究并未展开，导致影响甘蔗鞭黑粉菌丝生长及其致病性的分子机制鲜有报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法，所述方法可有效分离并培养甘蔗鞭黑粉菌菌丝体。弥补目前甘蔗鞭黑粉菌仅研究担孢子及二态型转变存在的不足，并成功应用于甘蔗鞭黑粉菌环境胁迫和生防菌筛选等方面的研究。
5.本发明的第二个目的在于提供分离获得的甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体在甘蔗鞭黑
粉菌环境胁迫和生防菌筛选中的应用。
6.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
7.一种甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法，包括如下步骤：
8.s1.分别挑取活化好的不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌担孢子进行培养，获得甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液；
9.s2.将步骤s1获得的甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液离心弃上清，无菌水重悬，离心，弃上清，再用无菌水重悬并调节担孢子液od
600
至0.8～1.2，获得不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液；
10.s3.将步骤s2获得的不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液等体积混匀，取混合液滴至固体培养基上，于26～30℃培养6～8天，即获得甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体。
11.本发明通过将不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌单倍体担孢子(即异型交配型单倍体)进行有性配合后，在一定的温度下于固体培养基上培养特定的时间(6～8天)，即可获得甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体。所述的初生菌丝体可弥补目前研究担孢子及二态型转变存在的不足，可用于甘蔗鞭黑粉菌环境胁迫、生防菌筛选等各方面后续试验研究。
12.优选地，所述甘蔗鞭黑粉菌为野生型甘蔗鞭黑粉菌菌株或者仍具有二态型转变能力的甘蔗鞭黑粉菌突变体菌株。
13.优选地，步骤s1所述培养采用yeps培养基。
14.优选地，步骤s1所述培养条件为26～30℃180～220rpm培养1～3天。
15.进一步优选地，步骤s1所述培养条件为28℃200rpm培养2天。
16.优选地，步骤s2所述od
600
为1.0。
17.优选地，步骤s3所述固体培养基为pda固体培养基。
18.优选地，步骤s3中取混合液滴至pda固体培养基后需吹干后封口再进行培养。
19.优选地，步骤s3所述培养为28℃培养7天。
20.优选地，步骤s1所述不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌担孢子为wt17( )、wt18(-)。
21.本发明获得的甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体可用于后续相关试验，例如环境胁迫和生防菌筛选等试验，而不仅局限于本发明涉及的胁迫试验。
22.本发明还提供上述任一所述培养方法获得的甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体在甘蔗鞭黑粉菌环境胁迫和生防菌筛选中的应用。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.本发明提供了一种甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法，通过将不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌单倍体担孢子进行有性配合后，在一定的温度下于pda固体培养基上培养特定的时间(6～8天)，即可获得甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体。所述的初生菌丝体用于后续试验可弥补目前研究担孢子及二态型转变存在的不足，可用于甘蔗鞭黑粉菌环境胁迫、生防菌筛选等各方面的研究。
附图说明
25.图1为不同光照条件下甘蔗鞭黑粉菌菌丝体菌落形态。
26.图2为不同处理条件的环境胁迫对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长的影响。
27.图3为生防菌对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长的影响。
具体实施方式
28.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
29.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
30.pda培养基：pda(购买自广州鼎国生物科技公司)40g/l加水充分混匀后经121℃灭菌20分钟，冷却后储存备用。
31.yeps培养基：酵母浸粉20g/l，蛋白胨10g/l，蔗糖20g/l，加水充分混匀后经121℃灭菌20分钟，冷却后储存备用。
32.本发明下列实施例中所采用的不同交配型( 、-)甘蔗鞭黑粉菌单倍体为甘蔗黑粉病菌担孢子wt17( )、wt18(-)，wt17( )、wt18(-)是从甘蔗黑粉病冬孢子经萌发后分离所得，经鉴定二者分别为“ ”和
“‑”
的单倍体，能相互识别，进行有性配合产生双核菌丝。
33.实施例1甘蔗鞭黑粉菌菌丝体培养
34.(1)分别挑取活化好的不同交配型( 、-)甘蔗鞭黑粉菌单倍体担孢子(野生型菌株)于含有2ml yeps的培养基中，28℃200rpm培养2天，可获得甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液。
35.(2)将步骤(1)获得的甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液离心弃去上清液，添加无菌水悬浮菌体后再次离心，弃去上清液，再添加无菌水悬浮菌体并调节od
600
至1.0，获得不同交配型的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液。
36.(3)将步骤(2)获得的不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液等体积混匀，混匀后的担孢子菌液取2μl点至pda平板，吹干后封口于28℃培养7天，可获得甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体。
37.实施例2甘蔗鞭黑粉菌菌丝体培养
38.(1)分别挑取活化好的不同交配型( 、-)甘蔗鞭黑粉菌单倍体担孢子(野生型菌株)于含有2ml yeps的培养基中，30℃180rpm培养1天，可获得甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液。
39.(2)将步骤(1)获得的甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液离心弃去上清液，添加无菌水悬浮菌体后再次离心，弃去上清液，再添加无菌水悬浮菌体并调节od
600
至1.2，获得不同交配型的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液。
40.(3)将步骤(2)获得的不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液等体积混匀，混匀后的担孢子菌液取2μl点至pda平板，吹干后封口于26℃培养8天，可获得甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体。
41.实施例3甘蔗鞭黑粉菌菌丝体培养
42.(1)分别挑取活化好的不同交配型( 、-)甘蔗鞭黑粉菌单倍体担孢子(野生型菌株)于含有2ml yeps的培养基中，26℃220rpm培养3天，可获得甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液。
43.(2)将步骤(1)获得的甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液离心弃去上清液，添加无菌水悬浮菌体后再次离心，弃去上清液，再添加无菌水悬浮菌体并调节od
600
至0.8，获得不同交配型的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液。
44.(3)将步骤(2)获得的不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液等体积混匀，混
匀后的担孢子菌液取2μl点至pda平板，吹干后封口于30℃培养6天，可获得甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体。
45.对比例1
46.与实施例1基本相同，唯一不同在于步骤(3)中混匀后的担孢子菌液转至pda平板培养的条件为28℃培养3天。结果仅能观察到甘蔗鞭黑粉菌二态型转变，而无法获得甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体。
47.实施例4研究光照条件对蔗鞭黑粉菌的菌落形态的影响
48.(1)分别挑取活化好的不同交配型( 、-)甘蔗鞭黑粉菌单倍体担孢子(野生型菌株)于含有2ml yeps的培养基中，28℃200rpm培养2天，可获得甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液。
49.(2)将步骤(1)获得的甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液离心弃去上清液，添加无菌水悬浮菌体后再次离心，弃去上清液，再添加无菌水悬浮菌体并调节od
600
至1.0，获得不同交配型的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液。
50.(3)将步骤(2)获得的不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌担孢子等体积混匀，混匀后的担孢子菌液取2μl点至pda平板，吹干后封口于28℃培养7天，可获得甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体。
51.(4)无菌的双面刀片小心的把培养好的初生菌丝体从菌落上切开，用无菌牙签把初生菌丝体转移至新的pda培养，28℃继续培养21天，可获得甘蔗鞭黑粉菌菌丝体菌落。光照条件可以影响菌落形态，持续光照和持续黑暗对甘蔗鞭黑粉菌的菌落形态影响如图1所示，表明可利用甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体来研究不同光照条件下甘蔗鞭黑粉菌菌丝体菌落形态变化。
52.实施例5不同处理对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长的影响
53.(1)分别挑取活化好的不同交配型( 、-)甘蔗鞭黑粉菌单倍体担孢子(野生型菌株)于含有2ml yeps的培养基中，28℃200rpm培养2天，可获得甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液。
54.(2)将步骤(1)获得的甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液离心弃去上清液，添加无菌水悬浮菌体后再次离心，弃去上清液，再添加无菌水悬浮菌体并调节od
600
至1.0，获得不同交配型的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液。
55.(3)将步骤(2)获得的不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌担孢子等体积混匀，混匀后的担孢子菌液取2μl点至pda平板，吹干后封口于28℃培养7天，可获得甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体。
56.(4)将初生菌丝转移至pda培养基中，提前在培养基中添加不同的处理试剂(本发明以葡萄糖和氯化钠处理为例，不额外添加试剂作为对照，培养条件为光暗交替(24h/24h))可对菌丝进行初步的环境条件胁迫实验(图2)。
57.实施例6生防菌对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长的影响
58.(1)分别挑取活化好的不同交配型( 、-)甘蔗鞭黑粉菌单倍体担孢子(野生型菌株)于含有2ml yeps的培养基中，28℃200rpm培养2天，可获得甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液。
59.(2)将步骤(1)获得的甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液离心弃去上清液，添加无菌水悬浮菌体后再次离心，弃去上清液，再添加无菌水悬浮菌体并调节od
600
至1.0，获得不同交配型的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液。
60.(3)将步骤(2)获得的不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌担孢子等体积混匀，混匀
后的担孢子菌液取2μl点至pda平板，吹干后封口于28℃培养7天，可获得甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体。
61.(4)将初生菌丝转移至pda培养基中，在菌丝周点上对丝状真菌有抑制作用的生防菌可以观察菌丝受生防菌抑制的现象(图3)。
62.综上可见，本发明提供了一种甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法，通过将不同交配型( 、-)的甘蔗鞭黑粉菌单倍体担孢子进行有性配合后，在一定的温度下于pda固体培养基上培养特定的时间(6～8天)，即可获得甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体。所述甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体可用于甘蔗鞭黑粉菌环境胁迫、生防菌筛选等各方面后续试验的研究，可弥补目前研究仅能针对甘蔗鞭黑粉菌担孢子及二态型转变存在的不足。