一种基于小球藻细胞原位形成金纳米粒子实现高效产氢的方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于小球藻细胞原位形成金纳米粒子实现高效产氢的方法。


背景技术：

2.能源是人类生活中非常重要的物质，目前人们所使用的能源一般是不可再生能源，比如煤，石油，天然气，而且其产物会对人们的生存环境造成极大的污染，比如雾霾天气，空气中二氧化碳的含量逐年上升，导致全球变暖现象的发生，严重危害了人们的生存环境。基于此，找出一种可以替代不可再生的能源，利用清洁可再生的能源成了一个非常重要的问题，可以有效的解决当今社会的一个能源危机，氢气是一种清洁可再生的能源，传统的制氢方法包括化石燃料制氢，电解水制氢和光解水制氢，但是这些方法会非常耗费资源，而且化石燃料制氢还会产生二氧化碳等污染环境的温室气体，所以一种简单方便的制氢方法，微生物制氢，逐渐走向制氢的舞台，在过去的近80年中，人们对多种具有产氢能力的微生物进行了探索和研究，从此以后许多微藻在代谢过程中产生氢气的现象被不断发现，当前微藻光合制氢成为许多生物学家研究的热点，但如何提高产氢效率和简化产氢方式成为微藻光合制氢过程的主要瓶颈技术问题。
3.使用微藻产氢时，氢化酶的活性和流向氢化酶的电子量是制约微藻制氢的关键因子，在微藻光合制氢过程中，psii光解水提供电子源的同时，还伴随着大量氧气的释放，氧气可使氢化酶失活，产氢量的多少，取决于流向氢化酶的电子数量，增加电子源可以明显提高产氢量。有研究者通过降低psii活性进而降低氧气含量达到提高产氢的目的，但这种方法也降低了流向氢化酶的电子[chen m,zhangj,zhao l,et al.loss ofalgal proton gradient regulation 5increases reactive oxygen species scavenging andh
2 evolution[j].journal ofintegrative plantbiology,2016,58(12):943-946.]，通过藻菌共培养，利用细菌耗氧来构建厌氧微环境使氢化酶激活产氢[wu s,li x,yu j,et al.increased hydrogen production in co-culture of chlamydomonas reinhardtii and bradyrhizobium japonicum[j].bioresource technology,2012,123:184-188.]，通过合成共轭聚合物分子，然后聚合物分子作用在小球藻细胞表面，通过协调psii和psi之间的活性极大的促进小球藻的光合作用[zhou x,zengy,tangy,et al.artificial regulation of state transition for augmenting plant photosynthesis using synthetic light-harvesting polymermaterials[j].scienceadvances,2020,6(35):eabc5237]，但上述操作繁琐，所需周期较长。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是为了解决生物制氢成本较高，步骤繁琐，操作复杂的问题，提供一种基于小球藻细胞原位形成金纳米粒子实现高效产氢的方法。
[0005]
本发明利用微藻体内的蛋白质，酚羟基类色素，葡萄糖等具有还原性的生物质还原au
3
合成金纳米粒子，同时通过控制氯金酸和小球藻细胞的作用时间从而控制金纳米粒子在小球藻体内的含量达到保持小球藻细胞活性的目的，氯金酸与小球藻细胞作用一段时间之后，可以在小球藻体内合成金纳米粒子，这是一种在细胞原位合成金纳米粒子的方法，相比于化学法加入还原剂和分散剂来形成金纳米粒子，再通过胞吞的过程使纳米粒子进入细胞体内，原位形成金纳米粒子没有残留的化学试剂，这种直接形成金纳米粒子的方法不受纳米粒子尺寸的限制，合成金纳米粒子之后，可以有效的提高微藻的光合效率和流向氢化酶的电子数量，从而提高微藻产氢效率。
[0006]
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
[0007]
一种基于小球藻细胞原位形成金纳米粒子实现高效产氢的方法，所述方法步骤为：
[0008]
步骤一：小球藻的培育：把小球藻藻种转移到含有500ml的培养基中，光照培养箱中光照强度为2000～5000lux，温度为25～30℃，对小球藻进行光照12h和黑暗12h循环，当小球藻细胞数目达到对数生长期时使用；
[0009]
步骤二：金纳米粒子在小球藻细胞的原位合成：基于天然小球藻的最适生长温度为25～30℃，所以反应温度在室温进行，取30～40ml的小球藻细胞溶液，加入去离子水洗涤三次，洗去上面吸附的无机盐粒子，然后分散在去离子水中，取1g氯金酸加入去离子水中制取氯金酸溶液，然后再把氯金酸溶液加入搅拌着的小球藻细胞溶液中，搅拌转速为600-800rpm，搅拌1～9h，利用小球藻细胞体内具有还原性的生物质还原au
3
形成金纳米粒子，采用去离子水清洗掉表面吸附的离子，得到含有金纳米粒子的小球藻细胞；
[0010]
步骤三：取步骤二中形成金纳米粒子的小球藻30～40ml离心收集，用水洗涤两次，洗去小球藻表面的无机盐粒子，再分散到30～40ml tap培养基中，再加入12～13mg na2so3，将密闭玻璃瓶放到光照培养箱中，光照强度为2500～4500lux，温度为25～28℃，对小球藻进行持续光照，开始产氢。
[0011]
进一步地，步骤一中，所述小球藻为蛋白核小球藻。
[0012]
蛋白核小球藻属于绿藻的一种，相比与普通的小球藻，蛋白核小球藻含有丰富的蛋白质，维生素，矿物质，叶绿素等，所以选用蛋白核小球藻来产氢。在自然界中，还有很多藻种含有氢化酶，可以用来进行产氢，比如纤维藻、莱茵衣藻、栅藻和月牙藻等等，绿藻相比于其他藻类的优势在于，绿藻是分散的单细胞，而且所含叶绿素的种类对光吸收的效率较高。
[0013]
进一步地，步骤一中，所述培养基为tap培养基，还可以是se培养基或bg-11培养基等，优选tap培养基。tap培养基提供蛋白核小球藻正常生长所需的元素，tap培养基是一种含有无机盐离子的培养基，可以维持小球藻的正常的繁育和生存，无机盐离子不会对小球藻产氢造成影响，因此，在tap培养基中，更能体现出金纳米粒子提高微藻产氢的优势。
[0014]
进一步地，步骤一中，所述培养基的ph为7.0，所述小球藻的od为3.5，此时小球藻生长状况最好，所述小球藻的培养温度为25℃，为小球藻最佳生长温度。
[0015]
进一步地，步骤二中，氯金酸与藻作用时间为3h。作用时间过长会使小球藻活性变差，选取作用时长目的是在使小球藻活性良好的状态下有最大含金量。
[0016]
进一步地，步骤二中，加入小球藻细胞溶液中的氯金酸溶液体积为3-30μl。
[0017]
进一步地，步骤二中，加入小球藻细胞溶液中的氯金酸溶液体积为24μl。这里使氯金酸的终浓度为10μg/ml，氯金酸浓度过低，小球藻的含金量不高，氯金酸浓度过高，会使小球藻的活性下降。
[0018]
进一步地，步骤二中，所述氯金酸的浓度为0.04g/ml～0.07g/ml。
[0019]
进一步地，步骤二中，所述氯金酸的浓度为0.05g/ml。
[0020]
进一步地，步骤三中，亚硫酸钠的终浓度为10mm。在此浓度下，亚硫酸钠不会抑制小球藻的生长，并且耗氧效率最高。
[0021]
本发明相对于现有技术的有益效果为：
[0022]
1、利用小球藻细胞体内的还原性生物质还原au
3
形成金纳米粒子，通过直接加入氯金酸和小球藻共培养还原形成金纳米粒子，该方法操作简便、快速、成本低；
[0023]
2、通过控制氯金酸与小球藻的作用时间来调控小球藻的活性，从而使形成的金纳米粒子具有良好的生物相容性；
[0024]
3、通过金纳米粒子作用小球藻提高小球藻的电子传输量从而有效的提高了小球藻的产氢总量，天然小球藻产氢总量为3.9μm，形成金纳米粒子之后的小球藻的产氢总量为8.3μm，是天然小球藻产氢总量的2倍。
附图说明
[0025]
图1为实施例1中得到的天然小球藻的扫描电子显微镜图片；
[0026]
图2为实施例1中得到的形成金纳米粒子的小球藻的扫描电子显微镜图片；
[0027]
图3为实施例1中得到的天然小球藻的透射电子显微镜图片；
[0028]
图4为实施例1中得到的形成金纳米粒子的小球藻的透射电子显微镜图片；
[0029]
图5为实施例1中氯金酸与小球藻细胞作用不同时间的金含量示意图；
[0030]
图6为实施例1中氯金酸与小球藻作用不同时间细胞存活率示意图；
[0031]
图7为实施例1中氯金酸作用3h形成金纳米粒子的小球藻细胞采用fda染色的激光共聚焦显微镜照片，其中活的小球藻发出绿色荧光；
[0032]
图8为实施例1中氯金酸作用3h形成金纳米粒子的小球藻的激光共聚焦显微镜图片，其中小球藻叶绿体发出红色荧光；
[0033]
图9为图7和图8的叠合图；
[0034]
图10为天然小球藻加入耗氧剂和形成金纳米粒子之后的小球藻加入耗氧剂的产氢量随时间变化的曲线图。
具体实施方式
[0035]
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
[0036]
本发明利用小球藻细胞体内带有还原性的生物质，比如蛋白质，酚羟基类色素，葡萄糖等等，直接与氯金酸作用，通过细胞直接还原的方法，在小球藻细胞原位形成金纳米粒子，相比于化学法加入还原剂和分散剂来形成金纳米粒子，再通过胞吞的过程使纳米粒子进入细胞体内，原位形成金纳米粒子没有残留的化学试剂，这种直接形成金纳米粒子的方
法不受纳米粒子尺寸的限制，并且通过控制氯金酸与小球藻作用的时间使形成的金纳米粒子对细胞具有良好的生物相容性，金纳米粒子具有等离子体共振效应，在生物体内有良好的光热效应，通过金纳米粒子修饰小球藻之后，产氢总量明显上升。
[0037]
本发明基于前期小球藻产氢过程中氢化酶表达受限并且电子传输效率低的问题，基于金纳米粒子良好的光热效应以及等离子体共振效应，利用小球藻细胞体内的还原性物质还原au
3
原位形成金纳米粒子的方法来提高小球藻向氢化酶的电子传递效率从而实现高效产氢的目的，相比于化学法加入还原剂和分散剂来形成金纳米粒子，再通过胞吞的过程使纳米粒子进入细胞体内，原位形成金纳米粒子没有残留的化学试剂，这种直接形成金纳米粒子的方法不受纳米粒子尺寸的限制，整个体系构筑简单，绿色环保，并且通过控制氯金酸与小球藻的作用时间很好的维持了小球藻细胞的活性，天然小球藻产氢总量为3.9μm，形成金纳米粒子之后的小球藻的产氢总量为8.3μm，使小球藻细胞的产氢总量增加了一倍。
[0038]
实施例1：
[0039]
一种基于小球藻细胞原位形成金纳米粒子实现高效产氢的方法，所述方法步骤为：
[0040]
步骤一：小球藻的培育：把小球藻藻种转移到含有500ml的tap培养基中，光照培养箱中光照强度为3600～4500lux，温度为27～29℃，对小球藻进行光照12h和黑暗12h循环，当小球藻细胞数目达到对数生长期时使用；
[0041]
步骤二：金纳米粒子在小球藻细胞的原位合成：基于天然小球藻的最适生长温度为25～30℃，所以反应温度在室温进行，取30～40ml的小球藻细胞溶液，加入去离子水洗涤三次，洗去上面吸附的无机盐粒子，然后分散在去离子水中，取1g氯金酸加入去离子水中制取氯金酸溶液，然后再把氯金酸溶液加入搅拌着的小球藻细胞溶液中，搅拌转速为700-800rpm，搅拌7～8h，氯金酸与小球藻作用不同时间后，小球藻体内的金含量如图5所示。图6所示为氯金酸与小球藻作用不同时间之后，小球藻的存活率。氯金酸与小球藻作用3h之后的fda染色图片如图7、8、9所示。利用小球藻细胞体内具有还原性的生物质还原au
3
形成金纳米粒子，采用去离子水清洗掉表面吸附的离子，最后得到含有金纳米粒子的小球藻细胞。天然小球藻的扫描电子显微镜照片和透射电子显微镜照片分别如图1和图3所示，形成金纳米粒子后的小球藻的扫描电子显微镜照片和透射电子显微镜照片分别如图2和图4所示，从图中我们可以清晰的看出原位形成的金纳米粒子；
[0042]
步骤三：金纳米粒子对小球藻产氢的影响：分别取培养箱中的天然小球藻和步骤二中形成金纳米粒子的小球藻30～40ml离心收集，用水洗涤两次，洗去小球藻表面的无机盐粒子，再分散到30～40mltap培养基中，分别把10～12ml小球藻细胞液加入到50ml的密闭玻璃瓶中产氢，标号1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，一组瓶中加入小球藻和12～13mg na2so3，二组瓶加入形成金纳米粒子的小球藻和12～13mg na2so3，将密闭玻璃瓶放到光照培养箱中，光照强度为3600～4500lux，温度为25～28℃，对小球藻进行持续光照，开始产氢。每隔一段时间收集产氢数据。如图10所示，形成金纳米粒子的小球藻的产氢量明显高于对照组小球藻，这说明形成金纳米粒子有利于小球藻的产氢。
[0043]
实施例2：
[0044]
一种基于小球藻细胞原位形成金纳米粒子实现高效产氢的方法，所述方法步骤为：
[0045]
步骤一：小球藻的培育：把小球藻藻种转移到含有500ml的tap培养基中，光照培养箱中光照强度为2500～3500lux，温度为25℃，对小球藻进行光照12h和黑暗12h循环，当小球藻细胞数目达到对数生长期时使用；经过洗涤的小球藻细胞重新分散于培养基，得到小球藻液，并通过紫外可见分光光度计将750nm处的光密度od值调至3.0～4.0，此时小球藻密度合适，生长稳定。
[0046]
步骤二：金纳米粒子在小球藻细胞的原位合成：基于天然小球藻的最适生长温度为25～30℃，所以反应温度在室温进行，取32～38ml的小球藻细胞溶液，加入去离子水洗涤三次，洗去上面吸附的无机盐粒子，然后分散在去离子水中，取1g氯金酸加入去离子水中制取氯金酸溶液，然后再把氯金酸溶液加入搅拌着的小球藻细胞溶液中，搅拌转速为650-700rpm，搅拌3h，搅拌3h是为了在保持小球藻活性良好的状态下使其含有最多的金，利用小球藻细胞体内具有还原性的生物质还原au
3
形成金纳米粒子，采用去离子水清洗掉表面吸附的离子，最后得到含有金纳米粒子的小球藻细胞。
[0047]
步骤三：金纳米粒子对小球藻产氢的影响：分别取培养箱中的天然小球藻和步骤二中形成金纳米粒子的小球藻32～38ml离心收集，用水洗涤两次，洗去小球藻表面的无机盐粒子，再分散到32～38mltap培养基中，分别把10～12ml小球藻细胞液加入到50ml的密闭玻璃瓶中产氢，标号1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，一组瓶中加入小球藻和12.6mg na2so3，二组瓶加入形成金纳米粒子的小球藻和12.6mgna2so3，此时亚硫酸钠含量对小球藻产氢最有利。将密闭玻璃瓶放到光照培养箱中，光照强度为2500～3500lux，温度为25～28℃，对小球藻进行持续光照，开始产氢。每隔一段时间收集产氢数据。