一种可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法与流程

一种可3d打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法
技术领域
1.本发明涉及胶原蛋白生物墨水材料技术领域，具体涉及一种可3d打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法。


背景技术：

2.机在修复重建外科领域，过去几十年中已经开发了一系列具有生物活性和生物可吸收性的复合材料，如聚乙醇酸(pga)、聚乳酸(pla)、聚己内酯(pcl)、壳聚糖、胶原蛋白和明胶等用于科研和临床工作。但它们较差的力学性能、有限的生物功能和较高的细胞毒性仍是外科应用的挑战。在这些材料中，胶原蛋白因其是人体组织如骨骼、皮肤、血管、韧带、软骨等的天然组成成分，应用范围广而受到广泛的关注和研究，在组织工程应用中被广泛用于构建基质。
3.i型胶原蛋白是胶原蛋白家族中的一员，在人体中占总蛋白质的三分之一，占皮肤干重的四分之三，是细胞外基质中最普遍的成分，具有良好的可生物降解性、弱抗原性和优异的生物相容性。i型胶原蛋白由三个多肽链在空间中组成三螺旋结构，每条链的组成是gly-x-y序列，其中x和y代表任意氨基酸，但主要是羟脯氨酸和脯氨酸。胶原蛋白的三螺旋结构使其具有较高的机械强度和良好的生物活性。胶原蛋白三螺旋结构可以进一步通过自组装和交联形成具有更高机械强度和稳定性的纤维结构，并可以通过调节交联度来控制机械强度和降解速率，具有良好的可控性，使其应用范围可以广泛覆盖从较软的脑组织到较硬的骨组织。在材料制备方面，i型胶原蛋白可以相对容易地从动物结缔组织(牛、猪、鸡和鱼类等)中提取，来源多样，存量丰富。常用的提取方法有酸提取法、碱提取法、酶提取法或以上多种方法联合应用，提取方法成熟，适于实验室操作或大规模工业应用。先前报道胶原蛋白的热降解产物明胶的肽链上的伯胺基可被甲基丙烯酰胺(ma)取代，改性后的明胶在光引发剂的存在下可被紫外光交联。作为结构上的类似物，胶原蛋白肽链上的伯氨基理论上也可被ma取代并进行光交联。目前该技术已被证明可行，通过调节胶原浓度、光引发剂添加比例、紫外光强度和暴露时间，可以控制胶原基质的强度，从而适用于不同应用。该项技术使得利用胶原蛋白进行光交联三维(3d)打印成为可能。
4.3d打印，或增材制造是一种工艺，该工艺可通过专用3d打印机将生物材料按照预设的3d建模打印出来并固化。在3d建模程序的帮助下，打印机根据文件中包含的信息将待打印的3d模型切分成多层二维(2d)图案，并将这些2d图案依照层的顺序叠加打印，直到全部模型打印完成。3d打印理论上可以打印出任意几何结构，使临床上针对患者的个性化材料制造具有可行性。目前主要的3d打印技术包括挤出式、喷墨式和激光辅助式。挤出式打印依赖机械力或气动力通过喷嘴挤出生物墨水，打印分辨率显著受限于喷头直径、墨水粘度和弹性等，并且对于胶原蛋白生物墨水无法实现边打印边交联，对于较大或较高的结构容易出现坍塌形变现象。喷墨式打印机是用加热或压电的方法以一定的频率将生物墨水通过针头喷洒到平台上形成结构，其要求墨水粘度低，滴到平台上迅速固化。胶原蛋白对温度敏
感，温度升高会显著改变胶原蛋白生物墨水的粘度，且造成具有生物活性的三螺旋结构降解。同时，若生物墨水混合细胞，细胞在静置时因重力会沉积在墨盒底部，易堵塞针头或细胞在打印结构中分布不均，因此亦不适合胶原蛋白生物墨水的打印。激光辅助式打印是采用激光代替喷墨式打印中的加热或压电，通过激光进行生物墨水的固化，可能会在固化过程中对生物墨水中的细胞造成较大损伤。最近，新出现的数字光处理(dlp)式打印使基于胶原蛋白的生物墨水打印得到优化。dlp式打印主要采用投影仪原理，通过将2d图像投影至液态光敏感样品池，每次固化整个层面，逐层固化成型。该方法可在低温下进行，投影采用可见光，分辨率不受喷嘴尺寸限制，较传统打印方法提高了4倍，而打印速度则较传统打印方法提高了8倍。其低温、温和和快速的特点保证了胶原蛋白三螺旋结构的稳定，但该打印方法因依靠倒置的打印平台依靠液体表面张力对生物墨水进行吸附，从而要求生物墨水粘度低、流动性高。
5.目前，用于dlp式3d打印的可光交联的生物墨水仍以明胶为主，主要是由于明胶提取工艺较简单；溶解度高且能在较高浓度下保持良好流动性；ph变化不会引起肽链的自组装而导致打印前交联，有利于在中性环境下与细胞混合打印；肽链结构不易受高温影响，可在打印过程中通过加热的方式保持生物墨水良好的流动性；ma改性过程中可调节ph至碱性，升温至60℃，保证取代反应在最高效率条件下进行。但基于明胶的生物墨水具有明显缺点，即机械强度低(通常报道压缩模量仅1～10kpa)，无法满足多数医学应用的需求。与明胶相比，传统胶原蛋白因其保持了完整的三螺旋结构，具有明显较高的机械强度(通常报道压缩模量数十至数百kpa)。然而，胶原蛋白制备工艺较复杂，提纯需要盐析和透析等步骤，耗时长；为保存生物活性三螺旋结构需在4℃低温下进行，但低温不利于胃蛋白酶对胶原蛋白的水解；胶原蛋白原纤维对ph变化敏感，如酸性环境下提取的胶原蛋白在中性和碱性环境中会发生自组装导致交联，溶解度降低而析出；而中性和碱性环境下提取的胶原蛋白三螺旋结构均受到不同程度的破坏；胶原蛋白浓度变化对溶液流动性影响大，无法配制高浓度墨水；在ma改性过程中，由于ma取代反应在碱性、高温条件下效率最高，反之亦然，因此胶原蛋白酸性溶液和4℃低温的反应条件不利于ma取代反应；此外，已知的胶原蛋白生物墨水由于不含光抑制剂，无法控制光交联深度，在打印多孔、中空结构时常因交联区域不可控导致过度交联，从而预留空部分也被交联而堵塞，严重影响打印精度。
6.综上所述，现有基于明胶的生物墨水虽然制备工艺简单，可进行dpl式3d打印，但所获得的结构机械强度低，限制了它的应用范围。目前已开发的基于胶原蛋白的生物墨水制备周期长，且仅适用于挤出式3d打印，打印精度低，可用于dlp式3d打印的生物墨水尚无报道。
7.在所述背景技术部分公开的上述信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此它可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。


技术实现要素：

8.针对现有生物墨水及其制备工艺存在的缺点和不足，本发明的目的之一旨在提供一种无需耗时长的盐析和透析步骤的高效、省时的可用于dlp式3d打印的i型胶原蛋白生物墨水的制备工艺，适用于实验室研究和工厂大规模生产。
9.本发明的目的之二旨在提供一种基于该墨水的dlp式3d打印技术方案，优化打印
参数，用于制作可用于细胞培养的3d打印仿生支架。
10.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种可3d打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
11.步骤(1)、取新鲜或冰冻牛肌腱用水洗净，切成1
×
1mm小块；将所得牛肌腱小块用75％乙醇浸泡15分钟无菌化处理；然后倒去乙醇，加入无菌水润洗三次以洗净残留乙醇。
12.步骤(2)、将步骤(1)中处理好的无菌牛肌腱小块加入到脱脂剂中，在摇床上过夜脱脂。
13.步骤(3)、将步骤(2)脱脂后的肌腱加入到含有胃蛋白酶的ph2.5的酸性溶液中，以搅拌速率200rpm～800rpm机械搅拌12h～72h，酶解提取消化产物。
14.步骤(4)、将步骤(3)消化产物以3000rpm离心15min～20min；收集含有i型胶原蛋白的粘稠上清液，弃去不溶物及未消化牛肌腱颗粒。
15.步骤(5)、i型胶原蛋白的初步纯化：将步骤(4)清液滴加naoh调节ph值至7.0，静置15min～30min，见清液逐渐凝胶化析出；收集析出的凝胶状物，置于离心管中以3000rpm离心15min～20min；收集含有i型胶原蛋白的凝胶状沉淀，弃去上清液。
16.步骤(6)、将步骤(5)凝胶状沉淀重新溶解于酸性溶液中，得到初步纯化后的含有i型胶原蛋白的溶液。
17.步骤(7)、i型胶原蛋白的进一步纯化：将步骤(6)溶液置于带有分子质量截止值100kda的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min；分子质量低于100kda的杂蛋白和肽链碎片被过滤至下方的废液管中，弃去；分子质量高于100kda的i型胶原蛋白溶液则被截留于上方的收集管中；收集i型胶原蛋白溶液。
18.步骤(8)、将步骤(7)i型胶原蛋白溶液冷冻干燥24h～48h后得到高纯度i型胶原蛋白冻干粉。
19.步骤(9)、i型胶原蛋白的ma改性：将步骤(8)冻干粉加入酸性溶液，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.5mg/ml i型胶原蛋白溶液。
20.步骤(10)、将ma(平均摩尔质量700g/mol)按体积比1：100逐滴加入步骤(9)溶液中，在室温20℃～25℃条件下以500rpm磁力搅拌24h～48h。
21.步骤(11)、将步骤(10)溶液置于带有分子质量截止值100kda的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min，过量的小分子ma及反应副产物被过滤至滤芯下方的废液管中，弃去；分子质量高于100kda的colma则被截留于上方的收集管中；收集colma溶液。
22.步骤(12)、将步骤(11)溶液冷冻干燥24h～48h后得到高纯度colma冻干粉。
23.步骤(13)、将步骤(12)冻干粉加入酸性溶液，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.5mg/ml～0.6mg/ml colma溶液，用于生物墨水的配制。
24.步骤(14)、将colma溶液、pegda、黄色食用色素、光引发剂、酸性溶液按比例混合，300rpm磁力搅拌15分钟使混合均匀，得到生物墨水材料。
25.优选的，所述的水为去离子水、蒸馏水或超纯水中的一种或几种。
26.优选的，所述的脱脂剂包括并不限于乙醇、异丙醇、丙酮、石油醚中的一种或几种；脱脂剂体积百分比为10％～100％；脱脂固液比为1：10～1：20。
27.优选的，所述酸性溶液包括并不限于醋酸、盐酸、柠檬酸中的一种或几种；酸性溶液固液比为1：20～1：40；胃蛋白酶与牛肌腱的质量比为1：10～1：1000。
28.优选的，所述黄色食用色素包括并不限于酒石酸(e102)、姜黄素(e100)中的一种或几种。
29.优选的，所述光引发剂包括并不限于irgacure 2959、苯基(2,4,6-三甲基甲酰基)磷酸锂盐(lap)中的一种或几种。
30.优选的，所述生物墨水材料的ph值为2.5～3.0。
31.一种基于可3d打印的可见光交联i型胶原蛋白生物墨水材料的应用，用于制作可用于细胞培养的3d打印仿生支架，其特征在于，按以下步骤进行：在4℃或室温下，将配制好的上述生物墨水材料均匀加样到dlp式3d打印机的样品池内，选择相应cad模型，设定打印层高精度为50μm～100μm，光照强度6.32mw/cm2，每层光照时间10s～30s，平台不加温。得到定型的凝胶样品后，将样品浸入平衡盐溶液(pbs)中静置12h，期间更换三次新鲜pbs，使黄色食用色素和酸性溶液彻底析出，最终得到无色透明、中性的凝胶样品；无菌化处理后的凝胶样品可用于细胞培养。
32.优选的，根据凝胶样品的不同应用，得到定型的凝胶样品后可进行1min～5min的后固化光照，增加凝胶样品的机械强度。
33.在上述技术方案中，本发明提供的技术效果和优点：
34.1、所得i型胶原蛋白生物墨水的特点是可进行dlp式3d打印，具有极适合该3d打印方法的低粘度和良好流动性；打印分辨率高，最高层高精度可达50μm，所得结构边缘锐利，适合构建多孔、中空结构；以低浓度(0.3％w/w)胶原蛋白达到较高机械强度(＞100kpa)，节约原料；在4℃或室温下使用405nm波长可见光交联，反应条件较温和，保证胶原蛋白生物活性三螺旋结构的完整性；
35.2、本发明生物墨水材料是基于i型胶原蛋白的天然高分子，生物相容性和生物降解性好，降解后无毒安全，免疫原性低，可促进细胞的黏附、增殖和分化；原材料不涉及对细胞有毒的试剂；
36.3、本发明生物墨水材料机械强度可控，针对人体不同组织应用特性，通过改变材料配比、光照强度和时间即可配制出一些列不同强度的凝胶样品；3d打印可针对个人进行定制化设计，适合临床个性化医疗应用。
附图说明
37.为了更清楚的说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.图1为用本发明方法提取的i型胶原蛋白、colma、商业i型胶原蛋白的紫外-可见光光谱；
39.图2为用本发明方法提取的i型胶原蛋白、colma、商业i型胶原蛋白、商业b型明胶的傅立叶变换红外光谱；
40.图3为i型胶原蛋白、colma、商业i型胶原蛋白、商业b型明胶的wester-blot凝胶电泳结果；
41.图4为dlp式3d打印人耳形状凝胶样品；
42.图5为dlp式3d打印4
×
4网格形状凝胶样品。
具体实施方式
43.为了使本领域的技术人员更好地理解本技术中的技术方案，下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
44.须知，本说明书附图所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本技术所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
45.此外，所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式结合在一个或更多示例实施方式中。在下面的描述中，提供许多具体细节从而给出对本公开的示例实施方式的充分理解。然而，本领域技术人员将意识到，可以实践本公开的技术方案而省略所述特定细节中的一个或更多，或者可以采用其它的方法、组元、步骤等。在其它情况下，不详细示出或描述公知结构、方法、实现或者操作以避免喧宾夺主而使得本公开的各方面变得模糊；
46.为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
47.实施例1：
48.所有溶液均在使用前平衡至4℃，所有操作均在4℃下进行，除非另有说明。
49.取新鲜或冰冻牛肌腱用水洗净，切成1
×
1mm小块；将所得牛肌腱小块用75％乙醇浸泡15分钟无菌化处理；然后倒去乙醇，加入无菌水润洗三次以洗净残留乙醇；
50.然后将处理好的中处理好的无菌牛肌腱小块加入到脱脂剂中，在摇床上过夜脱脂；
51.之后将脱脂后的肌腱加入到含有胃蛋白酶的ph2.5的酸性溶液中，以搅拌速率200rpm～800rpm机械搅拌12h～72h，酶解提取消化产物；
52.然后将消化产物以3000rpm离心15min～20min；收集含有i型胶原蛋白的粘稠上清液，弃去不溶物及未消化牛肌腱颗粒；
53.然后将步骤(4)清液滴加naoh调节ph值至7.0，静置15min～30min，见清液逐渐凝胶化析出；收集析出的凝胶状物，置于离心管中以3000rpm离心15min～20min；收集含有i型胶原蛋白的凝胶状沉淀，弃去上清液；
54.然后将凝胶状沉淀重新溶解于酸性溶液中，得到初步纯化后的含有i型胶原蛋白的溶液；
55.之后将溶液置于带有分子质量截止值100kda的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min；分子质量低于100kda的杂蛋白和肽链碎片被过滤至下方的废液管中，弃去；分子质量高于100kda的i型胶原蛋白溶液则被截留于上方的收集管中；收集i型胶原蛋白溶液；
56.然后将i型胶原蛋白溶液冷冻干燥24h～48h后得到高纯度i型胶原蛋白冻干粉；
57.之后将冻干粉加入酸性溶液，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.5mg/ml i型胶原蛋白溶液；
58.之后将ma(平均摩尔质量700g/mol)按体积比1：100逐滴加入步骤(9)溶液中，在室
温20℃～25℃条件下以500rpm磁力搅拌24h～48h；
59.之后将溶液置于带有分子质量截止值100kda的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min，过量的小分子ma及反应副产物被过滤至滤芯下方的废液管中，弃去；分子质量高于100kda的colma则被截留于上方的收集管中；收集colma溶液；
60.之后将溶液冷冻干燥24h～48h后得到高纯度colma冻干粉；
61.然后将冻干粉加入酸性溶液，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.5mg/ml～0.6mg/ml colma溶液，用于生物墨水的配制；
62.最后将colma溶液、pegda、黄色食用色素、光引发剂、酸性溶液按比例混合，300rpm磁力搅拌15分钟使混合均匀，得到生物墨水材料。
63.实施例2：
64.在4℃或室温下，将配制好的上述生物墨水材料均匀加样到dlp式3d打印机的样品池内，选择相应cad模型，设定打印层高精度为50μm～100μm，光照强度6.32mw/cm2，每层光照时间10s～30s，平台不加温。得到定型的凝胶样品后，将样品浸入平衡盐溶液(pbs)中静置12h，期间更换三次新鲜pbs，使黄色食用色素和酸性溶液彻底析出，最终得到无色透明、中性的凝胶样品；无菌化处理后的凝胶样品可用于细胞培养。
65.以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
66.最后应说明的几点是：首先，在本技术的描述中，需要说明的是，除非另有规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变，则相对位置关系可能发生改变；
67.其次：本发明公开实施例附图中，只涉及到与本公开实施例涉及到的结构，其他结构可参考通常设计，在不冲突情况下，本发明同一实施例及不同实施例可以相互组合；
68.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。
69.对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围；
70.最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。