一种预示和鉴定大骨鸡股骨长性状的分子标记方法

1.本发明属于动物分子遗传学领域，特别是涉及一种用分子标记辅助选择大骨鸡股骨长性状的方法。


背景技术：

2.蛋肉兼用型地方品种鸡由于其本身经济价值的特点，在中国等发展中国家具有良好的发展前景。然而自20世纪70年代以来，由于大量引进国外鸡种，中国本土地方品种鸡的饲养及销售都受到极大的冲击，对地方品种鸡的经济性状的改良已迫在眉睫。因此，从分子水平上探究地方品种鸡的生长性状的调控机制，基于分子遗传育种手段对地方鸡进行品种改良，对于优化我国家禽产业结构，保证我国畜牧业持续高效发展具有重大的战略意义和现实意义。
3.大骨鸡又称庄河大骨鸡、庄河鸡，原产于辽宁省庄河市，主要分布在东北、河北及内蒙古的部分地区，具有体躯高大、蛋大壳红、耐粗饲、耐寒、抗病力强等优点，被誉为东北鸡王。大骨鸡是我国地方鸡品种中被列入鸡标准品种的2个品种之一，2000年被列入国家重点保护地方畜禽品种资源名录，是我国具有极高价值的家禽育种素材之一。
4.前体蛋白转化酶(proprotein convertases，pcs)是一类具有钙离子依赖性的丝氨酸蛋白酶，主要参与细胞分泌途径中多种蛋白前体的加工过程。由于其催化结构域与枯草杆菌蛋白酶和酵母kexin蛋白相似，因此其相应的编码基因则命名为pcsks。pcsk1基因的编码产物pc1/3隶属于这一蛋白酶家族。研究结果表明，pc1/3蛋白主要参与细胞调节型分泌途径中分泌囊泡内的激素和神经肽前体的加工成熟过程，包括生长激素释放激素等，因此pc1/3蛋白可以通过参与动物机体生长激素的加工与释放过程进而影响动物体的生长发育过程。相关研究结果表明，pcsk1基因敲除小鼠会表现出生长迟缓，处理组小鼠体重与对照组小鼠相比减少约40％。目前为止，尚未发现有关pcsk1基因分子标记对大骨鸡股骨长性状进行选择的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种预示和鉴定大骨鸡股骨长性状的分子标记方法，其特征在于，根据鸡pcsk1基因突变位点c.809c》a上下游250bp序列设计引物，再根据所得引物进行鸡基因组dna的pcr扩增，之后利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行电泳分离，最后获得鸡腹脂标记基因型；
6.所述引物的核苷酸序列为：
7.pcsk1-f1:5
’‑
attatctaaatgaatagcaaaaggc-3’8.pcsk1-r1:5
’‑
attaaaatctctgttctccttttca-3’。
9.所述方法的步骤如下：
10.1)根据鸡pcsk1基因snp位点c.809c》a上下游序列设计引物，获得扩增引物；
11.2)利用步骤1)所得的扩增引物进行鸡基因组dna的pcr扩增，获得扩增产物；
12.3)利用限制性内切酶对步骤2)所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；
13.4)利用琼脂糖凝胶对步骤3)所得的酶切产物进行电泳分离，获得标记基因型；
14.步骤1)所述引物为
15.pcsk1-f1:5
’‑
attatctaaatgaatagcaaaaggc-3’16.pcsk1-r1:5
’‑
attaaaatctctgttctccttttca-3’；
17.步骤3)所述限制性内切酶，是限制性内切酶apal；
18.步骤4)所述琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶的浓度为1.5％。
19.步骤4)所述标记基因型，当鸡pcsk1基因位点c.809c》a为c碱基时，酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带大小为221bp，将其命名为cc基因型；当鸡pcsk1基因位点c.809c》a为a碱基时，酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带大小为430bp，将其命名为aa基因型；该位点杂合的个体酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带为两条，大小分别为221bp和430bp，将其命名为ca基因型。
20.所述方法用于大骨鸡的遗传育种。
21.本发明有益效果：
22.本发明证明突变位点c.809c》a对大骨鸡股骨长性状的影响达显著水平(p《0.05)。本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。利用本发明的分子标记方法对大骨鸡股骨长性状进行选择，为大骨鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效简便易行的分子标记方法，可以加速大骨鸡的育种进程。
附图说明
23.图1为pcsk1基因snp位点c.809c》a分析图谱。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
25.实施例一：预示和鉴定大骨鸡股骨长性状的分子标记
26.1.实验动物和性状测定
27.选取大骨鸡公鸡54只，屠宰并测量其股骨长性状，同时采集其血液样本。
28.2.鸡基因组dna的小量提取
29.(1)将20μl全血加入装有700μl 1
×
set的1.5ml离心管中，轻轻混匀。
30.(2)加入蛋白酶k(10mg/ml)至终浓度100-200μg/μl和10％的sds至终浓度0.5％，55℃消化12h。
31.(3)待消化完全后，加入等体积的tris饱和酚，来回颠倒，使其混匀。
32.(4)12,000rpm离心10min，用剪去尖端的吸头将上层水相小心移入另一个离心管中，弃去有机相。重复第三和第四步骤一次。
33.(5)向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比为24：23：1)，混合10min。12,000rpm.，离心10min，移出水相到另一个离心管。
34.(6)向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇混合液(23：1)，来回颠倒混合10min，12,000rpm，离心10min，移出水相到另一个离心管。
35.(7)向水相中加入1/10体积naac(3m，ph5.2)和2倍体积的无水乙醇，来回颠倒，沉淀dna。
36.(8)将dna挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。
37.(9)7,500rpm离心5min。小心倒掉管中乙醇，将倒置在滤纸上，让乙醇流尽，置于空气中干燥。
38.(10)加入200μl的te，置50℃水浴中过夜溶解dna。溶解后贮存于-20℃备用。
39.3.引物的设计与合成
40.根据鸡pcsk基因snp位点c.809c》a上下游序列设计引物，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成：
41.pcsk1-f1:5
’‑
attatctaaatgaatagcaaaaggc-3’42.pcsk1-r1:5
’‑
attaaaatctctgttctccttttca-3’。
43.4.pcr反应
44.(1)以鸡dna为模板进行pcr扩增，25ul反应体系中包含以下溶液或试剂：
[0045][0046]
(2)将上述溶液混合并按以下条件进行pcr反应
[0047]
94℃变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，32个循环；72℃延伸10min；
[0048]
(3)反应结束后，取pcr反应液(5～10μl)进行琼脂糖凝胶电泳，检测pcr产物。
[0049]
5.pcr-rflp酶切反应及电泳
[0050]
在0.2ml ep管中配制以下反应液并混合均匀
[0051][0052]
37℃反应3小时，1.5％琼脂糖凝胶检测酶切结果并进行基因分型。
[0053]
6.统计模型建立
[0054]
根据实验群体的特点，构建线性模型：y＝μ g e。其中y为性状观察值，μ为群体均值，g为基因型固定效应e为剩余值。使用统计软件jmp 4.0(sas institute，2000)检验基因型与股骨长性状间的相关程度，并估计性状的最小二乘均值。
[0055]
利用本发明的引物(pcsk1-f1和pcsk1-r1)对大骨鸡群体54个个体的基因组dna进行pcr扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析。在大骨鸡群体中共检测到3种基因型，酶切产物
琼脂糖凝胶电泳条带大小为221bp，将其命名为cc基因型；酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带大小为430bp，将其命名为aa基因型；该位点杂合的个体酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带为两条，大小分别为221bp和430bp，将其命名为ca基因型。
[0056]
数据分析结果显示，pcsk1基因c.809c》a与大骨鸡股骨长性状存在显著相关(p＝0.0431)；对pcsk1基因c.809c》a突变位点的3种基因型间大骨鸡群体股骨长的最小二乘均值进行多重比较，结果表明具有aa基因型鸡只的股骨长显著高于具有cc基因型鸡只的股骨长(p《0.05)，具有aa基因型鸡只的股骨长显著高于具有ca基因型鸡只的跖骨长(p《0.05)。(表1)
[0057]
表1 pcsk1基因不同基因型对大骨鸡群体鸡只股骨长的影响
[0058][0059]
注：同一行不同字母表示差异显著(ap《0.05)
[0060]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。