海杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法

1.本发明涉及微生物应用技术领域，具体是海杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法。


背景技术：

2.自20世纪初期发明塑料以来，它给人们的生活带来翻天覆地的变化，但因塑料引发的问题也愈发凸显并急需解决。海洋约占地球表面积的71%，已然成为了塑料污染的重灾区。更为严重的是，塑料污染损害海洋生态系统，碎化而成的微塑料被海洋生物误食，还会随食物链极大地危害人类健康。
3.目前，针对海洋塑料污染的治理问题尚缺乏有效的技术手段。部分塑料入海后淤积埋入近岸滩涂泥沙中或沉集到底泥；漂浮在海水中的塑料久而久之也都腐蚀成微塑料，很难通过打捞并接续在陆上集中处置的办法（如堆积、填埋、焚烧、回收利用等）进行处理。微生物原位降解修复的办法具有成本低、效益高和环境友好的特点，但现阶段获得的能适应海洋环境的塑料降解菌种质资源非常有限，使得其在海洋塑料污染的原位修复应用方面存在大的技术瓶颈。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供海杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法，本发明提供的海杆菌具有塑料降解功能，能够降解海水中的塑料，降解效率高。
5.本发明提供了海杆菌（marinobacter salinexigens），于2022年7月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，其保藏编号为cgmcc no. 25242。
6.上述海杆菌及其细胞成分、代谢物、代谢物的衍生物、分泌物中的至少一种均在本发明的保护范围以内。可以理解的是，所述细胞成分包括细胞、包含该细胞的培养液和组成细胞的各种化学成分中的至少一种；所述代谢物包括新陈代谢中的中间代谢物和最终代谢物中的至少一种；所述分泌物包括核酸、酶、抗体、外泌体和激素中的至少一种。
7.本发明提供了上述海杆菌在降解塑料中的应用。本发明提供的海杆菌能够利用塑料为碳源和能源，具有降解塑料的功能，降解效率高。在本发明的某些实施例中，所述塑料包括聚乙烯塑料、聚丙烯塑料或聚苯乙烯塑料中的至少一种。在一个实施例中，所述塑料为塑料颗粒或塑料薄膜。在一个实施例中，所述塑料为微塑料。
8.本发明提供了降解塑料的方法，包括：用上述海杆菌对塑料进行降解。具体而言，本发明所述降解塑料的方法包括：用上述海杆菌与塑料接触，进行繁殖，降解。本发明所述降解塑料的方法可以在自然环境或培养基中进行。在一个实施例中，用上述海杆菌与塑料接触，在海水中进行繁殖，降解。在一个实施例中，用上述海杆菌与塑料接触，在培养基中进行繁殖，降解。本发明所述塑料和上述一样，不再赘述。
9.本发明提供了上述海杆菌的培养方法，包括：将上述海杆菌接种于含有塑料的培养基，进行培养。具体而言，本发明将上述海杆菌的培养液接种于含有塑料的培养基中进行培养。更具体而言，本发明将上述海杆菌的培养液接种于含有塑料的无机盐液体培养基或含有塑料的无机盐固体培养基中进行培养。在本发明的某些实施例中，本发明将上述海杆菌的培养液接种于含有塑料的无机盐固体培养基的平板上或含有塑料的无机盐固体培养基的斜面试管中进行培养。本发明所述塑料和上述一样，不再赘述。本发明所述培养基中，每一升体积的培养基中含有所述塑料的质量为1 g~3 g，优选为2 g。
10.在本发明的某些实施例中，所述海杆菌的接种量为5%~20%，优选为5%~10%，更优选为10%。在本发明的某些实施例中，所述培养在ph值为6~8下进行，优选在ph值为7下进行。在本发明的某些实施例中，所述培养在10℃~40℃、100 r/min~150 r/min下进行，优选在28℃、120 r/min下进行。在本发明的某些实施例中，所述培养的时间为4周以上。
11.本发明通过调节所述培养基的ph值，从而调节上述培养过程中的ph值。在一个实施例中，用1 mol/l~3 mol/l的naoh来调节所述培养基的ph值为6~8，优选为7。
12.在本发明的某些实施例中，以质量份计，所述无机盐液体培养基的成分包括：0.5份~1份的k2hpo4、0.5份~1份的kh2po4、0.8份~1.2份的nh4no3、0.08份~0.12份的cacl2、0.01份~0.04份的feso4和500份~1500份的海水；所述无机盐固体培养基的成分包括：0.5份~1份的k2hpo4、0.5份~1份的kh2po4、0.8份~1.2份的nh4no3、0.08份~0.12份的cacl2、0.01份~0.04份的feso4、10份~20份的琼脂和500份~1500份的海水。在一个实施例中，所述无机盐液体培养基的成分包括：0.7 g的k2hpo4、0.7 g的kh2po4、1.0 g的nh4no3、0.1 g的cacl2、0.02g的feso4和1 l的海水。在一个实施例中，所述无机盐固体培养基的成分包括：0.7 g的k2hpo4、0.7 g的kh2po4、1.0 g的nh4no3、0.1 g的cacl2、0.02 g的feso4、15 g的琼脂和1 l的海水。
13.在本发明的某些实施例中，上述海杆菌的培养液的获得步骤包括：将环境样品中的本发明所述海杆菌进行驯化，富集，初筛，复筛，得到上述海杆菌的培养液。
14.首先在环境中对本发明所述海杆菌进行驯化。具体而言，首先将塑料置于环境中，进行连续原位驯化。在本发明的某些实施例中，将塑料置于海南三亚红树林根泥中，连续原位驯化土著微生物4周以上，取所述塑料和塑料周围的根泥作为环境样品。
15.在环境中对本发明所述海杆菌进行驯化后，再进行富集。具体而言，将驯化后得到的环境样品置于富集培养基中，对本发明所述海杆菌进行富集培养。更具体而言，将驯化后得到的环境样品置于含有塑料的富集培养基中，对本发明所述海杆菌进行初次富集培养，再进行连续传代富集培养。在本发明的某些实施例中，将驯化后得到的环境样品置于含有塑料的富集培养基中，对本发明所述海杆菌进行初次富集培养4周以上，优选为6周；再进行连续传代富集培养3~5次，优选为3次；每次连续传代富集培养的时间为4~6周。本发明所述塑料和上述一样，不再赘述。本发明所述培养基中，每一升体积的培养基中含有所述塑料的质量为1 g~3 g，优选为2 g。在一个实施例中，所述富集培养在ph值为6~8下进行，优选为7。在一个实施例中，所述富集培养在10℃~40℃、100 r/min~150 r/min下进行，优选在28℃、120 r/min下进行。在一个实施例中，所述环境样品按5~10%的接种量置于所述富集培养基中。
16.本发明通过调节所述富集培养基的ph值，从而调节上述富集过程中的ph值。在一个实施例中，用1 mol/l~3 mol/l的naoh来调节所述富集培养基的ph值为6~8，优选为7。
17.在本发明的某些实施例中，以质量份计，所述富集培养基的成分包括：0.5份~1份的k2hpo4，0.5份~1份的kh2po4，0.8份~1.2份的nh4no3，0.08份~0.12份的cacl2，0.01份~0.04份的feso4，0.08份~0.12份的酵母浸粉和500份~1500份的海水。在一个实施例中，所述富集培养基的成分包括：0.7 g的k2hpo4，0.7 g的kh2po4，1.0 g的nh4no3，0.1 g的cacl2，0.02 g的feso4，0.1 g的酵母浸粉和1 l的海水。
18.将本发明所述海杆菌进行驯化和富集后，再进行初筛和复筛，得到海杆菌的培养液。具体而言，将上述富集培养后的海杆菌稀释涂布后，采用平板划线法进行初筛，再在无机盐液体培养基中进行复筛培养，得到海杆菌的培养液。在本发明的某些实施例中，将上述富集培养后的海杆菌通过稀释涂布转接到含有塑料的无机盐固体培养基中培养1~2周，然后采用平板划线法根据形态、大小和颜色进行分离纯化，得到初筛海杆菌；然后挑一环所述初筛海杆菌在含有塑料的无机盐液体培养基中进行复筛培养1~2周，得到海杆菌的培养液。本发明所述培养基中，每一升体积的培养基中含有所述塑料的质量为1 g~3 g，优选为2 g。在本发明的某些实施例中，所述稀释涂布的稀释梯度为10-1
、10-2
、10-3
。本发明所述培养的条件、所述无机盐液体培养基、所述无机盐固体培养基和所述塑料独立地和上述一样，不再赘述。
19.本发明提供了海杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法。本发明提供的海杆菌（marinobacter salinexigens），其保藏编号为cgmcc no. 25242。本发明提供的海杆菌具有塑料降解功能，能够降解海水中的聚乙烯，降解效率高。实验表明，本发明从海南三亚河近入海口附近红树林底泥中成功分离筛选出海杆菌my04，经过所述海杆菌my04处理4周的聚乙烯塑料薄膜表面变得粗糙，并且出现明显的裂痕，其发生了降解，其降解速率为1.1
±
0.12 g/(d
•
m3)，而对照组的聚乙烯塑料薄膜表面没有被侵蚀的痕迹，也未出现质量变化，通过红外光谱分析进一步证实了本发明所述海杆菌my04利用塑料为能源，具有塑料降解功能。
20.生物保藏说明生物材料：my04，分类命名：marinobacter salinexigens，于2022年7月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no. 25242。
附图说明
21.图1为基于16s rrna基因序列构建的实施例1所得菌株的系统发育树图；图2为实施例1所得菌株在2216e固体培养基中的形态图；图3为实施例1所得菌株的生长曲线图；图4为对照组的聚乙烯塑料薄膜的表面形态图；图5为处理组的聚乙烯塑料薄膜的表面形态图；图6为处理组和对照组的聚乙烯塑料薄膜的红外光谱图。
具体实施方式
22.本发明公开了海杆菌及其应用和培养方法、降解塑料的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本
领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
23.以下结合实施例对本发明进行进一步阐述：实施例1分离聚乙烯塑料海洋降解菌，步骤包括原位驯化和富集培养，具体如下：1、原位驯化：在位于海南省三亚市三亚河近入海口附近岸边红树林根泥中，浅层埋放聚乙烯塑料薄膜条带，连续原位驯化土著微生物，增生塑料降解菌群落，驯化时间为期4周。然后采集所述聚乙烯塑料薄膜及其包覆的根泥作为样品，供下一步富集培养用。
24.2、富集培养：无菌操作条件下，取原位驯化获得的样品，即所述聚乙烯塑料薄膜及包覆的根泥作为接种物，其中所述聚乙烯塑料薄膜用无菌剪刀剪成长宽均为1 cm大小的方块，按10%的接种量加入到300 ml锥形瓶内的100 ml灭菌的初次富集培养基中，在28℃、120 r/min的条件下，摇床培养6周。所述灭菌的初次富集培养基事先用121℃高压灭菌20分钟，待冷却至室温后，按2 g/l加入长和宽均为1 cm的事先经过无菌处理的聚乙烯塑料薄膜，所述无菌处理的方法为将聚乙烯塑料薄膜用2% sds浸泡2 h，再用75%的酒精浸泡2 h，无菌水冲洗3次。接续富集培养使用去除了酵母浸粉成份的初次富集培养基进行定向富集，连续传代富集3次，每次4周。所述初次富集液体培养基的配方(/l)包括：0.7 g的k2hpo4，0.7 g的kh2po4，1.0 g的nh4no3，0.1 g的cacl2，0.02 g的feso4，0.1 g的酵母浸粉和1000ml的天然陈化海水，调节ph至7.0。
25.对上述富集培养后的聚乙烯塑料海洋降解菌进行活性筛选，步骤包括初筛和复筛，具体如下：1、初筛：将上述经富集培养后生长到对数期的菌液，采用平皿稀释涂布法进行分离，稀释梯度为10-1
、10-2
、10-3
。所述菌液在培养皿平板上生长一周后，挑选涂布长出的形态、大小、颜色不同的菌落，在新鲜无机盐固体培养基平板上进行划线分离2~3次，获得纯菌株。所述无机盐固体培养基的配方（/l）为0.7 g的k2hpo4，0.7 g的kh2po4，1.0 g的nh4no3，0.1 g的cacl2，0.02 g的feso4，15 g的琼脂和1000 ml的天然海水，向其中加入2.0 g 的pe粉末（聚乙烯微塑料），用1 mol/l的naoh调节ph至7.0。121℃高压灭菌20分钟。
26.2、复筛（回测）：为防止混合菌群和无机盐固体培养基中的琼脂对活性菌株分离的假阳性结果，将初筛得到的纯菌株进行复筛（回测），挑一环生长好的纯菌株菌苔至100 ml的无机盐液体培养基（即去除琼脂的初筛时用的无机盐固体培养基）中，在28℃、120 r/min的条件下培养1周后，得到海杆菌培养液。将所述海杆菌培养液作为接种物接种到含有固体培养基的平板上，经培养有生长物者作为有效菌株。所述无机盐液体培养基的配方（/l）为：0.7 g的k2hpo4，0.7 g的kh2po4，1.0 g的nh4no3，0.1 g的cacl2，0.02 g的feso4和1 l的天然海水，向其中加入2.0 g 的pe粉末（聚乙烯微塑料），用1 mol/l的naoh调节ph至7.0。121℃高压灭菌20分钟。
27.实施例2对实施例1所得的菌株进行分类鉴定，具体如下：将实施例1所得的菌株接种到海洋2216e固体培养基上生长，2~3天采收平板上的菌落，用于提取菌体核酸测序，所述2216e固体培养基的配方（/l）为：5.0 g的蛋白胨，1.0 g
的酵母粉，0.1 g的柠檬酸铁，19.45 g的氯化钠，5.98 g的氯化镁，3.24 g的硫酸钠，1.8 g的氯化钙，0.55 g的氯化钾，0.16 g的碳酸钠，0.08 g的溴化钾，0.034 g的氯化锶，0.022 g的硼酸，0.004 g的硅酸钠，0.0024 g的氟化钠，0.0016 g的硝酸铵，0.008 g的磷酸氢二钠，15 g的琼脂和1 l的去离子水，ph值为7.6
ꢀ±ꢀ
0.2。进行16s rrna基因测序和同源性分析，具体如下：使用tsingke植物dna提取试剂盒（通用型）对实施例1所得菌株进行dna提取，得到所述菌株的dna样品。所提取的dna样品适量稀释后作为pcr模板,采用细菌通用引物27f(5
’‑
agtttgatcmtggctcag-3’),1492r(5
’‑
ggttaccttgttcgactt-3’)进行pcr扩增，长度1500 bp。扩增体系：45
ꢀµ
l 的1
×
tse101金牌mix，2
ꢀµ
l的引物27f，2
ꢀµ
l的引物1492r，1
ꢀµ
l 的dna模板。扩增程序：预变性98℃ 2 min；循环阶段98℃ 10 s、56℃ 10 s、72℃ 10 s，循环35次；延伸阶段 72℃ 5 min，保存阶段4℃。将扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳（2
ꢀµ
l样品 6
ꢀµ
l溴酚蓝），300 v电压下12 min，获取鉴定胶图。将准备好的pcr产物送至广州擎科测序部进行一代测序。所得序列用contigexpress拼接，并去除两端不准的部分，将拼接好的序列在ezbiocloud比对，发现其与marinobacter salinexigens 相似度99.79%，基于16s rrna基因序列构建了菌株系统发育树，如图1所示，图1为基于16s rrna基因序列构建的实施例1所得菌株的系统发育树图，图1显示了实施例1所得菌株与marinobacter salinexigens在进化树上聚在同一个分支，并上传至ncbi获得登录号为on878183。
28.实施例1所得菌株在海洋2216e固体培养基上的菌落呈乳白色，形状为圆形，表面光滑，边缘整齐，如图2所述，图2为实施例1所得菌株在2216e固体培养基中的形态图。然后将其接种至2216e液体培养基中，在28℃、120 r/min的条件下有氧培养测定生长曲线，结果如图3和表1所示，图3为实施例1所得菌株的生长曲线图，表1为图3所示菌株的生长曲线的数据。其中，所述2216e液体培养基的配方(/l)为：5.0 g的蛋白胨，1.0 g的酵母粉，0.1 g的柠檬酸铁，19.45 g的氯化钠，5.98 g的氯化镁，3.24 g的硫酸钠，1.8 g的氯化钙，0.55 g的氯化钾，0.16 g的碳酸钠，0.08 g的溴化钾，0.034 g的氯化锶，0.022 g的硼酸，0.004 g的硅酸钠，0.0024 g的氟化钠，0.0016 g的硝酸铵，0.008 g的磷酸氢二钠和1000 ml的去离子水，ph值为7.6
ꢀ±ꢀ
0.2。
29.表1
时间(h)024681012141822263034od
600
0.0270.05950.1120.1350.1510.1820.2040.2370.2580.2690.2700.2700.271
综合比对以上特征，初步将实施例1所得菌株鉴定为marinobacter salinexigens my04菌株，即海杆菌my04。
30.实施例3本发明所述海杆菌my04在降解商用聚乙烯塑料方面的应用，降解及表征分别采用以下步骤进行（所用到的培养基的配方和上述一样，不再赘述）：1、种子培养液的制备共有两种方式；第一种是将本发明所述海杆菌my04斜面菌苔接种到无机盐液体培养基中，用1 mol/l的naoh调节ph至7.0，不加入pe粉末，所述培养基事先按2 g/l的量加入了长宽均为1 cm的事先经过无菌处理的聚乙烯塑料薄膜（处理方法和实施例1所述相同）；将其在28℃、120 r/min的条件下培养1周得到菌悬液；第二种是将本发明所述海杆菌my04
斜面菌苔接种到2216e液体培养基中，所述培养基事先按2 g/l的量加入了长宽均为1 cm的无菌聚乙烯塑料薄膜（处理方法和实施例1所述相同）；在28℃、120 r/min的条件下培养24小时得到菌悬液。以上两种方式制得的菌悬液均可以作为种子培养液使用，在本方案中，进行实施例2的生长曲线测定时采用了第二种方式制得菌悬液，进行实施例3的降解聚乙烯塑料并进行扫描电镜表面形态的测定和官能团的测定均采用第一种方式制得菌悬液。
31.2、扩大培养降解聚乙烯塑料。
32.将上述种子培养液按照10%的接种量接种到事先按2 g/l的量加入了长宽均为1 cm的聚乙烯塑料薄膜的无机盐液体培养基中并以此为处理组，再以不接菌的事先按2 g/l的量加入了聚乙烯塑料薄膜的无机盐液体培养基为对照组，所述处理组和对照组的聚乙烯薄膜均事先按照实施例1所述的方法进行无菌处理并恒重称量得到聚乙烯薄膜的初始重量；处理组和对照组每组设置3个平行，在28℃、120 r/min的条件下培养4周后，测定聚乙烯塑料薄膜的失重情况、表面形态变化、官能团变化等。
33.3、定量和定性表征聚乙烯薄膜降解效果1）聚乙烯薄膜降解速率定方法：将上述处理组和对照组中的聚乙烯薄膜经5% sds清洗振荡清洗5 h，超声波清洗30 min，再用75%的酒精浸泡2小时，最后用无菌水冲洗3次，放置40℃烘箱干燥24 h后恒重称量，得到细菌降解后的聚乙烯薄膜重量。降解速率按照下列公式计算：降解速率=（聚乙烯薄膜的初始重量-细菌降解后的聚乙烯薄膜重量）/(培养液体积
×
降解时间)。
34.经过海杆菌my04菌株处理4周后，塑料薄膜发生了降解，其降解速率为1.1
±
0.12 g/(d
•
m3)，而对照组并未出现质量变化，说明海杆菌my04能够有效降解聚乙烯塑料。
35.2）聚乙烯薄膜的表面形态观察：分别取上述处理组和对照组的聚乙烯塑料薄膜按照上述1）中相同的做法进行清洗和干燥，再分别溅射喷金120 s制备电镜观察样品，并通过场发射扫描电子显微镜在束流40 ma和加速电压5 kv条件下观察其表面形态，如图4~5所示，图4为对照组的聚乙烯塑料薄膜的表面形态图，图5为处理组的聚乙烯塑料薄膜的表面形态图。由图4~5可知，处理组的聚乙烯塑料薄膜表面变得粗糙，并且出现明显的侵蚀孔洞和裂痕，而未经细菌处理的对照组的聚乙烯塑料薄膜表面没有被侵蚀的痕迹。
36.聚乙烯薄膜官能团测定：分别取上述处理组和对照组的聚乙烯塑料薄膜按照上述1）中相同的做法进行清洗和干燥，通过傅立叶红外变换仪以atr模式进行测定，波数范围4000 cm-1
~400 cm-1
，扫描次数32次，分辨率4 cm-1
。测定结果如图6所示，图6为处理组和对照组的聚乙烯塑料薄膜的红外光谱图；与对照组相比，处理组在1260 cm-1
处引入了醚键(c-o-c伸)，在1650 cm-1
处引入了羰基键(c=o)不稳定极性官能团，并且在2850 cm-1
处的对称伸缩振动碳氢键(ch
2-)吸收峰减弱，主链ch
2-结构式减少，主链有被切断可能性，表明处理组中海杆菌my04对聚乙烯薄膜存在化学降解作用。
37.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。