经工程化以治疗其中草酸盐有害的病症的细菌
1.相关申请
2.本技术要求于2020年11月9日提交的美国临时申请号63/111,376；于2020年10月14日提交的美国临时申请号63/091,620；于2020年10月9日提交的美国临时申请号63/089,758；于2020年8月14日提交的美国临时申请号63/065,752；于2020年5月22日提交的美国临时申请号63/028,902；于2020年3月23日提交的美国临时申请号62/993,301；和于2020年1月14日提交的美国临时申请号62/960,950的优先权；每篇美国临时申请的全部内容以引用的方式整体并入本文。
3.序列表
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背景技术：
5.草酸盐(草酸的离子形式)在人体内起源于饮食摄入或内源性合成。草酸盐普遍存在于植物和植物源性食物中，并因此不可避免地成为人类饮食的一部分。内源性合成的草酸盐主要来源于肝脏中的乙醛酸盐，在肝脏中过量的乙醛酸盐通过乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase)或乳酸脱氢酶转化为草酸(robijn等人,kidney int.80:1146-58(2011))。健康个体通常每24小时排泄在20-40mg草酸盐之间范围内的尿草酸盐。然而，尿草酸盐排泄浓度超过每24小时40-45mg时，在临床上被认为是高草酸尿症(hyperoxaluria)(robijn等人(2011))。高草酸尿症的特征在于草酸盐的尿排泄增加和全身水平升高，并且在原发性高草酸尿症中，尿草酸盐水平通常为每24小时约90-500mg，并且在肠道高草酸尿症中为每24小时约45-130mg。如果不进行治疗，高草酸尿症可能导致显著的发病率和死亡率，包括肾结石(肾脏结石)、肾钙质沉着症(肾中钙增加)、结晶病(crystallopathy)以及最重要的终末期肾病的发生(tasian等人,j.am.soc.nephrol.,2018；29(6):1731-1740；以及siener等人,kidney international,2013:83:1144-1149)。
6.高草酸尿症一般可以分为两种临床类型：原发性高草酸尿症和继发性高草酸尿症。原发性高草酸尿症是由参与草酸盐代谢的几个基因之一中的突变引起的常染色体隐性遗传疾病(hoppe等人,nephr.dial.transplant.26:3609-15(2011))。原发性高草酸尿症的特征在于尿草酸盐排泄升高，其最终可能导致复发性尿石症、结晶病、进行性肾钙质沉着症和早期终末期肾病。此外，当原发性高草酸尿症患者出现慢性肾功能不全时，各种器官系统中可能会出现草酸钙的全身沉积(也称为草酸盐沉着)，这可能导致骨病、促红细胞生成素难治性贫血、皮肤溃疡、手指坏疽、心律失常和心肌病(hoppe等人(2011))。
7.原发性i型高草酸尿症(phi)是最常见和最严重的高草酸尿症形式，并且是由维生素b6依赖性肝过氧化物酶体酶丙氨酸乙醛酸氨基转移酶(agt，由agxt基因编码)的缺陷引起，所述丙氨酸乙醛酸氨基转移酶催化乙醛酸盐向甘氨酸盐的转氨作用(purdue等人,j.cell biol.111:2341-51(1990)；hoppe等人,kidney int.75:1264-71(2009))。agt缺乏
使乙醛酸盐被还原成乙醇酸盐，乙醇酸盐然后被氧化产生草酸盐。已经鉴定了人agxt基因的超过140个突变(williams等人,hum.mut.30:910-7(2009))。原发性ii型高草酸尿症(phii)是由酶乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶(grhpr)的突变引起的，所述酶是具有乙醛酸还原酶(gr)、羟基丙酮酸还原酶(hpr)和d-甘油酸脱氢酶的酶(dgdh)活性(参见例如，cramer等人,hum.mol.gen.8:2063-9(1999))。已经鉴定了人grhpr基因的超过十二个突变(cregeen等人,hum.mut.22:497(2003))。phi和phii两者都会导致严重的高草酸尿症(robijn等人(2011))。原发性iii型高草酸尿症(phiii)由hoga1基因中的突变引起，所述基因编码4-羟基2-酮戊二酸醛缩酶，这是一种将4-羟基2-酮戊二酸盐分解为丙酮酸盐和乙醛酸盐的线粒体酶(pitt等人,jimd reports 15:1-6(2015))。已经鉴定了人hoga1基因中的15个突变(bhasin等人,world j.nephrol.4:235-44(2015))。
8.继发性高草酸尿症通常是由以草酸盐吸收增加为基础的病状(包括草酸盐的饮食摄入增加、草酸盐的肠道吸收增加、草酸盐前体的过量摄入、肠道微生物群落失衡和肠道草酸盐转运蛋白的遗传变异)引起的(bhasin等人,2015；robijn等人(2011))。在患有多种肠道病症(包括细菌过度生长综合征、克罗恩病(crohn’s disease)、炎性肠病以及其他吸收不良状态(诸如在因肥胖进行空肠回肠旁路术之后、在胃溃疡手术之后和慢性肠系膜缺血))的患者中观察到草酸盐吸收增加，伴随必然的高草酸尿症，通常称为肠高草酸尿症(pardi等人,am.j.gastroenterol.93:500-14(1998)；hylander等人,scand.j.gastroent.15:349-52(1980)；canos等人,can.med.assoc.j.124:729-33(1981)；drenick等人,ann.intern.med.89:594-9(1978))。此外，肾移植后也可能出现高草酸尿症(robijn等人(2011))。患有继发性高草酸尿症和肠高草酸尿症的患者易患上草酸钙结石，这可能导致严重的肾脏损害，并最终导致终末期肾病。
9.目前可用的高草酸尿症治疗是不够的。治疗原发性高草酸尿症的策略包括用吡多辛减少尿草酸盐，这仅在不到一半的phi患者中有效，而对phii和phiii患者无效(hoppe等人(2011))。此外，用柠檬酸盐、正磷酸盐和镁来增加草酸钙的尿溶解度并从而保护肾功能的治疗尚未得到很好地表征(hoppe等人(2011))。治疗继发性和肠高草酸尿症的其他策略相当费力且通常无效，包括减少草酸盐的饮食摄入、口服钙补充和使用胆汁酸螯合剂(parivar等人,j.urol.155:432-40(1996)；hylander等人(1980)；mcleod和churchhill,j.urol.148:974-8(1992))。一般来说，饮食限制并不完全有效，因为患者不能容易地识别要避免的食物(parivar等人(1996))。因此，对高草酸尿症的有效、可靠和/或长期治疗的需求仍未得到满足。
技术实现要素：
10.本公开提供了工程化细菌细胞、其药物组合物以及调节和治疗其中草酸盐是有害的病症的方法。具体而言，本文公开的工程化细菌已被构建成包含由例如治疗所述疾病的一种或多种草酸分解代谢基因(oxalate catabolism gene)构成的遗传回路，以及设计成确保被施用工程化细菌的受试者的安全性和不建群的其他任选回路(例如营养缺陷型、杀灭开关及它们的组合)。这些工程化细菌是安全的且耐受性良好，并且增强受试者微生物组的固有活性以达到治疗效果。
11.在一个实施方案中，本文公开了降低受试者的草酸盐水平的方法，所述方法包括
向所述受试者施用包含重组细菌的药物组合物，所述重组细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列，所述一个或多个基因序列可操作地连接到天然地与草酸分解代谢酶基因不相关直接或间接第一启动子上，从而降低所述受试者的草酸盐水平。
12.在一个实施方案中，重组细菌具有1μmol/1x109个细胞的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中，重组细菌具有约50-600mg/天、约100-550mg/天、约100-500mg/天、约100-400mg/天、约100-300mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中，重组细菌具有约150-300mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中，重组细菌具有约50mg/天、约100mg/天、约150mg/天、约200mg/天、约210mg/天、约211mg/天、约225mg/天、约250mg/天、约275mg/天、约300mg/天、约325mg/天、约350mg/天、约350mg/天、约375mg/天、约400mg/天、约425mg/天、约450mg/天、约475mg/天、约500mg/天、约525mg/天、约550mg/天、约575mg/天或约600mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中，重组细菌在厌氧条件下具有约50mg/天、约100mg/天、约150mg/天、约200mg/天、约211mg/天、约225mg/天、约250mg/天、约275mg/天、约300mg/天、约325mg/天、约350mg/天、约350mg/天、约375mg/天、约400mg/天、约425mg/天、约450mg/天、约475mg/天、约500mg/天、约525mg/天、约550mg/天、约575mg/天或约600mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中，重组细菌在向受试者每天施用三次时在厌氧条件下具有约50mg/天、约100mg/天、约150mg/天、约200mg/天、约211mg/天、约225mg/天、约250mg/天、约275mg/天、约300mg/天、约325mg/天、约350mg/天、约350mg/天、约375mg/天、约400mg/天、约425mg/天、约450mg/天、约475mg/天、约500mg/天、约525mg/天、约550mg/天、约575mg/天或约600mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中，厌氧条件是在受试者的肠和/或结肠中的条件。
13.在一个实施方案中，所述方法将受试者的急性草酸盐水平降低约两倍。在一个实施方案中，所述方法将受试者的急性草酸盐水平降低约三倍。在一个实施方案中，所述方法将受试者的慢性草酸盐水平降低约两倍。在一个实施方案中，所述方法将受试者的慢性草酸盐水平降低约三倍。
14.在一个实施方案中，所述方法将受试者的急性草酸盐水平降低至约25mg/天、约30mg/天、约40mg/天、约50mg/天、约60mg/天、约70mg/天、约80mg/天、约90mg/天或约100mg/天。在一个实施方案中，所述方法将受试者的慢性草酸盐水平降低至约25mg/天、约30mg/天、约40mg/天、约50mg/天、约60mg/天、约70mg/天、约80mg/天、约90mg/天或约100mg/天。
15.在一个实施方案中，所述方法在施用后第5天将受试者的急性草酸盐水平降低至少约40％。在一个实施方案中，所述方法在施用后第5天将受试者的急性草酸盐水平降低至少约50％。在一个实施方案中，所述方法在施用后第5天将受试者的急性草酸盐水平降低至少约60％。在一个实施方案中，所述方法在施用后第5天将受试者的急性草酸盐水平降低至少约70％。在一个实施方案中，所述方法在施用后第5天将受试者的急性草酸盐水平降低至少约80％。
16.在一个实施方案中，所述方法在施用后约24小时将受试者的急性草酸盐水平降低至少约10％。在一个实施方案中，所述方法在施用后约24小时将受试者的急性草酸盐水平降低至少约15％。在一个实施方案中，所述方法在施用后约24小时将受试者的急性草酸盐水平降低至少约20％。
17.在一个实施方案中，重组细菌属于埃希氏菌属(escherichia)。在一个实施方案
中，重组细菌属于大肠埃希氏菌(escherichia coli)菌株尼斯勒(nissle)。
18.在一个实施方案中，口服施用药物组合物。在一个实施方案中，在施用药物组合物的一小时内给受试者喂食膳食。在一个实施方案中，在施用药物组合物的同时给受试者喂食膳食。在一个实施方案中，受试者是人受试者。
19.在一个实施方案中，本文公开了重组细菌，其包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列，所述一个或多个基因序列可操作地连接到天然地与草酸分解代谢酶基因不相关的直接或间接第一诱导型启动子上。
20.在一个实施方案中，重组细菌具有1μmol/1x109个细胞的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中，重组细菌在厌氧条件下具有约150-300mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中，重组细菌在厌氧条件下具有约200mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中，当每天三次施用于受试者时，重组细菌在厌氧条件下具有约200mg/天的草酸盐消耗活性。在一个实施方案中，厌氧条件是在受试者的肠和/或结肠中的条件。
21.在一个实施方案中，所述一个或多个基因序列包含scaae3基因、frc基因和oxdc基因。在一个实施方案中，scaae3基因包含与seq id no:3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含seq id no:3，或由seq id no:3组成含。在一个实施方案中，frc基因包含与seq id no:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含seq id no:1，或由seq id no:1组成。在一个实施方案中，scaae3基因包含seq id no:3。在一个实施方案中，oxdc基因包含与seq id no:2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含seq id no:2，或由seq id no:2组成。在一个实施方案中，frc基因包含seq id no:2。
22.在一个实施方案中，重组细菌还包含编码草酸盐输入蛋白(importer)的基因。在一个实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的基因是oxlt基因。在一个实施方案中，oxlt基因包含与seq id no:11具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含seq id no:11，或由seq id no:11组成。在一个实施方案中，oxlt基因包含seq id no:11。
23.在一个实施方案中，重组细菌还包含营养缺陷型。在一个实施方案中，营养缺陷型是thya营养缺陷型。在一个实施方案中，thya与seq id no:62具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，包含seq id no:62，或由seq id no:62组成。
24.在一个实施方案中，重组细菌还包含内源噬菌体中的缺失。在一个实施方案中，内源噬菌体包含与seq id no:63具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含seq id no:63，或由seq id no:63组成。在一个实施方案中，内源噬菌体包含seq id no:63的序列。
25.在一个实施方案中，重组细菌不包含编码抗生素抗性的基因。在一个实施方案中，第一启动子是诱导型启动子。在一个实施方案中，诱导型启动子由低氧或厌氧条件、温度或肿瘤的低氧环境诱导。在一个实施方案中，诱导型启动子是fnr启动子。在一个实施方案中，fnr启动子是选自由seq id no:13-29中任一者组成的组的启动子。
26.在一个实施方案中，重组细菌包含在诱导型启动子(任选地fnr启动子)的控制下
的oxlt基因；在诱导型启动子(任选地frn启动子)的控制下的scaae3基因、oxcd基因和frc基因；thya缺失(或营养缺陷型)和内源噬菌体3的缺失。在一个实施方案中，重组细菌包含ha910::fnr_oxlt、ha12::fnr_scaae3-oxcd-frc、δthya、δ噬菌体3。
27.在一个实施方案中，重组细菌是syn5752、syn7169或synb8802。在一个实施方案中，重组细菌是synb8802。
28.在一个实施方案中，受试者患有高草酸尿症。在一个实施方案中，高草酸尿症是原发性高草酸尿症、饮食性高草酸尿症或肠高草酸尿症。在一个实施方案中，受试者患有短肠综合征、慢性胰腺炎、炎性肠病(ibd)、囊性纤维化、肾病和/或roux-en-y胃旁路术。
29.在一个实施方案中，受试者的尿草酸盐(uox)水平在施用之前为至少70mg/天。在一个实施方案中，受试者在施用之后显示uox水平降低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一个实施方案中，受试者在施用之前具有egfr《30ml/min/1.73m2，需要血液透析，或具有全身性草酸盐沉着。
30.在一个实施方案中，重组细菌以约1x10
11
个活重组细菌、约2x10
11
个活重组细菌、约3x10
11
个活重组细菌、约4x10
11
个活重组细菌、约5x10
11
个活重组细菌、约6x10
11
个活重组细菌、约1x10
12
个活的重组细菌或约2x10
12
个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中，重组细菌以约6x10
11
个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中，重组细菌以约3x10
11
个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中，重组细菌以约1x10
11
个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中，施用是约5x10
11
个活重组细菌。在一个实施方案中，重组细菌以约1x10
12
个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中，重组细菌以约2x10
12
个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中，施用是将约5x10
11
个活重组细菌与膳食一起每天施用三次。在一个实施方案中，重组细菌以约1x10
11
个活重组细菌至约2x10
12
个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中，重组细菌以约1x10
12
个活重组细菌至约2x10
12
个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中，重组细菌以约5x10
11
个活重组细菌至约2x10
12
个活重组细菌的剂量施用。
31.在另一个实施方案中，施用是与膳食一起口服，每天两次。在另一个实施方案中，施用是与膳食一起口服，每天三次。
32.在另一个实施方案中，向受试者施用质子泵抑制剂(ppi)。在另一个实施方案中，ppi是埃索美拉唑。在另一个实施方案中，ppi的施用是每天一次。
33.在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被遗传工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶或草酸分解代谢途径的一个或多个基因、基因盒和/或合成回路，并且能够代谢草酸盐和/或其他代谢物，诸如草酰辅酶a。因此，遗传工程化细菌细胞和包含所述细菌细胞的药物组合物可以用于治疗和/或预防与其中草酸盐有害的病症相关的疾病，诸如原发性高草酸尿症和继发性高草酸尿症。
34.在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列。在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列，并且能够降低草酸盐和/或其他代谢物(例如草酰辅酶a)的水平。在一些实施方案中，细菌细胞已被工程化以包含编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列。在一些实施方案中，细菌细胞已被工程化以包含编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列。在一些实施方案中，工程化细菌包含编码
一种或多种多肽的基因序列，所述一种或多种多肽介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)。在一些实施方案中，工程化细菌包含编码以下物质中的一种或多种的基因序列：(i)一种或多种草酸盐转运蛋白；(ii)一种或多种甲酸盐输出蛋白；(iii)介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)；和(iv)它们的任何组合。在一些实施方案中，细菌细胞已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列。在一些实施方案中，本公开的细菌细胞已被遗传工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和一种或多种多肽的基因序列，所述一种或多种多肽介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)。在一些实施方案中，细菌细胞已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码以下物质中的一种或多种的基因序列：(i)一种或多种草酸盐转运蛋白；(ii)一个或多个甲酸盐输出蛋白；(iii)介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出两者的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)；和(iv)它们的任何组合。
35.在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，以下基因序列中的任何一个或多个，如果存在于细菌细胞中，与诱导型启动子可操作地连接：(i)编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列；(ii)编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因序列；(iii)编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列；和(iv)编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列。
36.在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列，所述基因序列与在低氧和/或厌氧条件下(例如在哺乳动物肠道中发现的那些条件下)诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被工程化以包含编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列，所述基因序列与在低氧和/或厌氧条件下(例如在哺乳动物肠道中发现的那些条件下)诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被工程化以包含编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列，所述基因序列与在低氧和/或厌氧条件下(例如在哺乳动物肠道中发现的那些条件下)诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被工程化以包含编码介导草酸盐的
转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列，所述基因序列与在低氧和/或厌氧条件下(例如在哺乳动物肠道中发现的那些条件下)诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列与在低氧和/或厌氧条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列与在低氧和/或厌氧条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列与在低氧和/或厌氧条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，以下基因序列中的任何一个或多个，如果存在于细菌细胞中，与在低氧和/或厌氧条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接：(i)编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列；(ii)编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因序列；(iii)编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列；和(iv)编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列。
37.在一个实施方案中，诱导型启动子是能够用iptg诱导的laci启动子。在另一个实施方案中，诱导型启动子是能够用阿拉伯糖诱导的pbad启动子。
38.在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列，所述基因序列与诱导型启动子可操作地连接，所述诱导型启动子由哺乳动物肠道中发现的环境信号和/或条件诱导(例如，由哺乳动物肠道中发现的代谢物(例如，草酸盐代谢物)或其他生物分子诱导，和/或由炎症条件(例如，活性氮物质和/或活性氧物质)诱导)。在哺乳动物肠道中发现的环境信号和/或条件可以是在健康的哺乳动物肠道中发现的信号和条件，或者在患病的哺乳动物肠道(诸如患有高草酸尿症或其中草酸盐和/或草酸盐代谢物水平升高的其他病状的受试者的肠道，和/或患有炎性病状(诸如过敏性肠病、自身免疫性疾病和导致肠道炎症的任何其他病状)的受试者的肠道)中发现的信号和条件。在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列，所述基因序列与在炎症条件下(例如，在哺乳动物肠道中发现的炎症条件下)被诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被工程化以包含编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列，所述基因序列与在炎症条件下(例如，在哺乳动物肠道中发现的炎症条件下)被诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被工程化以包含编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列，所述基因序列与在炎症条件下(例如在哺乳动物肠道中发现的炎症条件下)被诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被工程化以包含编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列，所述基因序列与在炎症条件下(例如，在哺乳动物肠道中发现的炎症条件下)被诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码一种或多种草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的基因序列与在炎症条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列与在炎症条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接。
在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列与在炎症条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，以下基因序列中的任何一个或多个，如果存在于细菌细胞中，与在炎症条件下诱导的诱导型启动子可操作地连接：(i)编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列；(ii)编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因序列；(iii)编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列；和(iv)编码介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列。
39.在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其已被工程化以包含编码一种或多种多肽的基因序列，所述一种或多种多肽能够在低氧环境(例如肠道)中降低草酸盐和/或其他代谢物(例如草酰辅酶a)的水平。在一些实施方案中，细菌细胞已被工程化以包含编码以下中的一种或多种的基因序列：(i)一种或多种草酸分解代谢酶；(ii)一种或多种草酸盐转运蛋白；(ii)一种或多种甲酸盐输出蛋白；和(iv)一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白。在一些实施方案中，细菌细胞已被遗传工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个回路，并且能够例如在低氧环境(例如肠道)中处理和降低草酸盐和/或草酰辅酶a的水平。因此，在一些实施方案中，遗传工程化细菌细胞和包含本公开的细菌细胞的药物组合物可以被用于将过量的草酸盐和/或草酰辅酶a输入细菌细胞中，以便治疗和/或预防与草酸盐有害的病症相关的病状，诸如原发性高草酸尿症和继发性高草酸尿症。在一些实施方案中，遗传工程化细菌细胞和包含本公开的细菌细胞的药物组合物可以被用于将过量的草酸盐和/或草酰辅酶a转化为无毒分子，以便治疗和/或预防与草酸盐有害的病症相关的病状，诸如原发性高草酸尿症和继发性高草酸尿症。
40.本发明提供了重组细菌细胞、其药物组合物以及调节和治疗草酸盐有害的病症的方法。遗传工程化细菌细胞和包含本发明的细菌细胞的药物组合物可以被用于将过量的草酸盐和/或草酸转化为无毒分子，以便治疗和/或预防与草酸盐有害的病症相关的病状，诸如原发性高草酸尿症和继发性高草酸尿症。在一些实施方案中，本发明的细菌细胞已被工程化以包含编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因，并且能够在低氧环境(例如肠道)中处理和降低草酸盐水平。在一些实施方案中，本发明的细菌细胞已被工程化以包含编码草酸盐输入蛋白的至少一个异源基因，并且能够在低氧环境(例如肠道)中降低草酸盐水平。在一些实施方案中，本发明的细菌细胞已被工程化以包含编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因，并且能够在低氧环境(例如肠道)中降低草酸盐水平。在一些实施方案中，本发明的细菌细胞已被工程化以包含编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因，并且能够在低氧环境(例如肠道)中降低草酸盐水平。在一些实施方案中，本发明的细菌细胞已被工程化以包含编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因，并且能够在炎症环境中处理和降低草酸盐水平，诸如可能存在于肠道中。在一些实施方案中，本发明的细菌细胞已被工程化以包含编码草酸盐输入蛋白的至少一个异源基因，并且能够在炎症环境中降低草酸盐水平，例如可能存在于肠道中。在一些实施方案中，本发明的细菌细胞已被工程化以包含编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因，并且能够在炎症环境中降低草酸盐水平，例如可能存在于肠道中。在一些实施方案中，本发明的细菌细胞已被工程化以包含编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因，并且能够在炎症环境中降低草
酸盐水平，例如可能存在于肠道中。
41.在一些实施方案中，所述至少一种草酸分解代谢酶将草酸盐转化为甲酸盐或甲酰辅酶a。在一些实施方案中，所述至少一种草酸分解代谢酶选自草酸辅酶a连接酶(例如，来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(oxc，例如，来自产甲酸草酸杆菌(o.formigenes))和甲酰辅酶a转移酶(例如，frc，例如，来自产甲酸草酸杆菌)。在一些实施方案中，所述编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因选自frc基因和oxc基因。在一个实施方案中，所述编码草酸盐转运蛋白的至少一个异源基因是oxlt基因。在一些实施方案中，所述编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因位于细菌细胞中的质粒上。在一些实施方案中，所述编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因位于细菌细胞中的染色体上。在一些实施方案中，所述编码草酸盐转运蛋白的至少一个异源基因位于细菌细胞中的质粒上。在一些实施方案中，所述编码草酸盐转运蛋白的至少一个异源基因位于细菌细胞中的染色体上。在一些实施方案中，所述编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因位于细菌细胞中的质粒上。在一些实施方案中，所述编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因位于细菌细胞中的染色体上。在一些实施方案中，所述编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因位于细菌细胞中的质粒上。在一些实施方案中，所述编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因位于细菌细胞中的染色体上。
42.在一些实施方案中，工程化细菌细胞是益生菌细胞。在一些实施方案中，工程化细菌细胞是选自由拟杆菌属(bacteroides)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、梭菌属(clostridium)、埃希氏菌属(escherichia)、乳杆菌属(lactobacillus)和乳球菌属(lactococcus)组成的组的属的成员。在一些实施方案中，工程化细菌细胞属于属埃希氏菌属。在一些实施方案中，重组细菌细胞属于物种大肠埃希氏菌菌株尼斯勒。
43.在一些实施方案中，工程化细菌细胞是当工程化细菌细胞存在于哺乳动物肠道中时被补充的基因的营养缺陷型。在一些实施方案中，哺乳动物肠道是人类肠道。在一些实施方案中，工程化细菌细胞是二氨基庚二酸或胸腺嘧啶生物合成途径中的酶的营养缺陷型。在一些实施方案中，工程化细菌细胞还包含编码对细菌细胞有毒的物质的异源基因，所述异源基因与诱导型启动子可操作地连接，其中所述诱导型启动子由哺乳动物肠道中不天然存在的环境条件直接或间接诱导。
44.在另一个方面，本发明提供了包含重组细菌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，所述重组细菌细胞包含与第一诱导型启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因。在另一个方面，本发明提供了包含重组细菌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，所述重组细菌细胞包含与第一诱导型启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因、与第二诱导型启动子可操作地连接的编码草酸盐转运蛋白的至少一个异源基因，所述第二诱导型启动子可以是与所述第一诱导型启动子相同或不同的启动子。在另一个方面，本发明提供了包含重组细菌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，所述重组细菌细胞包含与第一诱导型启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因、与第二诱导型启动子可操作地连接的编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因，所述第二诱导型启动子可以是与所述第一诱导型启动子相同或不同的启动子。在另一个方面，本发明提供了包含重组细菌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，所述重组细菌细胞包含与第一诱导型启动子可操作地连接的编
码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因、与第二诱导型启动子可操作地连接的编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因，所述第二诱导型启动子可以是与所述第一诱导型启动子相同或不同的启动子。在任何这些实施方案中，所述第一启动子和所述第二启动子可以是同一启动子的单独拷贝。在一些实施方案中，所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自由环境条件直接诱导。在一些实施方案中，所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自由环境条件间接诱导。在一些实施方案中，所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自由哺乳动物肠道中的环境条件直接或间接诱导。在一些实施方案中，所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自由低氧或厌氧条件直接或间接诱导。在一些实施方案中，所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自由炎症条件直接或间接诱导。在一些实施方案中，所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自是fnr响应性启动子。在一些实施方案中，所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自是rns响应性启动子。在一些实施方案中，所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子、或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子各自是ros响应性启动子。在另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者中草酸盐有害的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用工程化细菌细胞或包含工程化细菌细胞的药物组合物，其中所述工程化细菌细胞包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列。在另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者中草酸盐有害的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用工程化细菌细胞或包含工程化细菌细胞的药物组合物，其中所述工程化细菌细胞包含编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因序列。在另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者中草酸盐有害的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用工程化细菌细胞或包含工程化细菌细胞的药物组合物，其中所述工程化细菌细胞包含编码一种或多种甲酸盐输出蛋白的基因序列。在另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者中草酸盐有害的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用工程化细菌细胞或包含工程化细菌细胞的药物组合物，其中所述工程化细菌细胞包含编码一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因序列。在另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者中草酸盐有害的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用工程化细菌细胞或包含工程化细菌细胞的药物组合物，其中所述工程化细菌细胞包含编码以下物质中的一种或多种的基因序列：(i)一种或多种草酸分解代谢酶；(ii)一种或多种草酸盐转运蛋白；(iii)一种或多种甲酸盐输出蛋白；和(iv)一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白。
45.在另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者的草酸盐有害的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用工程化细菌细胞或包含工程化细菌细胞的药物组合物，其中所述工程化细菌细胞响应于受试者的外源环境条件表达编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因，从而治疗受试者的草酸盐有害的疾病或病症。在一些实施方案中，工程化细菌细胞还表达以下基因中的一种或多种：(i)编码草酸盐输入蛋白的至少一个异源基因；(ii)编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因；和/或(iii)编码草酸盐:甲酸盐
反向转运蛋白的至少一个异源基因。在一个方面，本发明提供了治疗受试者的草酸盐有害的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的工程化细菌细胞或药物组合物，从而治疗受试者的草酸盐有害的病症。在另一个方面，本发明提供了降低受试者血浆中的草酸盐水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的工程化细菌细胞或药物组合物，从而降低受试者血浆中的草酸盐水平。在另一个方面，本发明提供了降低受试者尿液中的草酸盐水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的工程化细菌细胞或药物组合物，从而降低受试者尿液中的草酸盐水平。在一个实施方案中，在向所述受试者施用工程化细菌细胞或药物组合物之后，受试者血浆中的草酸盐水平降低。在另一个实施方案中，在向所述受试者施用工程化细菌细胞或药物组合物之后，受试者尿液中的草酸盐水平降低。在一个实施方案中，口服施用工程化细菌细胞或药物组合物。在另一个实施方案中，所述方法还包括在向所述受试者施用工程化细菌细胞或药物组合物之后，分离来自受试者的血浆样品或来自受试者的尿液样品，并且确定来自受试者的血浆样品中或来自受试者的尿液样品中的草酸盐水平。在另一个实施方案中，所述方法还包括将来自受试者的血浆样品或来自受试者的尿液样品中的草酸盐水平与对照草酸盐水平进行比较。在一个实施方案中，对照草酸盐水平是在施用工程化细菌细胞或药物组合物之前在受试者血浆或受试者尿液中的草酸盐水平。
46.在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是高草酸尿症。在一个实施方案中，高草酸尿症是原发性i型高草酸尿症。在另一个实施方案中，高草酸尿症是原发性ii型高草酸尿症。在另一个实施方案中，高草酸尿症是原发性iii型高草酸尿症。在一个实施方案中，高草酸尿症是肠高草酸尿症。在另一个实施方案中，高草酸尿症是饮食性高草酸尿症。在另一个实施方案中，高草酸尿症是特发性高草酸尿症。
47.在一个实施方案中，在施用药物组合物的一小时内给受试者喂食膳食。在另一个实施方案中，在施用药物组合物的同时给受试者喂食膳食。
附图说明
48.图1描绘了显示与野生型大肠埃希氏菌nissle菌株相比时使用工程化大肠埃希氏菌尼斯勒菌株的体外草酸盐降解测定的结果的图。
49.图2a描绘了显示通过测量当与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒菌株(ecn)相比使用工程化大肠埃希氏菌尼斯勒菌株(工程化ecn)的急性
13
c-草酸盐尿回收进行的体内草酸盐消耗实验的结果的柱状图。图2b描绘了显示通过测量当与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒菌株(ecn)相比使用工程化大肠埃希氏菌尼斯勒菌株(工程化ecn)的慢性尿草酸盐回收进行的体内草酸盐消耗实验的结果的柱状图。
50.图3是概括了肠高草酸尿症的疾病发病机理的图。
51.图4a描绘了菌株synb8802的组分，并且图4b描绘了显示与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒菌株相比使用synb8802的体外草酸盐降解测定的结果的图。图4c描绘了显示与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒菌株相比使用synb8802的体外草酸盐降解和甲酸盐产生测定的结果的图。
52.图5a描绘了当在模拟的胃和结肠液中激活syn-hox时syn-hox(syn5752)的草酸盐消耗。图5b描绘了工程化大肠埃希氏菌尼斯勒菌株(工程化ecn)syn5752在小鼠肠道中消耗
草酸盐。syn5752是具有抗生素抗性的整合菌株。syn7169是一种具有抗生素抗性、营养缺陷型和噬菌体3缺失的整合菌株。在多次急性小鼠研究中测量了
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c-草酸盐消耗，并且所述菌株的功效在50％-75％之间。在该小鼠模型中，syn7169的行为与syn5752相似。图5c描绘了健康小鼠胃肠道(gi)中synb8802的草酸盐消耗。数据表示为通过肌酐归一化的平均尿
13
c-草酸盐回收
±
平均值的标准误差。统计分析采用单因子方差分析，随后采用dunnett多重比较检验进行。****p《0.0001。
53.图6描绘了健康猴子中的尿草酸盐增加的减弱。
54.图7a描绘了显示在用syn7169治疗后在健康猴子(nhp)中尿草酸盐的剂量依赖性回收的条形图。图7b描绘了显示在用syn7169治疗后在健康猴子中尿
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c-草酸盐的剂量依赖性回收的条形图。图7c描绘了患有急性高草酸尿症的食蟹猴胃肠道中的草酸盐和
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c-草酸盐消耗。数据表示为通过肌酐归一化的平均尿草酸盐或
13
c-草酸盐回收
±
平均值的标准误差。使用配对t检验进行统计分析。**p《0.01。
55.图8a描绘了synb8802在体内存活，并且在24小时后从小鼠的粪便中被清除。图8b描绘了在6小时和24小时内从食蟹猴的粪便中回收的syn-hox(syn8802)。
56.图9描绘了在非人灵长类动物(nhp)中用冻干的synb8802(lyo)和冷冻液体(fl)的草酸盐消耗。
57.图10描绘了基于cfu和活细胞用冻干的syn-hox(syn7169)(lyo)和冷冻液体在小鼠中的草酸盐消耗。
58.图11a描绘了对在用synb8802治疗后在人类患者中尿草酸盐的剂量依赖性回收建模的图。图11b描绘了肠高草酸尿症计算机仿真模拟(iss)模型的示意图。图11c描绘了在给予synb8802之后从基线的尿草酸盐百分比变化的计算机仿真模拟(iss)。该建模表明，在目标剂量范围内synb8802有可能实现》20％的尿草酸盐降低。
59.图12是概括临床试验的组织的示意图。
具体实施方式
60.本公开包括工程化和编程的微生物(例如细菌、酵母、病毒等)、其药物组合物以及调节和治疗草酸盐有害的病症的方法。在一些实施方案中，微生物(例如细菌、酵母或病毒)已被遗传工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的异源基因序列。在一些实施方案中，微生物(例如细菌、酵母或病毒)已被遗传工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的异源基因序列，并且能够在低氧环境(例如肠道)中处理和降低草酸盐和/或草酸。在一些实施方案中，工程化微生物包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的异源基因序列，并且能够将草酸和/或草酸盐和/或另一种相关代谢物转运到细菌中。因此，重组微生物和包含本发明的微生物的药物组合物可以被用于分解代谢草酸盐或草酸，以治疗和/或预防与草酸盐有害的病症相关的病状。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是涉及异常草酸盐水平的病症，诸如原发性高草酸尿症(即phi、phii和phiii)、继发性高草酸尿症、肠高草酸尿症、饮食性高草酸尿症或特发性高草酸尿症。
61.在一些实施方案中，工程化微生物包含编码以下物质中的一种或多种的基因序列：(i)一种或多种草酸盐转运蛋白；(ii)一个或多个甲酸盐输出蛋白；(iii)介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出两者的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)；
和(iv)它们的任何组合。在一些实施方案中，微生物已被工程化以包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和以下物质中的一种或多种的基因序列：(i)一种或多种草酸盐转运蛋白；(ii)一个或多个甲酸盐输出蛋白；(iii)介导草酸盐的转运(输入)和甲酸盐的输出两者的一种或多种多肽(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)；和(iv)它们的任何组合。
62.为了能够更容易地理解本公开，首先定义某些术语。应当根据本公开的其余部分并如本领域普通技术人员所理解的来解读这些定义。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。附加定义如整个具体实施方式中所阐述。
63.如本文所用，术语“微生物”或“重组微生物”是指已经从其天然状态进行遗传修饰的微生物(例如细菌或病毒细胞、或细菌或病毒)。因此，“重组细菌细胞”或“重组细菌”是指已经从其天然状态进行遗传修饰的细菌细胞或细菌。例如，重组细菌细胞可以在其dna中引入核苷酸插入、核苷酸缺失、核苷酸重排和核苷酸修饰。这些遗传修饰可能存在于细菌或细菌细胞的染色体中，或者存在于细菌或细菌细胞的质粒上。本文所公开的重组细菌细胞可以包含在质粒上的外源核苷酸序列。可替代地，重组细菌细胞可以包含稳定掺入其染色体中的外源核苷酸序列。
[0064]“编程的或工程化微生物”是指已经从其天然状态进行了遗传修饰以执行特定功能的微生物(例如细菌或病毒细胞、或细菌或病毒)。因此，“编程的或工程化细菌细胞”或“编程的或工程化的细菌”或“遗传工程化细菌细胞或细菌”是指已经从其天然状态进行遗传修饰以执行特定功能(例如代谢代谢物(例如草酸盐))的细菌细胞或细菌。在某些实施方案中，编程的或工程化细菌细胞已经被修饰以表达一种或多种蛋白质，例如具有治疗活性或服务于治疗目的的一种或多种蛋白质。一旦所关注的蛋白质已经被表达，编程的或工程化细菌细胞还可以具有停止生长或自身毁灭的能力。
[0065]
如本文所用，术语“基因”是指编码蛋白质或其片段的核酸片段，任选地包括编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调节序列。在一个实施方案中，“基因”不包括编码序列之前和之后的调节序列。“天然基因”是指在自然界中发现的基因，任选地在编码序列之前和之后具有其自身的调节序列。“嵌合基因”是指任何非天然基因的基因，任选地包含在编码序列之前和之后的调节序列，其中所述编码序列和/或所述调节序列全部或部分在自然界中并不存在。因此，嵌合基因可以包含源自不同来源的调节序列和编码序列，或者源自相同来源但以不同于自然界中存在的方式排列的调节序列和编码序列。
[0066]
如本文所用，术语“基因序列”意指遗传序列，例如核酸序列。基因序列或遗传序列意在包括完整基因序列或部分基因序列。基因序列或遗传序列意在包括编码蛋白质或多肽的序列，并且也意在包括不编码蛋白质或多肽的遗传序列，例如调节序列、前导序列、信号序列或其他非蛋白质编码序列。
[0067]
如本文所用，“异源”基因或“异源序列”是指通常在自然界中在给定细胞中不存在的核苷酸序列。如本文所用，异源序列涵盖外源引入给定细胞中的核酸序列，并且可以是天然序列(在细胞中天然存在或表达)或非天然序列(在细胞中非天然存在或表达)，并且可以是天然或野生型序列或变体、非天然或合成的序列。“异源基因”包括以不同于相应的天然基因的形式引入宿主细胞中的天然基因或其片段。例如，异源基因可以包括作为嵌合基因一部分的天然编码序列，以包括重新引入宿主细胞中的非天然调节区。异源基因也可以包
括引入非天然宿主细胞中的天然基因或其片段。因此，异源基因对于受体细胞可以是外源的或天然的；在给定细胞中天然存在但表达非天然量的核酸和/或其编码的多肽的核酸序列；和/或在自然界中彼此不存在于相同关系中的两个或更多个核酸序列。如本文所用，术语“内源基因”是指在生物体基因组中在其天然位置中的天然基因。如本文所用，术语“转基因”是指已经被引入宿主生物体(例如宿主细菌细胞)基因组中的基因。
[0068]
如本文所用，“非天然”核酸序列是指通常不存在于微生物中的核酸序列，例如内源序列的额外拷贝或异源序列(诸如来自细菌或病毒的不同物种、品系或亚株的序列、或与来自相同亚型的细菌或病毒的未修饰序列相比被修饰和/或突变的序列)。在一些实施方案中，非天然核酸序列是合成的、非天然存在的序列(参见例如，purcell等人,2013)。非天然核酸序列可以是调节区、启动子、基因和/或基因盒中的一个或多个基因。在一些实施方案中，“非天然的”是指在自然界中彼此不存在于相同关系中的两个或更多个核酸序列。非天然核酸序列可以存在于质粒或染色体上。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化微生物包含与天然不与所述基因相关的启动子可操作地连接的基因和/或基因盒。例如，在一些实施方案中，本文所公开的遗传工程化细菌包含编码本文所述的一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白、一种或多种输出蛋白(例如甲酸盐的)和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因或基因盒，所述基因或基因盒可操作地连接到天然不与所述基因相关的直接或间接诱导型启动子上，所述启动子例如与编码本文所述的一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸转运蛋白、一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因可操作地连接的fnr响应性一种或多种本文所述的草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白、一种或多种输出蛋白(例如甲酸盐的)和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)(或本文所公开的其他启动子)。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化病毒包含可操作地连接到天然不与所述基因或基因盒相关的直接或间接诱导型启动子上的基因或基因盒，所述启动子例如与编码一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因和/或基因盒可操作地连接的启动子。
[0069]
如本文所用，术语“编码区”是指编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。术语“调节序列”是指位于编码序列上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关编码序列的转录、rna加工、rna稳定性或翻译。调节序列的实例包括但不限于启动子、翻译前导序列、效应子结合位点、信号序列和茎环结构。在一个实施方案中，调节序列包含启动子，例如fnr响应性启动子或本文所公开的其他启动子。
[0070]“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。当调节元件能够影响基因编码序列的表达时，其与编码序列可操作地连接，而不管调节元件与编码序列之间的距离。更具体而言，可操作地连接是指核酸序列(例如编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因或基因盒)其以允许所述核酸序列表达的方式与调节序列连接，所述核酸序列例如编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或一种或多种草酸转运蛋白、一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因或基因盒。换句话说，调节序列以顺式发挥作用。在一个实施方案中，可以将基因以允许基因表达的方式“直接连接”到调节序列上。在
另一个实施方案中，可以将基因以允许基因表达的方式“间接连接”到调节序列上。在一个实施方案中，可以将两个或更多个基因以允许两个或更多个基因表达的方式直接或间接连接到调节序列上。调节区或序列是能够指导所关注基因的转录的核酸，并且可以包含启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、启动子控制元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列和内含子。
[0071]
如本文所用的“启动子”是指能够控制编码序列或基因表达的核苷酸序列。启动子通常位于它们所调节的序列的5'端。启动子可以全部来源于天然基因，或者由来源于自然界中存在的启动子的不同元件构成，和/或包含合成的核苷酸区段。本领域技术人员将容易地确定，不同的启动子可以响应于特定的刺激(例如以细胞或组织特异性的方式响应于不同的环境或生理条件或响应于特定的化合物)来调节编码序列或基因的表达。原核生物启动子通常被分为两个类别：诱导型和组成型。“组成型启动子”是指允许在其控制下的编码序列或基因连续转录的启动子。
[0072]“组成型启动子”是指能够促进在其控制下和/或与其可操作地连接的编码序列或基因连续转录的启动子。组成型启动子和变体是本领域熟知的，并且包括但不限于ptac启动子、bba_j23100、组成型大肠埃希氏菌σs启动子(例如，osmy启动子(国际遗传工程机器(international genetically engineered machine，igem)标准生物部分注册名称bba_j45992；bba_j45993))、组成型大肠埃希氏菌σ
32
启动子(例如，htpg热休克启动子(bba_j45504))、组成型大肠埃希氏菌σ
70
启动子(例如，lacq启动子(bba_j54200；bba_j56015)、大肠埃希氏菌creabcd磷酸盐感应操纵子启动子(bba_j64951)、glnrs启动子(bba_k088007)、lacz启动子(bba_k119000；bba_k119001)；m13k07基因i启动子(bba_m13101)；m13k07基因ii启动子(bba_m13102)、m13k07基因iii启动子(bba_m13103)、m13k07基因iv启动子(bba_m13104)、m13k07基因v启动子(bba_m13105)、m13k07基因vi启动子(bba_m13106)、m13k07基因viii启动子(bba_m13108)、m13110(bba_m13110))、组成型枯草芽孢杆菌σa启动子(例如，启动子veg(bba_k143013)、启动子43(bba_k143013)、p
liag
(bba_k823000)、p
lepa
(bba_k823002)、p
veg
(bba_k823003))、组成型枯草芽孢杆菌σb启动子(例如，启动子ctc(bba_k143010)、启动子gsib(bba_k143011))、沙门氏菌属启动子(例如，来自沙门氏菌属的pspv2(bba_k112706)、来自沙门氏菌属的pspv(bba_k112707))、噬菌体t7启动子(例如，t7启动子(bba_i712074；bba_i719005；bba_j34814；bba_j64997；bba_k113010；bba_k113011；bba_k113012；bba_r0085；bba_r0180；bba_r0181；bba_r0182；bba_r0183；bba_z0251；bba_z0252；bba_z0253))和噬菌体sp6启动子(例如，sp6启动子(bba_j64998))。
[0073]“诱导型启动子”是指与一个或多个基因可操作地连接的调节区，其中在所述调节区的诱导物的存在下基因的表达增加。“诱导型启动子”是指响应于刺激或外源环境条件启动在其控制下的编码序列或基因的转录水平增加的启动子。“直接诱导型启动子”是指调节区，其中调节区与编码一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因和/或基因盒可操作地连接，其中在所述调节区的诱导物的存在下蛋白质或多肽得以表达。“间接诱导型启动子”是指包含两个或更多个调节区的调节系统，所述两个或更多个调节区例如与编码第一蛋白质、多肽或因子(例如转录调节因子)的第一基因可操作地连接的第一调节区，所述第一调节区能够调节与第二基因可操作地连接的第二调节
区，所述第二调节区可以被激活或阻遏，从而激活或阻遏所述第二基因的表达。“诱导型启动子”涵盖直接诱导型启动子和间接诱导型启动子两者。本文所述的示例性诱导型启动子包括氧水平依赖性启动子(例如，fnr诱导型启动子)、由炎症或炎症反应诱导的启动子(rns、ros启动子)和由由可能天然地存在于或可能不天然地存在于(例如，可以外源地添加到)肠道中的代谢物(例如阿拉伯糖和四环素)诱导的启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于fnr响应性启动子、p
arac
启动子、p
arabad
启动子、p
tetr
启动子和p
laci
启动子，它们各自在本文中有更详细的描述。本文下面提供了其他诱导型启动子的实例。
[0074]
如本文所用，“稳定维持的”或“稳定的”细菌用于指携带非天然遗传物质的细菌宿主细胞，所述非天然遗传物质例如编码一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因和/或基因盒，所述非天然遗传物质被整合到宿主基因组中或在自我复制的染色体外质粒上增殖，使得所述非天然遗传物质得以保留、表达和增殖。稳定的细菌能够在体外(例如在培养基中)和/或在体内(例如在肠道中)存活和/或生长。例如，稳定的细菌可以是包含编码一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌，其中携带所述基因的质粒或染色体稳定地保持在细菌中，使得所述一种或多种草酸分解代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如，草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)可以在细菌中被表达，并且所述细菌能够在体外和/或在体内存活和/或生长。在一些实施方案中，拷贝数影响所述非天然遗传物质表达的稳定性。在一些实施方案中，拷贝数影响所述非天然遗传物质的表达水平。
[0075]
如本文所用，术语“表达”是指来自核酸的有义(mrna)或反义rna的转录和稳定积累，和/或mrna翻译成多肽。
[0076]
如本文所用，术语“质粒”或“载体”是指未整合到细菌细胞基因组中的染色体外核酸(例如dna)构建体。质粒通常是环状的，并且能够自主复制。质粒可以是低拷贝、中等拷贝或高拷贝的，如本领域熟知的。质粒可以任选地包含有助于选择含有质粒的细菌细胞并且确保质粒保留在细菌细胞中的选择性标记，诸如抗生素抗性基因，其。本文所公开的质粒可以包含编码异源基因的核酸序列，所述异源基因例如编码一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因和/或基因盒。
[0077]
如本文所用，术语“转化”(“transform”或“transformation”)是指将核酸片段转移到宿主细菌细胞中，导致遗传稳定的遗传。包含转化的核酸片段的宿主细菌细胞被称为“重组的”或“转基因的”或“转化的”生物体。
[0078]
如本文所用的术语“遗传修饰”是指任何遗传变化。示例性的遗传修饰包括增加、减少或消除基因表达的修饰，包括例如天然染色体或染色体外遗传物质的修饰。示例性的遗传修饰还包括引入至少一个质粒、染色体或染色体外遗传序列的修饰、突变、碱基缺失、碱基添加、碱基取代和/或密码子修饰、基因过表达、基因扩增、基因抑制、启动子修饰或取代、基因添加(单拷贝或多拷贝)、反义表达或抑制、或宿主细胞遗传元件的任何其他变化(无论所述变化是否产生表型变化)。遗传修饰可以包括将质粒引入细菌细胞中，所述质粒
例如包含与启动子可操作地连接的编码一种或多种草酸代谢酶和/或一种或多种草酸盐转运蛋白和/或一种或多种(例如甲酸盐的)输出蛋白和/或一种或多种反向转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因和/或基因盒的质粒。遗传修饰也可能涉及染色体中的靶向替换，例如，用诱导型启动子、调节性启动子、强启动子或组成型启动子替换天然基因启动子。遗传修饰也可以包括基因扩增，例如，将天然基因的至少一个额外拷贝引入细胞的染色体中。可替代地，染色体遗传修饰可能涉及遗传突变。
[0079]
如本文所用，术语“遗传突变”是指与其天然或野生型序列相比在基因或相关调节区的核苷酸序列中改变了核苷酸序列的一个或多个变化。突变包括例如在野生型序列中全部或部分的取代、添加和缺失。此类取代、添加或缺失可以是单个核苷酸变化(例如，一个或多个点突变)，或者可以是两个或更多个核苷酸变化，这可能导致序列的实质性变化。突变可以发生在基因的编码区内，也可以发生在基因的非编码和调节序列内。术语“遗传突变”旨在包括编码区内的沉默和保守突变，以及改变由基因编码的多肽的氨基酸序列的变化。基因编码序列中的遗传突变可以例如增加、减少或以其他方式改变基因多肽产物的活性(例如酶活性)。调节序列中的遗传突变可以增加、减少或以其他方式改变与改变的调节序列可操作地连接的序列的表达。
[0080]
具体而言，术语“减少草酸盐从细菌细胞输出的遗传修饰”是指与草酸盐从不具有所述修饰的细菌细胞(例如野生型细菌细胞)的输出速率或输出量相比，减少草酸盐从细菌细胞的输出速率或输出量的遗传修饰。在一个实施方案中，具有减少草酸盐从细菌细胞输出的遗传修饰的重组细菌细胞包含天然基因中的遗传突变。在另一个实施方案中，具有减少草酸盐从细菌细胞输出的遗传修饰的重组细菌细胞包含天然启动子中的遗传突变，其减少或抑制编码草酸盐输出蛋白的基因的转录。在另一个实施方案中，具有减少草酸盐从细菌细胞输出的遗传修饰的重组细菌细胞包含导致草酸盐输出蛋白的阻遏物过表达的遗传突变。在另一个实施方案中，具有减少草酸盐从细菌细胞输出的遗传修饰的重组细菌细胞包含减少或抑制编码草酸盐输出蛋白的基因翻译的遗传突变。
[0081]
此外，术语“增加细菌细胞中草酸盐的输入的遗传修饰”是指与不具有所述修饰的细菌细胞(例如野生型细菌细胞)的细胞溶质中草酸盐的摄取速率或摄取量相比，增加细菌细胞的细胞溶质中草酸盐的摄取速率或摄取量的遗传修饰。在一些实施方案中，具有增加细菌细胞中草酸盐的输入的遗传修饰的工程化细菌细胞是指包含编码一种或多种草酸盐输入蛋白/转运蛋白的异源基因序列(天然或非天然)的细菌细胞。在一些实施方案中，包含增加细菌细胞中草酸盐的输入的遗传修饰的遗传工程化细菌包含编码草酸盐转运蛋白或其他代谢物转运蛋白或反向转运蛋白(例如将草酸盐转运到细菌细胞中的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的基因序列。转运蛋白可以是辅助或允许草酸盐输入细胞中的任何转运蛋白。在某些实施方案中，草酸盐转运蛋白是反向转运蛋白，例如来自产甲酸草酸杆菌的例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白，例如oxlt。在某些实施方案中，工程化细菌细胞包含编码例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt的基因序列。在一些实施方案中，工程化细菌包含多于一个拷贝的编码草酸盐转运蛋白(例如草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白，例如oxlt，例如来自产甲酸草酸杆菌)的基因序列。在一些实施方案中，工程化细菌包含编码多于一种草酸盐转运蛋白(例如两种或更多种不同的草酸盐转运蛋白)的基因序列。
[0082]
如本文所用，术语“转运蛋白”意在指用于将分子(例如，氨基酸、肽(二肽、三肽、多
肽等)、毒素、代谢物、底物以及其他生物分子)从细胞外环境输入微生物中的一种机制(例如，一种蛋白质、多种蛋白质或蛋白质复合物)。如本文所用，术语“转运蛋白”还包括可以输入和输出代谢物的反向转运蛋白，例如本文所述的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白。如本文所用，术语“转运蛋白”和“输入蛋白”被等效地使用。
[0083]
如本文所用的术语“草酸盐”是指式c2o
42-的二价阴离子。草酸盐是草酸的共轭碱。如本文所用的术语“草酸”是指化学式h2c2o4的二羧酸。
[0084]
如本文所用，短语“外源环境条件”或“外源环境信号”是指直接或间接诱导的本文所述的启动子的设置、环境、刺激或生物分子。短语“外源环境条件”意在指对于工程化微生物是外部的但是对于宿主受试者环境是内源的或天然的环境条件。因此，“外源”和“内源”可以互换使用，是指环境条件，其中所述环境条件对于哺乳动物体是内源的但是对于完整的微生物细胞是外部的或外源的。在一些实施方案中，外源环境条件对于哺乳动物的肠道是特异的。在一些实施方案中，外源环境条件对于哺乳动物的上胃肠道是特异的。在一些实施方案中，外源环境条件对于哺乳动物的下胃肠道是特异的。在一些实施方案中，外源环境条件对于哺乳动物的小肠是特异的。在一些实施方案中，外源环境条件是低氧、微需氧或厌氧条件，诸如哺乳动物肠道的环境。在一些实施方案中，外源环境条件是对哺乳动物肠道特异的分子或代谢物，例如丙酸盐。在一些实施方案中，外源环境条件是组织特异性或疾病特异性代谢物或分子。在一些实施方案中，外源环境条件对疾病(例如高草酸尿症)是特异的。在一些实施方案中，外源环境条件是低ph环境。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化微生物包含ph依赖性启动子。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化微生物包含氧水平依赖性启动子。在一些方面，细菌已经进化出能够感知氧水平的转录因子。不同的信号传导途径可能由不同的氧水平触发，并且以不同的动力学发生。“氧水平依赖性启动子”或“氧水平依赖性调节区”是指一种或多种氧水平感知转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合和/或激活会激活下游基因表达。
[0085]
氧水平依赖性转录因子的实例包括但不限于fnr(延胡索酸和硝酸还原酶)、anr和dnr。相应的fnr响应性启动子、anr(厌氧硝酸呼吸)响应性启动子和dnr(异化硝酸呼吸调节剂)响应性启动子是本领域已知的(参见例如，castiglione等人,2009；eiglmeier等人,1989；galimand等人,1991；hasegawa等人,1998；hoeren等人,1993；salmon等人,2003)，并且非限制性实例在表1中示出。
[0086]
在非限制性实例中，启动子(pfnrs)衍生自已知在低或无环境氧的条件下高度表达的大肠埃希氏菌尼斯勒延胡索酸和硝酸还原酶基因s(fnrs)(durand和storz,2010；boysen等人,2010)。pfnrs启动子在厌氧条件下被在尼斯勒中天然存在的全局转录调节因子fnr激活。在厌氧条件下，fnr形成二聚体，并且在其控制下与特定基因启动子中的特定序列结合，从而激活它们的表达。然而，在有氧条件下，氧与fnr二聚体中的铁-硫簇发生反应，并且将它们转化为非活性形式。以这种方式，采用pfnrs诱导型启动子来调节蛋白质或rna的表达。pfnrs在本技术中与fnrs、fnrs、fnr、p-fnrs启动子和其他表示启动子pfnrs的此类相关名称可互换使用。
[0087]
表1.转录因子和响应性基因及调节区的实例
[0088][0089][0090]
活性氧物质(ros)的存在或不存在。在其他实施方案中，外源环境条件是活性氮物质(rns)的存在或不存在。在一些实施方案中，外源环境条件是参与炎症反应的生物分子，例如，存在于肠道炎症性病症中的分子。在一些实施方案中，外源环境条件或信号在重组细菌细胞所在的环境中天然存在或天然不存在。在一些实施方案中，外源环境条件或信号是人工产生的，例如，通过产生或去除生物条件和/或施用或去除生物分子。
[0091]
在一些实施方案中，外源环境条件和/或信号刺激诱导型启动子的活性。在一些实施方案中，用于激活诱导型启动子的外源环境条件和/或信号不是天然存在于哺乳动物的肠道中。在一些实施方案中，诱导型启动子被与本公开的药物组合物联合施用的分子或代谢物(例如四环素、阿拉伯糖或任何用于激活诱导型启动子的生物分子)刺激。在一些实施方案中，将外源环境条件和/或信号添加到包含本公开的重组细菌细胞的培养基中。在一些实施方案中，用于激活诱导型启动子的外源环境条件天然存在于哺乳动物的肠道内(例如，低氧或厌氧条件，或参与炎症反应的生物分子)。在一些实施方案中，暴露于外源环境条件(例如，体内)的丢失抑制诱导型启动子的活性，因为不存在外源环境条件来诱导启动子(例如，肠道外部的有氧环境)。“肠道”是指负责食物转移和消化、营养吸收和废物排泄的器官、腺体、肠道和系统。在人类中，肠道包括胃肠(gi)道，其开始于嘴并终止于肛门，并且另外还包括食道、胃、小肠和大肠。肠道还包括附属器官和腺体，诸如脾、肝、胆囊和胰腺。上胃肠道包括食道、胃和小肠的十二指肠。下胃肠道包括小肠的剩余部分(即空肠和回肠)以及大肠的全部(即盲肠、结肠、直肠和肛管)。可以在整个肠道(例如在胃肠道中，以及特别是在小肠中)中发现细菌。
[0092]“微生物”是指通常由单细胞组成的微观、亚微观或超微观大小的生物体或微生物。微生物的实例包括细菌、病毒、寄生虫、真菌、某些藻类和原生动物。在一些方面，微生物被工程化(“工程化微生物”)以产生一种或多种治疗分子，例如一种或多种草酸分解代谢酶。在某些实施方案中，工程化微生物是工程化细菌。在某些实施方案中，工程化微生物是工程化病毒。
[0093]“非致病性细菌”是指不能在宿主体内引起疾病或有害反应的细菌。在一些实施方案中，非致病性细菌是革兰氏阴性菌。在一些实施方案中，非致病性细菌是革兰氏阳性菌。在一些实施方案中，非致病性细菌不含有脂多糖(lps)。在一些实施方案中，非致病性细菌是共生细菌。非致病性细菌的实例包括但不限于属于属芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、短杆菌属、梭菌属、肠球菌属、大肠埃希氏菌、乳酸杆菌属、乳球菌属、酵母菌属和葡萄球菌属的某些菌株，例如凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)、枯草芽孢杆菌、脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)、枯草拟杆菌(bacteroides subtilis)、多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌
(bifidobacterium longum)、丁酸梭菌(clostridium butyricum)、屎肠球菌(enterococcus faecium)、大肠埃希氏菌、大肠埃希氏菌尼斯勒、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、约翰逊乳杆菌(lactobacillus johnsonii)、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、罗伊乳杆菌(lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)和布拉尔酵母菌(saccharomyces boulardii)(sonnenborn等人,2009；dinleyici等人,2014；美国专利号6,835,376；美国专利号6,203,797；美国专利号5,589,168；美国专利号7,731,976)。非致病性细菌还包括共生细菌，它们存在于肠道的固有微生物群中。在一个实施方案中，本公开还包括非致病性酵母菌属，诸如布拉尔酵母菌。天然致病性细菌可以进行遗传工程化来降低或消除致病性。
[0094]“益生菌”用于指可以赋予含有适当量微生物的宿主生物体健康益处的活的非致病性微生物，例如细菌。在一些实施方案中，宿主生物体是哺乳动物。在一些实施方案中，宿主生物体是人。在一些实施方案中，益生菌是革兰氏阴性菌。在一些实施方案中，益生菌是革兰氏阳性菌。非致病性细菌的一些物种、菌株和/或亚型目前被认为是益生菌。益生菌的实例包括但不限于属于属双歧杆菌属、大肠埃希氏菌、乳杆菌属和酵母菌属的某些菌株，例如两歧双歧杆菌、屎肠球菌、大肠埃希氏菌菌株尼斯勒、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、副干酪乳杆菌和植物乳杆菌、以及布拉尔酵母菌(dinleyici等人,2014；美国专利号5,589,168；美国专利号6,203,797；美国专利号6,835,376)。益生菌可以是细菌的变体或突变菌株(arthur等人,2012；cuevas-ramos等人,2010；olier等人,2012；nougayrede等人,2006)。可以对非致病性细菌进行遗传工程化以增强或改善所需的生物特性，例如生存能力。可以对非致病性细菌进行遗传工程化以提供益生菌特性。可以对益生菌进行遗传工程化以增强或改善益生菌特性。
[0095]
如本文所用，术语“营养缺陷型”或“营养缺陷型的”是指需要特定因子(例如，氨基酸、糖或其他营养素)来支持其生长的生物体。“营养缺陷型修饰”是导致生物体在不存在生存或生长所必需的外源添加的营养素的情况下因为所述生物体不能产生所述营养素而死亡的一种遗传修饰。如本文所用，术语“必需基因”是指细胞生长和/或存活所必需的基因。必需基因在下文中有更详细的描述，并且包括但不限于dna合成基因(诸如thya)、细胞壁合成基因(诸如dapa)和氨基酸基因(诸如sera和meta)。
[0096]
如本文所用，术语“调节”和“治疗”及其同源词是指疾病、病症和/或病状或其至少一种可辨别症状的改善。在另一个实施方案中，“调节”和“治疗”是指至少一个可测量的物理参数(不一定可由患者辨别)的改善。在另一个实施方案中，“调节”和“治疗”是指在身体上(例如，可辨别症状的稳定)、在生理上(例如，物理参数的稳定)或两者抑制疾病、病症和/或病状的进展。在另一个实施方案中，“调节”和“治疗”是指减缓疾病、病症和/或病状的进展或逆转其进展。如本文所用，“预防”及其同源词是指延迟给定疾病、病症和/或病状或与此类疾病、病症和/或病状相关的症状的发病或降低获得给定疾病、病症和/或病状或与此类疾病、病症和/或病状相关的症状的风险。
[0097]
需要治疗者可能包括已经患有某种特定医学疾病的个体，以及有患上疾病的风险或最终可能患上疾病的个体。例如，通过与发展疾病相关的一种或多种风险因素的存在、疾
病的存在或进展、或患有疾病的受试者对治疗的可能接受性来评估治疗的需要。草酸盐有害的病症(例如高草酸尿症)可能是由先天性遗传突变引起的，目前尚无治愈方法。疾病也可以继发于其他病状，例如肠道病症。治疗草酸盐有害的疾病(诸如原发性高草酸尿症或继发性高草酸尿症)可以涵盖降低草酸盐和/或草酸的正常水平，降低草酸盐和/或草酸的过量水平，或消除草酸盐和/或草酸，但不一定涵盖消除基础疾病。
[0098]
如本文所用，术语“分解代谢”是指草酸盐的细胞摄取、和/或草酸盐降解成其相应的草酰辅酶a、和/或草酰辅酶a甲酸盐和二氧化碳的降解。在一个实施方案中，草酸盐的细胞摄取发生在肾脏中。在一个实施方案中，细胞摄取发生在肝脏中。在一个实施方案中，草酸盐的细胞摄取发生在肠道中。在一个实施方案中，草酸盐的细胞摄取发生在胃中。在一个实施方案中，细胞摄取由slc26转运蛋白介导(参见robijn等人(2011))。在一个实施方案中，细胞摄取由转运蛋白slc26a1介导。在一个实施方案中，细胞摄取由转运蛋白slc26a6介导。在一个实施方案中，草酸盐的细胞摄取由细胞旁转运系统介导。在一个实施方案中，草酸盐的细胞摄取由跨细胞转运系统介导。
[0099]
在一个实施方案中，“异常分解代谢”是指草酸盐的细胞摄取的速率降低。在一个实施方案中，“异常分解代谢”是指导致每日尿草酸盐排泄超过每24小时40mg的任何病状、病症、疾病、倾向和/或遗传突变。在一个实施方案中，“异常分解代谢”是指器官和/或系统处理和/或介导草酸盐细胞摄取的能力失能和/或降低。在一个实施方案中，所述器官和/或系统处理和/或介导草酸盐细胞摄取的能力失能或降低是由草酸盐的内源性产生增加引起的。在一个实施方案中，内源性草酸盐产生的增加是由过氧化物酶体肝酶agt的缺乏或缺失引起的。在一个实施方案中，内源性草酸盐产生的增加是由酶grhpr的缺乏或缺失引起的。在一个实施方案中，内源性草酸盐产生的增加是由酶4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶的缺乏或缺失引起的。在一个实施方案中，所述器官和/或系统处理和/或介导草酸盐细胞摄取的能力失能或降低是由草酸盐吸收增加引起的。在一个实施方案中，所述草酸盐吸收的增加是由草酸盐的饮食摄入增加引起的。在一个实施方案中，所述草酸盐吸收的增加是由草酸盐的肠吸收增加引起的。在一个实施方案中，所述草酸盐吸收的增加是由草酸盐前体的过量摄入引起的。在一个实施方案中，所述草酸盐吸收的增加是由肠草酸盐降解微生物的减少引起的。在一个实施方案中，所述草酸盐吸收的增加是由肠草酸盐转运蛋白的遗传变异引起的。
[0100]
在一个实施方案中,“其中草酸盐有害的病症”是涉及草酸盐和/或草酸或直接位于上游的分子(诸如乙醛酸盐)的水平异常(例如增加)的疾病或病症。在一个实施方案中，其中草酸盐有害的病症是在受试者中观察到高草酸尿症的病症或疾病。在一个实施方案中，其中草酸盐有害的病症是指导致每日尿草酸盐排泄超过每24小时40mg的任何病状、病症、疾病、倾向和/或遗传突变。在一个实施方案中，其中草酸盐有害的病症是选自由以下组成的组的病症或疾病：phi、phii、phii、继发性高草酸尿症、肠高草酸尿症、细菌过度生长综合征、克罗恩病、炎性肠病、肾移植后高草酸尿症、因肥胖进行空肠回肠旁路术后的高草酸尿症、胃溃疡手术后的高草酸尿症、慢性肠系膜缺血、胃旁路术、囊性纤维化、短肠综合征、胆/胰腺疾病(例如慢性胰腺炎)。
[0101]
如本文所用，“药物组合物”是指本公开的遗传工程化微生物(例如遗传工程化细菌或病毒)以及其他组分(诸如生理学上合适的载体和/或赋形剂)的制剂。在一个实施方案
中，药物组合物是冷冻液体组合物。在另一个实施方案中，药物组合物是冻干组合物。
[0102]
可以互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用的细菌或病毒化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。佐剂包括在这些短语中。
[0103]
术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。实例包括但不限于碳酸氢钙、碳酸氢钠、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂(包括例如聚山梨醇酯20)。
[0104]
术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”用于指导致预防、延迟病状(例如草酸盐有害的病症)的症状发作或改善其症状的化合物的量。治疗有效量可以例如足以治疗、预防、降低与超过每24小时40mg的每日尿草酸盐排泄相关的疾病或病状的一种或多种症状的严重性、延迟其发作和/或降低其发生的风险。治疗有效量以及治疗有效的施用频率可以通过本领域已知的方法来确定，并且在下面进行论述。
[0105]
如本文所用，术语“抑菌的”或“抑制细胞生长的”是指能够阻止、延缓或抑制本公开的重组细菌细胞的生长、分裂、增殖或复制的分子或蛋白质。
[0106]
如本文所用，术语“杀菌的”是指能够杀灭本公开的重组细菌细胞的分子或蛋白质。
[0107]
如本文所用，术语“毒素”是指能够阻止、延缓或抑制本公开的重组细菌细胞的生长、分裂、增殖或复制或能够杀灭本公开的重组细菌细胞的蛋白质、酶或其多肽片段或其他分子。术语“毒素”旨在包括抑菌蛋白和杀菌蛋白。术语“毒素”旨在包括但不限于溶解蛋白、细菌素(例如微菌素和大肠埃希氏菌素)、促旋酶抑制剂、聚合酶抑制剂、转录抑制剂、翻译抑制剂、dna酶和rna酶。如本文所用的术语“抗-毒素”或“抗毒素”是指能够抑制毒素活性的蛋白质或酶。术语抗-毒素旨在包括但不限于免疫调节剂和毒素表达抑制剂。毒素和抗毒素的实例是本领域已知的，并且在下文中有更详细的描述。
[0108]
如本文所用，术语“草酸分解代谢(catabolic或catabolism)酶”或“草酸分解代谢酶”或“草酸代谢酶”是指任何能够代谢草酸盐或能够减少草酸盐积聚或能够减轻、改善或预防一种或多种草酸盐有害的疾病或疾病症状的酶。草酸酶的实例包括但不限于甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(也称为甲酰辅酶a转移酶)(例如来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(也称为草酸辅酶a连接酶)(例如来自酿酒酵母的酿酒酵母酰基活化酶3(scaae3))、草酰辅酶a脱羧酶(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxc(本文也称为oxdc或草酸盐脱羧酶))、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(acoct)(例如，来自大肠埃希氏菌的yfde)和任何分解代谢草酸、草酰辅酶a或其任何其他代谢物的其他酶。分解代谢酶还包括丙氨酸乙醛酸转氨酶(agt，由agxt基因编码，例如人形式)、乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶(grhpr；具有乙醛酸还原酶(gr)、羟基丙酮酸还原酶(hpr)和d-甘油酸脱氢酶(dgdh)活性的酶，例如人形式)、以及4-羟基2-酮戊二酸醛缩酶(由hoga1基因编码，例如在人中，并且其将4-羟基2-酮戊二酸分解为丙酮酸和乙醛酸)。这些蛋白质的功能缺陷导致草酸盐或其相应的α-酮酸在细胞和组织中积聚。本公开的草酸分解代谢酶包括野生型或经修饰的草酸代谢酶两者，并且可以使用重组和合成方法产生或从天然来源纯化。草酸代谢酶包括全长多肽及其功能片段、以及其同系物和变体。草酸代谢酶包括已经由野生型序列修饰的多肽，包括例如具有一个或多个氨基酸缺失、插入和/或取代的多肽，并且可以包括例如融合多肽和具有额外序列的
多肽，所述额外序列例如调节肽序列、接头肽序列和其他肽序列。
[0109]
如本文所用，“有效负载”是指将由遗传工程化微生物诸如细菌或病毒产生的一种或多种所关注的分子。在一些实施方案中，有效负载是治疗性有效负载，例如，草酸分解代谢酶或草酸盐转运蛋白多肽。在一些实施方案中，有效负载是调节分子，例如转录调节因子诸如fnr。在一些实施方案中，有效负载包含调节元件，诸如启动子或阻遏物。在一些实施方案中，有效负载包含诱导型启动子，诸如来自fnrs。在一些实施方案中，有效负载包含阻遏物元件，诸如杀灭开关。在一些实施方案中，有效负载包含抗生素抗性基因或基因盒。在一些实施方案中，有效负载由一个基因、多个基因、基因盒或操纵子编码。在替代性实施方案中，有效负载通过生物合成或生物化学途径产生，其中所述生物合成或生物化学途径可以任选地是对微生物内源的。在替代性实施方案中，有效负载通过生物合成或生物化学途径产生，其中所述生物合成或生物化学途径不是对微生物内源的。在一些实施方案中，遗传工程化微生物包含两种或更多种有效负载。
[0110]
如本文所用，术语“常规高草酸尿症治疗”或“常规高草酸尿症疗法”是指目前被接受、被认为是当前护理标准和/或被大多数健康护理专业人员用于治疗草酸盐有害的疾病或病症的治疗或疗法。其不同于未被广泛使用的替代疗法或补充疗法。
[0111]
如本文所用，术语“多肽”包括“一种多肽”以及“多种多肽”，并且是指由通过酰胺键(即肽键)线性连接的氨基酸单体构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，而不是指产物的特定长度。因此，“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的一条链或多条链的任何其他术语都包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个使用，或者与这些术语中的任何一个互换使用。术语“多肽”也旨在指多肽的表达后修饰的产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白水解切割或通过非天然存在氨基酸的修饰。多肽可以来源于天然生物来源或通过重组技术产生。在其他实施方案中，多肽由本发明的遗传工程化细菌或病毒产生。本发明的多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个、或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有确定的三维结构，尽管它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的，并且不具有确定的三维结构而是可以采用大量不同构象的多肽被称为未折叠的。术语“肽”或“多肽”可以指与蛋白质或蛋白质的一部分对应的氨基酸序列，或者可以指与非蛋白质序列对应的氨基酸序列，例如选自调节肽序列、前导肽序列、信号肽序列、接头肽序列和其他肽序列的序列。
[0112]“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指不在其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。为了本发明的目的而分离的在宿主细胞(包括但不限于细菌或哺乳动物细胞)中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是已通过任何合适的技术被分离、分馏或部分或基本上被纯化的天然或重组多肽。重组肽、多肽或蛋白质是指通过重组dna技术产生的肽、多肽或蛋白质，即从被编码多肽的外源重组dna表达构建体转化的细胞、微生物或哺乳动物产生的肽、多肽或蛋白质。在大多数细菌培养物中表达的蛋白质或肽将通常不含聚糖。前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任何组合也包括在多肽内。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括具有与原始肽的氨基酸序列足够相似的氨基酸序列的多肽，
并且包括保留相应原始多肽的至少一种或多种特性的任何多肽。本发明多肽的片段包括蛋白水解片段、以及缺失片段。片段还包括来源于本文所述的任何多肽的特异性抗体或生物活性片段或免疫活性片段。变体可以是天然存在的或非天然存在的。使用本领域已知的诱变方法可以产生非天然存在的变体。变体多肽可以包含保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。
[0113]
多肽还包括融合蛋白。如本文所用，术语“变体”包括融合蛋白，其包含原始肽的序列或与原始肽足够相似的序列。如本文所用，术语“融合蛋白”是指包含两种或更多种不同蛋白质的氨基酸序列的嵌合蛋白。通常，融合蛋白产生自熟知的体外重组技术。融合蛋白可以具有与作为融合蛋白组分的单个原始蛋白相似的结构功能(但不一定达到相同的程度)、和/或相似的调节功能(但不一定达到相同的程度)、和/或相似的生物化学功能(但不一定达到相同的程度)和/或免疫活性(但不一定达到相同的程度)。“衍生物”包括但不限于肽，其含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物。通过比较一个肽的氨基酸序列和另一个肽的序列来确定两个肽之间的“相似性”。如果其是相同的或保守的氨基酸取代，则一个肽的氨基酸与第二个肽的相应氨基酸相似。保守取代包括在dayhoff,m.o.编辑,the atlas of protein sequence and structure 5,national biomedical research foundation,washington,d.c.(1978)以及argos,embo j.8(1989),779-785中所述的那些。例如，属于以下组之一的氨基酸代表保守改变或取代：-ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；-cys、ser、tyr、thr；-val、ile、leu、met、ala、phe；-lys、arg、his；-phe、tyr、trp、his；和-asp、glu。
[0114]
如本文所用，术语“足够相似”意指第一氨基酸序列相对于第二氨基酸序列含有足够或最小数量的相同或等同的氨基酸残基，使得所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列具有共同的结构性结构域和/或共同的功能活性。例如，包含为45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％相同的共同结构性结构域的氨基酸序列在本文中被定义为足够相似。优选地，变体将与本发明的肽的氨基酸序列足够相似。此类变体通常保留了本发明肽的功能活性。变体包括分别通过一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代而与天然和野生型肽在氨基酸序列上不同的肽。这些可能是天然存在的变体，也可能是人工设计的变体。
[0115]
如本文所用，术语“接头”、“接头肽”或“肽接头”或“接头”是指联结或连接两个多肽序列(例如，连接两个多肽结构域)的合成的或非天然的或非天然存在的氨基酸序列。如本文所用，术语“合成的”是指不是天然存在的氨基酸序列。本文描述了示例性的接头。us20140079701中提供了附加的示例性接头，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。
[0116]
如本文所用，术语“密码子优化的”是指修改在核酸分子的基因或编码区中密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变由核酸分子编码的多肽。这种优化包括用一个或多个在宿主生物体的基因中更频繁地使用的密码子替换至少一个、多于一个或大量的密码子。“密码子优化的序列”是指由现有的编码序列修改而成或者被设计成例如改善由编码序列转录的转录物rna分子在表达宿主细胞或生物体中的翻译或改善编码序列的转录的一种序列。密码子优化包括但不限于包括为编码序列选择密码子以适合表达宿主生物体
的密码子偏爱的过程。许多生物体表现出对使用特定密码子来编码以将特定氨基酸插入生长多肽链中的偏好或偏爱。密码子偏爱或密码子偏好(即生物体之间密码子使用的差异)是遗传密码简并性所允许的，并且在许多生物体中被很好地证明。密码子偏好通常与信使rna(mrna)的翻译效率相关，而翻译效率又被认为取决于被翻译的密码子的特性和特定转移rna(trna)分子的可用性等。细胞中所选trna的优势通常反映了肽合成中最常使用的密码子。因此，可以基于密码子优化针对给定生物体中的最佳基因表达来定制基因。
[0117]
如本文所用，术语“分泌系统”或“分泌蛋白”是指能够分泌或输出生物分子(例如来自微生物(例如细菌细胞质)的多肽)的天然或非天然分泌机制。分泌系统可以包含单一蛋白质或者可以包含组装成复合物(例如hlybd)的两种或更多种蛋白质。革兰氏阴性菌的分泌系统的非限制性实例包括经修饰的iii型鞭毛、i型(例如溶血素分泌系统)、ii型、iv型、v型、vi型和vii型分泌系统、抗性小结分裂区(resistance-nodulation-division，rnd)多药物外排泵、各种单膜分泌系统。革兰氏阳性菌的分泌系统的非限制性实例包括sec和tat分泌系统。在一些实施方案中，待分泌的多肽包括将多肽导向特定分泌系统的rna或肽来源“分泌标签”。在一些实施方案中，分泌系统能够在从工程化细菌中分泌多肽之前去除该标签。例如，在v型自分泌介导的分泌中，n末端肽分泌标签在由天然sec系统将“过客”肽从细胞质移位到周质区室中时被去除。此外，一旦自分泌器跨外膜移位，c末端分泌标签可以通过自动催化或蛋白酶催化的例如ompt切割而被去除，从而将治疗性多肽释放到细胞外环境中。在一些实施方案中，分泌系统涉及“渗漏”或去稳定外膜的产生，这可以通过缺失或诱变负责将外膜栓系到刚性肽聚糖骨架上的基因(包括例如lpp、ompc、ompa、ompf、tola、tolb、pal、degs、degp和nlpl)来实现。lpp作为细菌细胞壁与肽聚糖的主要
‘
肘钉(staple)’起作用。tola-pal和ompa复合物的功能与lpp类似，并且是产生遗漏表型的其他缺失靶标。此外，当周质蛋白酶诸如degs、degp或nlpi失活时，观察到渗漏表型。因此，在一些实施方案中，工程化细菌具有一个或多个缺失或突变的膜基因，例如选自lpp、ompa、ompa、ompf、tola、tolb和pal基因。在一些实施方案中，工程化细菌具有一个或多个缺失或突变的周质蛋白酶基因，例如选自degs、degp和nlpl。在一些实施方案中，工程化细菌具有选自lpp、ompa、ompa、ompf、tola、tolb、pal、degs、degp和nlpl基因的一个或多个缺失或突变的基因。
[0118]
如本文所用的冠词“一个/一种”应被理解为意指“至少一个/至少一种”，除非有明确相反的指示。
[0119]
短语“和/或”在列表中的要素之间使用时，旨在表示(1)仅存在单个列出的要素，或者(2)存在列表中的多于一个要素。例如，“a、b和/或c”表示选择可以是单独的a；单独的b；单独的c；a和b；a和c；b和c；或者a、b和c。短语“和/或”可以与列表中的“至少一个”或“一个或多个”要素互换使用。
[0120]
本文提供的范围被理解为所述范围内所有值的速写。例如，1至50的范围被理解为包括选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组的任何数字、数字组合或子范围。
[0121]
细菌
[0122]
遗传工程化微生物或编程的微生物(诸如本公开的遗传工程化细菌)能够产生一种或多种用于代谢草酸盐和/或其代谢物的酶。在一些方面，本公开提供了细菌细胞，所述
细菌细胞包含编码导致草酸盐水平降低的草酸分解代谢酶或其他蛋白质的一个或多个异源基因序列。
[0123]
在某些实施方案中，遗传工程化细菌是专性厌氧细菌。在某些实施方案中，遗传工程化细菌是兼性厌氧细菌。在某些实施方案中，遗传工程化细菌是需氧细菌。在一些实施方案中，遗传工程化细菌是革兰氏阳性菌。在一些实施方案中，遗传工程化细菌是革兰氏阳性菌并且缺乏lps。在一些实施方案中，遗传工程化细菌是革兰氏阴性菌。在一些实施方案中，遗传工程化细菌是革兰氏阳性菌和专性厌氧细菌。在一些实施方案中，遗传工程化细菌是革兰氏阳性菌和兼性厌氧细菌。在一些实施方案中，遗传工程化细菌是非致病性细菌。在一些实施方案中，遗传工程化细菌是共生细菌。在一些实施方案中，遗传工程化细菌是益生菌。在一些实施方案中，遗传工程化细菌是被修饰或突变以降低或消除致病性的天然致病性细菌。示例性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、短杆菌属、柄杆菌属、梭菌属、肠球菌属、大肠埃希氏菌、乳杆菌属、乳球菌属、李斯特菌属、分枝杆菌属、酵母菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属、弧菌属、凝结芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、枯草拟杆菌、多形拟杆菌、青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌(bifidobacterium breve)ucc2003、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、丙酮丁醇梭菌(clostridium acetobutylicum)、丁酸梭菌、丁酸梭菌m-55、匙形梭菌(clostridium cochlearum)、费新尼亚梭菌(clostridium felsineum)、溶组织梭菌(clostridium histolyticum)、多酶梭菌(clostridium multifermentans)、诺维梭菌(clostridium novyi)-nt、副腐化梭菌(clostridium paraputrificum)、巴斯德梭菌(clostridium pasteureanum)、蚀果胶梭菌(clostridium pectinovorum)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)、玫瑰色梭菌(clostridium roseum)、产孢梭菌(clostridium sporogenes)、第三梭菌(clostridium tertium)、破伤风梭菌(clostridium tetani)、酪丁酸梭菌(clostridium tyrobutyricum)、短小棒状杆菌(corynebacterium parvum)、大肠埃希氏菌mg1655、大肠埃希氏菌尼斯勒1917、单核细胞增多性李斯特菌(listeria monocytogenes)、牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)、猪霍乱沙门氏菌(salmonella choleraesuis)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)和霍乱弧菌(vibrio cholera)。在某些实施方案中，遗传工程化细菌选自由以下组成的组：屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、约翰逊乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊乳杆菌(lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌和产甲酸草酸杆菌细菌细胞。布拉尔酵母菌。在某些实施方案中，遗传工程化细菌选自脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、枯草拟杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、丁酸梭菌、大肠埃希氏菌、大肠埃希氏菌尼斯勒、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊乳杆菌和乳酸乳球菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是脆弱拟杆菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是多形拟杆菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是枯草拟杆菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是两歧双歧杆菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是婴儿双歧杆菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是乳双歧杆菌或婴儿双歧杆菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是丁酸梭菌(clostridium butyricum)细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是大肠埃希氏菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是植物乳杆菌细菌
细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是乳双歧杆菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是丁酸梭菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是大肠埃希氏菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是嗜酸乳杆菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是植物乳杆菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是罗伊乳杆菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是乳酸乳球菌细菌细胞。在一个实施方案中，细菌细胞是产甲酸草酸杆菌细菌细胞。在另一个实施方案中，细菌细胞不包括产甲酸草酸杆菌。
[0124]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌是大肠埃希氏菌菌株尼斯勒1917(大肠埃希氏菌尼斯勒)，其是已进化成最佳表征的益生菌之一的肠杆菌科革兰氏阴性菌(ukena等人,2007)。所述菌株的特点在于其完全无害(schultz,2008)，并且具有gras(通常被认为是安全的)状态(reister等人,2014，重点部分已标明)。基因组测序证实，大肠埃希氏菌尼斯勒缺乏显著的毒力因子(例如，大肠埃希氏菌α溶血素、p菌毛粘附素)(schultz,2008)。此外，已经表明，大肠埃希氏菌尼斯勒不携带致病性粘附因子，不产生任何肠毒素或细胞毒素，不具有侵袭性并且不具有尿路致病性(sonnenborn等人,2009)。早在1917年，大肠埃希氏菌尼斯勒被包装成药用胶囊(称为mutaflor)，用于治疗用途。从那以后大肠埃希氏菌尼斯勒已经被用于体内治疗人的溃疡性结肠炎(rembacken等人,1999)，以体内治疗人的炎性肠病、克罗恩病和隐窝炎(schultz,2008)，并且在体外抑制肠侵袭性沙门氏菌、军团菌(legionella)、耶尔森氏菌(yersinia)和志贺氏菌(shigella)(altenhoefer等人,2004)。普遍认为，大肠埃希氏菌尼斯勒的治疗功效和安全性已得到令人信服的证明(ukena等人,2007)。
[0125]
在一个实施方案中，本发明的重组细菌细胞不在患有草酸盐有害的病症的受试者体内建群。
[0126]
本领域普通技术人员将会理解，本文所公开的遗传修饰可以适用于细菌的其他物种、菌株和亚型。此外，来自一种或多种不同物种的基因可以彼此相互引入，例如，来自乳酸乳球菌的草酸分解代谢基因可以在大肠埃希氏菌中表达。未修饰的大肠埃希氏菌尼斯勒和本发明的遗传工程化细菌可以被例如肠道或血清中的防御因子破坏(sonnenborn等人,2009)。在一些实施方案中，为人类受试者计算停留时间。在一些实施方案中，为本发明的遗传工程化细菌计算在体内的停留时间。
[0127]
在一些实施方案中，细菌细胞是遗传工程化细菌细胞。在另一个实施方案中，细菌细胞是重组细菌细胞。在一些实施方案中，本公开包含本文所公开的细菌细胞的菌落。
[0128]
在另一个方面，本公开提供了包含本文所公开的细菌细胞的重组细菌培养物。在一个方面，本公开提供了降低培养物培养基中的草酸盐或草酸的水平的重组细菌培养物。在一个实施方案中，在细胞培养物的培养基中草酸盐或草酸的水平降低约50％、约75％或约100％。在另一个实施方案中，在细胞培养物的培养基中草酸盐或草酸的水平降低约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一个实施方案中，在细胞培养物的培养基中草酸盐或草酸的水平降低到检测极限以下。
[0129]
在上述遗传工程化细菌的一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌中的质粒上。在上述遗传工程化细菌的一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌中的质粒上，并且在质粒上可操作地连接到在低氧或厌氧条件下诱导的启动子(诸如本文公开的任何启动子)上。在其他实
施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌染色体中。在其他实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌染色体中，并且在染色体中可操作地连接到在低氧或厌氧条件下诱导的启动子(诸如本文公开的任何启动子)上。在上述遗传工程化细菌的一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌中的质粒上，并且在质粒上可操作地连接到在炎症条件下诱导的启动子(诸如本文公开的任何启动子)上。在其他实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌染色体中，并且在染色体中可操作地连接到在炎症条件下诱导的启动子(诸如本文公开的任何启动子)上。
[0130]
在一些实施方案中，包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含编码草酸盐转运蛋白的基因序列。在一些实施方案中，包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含编码甲酸盐输出蛋白的基因序列。在一些实施方案中，包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因序列。在一些实施方案中，包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含编码以下物质中的一种或多种的基因序列：草酸盐转运蛋白、甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白。
[0131]
在一些实施方案中，包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白和/或甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌是营养缺陷型。在一个实施方案中，遗传工程化细菌是选自cyse、glna、ilvd、leub、lysa、sera、meta、glya、hisb、ilva、phea、proa、thrc、trpc、tyra、thya、uraa、dapa、dapb、dapd、dape、dapf、flhd、metb、metc、proab和thi1营养缺陷型的营养缺陷型。在一些实施方案中，工程化细菌具有多于一种营养缺陷型，例如它们可以是δthya和δdapa营养缺陷型。
[0132]
在一些实施方案中，包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白和/或甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含编码用于分泌生物分子的分泌蛋白或蛋白质复合物(诸如本文公开的任何分泌系统)的基因序列。
[0133]
在一些实施方案中，包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白和/或甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含编码一种或多种抗生素基因(诸如本文公开的任何抗生素基因)的基因序列。
[0134]
在一些实施方案中，包含编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白和/或甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因和/或基因盒的遗传工程化细菌还包含杀灭开关回路(诸如本文提供的任何杀灭开关回路)。例如，在一些实施方案中，遗传工程化细菌还包含编码在诱导型启动子控制下的一种或多种重组酶的一个或多个基因、以及反向毒素序列。在一些实施方案中，遗传工程化细菌还包含编码抗毒素的一个或多个基因。在一些实施方案中，工程化细菌还包含在诱导型启动子的控制下的编码一种或多种重组酶的一个或多个基因和一个或多个反向切除基因，其中所述切除基因编码缺失必需基因的酶。在一些实施方案中，遗传工程化细菌还包含编码抗毒素的一个或多个基因。在一些实施方案中，工程化细菌还包含在具有tetr阻遏物结合位点的启动子的控制下的一种或多种编码毒素的基因，以及在由阿拉伯糖诱导的诱导型启动子诸如p
arabad
的控制下的编
码tetr的基因。在一些实施方案中，遗传工程化细菌还包含编码抗毒素的一个或多个基因。
[0135]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌是包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒的营养缺陷型，并且还包含杀灭开关回路，诸如本文所述的任何杀灭开关回路。
[0136]
在上述遗传工程化细菌的一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌中的质粒上。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于细菌染色体中。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码将草酸盐转运到细菌细胞中的一种或多种草酸盐转运蛋白的一种或多种基因和/或基因盒。在一些实施方案中，编码草酸盐转运蛋白的基因序列存在于细菌中的质粒上。在一些实施方案中，编码草酸盐转运蛋白的基因序列存在于细菌染色体中。在一些实施方案中，编码用于分泌生物分子的分泌蛋白或蛋白质复合物(诸如本文公开的任何分泌系统)的基因序列存在于细菌中的质粒上。在一些实施方案中，编码用于分泌生物分子的分泌蛋白或蛋白质复合物(诸如本文公开的任何分泌系统)的基因序列存在于细菌染色体中。在一些实施方案中，编码抗生素抗性基因的基因序列存在于细菌中的质粒上。在一些实施方案中，编码抗生素抗性基因的基因序列存在于细菌染色体中。
[0137]
草酸分解代谢酶
[0138]
产甲酸草酸杆菌是第一个在人类中被描述的降解草酸盐的专性厌氧菌，并且已经用作研究厌氧草酸盐降解的模式生物体。产甲酸草酸杆菌有三种参与草酸的分解代谢的酶。首先细胞外的草酸盐通过由oxlt基因编码的膜缔合的草酸盐-甲酸盐反向转运蛋白oxlt被吸收。frc基因编码甲酰辅酶a转移酶frc，其激活细胞内草酸盐形成草酰辅酶a。这在硫胺素ppi依赖性反应中被由oxc基因表达的草酰辅酶a脱羧酶oxc酶脱羧。甲酸盐和二氧化碳是最终产物，并且草酸盐-甲酸盐反向转运蛋白oxlt催化细胞内甲酸盐向细胞外的输出。在产甲酸草酸杆菌中，能量的产生与草酸盐转运偶联，草酸盐转运由草酸盐转运膜蛋白oxlt介导(如在abratt和reid的(oxalate-degrading bacteria of the human gut as probiotics in the management of kidney stone disease)中所述，其内容以及其中的参考文献以引用的方式整体并入本文)。
[0139]
如本文所用，术语“草酸分解代谢酶”是指参与草酸盐分解代谢成其相应的草酰辅酶a分子、草酰辅酶a分解代谢成甲酸盐和二氧化碳或草酸盐分解代谢成另一种代谢物的酶。参与草酸盐的分解代谢的酶是本领域技术人员熟知的。例如，在专性厌氧菌产甲酸草酸杆菌中，甲酰辅酶a转移酶frc(由frc基因编码)将辅酶a部分转移到草酸上，形成草酰辅酶a(参见例如，sidhu等人,j.bacteriol.179:3378-81(1997)，其全部内容以引用的方式整体明确并入本文)。随后，草酰辅酶a经历由草酰辅酶a脱羧酶oxc(由oxc基因编码)介导的反应，这导致甲酸盐和二氧化碳的形成(参见例如，lung等人,j.bacteriol.176:2468-72(1994)，其全部内容以引用的方式整体明确并入本文)。此外，大肠埃希氏菌蛋白质yfdw(蛋白质数据库登录号1pt5)和yfdu(蛋白质数据库登录号e0snc8)是甲酰辅酶a转移酶和草酰辅酶a脱羧酶，它们已被证明是产甲酸草酸杆菌frc和oxc酶的功能同系物(参见例如，toyota等人,j.bact.190:2256-64(2008)；werther等人,febs j.277:2628-40(2010)；fontenot等人,j.bact.195:1446-55(2013))。
[0140]
另一种草酸分解代谢酶乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶将乙酰辅酶a和草酸盐转化
为草酰辅酶a和乙酸盐。在非限制性实例中，乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶是来自大肠埃希氏菌的yfde(例如，描述于function and x-ray crystal structure of escherichia coli yfde；plos one.2013年7月23日；8(7):e67901)。乙酰辅酶a底物是细菌(诸如大肠埃希氏菌)中非常普遍的代谢物，并且所产生的乙酸盐可以例如扩散到细胞外空间，而不需要转运蛋白。在一个实例中，乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶反应之后可以是草酰辅酶a脱羧酶oxc(由oxc基因编码)，这导致甲酸盐和二氧化碳的形成。甲酸盐可以例如通过甲酸盐输出蛋白(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)离开细胞。
[0141]
另一种示例性的草酸分解代谢酶草酰辅酶a合成酶(ocl；也称为草酸辅酶a连接酶)，其将草酸和辅酶a和atp转化为草酰辅酶a和amp以及二磷酸。在非限制性实例中，草酸辅酶a连接酶是酿酒酵母酰基活化酶3(scaae3)(例如，描述于foster和nakata,an oxalyl-coa synthetase is important for oxalate metabolism in saccharomyces cerevisiae.febs lett.2014年1月3日；588(1):160-6)。在一个实例中，草酸辅酶a连接酶之后可以是草酰辅酶a脱羧酶oxc(由oxc基因编码)，这导致甲酸盐和二氧化碳的形成。甲酸盐可以例如通过甲酸盐输出蛋白(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)离开细胞。
[0142]
在一些实施方案中，本公开的遗传工程化细菌包含编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒。在一些实施方案中，工程化细菌包含编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒，并且能够将草酸盐转化为草酰辅酶a。在一些实施方案中，工程化细菌包含编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒，并且能够将草酰辅酶a转化为甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，工程化细菌包含编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒，并且能够将草酸盐转化为草酰辅酶a，并将草酰辅酶a转化为甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，本公开的工程化细菌包含编码将草酸盐和甲酰辅酶a转化为草酰辅酶a和甲酸盐的一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒。在一些实施方案中，本公开的工程化细菌包含编码将草酸盐和乙酰辅酶a转化为草酰辅酶a和乙酸盐的一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒。在一些实施方案中，本公开的工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酸盐和辅酶a转化为草酰辅酶a(例如，通过将一个atp转化为amp加二磷酸)。在一些实施方案中，本公开的工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒，所述草酸分解代谢酶将草酰辅酶a转化为二氧化碳和甲酰辅酶a。在一些实施方案中，工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐。在一些实施方案中，工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生乙酸。在一些实施方案中，工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生乙酸盐和二氧化碳。在一些实施方案中，工程化细菌由于草酸盐分解代谢而产生甲酸盐、乙酸盐和二氧化碳。
[0143]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列。在一些实施方案中，所述一种或多种草酸分解代谢酶增加细胞中草酸盐和/或草酰辅酶a分解代谢的速率。在一些实施方案中，所述一种或多种草酸分解代谢酶降低细胞中草酸盐的水平。在一些实施方案中，所述一种或多种草酸分解代谢酶降低细胞中草酰辅酶a的水平。在一些实施方案中，所述一种或多种草酸分解代谢酶降低细胞中草酸的水平。
[0144]
在一些实施方案中，与细胞中其相应的草酸盐水平相比，所述一种或多种草酸分
解代谢酶增加了细胞中草酰辅酶a的水平。在一些实施方案中，与细胞中其相应的草酰辅酶a的水平相比，所述一种或多种草酸分解代谢酶增加了细胞中甲酸盐和二氧化碳的水平。在一些实施方案中，与细胞中草酸盐的水平相比，所述一种或多种草酸分解代谢酶降低了草酸盐和/或草酰辅酶a的水平。
[0145]
参与草酸盐的分解代谢的酶可以在本发明的细菌中表达或修饰，以增强草酸盐的分解代谢。具体而言，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，当至少一种草酸分解代谢酶在本发明的工程化细菌细胞中表达时，当分解代谢酶表达时，工程化细菌细胞将更多的草酸盐转化为草酰辅酶a，或者将更多的草酰辅酶a转化为甲酸盐和二氧化碳。因此，包含编码草酸分解代谢酶的异源基因的遗传工程化细菌可以分解代谢草酸盐和/或草酰辅酶a以治疗草酸盐有害的病症，诸如phi、phii、phiii以及继发性高草酸尿症、肠高草酸尿症和特发性高草酸尿症。
[0146]
在一个实施方案中，本发明的细菌细胞包含编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因。在一个实施方案中，本发明的细菌细胞包含编码草酸盐输入蛋白的至少一个异源基因和个编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一异源基因。在一个实施方案中，本发明的细菌细胞包含编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因和编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因。在一个实施方案中，本发明的细菌细胞包含编码草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的至少一个异源基因和编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因。
[0147]
在一些实施方案中，本发明提供了细菌细胞，其包含与第一启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因。在一个实施方案中，细菌细胞包含编码来自不同生物体(例如不同的细菌物种)的至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因。在另一个实施方案中，细菌细胞包含多于一个拷贝的编码草酸分解代谢酶的天然基因。在又另一个实施方案中，细菌细胞包含编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个天然基因，以及至少一个拷贝的编码来自不同生物体(例如不同细菌物种)的草酸分解代谢酶的至少一个基因。在一个实施方案中，细菌细胞包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个拷贝的编码草酸分解代谢酶的基因。在一个实施方案中，细菌细胞包含多个拷贝的编码草酸分解代谢酶的基因。
[0148]
草酸分解代谢酶是本领域已知的。在一些实施方案中，草酸分解代谢酶由至少一个基因编码，所述至少一个基因编码来源于细菌物种的至少一种草酸分解代谢酶。在一些实施方案中，草酸分解代谢酶由编码来源于非细菌物种的草酸分解代谢酶的基因编码。在一些实施方案中，草酸分解代谢酶由来源于真核物种(例如酵母物种或植物物种)的基因编码。在一个实施方案中，草酸分解代谢酶由来源于人类的基因编码。在一个实施方案中，编码所述一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列来源于包括但不限于以下的属或物种的生物体：双歧杆菌属、博德特菌属(bordetella)、慢生根瘤菌属(bradyrhizobium)、伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)、梭菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、真细菌属(eubacterium)、乳杆菌属、磁螺菌属(magnetospirillium)、分枝杆菌属、脉孢菌属(neurospora)、草酸杆菌属(oxalobacter)(例如，产甲酸草酸杆菌)、罗尔斯通氏菌属(ralstonia)、红假单胞菌属(rhodopseudomonas)、志贺氏菌属(shigella)、热原体属(thermoplasma)和需氧去氮菌(thauera)，例如，动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)、两岐双岐杆菌、婴儿双岐杆
菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、支气管炎博德特菌(bordatella bronchiseptica)、副百日咳博德特菌(bordatella parapertussis)、真菌伯克霍尔德菌(burkholderia fungorum)、burkholderia xenovorans、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobium japonicum)、丙酮丁醇梭菌(clostridium acetobutylicum)、艰难梭菌(clostridium difficile)、闪烁梭菌(clostridium scindens)、产孢梭菌(clostridium sporogenes)、破伤风梭菌(clostridium tentani)、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、迟缓真杆菌(eubacterium lentum)、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、加氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、向磁磁螺菌(magnetospirilliummagentotaticum)、鸟分枝杆菌(mycobacterium avium)、胞内分枝杆菌(mycobacterium intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(mycobacterium kansasii)、麻风分枝杆菌(mycobacterium leprae)、耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(mycobacterium ulcerans)、粗糙脉孢菌(neurospora crassa)、产甲酸草酸杆菌、雷氏普罗威登斯菌(providencia rettgeri)、迟缓真杆菌(eubacterium lentum)、富养产碱菌(ralstonia eutropha)、ralstonia metallidurans、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustris)、弗氏志贺氏菌(shigella flexneri)、火山热原体(thermoplasma volcanium)和芳香族需氧去氮菌(thauera aromatica)。
[0149]
在一个实施方案中，由遗传工程化细菌编码的一种或多种草酸分解代谢酶来源于产甲酸草酸杆菌，例如上述oxc和frc。
[0150]
在一个实施方案中，由工程化细菌编码的一种或多种草酸分解代谢酶来源于粪肠球菌。已经在粪肠球菌中描述了可诱导的草酸分解代谢系统，其包含产甲酸草酸杆菌frc和oxc的同系物(hokama等人,oxalate-degrading enterococcus faecalis.microbiol.immunol.44,235
–
240)。
[0151]
在一个实施方案中，由工程化细菌编码的一种或多种草酸分解代谢酶来源于迟缓真杆菌。据报道，草酸降解蛋白草酰辅酶a脱羧酶和甲酰辅酶a转移酶分离自该菌株(ito,h.,kotake,t.和masai,m.(1996).in vitro degradation of oxalic acid by human feces.int.j.urol.3,207
–
211.)。
[0152]
在一个实施方案中，由工程化细菌编码的一种或多种草酸分解代谢酶来源于雷氏普罗威登斯菌，其已显示出为产甲酸草酸杆菌frc和oxc的同系物(例如，如abratt和reid,oxalate-degrading bacteria of the human gut as probiotics in the management of kidney stone disease；adv appl microbiol.2010；72:63-87以及其中的参考文献所述)。
[0153]
在一个实施方案中，由工程化细菌编码的一种或多种草酸分解代谢酶来源于大肠埃希氏菌，例如来自yfdxwuve操纵子。例如，ydfu被认为是oxc同系物。在一个实施方案中，由工程化细菌编码的一种或多种草酸分解代谢酶来源于乳杆菌属和/或双歧杆菌属物种。在非限制性实例中，一种或多种草酸分解代谢酶来源于oxc和frc同系物乳杆菌属和/或双歧杆菌属物种。此类乳杆菌属物种的非限制性实例包括植物乳杆菌、短乳杆菌(lactobacillus brevis)、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、加氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)。此类双歧杆菌属物种的非限制性实例包括婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌和青春双歧杆菌。
[0154]
在一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列已经被密码子优化，以用于本发明的重组细菌细胞。在一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列已经被密码子优化以用于大肠埃希氏菌。在一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列尚未被密码子优化以用于大肠埃希氏菌。在另一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列已经被密码子优化以用于乳球菌属。当编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在本发明的重组细菌细胞中表达时，在相同条件(例如，培养或环境条件)下细菌细胞比相同细菌亚型的未修饰细菌分解代谢更多的草酸盐或草酰辅酶a。因此，包含编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因的遗传工程化细菌可以用于分解代谢过量的草酸盐、草酸和/或草酰辅酶a，以治疗草酸盐有害的病症，诸如phi、phii、phiii以及继发性高草酸尿症、肠高草酸尿症和特发性高草酸尿症。
[0155]
本发明还包括编码草酸分解代谢酶的功能片段或草酸分解代谢酶的功能变体的基因。如本文所用，草酸分解代谢酶的术语“其功能片段”或“其功能变体”涉及具有与所述片段或变体所来源的野生型草酸分解代谢酶共有的定性生物活性的元件。例如，突变的草酸分解代谢酶的功能片段或功能变体是保留了与所述功能片段或功能变体所来源的草酸分解代谢酶基本相同的分解代谢草酰辅酶a的能力的功能片段或功能变体。例如，具有草酸分解代谢酶活性的多肽可以是在n末端或c末端截短的，并且草酸分解代谢酶活性的保留使用本领域技术人员已知的测定(包括本文提供的示例性测定)进行评估。在一个实施方案中，本发明的重组细菌细胞包含编码草酸分解代谢酶功能变体的异源基因。在另一个实施方案中，本发明的重组细菌细胞包含编码草酸分解代谢酶功能片段的异源基因。
[0156]
用于测试草酸分解代谢酶、草酸分解代谢酶功能变体或草酸分解代谢酶功能片段的活性的测定是本领域普通技术人员熟知的。例如，可以通过在缺乏内源性草酸分解代谢酶活性的重组细菌细胞中表达蛋白质、其功能变体或片段来评估草酸分解代谢。草酸分解代谢活性可以通过定量培养基中的草酸盐降解来评估，如federici等人,appl.environ.microbiol.70:5066-73(2004)中所述，所述文献的全部内容以引用的方式明确地并入本文。甲酰辅酶a转移酶和草酰辅酶a脱羧酶活性可以通过毛细管电泳来测量，如在描turroni等人,j.appl.microbiol.103:1600-9(2007)中所述。
[0157]
如本文所用，术语“序列同一性百分比(％)”或“同一性百分比(％)”，也包括“同源性”，被定义为在比对序列并引入缺口(如果必要的话)以达到最大序列同一性百分比并且不考虑任何保守取代作为序列同一性一部分之后候选序列中的氨基酸残基或核苷酸与参考序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的百分比。用于比较的序列的最佳比对(除了手动以外)可以通过以下手段来产生：smith和waterman,1981,ads app.math.2,482的局部同源算法、neddleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48,443的局部同源算法、pearson和lipman,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85,2444的相似性搜索方法、或通过使用这些算法的计算机程序(威斯康星遗传学软件包(genetics computer group,575science drive,madison,wis.)中的gap、bestfit、fasta、blast p、blast n和tfasta)。在一个实施方案中，基因或蛋白质与本文所公开的基因或蛋白质至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
[0158]
本发明涵盖编码草酸分解代谢酶的基因，所述草酸分解代谢酶在其序列中包含与本文所述的氨基酸序列基本相同的氨基酸。与本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括包
含保守氨基酸取代以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸取代是指第一个氨基酸被第二个氨基酸替换，所述第二个氨基酸具有与第一个氨基酸相似的化学和/或物理性质(例如，电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)。保守取代包括一个氨基酸被以下组内的另一个氨基酸替换：赖氨酸(k)、精氨酸(r)和组氨酸(h)；天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)；天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、酪氨酸(y)、k、r、h、d和e；丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、脯氨酸(p)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)、甲硫氨酸(m)、半胱氨酸(c)和甘氨酸(g)；f、w和y；c、s和t。类似地，预期碱性氨基酸被另一种碱性氨基酸替换(例如，lys、arg、his之间的替换)，酸性氨基酸被另一种酸性氨基酸替换(例如，asp和glu之间的替换)，中性氨基酸被另一种中性氨基酸替换(例如，ala、gly、ser、met、thr、leu、ile、asn、gln、phe、cys、pro、trp、tyr、val之间的替换)。
[0159]
在一些实施方案中，诱变编码草酸分解代谢酶的基因；选择表现出活性增加的突变体；并且将诱变的编码草酸分解代谢酶的基因分离并插入本发明的细菌细胞中。在一个实施方案中，可以筛选和选择允许细菌在草酸盐作为唯一碳源上生长的自发突变体。包含本文所述修饰的基因可以存在于质粒或染色体上。表2中列出了本公开的草酸分解代谢酶的非限制性实例。
[0160]
表2.草酸分解代谢酶多核苷酸序列
[0161][0162]
在一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列包含甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶序列。在一个实施方案中，甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶是frc，例如来自产甲酸草酸杆菌。因此，在一个实施方案中，frc基因与seq id no:1的整个序列具有至少约80％的同一性。因此，在一个实施方案中，frc基因与seq id no:1的整个序列具有至少约90％的同一性。因此，在一个实施方案中，frc基因与seq id no:1的整个序列具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方案中，frc基因与seq id no:1的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，frc基因包含seq id no:1的序列。在又另一个实施方案中，frc基因由seq id no:1的序列组成。
[0163]
在一个实施方案中，所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列包含草酰辅酶a脱羧酶序列。在一个实施方案中，草酰辅酶a脱羧酶是oxc，例如来自产甲酸草酸杆菌。因此，在一个实施方案中，oxc基因与seq id no:2的整个序列具有至少约80％的同一性。因此，在一个实施方案中，oxc基因与seq id no:2的整个序列具有至少约90％的同一性。因此，在一个实施方案中，oxc基因与seq id no:2的整个序列具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方案中，oxc基因与seq id no:2的整个序列具有至少约85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，oxc基因包含seq id no:2的序列。在又另一个实施方案中，oxc基因由seq id no:2的序列组成。在另一个实施方案中，oxc基因由seq id no:2的序列组成。
[0164]
在一个实施方案中，所述编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因包含草酸辅酶a连接酶序列。在一个实施方案中，草酸辅酶a连接酶是来自酿酒酵母的scaae3。因此，在一个实施方案中，scaae3基因与seq id no:3的整个序列具有至少约80％的同一性。因此，在一个实施方案中，scaae3基因与seq id no:3的整个序列具有至少约90％的同一性。因此，在一个实施方案中，scaae3基因与seq id no:3的整个序列具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方案中，scaae3基因与seq id no:3的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，scaae3基因包含seq id no:3的序列。在又另一个实施方案中，scaae3基因由seq id no:3的序列组成。
[0165]
在一个实施方案中，所述至少一个编码至少一种草酸分解代谢酶的基因包含乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶序列。在一个实施方案中，乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶是来自大肠埃希氏菌、来自酿酒酵母的yfde。因此，在一个实施方案中，yfde基因与seq id no:4的整个序列具有至少约80％的同一性。因此，在一个实施方案中，yfde基因与seq id no:4的整个序列具有至少约90％的同一性。因此，在一个实施方案中，yfde基因与seq id no:4的整个序列具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方案中，yfde基因与seq id no:4的整个序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，yfde基因包含seq id no:4的序列。在又另一个实施方案中，yfde基因由seq id no:4的序列组成。
[0166]
表3列出了草酸分解代谢酶多肽序列的非限制性实例。
[0167]
表3.草酸分解代谢酶的多肽序列
[0168][0169]
在一个实施方案中，由草酸盐分解代谢盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽包含甲酰辅酶a转移酶，例如来自产甲酸草酸杆菌的frc。在一个实施方案中，多肽与seq id no:5具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:5具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的
一种或多种多肽与seq id no:5具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:5具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:5具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:5具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽包含seq id no:5的序列。在又另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽由seq id no:5的序列组成。
[0170]
在一个实施方案中，由草酸盐分解代谢盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含草酰辅酶a脱羧酶，例如来自产甲酸草酸杆菌的oxc。在一个实施方案中，多肽与seq id no:6具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:6具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:6具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:6具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:6具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:6具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含seq id no:6的序列。在又另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽由seq id no:6的序列组成。
[0171]
在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含草酸辅酶a连接酶，例如来自酿酒酵母的scaae3。在一个实施方案中，多肽与seq id no:7具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:7具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:7具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:7具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:7具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:7具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含seq id no:7的序列。在又另一个实施方案中，由草酸盐分解代谢盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种
或多种多肽由seq id no:7的序列组成。
[0172]
在一个实施方案中，由草酸盐分解代谢盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含来自例如来自大肠埃希氏菌的yfde的乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶。在一个实施方案中，多肽与seq id no:8具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:8具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:8具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:8具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:8具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:8具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含seq id no:8的序列。在又另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽由seq id no:8的序列组成。
[0173]
在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽包含甲酰辅酶a转移酶，例如来自大肠埃希氏菌的yfdw。在一个实施方案中，多肽与seq id no:9具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:9具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:9具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:9具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:9具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:9具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含seq id no:9的序列。在又另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽由seq id no:9的序列组成。
[0174]
在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含草酰辅酶a脱羧酶，例如来自大肠埃希氏菌的yfdu。在一个实施方案中，多肽与seq id no:10具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:10具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:10具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:10具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化
细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:10具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:10具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含seq id no:10的序列。在又另一个实施方案中，由草酸分解代谢基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽由seq id no:10的序列组成。
[0175]
在一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列直接与第一启动子可操作地连接。在另一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列直接与第一启动子可操作地连接。在一个实施方案中，启动子不与天然编码草酸分解代谢酶的至少一个基因可操作地连接。
[0176]
在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在组成型启动子的控制下表达。在另一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在诱导型启动子的控制下表达。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在由外源环境条件直接或间接诱导的启动子的控制下表达。在一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在启动子的控制下表达，所述启动子由低氧或厌氧条件(诸如哺乳动物肠道的环境条件)直接或间接诱导，其中所述编码所述一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的表达在低氧或厌氧环境(诸如哺乳动物肠道环境)下被激活。在一些实施方案中，所述编码所述一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在由炎症条件直接或间接诱导的启动子的控制下表达。本文所述的示例性诱导型启动子包括氧水平依赖性启动子(例如，fnr诱导型启动子)、由炎症或炎症反应诱导的启动子(rns、ros启动子)和由由可能天然地存在于或可能不天然地存在于(例如，可以外源地添加到)肠道中的代谢物(例如阿拉伯糖和四环素)诱导的启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于fnr响应性启动子、p
arac
启动子、p
arabad
启动子、p
tetr
启动子和p
laci
启动子，它们各自在本文中更详细地描述。诱导型启动子在下文中有更详细的描述。
[0177]
所述编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因可以存在于细菌细胞中的质粒或染色体上。在一个实施方案中，所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列位于细菌细胞中的质粒上。在另一个实施方案中，所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列位于细菌细胞的染色体中。在又另一个实施方案中，所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中，并且编码来自不同细菌物种的至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中，所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的天然拷贝位于细菌细胞中的质粒上，并且编码来自不同细菌物种的至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中，所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中，并且编码来自不同细菌物种的至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因位于细菌细胞中的染色体中。
[0178]
在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在低拷贝质粒上表达。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在高拷贝质粒上表达。在一些实施方案中，高拷贝质粒可以用于增加所述至少一种草酸分解代谢酶的表达，从
而增加对草酸盐、草酸和/或草酰辅酶a的分解代谢。
[0179]
在一些实施方案中，与重组细菌相比，包含在高拷贝质粒上表达的编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因的本发明的重组细菌细胞不增加草酸分解代谢或降低草酸盐和/或草酸水平包含在低拷贝质粒上表达的相同基因的细胞，不存在草酸盐的异源输入者和草酸的天然输入者的额外拷贝。此外，在将草酸盐输入蛋白掺入重组细菌细胞中的一些实施方案中，联合使用包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的低拷贝质粒以便增强草酸分解代谢酶表达的稳定性，同时保持高草酸分解代谢并降低对转化细菌的阴性选择压力可能具有附加的优势。在替代性实施方案中，草酸盐输入蛋白与高拷贝质粒联合使用。
[0180]
草酸盐转运蛋白(输入蛋白)
[0181]
已经发现，厌氧细菌产甲酸草酸杆菌(oxalobacter formigenes)对草酸盐的摄取是通过草酸盐转运蛋白oxlt发生的(参见例如，ruan等人,j.biol.chem.267:10537-43(1992)，其全部内容以引用的方式整体明确并入本文)。oxlt催化细胞外草酸盐(二价阴离子)与细胞内甲酸盐(来源于草酸盐脱羧的一价阳离子)的交换，因此产生质子原动力。介导草酸盐输入的其他蛋白质是本领域技术人员熟知的。
[0182]
可以在本发明的细菌中表达或修饰草酸盐转运蛋白(例如草酸盐输入蛋白)，以便增强草酸盐向细胞中的转运。具体而言，当草酸盐输入蛋白在本发明的重组细菌细胞中表达时，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，当输入蛋白被表达时，细菌细胞将更多的草酸盐输入细胞中。因此，包含编码草酸盐输入蛋白的一个或多个异源基因序列的遗传工程化细菌可以用于将草酸盐输入细菌中，使得可以将在生物体中表达的编码草酸分解代谢酶的任何基因序列用于治疗草酸盐有害的病症，诸如phi、phii、phiii以及继发性高草酸尿症、肠高草酸尿症和特发性高草酸尿症。在一个实施方案中，本发明的细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的异源基因序列。在一个实施方案中，本发明的细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白的异源基因序列和编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个异源基因序列。在一个实施方案中，本发明的细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白的异源基因序列和编码选自甲酸盐输出蛋白、草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白及它们的组合的一种或多种多肽的一个或多个异源基因序列。在一个实施方案中，本发明的细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白的异源基因序列、编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个异源基因序列、和编码选自甲酸盐输出蛋白、草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白及它们的组合的一种或多种多肽的一个或多个异源基因序列。
[0183]
因此，在一些实施方案中，本发明提供了细菌细胞，其包含与第一启动子可操作地连接的编码草酸分解代谢酶的一个或多个异源基因序列以及编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个异源基因序列。在一些实施方案中，本发明提供了细菌细胞，其包含与第一启动子可操作地连接的编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个异源基因序列。在另一个实施方案中，本发明提供了细菌细胞，其包含与第一启动子可操作地连接的编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个异源基因序列以及与第二启动子可操作地连接的编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个异源基因序列。在一个实施方案中，第一启动子和第二启动子是相同启动子的独立拷贝。在另一个实施方案中，第一启动子和第二启动子是不同的启动子。
[0184]
在一个实施方案中，细菌细胞包含编码来自不同生物体(例如不同细菌物种)的草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个基因序列。在一个实施方案中，细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个天然基因序列。在一些实施方案中，所述编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个天然基因序列没有被修饰。在另一个实施方案中，细菌细胞包含多于一个拷贝的编码草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个天然基因序列。在又另一个实施方案中，细菌细胞包含一个拷贝的编码天然草酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个基因序列、以及一个或多个拷贝的编码来自不同细菌物种的草酸盐转运蛋白的一个或多个异源基因序列。在一个实施方案中，细菌细胞包含一个或多个、两个、三个、四个、五个或六个拷贝的编码草酸盐转运蛋白的一个或多个异源基因序列。在一个实施方案中，细菌细胞包含多个拷贝的编码草酸盐转运蛋白的一个或多个异源基因序列。
[0185]
在一些实施方案中，草酸盐转运蛋白由来自细菌属或物种(包括但不限于草酸杆菌)的草酸盐转运蛋白基因编码。在一些实施方案中，草酸盐转运蛋白基因来源于产甲酸草酸杆菌物种的细菌。在一些实施方案中，转运蛋白是来自产甲酸草酸杆菌的oxlt草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白。
[0186]
在其他实施方案中，草酸盐转运蛋白由选自草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白(ofa)家族的基因编码。ofa家族成员属于主要促进因子超家族，并且广泛分布于自然界中，存在于细菌、古细菌和真核生物界在(参见例如,pao等人,major facilitator superfamily microbiol.mol.biol.rev.1998年3月第62卷第1期1-34)。在非限制性实例中，转运蛋白是产甲酸草酸杆菌草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的同系物和/或直向同系物。在另一个非限制性实例中，转运蛋白是产甲酸草酸杆菌草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白(oxlt)的细菌来源同系物和/或直向同系物。本发明还包括编码草酸盐转运蛋白的功能片段或草酸盐转运蛋白的功能变体的基因。如本文所用，草酸盐转运蛋白的术语“其功能片段”或“其功能变体”涉及具有与所述片段或变体所来源的野生型草酸盐转运蛋白共有的定性生物活性的元件。例如，突变的草酸盐转运蛋白的功能片段或功能变体保留了与所述功能片段或功能变体所来源的转运蛋白基本相同的将草酸盐输入细菌细胞中的能力。在一个实施方案中，本发明的重组细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白功能片段的一个或多个异源基因序列。在另一个实施方案中，本发明的重组细菌细胞包含编码草酸盐转运蛋白功能变体的一个或多个异源基因序列。
[0187]
用于测试草酸盐转运蛋白、草酸盐转运蛋白功能变体或草酸盐转运蛋白功能片段的活性的测定对本领域普通技术人员而言是熟知的。例如，可以通过从表达蛋白质、其功能变体或片段的重组细菌细胞中制备洗涤剂提取的蛋白脂质体并确定[
14
c]草酸盐摄取来评估草酸盐输入，如abe等人,j.biol.chem.271:6789-93(1996)中所述，所述文献的全部内容以引用的方式整体明确并入本文。
[0188]
在一个实施方案中，编码草酸盐转运蛋白的基因已经被密码子优化以用于宿主生物体。在一个实施方案中，编码草酸盐转运蛋白的基因已经被密码子优化以用于大肠埃希氏菌。
[0189]
本发明涵盖编码草酸盐转运蛋白的基因，所述草酸盐转运蛋白在其序列中包含与本文所述的氨基酸序列基本相同的氨基酸。与本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸取代以及氨基酸缺失和/或插入的序列。
[0190]
在一些实施方案中，诱变编码草酸盐转运蛋白的一个或多个基因序列；选择表现出草酸盐转运增加的突变体；并且将诱变的编码草酸盐转运蛋白的一个或多个基因序列分离并插入本发明的细菌细胞中。在一些实施方案中，诱变编码草酸盐转运蛋白的一个或多个基因序列；选择表现出草酸盐转运减少的突变体；并且将诱变的编码草酸盐转运蛋白的一个或多个基因序列分离并插入本发明的细菌细胞中。本文所述的转运蛋白修饰可以存在于质粒或染色体上。
[0191]
表4列出了草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的非限制性实例的多肽和多核苷酸序列。
[0192]
表4.oxlt序列
[0193][0194]
在一个实施方案中，草酸盐输入蛋白是草酸盐:甲酸盐反向反向转运蛋白oxlt。在一个实施方案中，oxlt基因与seq id no:11具有至少约80％的同一性。因此，在一个实施方案中，oxlt基因与seq id no:11具有至少约90％的同一性。因此，在一个实施方案中，oxlt基因与seq id no:11具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方案中，oxlt基因与seq id no:11具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，oxlt基因包含seq id no:11的序列。在又另一个实施方案中，oxlt基因由seq id no:11的序列组成。
[0195]
在一个实施方案中，由一个或多个基因或基因盒编码并由遗传工程化细菌表达的一种或多种多肽是草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt。在一个实施方案中，多肽与seq id no:12具有至少约80％的同一性。在另一个实施方案中，由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:12具有至少约85％的同一性。在一个实施方案中，由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:12具有至少约90％的同一性。在一个实施方案中，由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:12具有至少约95％的同一性。在另一个实施方案中，由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:12具有至少约96％、97％、98％或99％的同一性。因此，在一个实施方案中，由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽与seq id no:12具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽包含seq id no:12的序列。在又另一个实施方案中，由一个或多个基因或基因盒编码并由工程化细菌表达的一种或多种多肽由seq id no:12的序列组成。
[0196]
在一些实施方案中，细菌细胞包含与第一启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个异源基因序列以及编码草酸盐输入蛋白的一个或多个异源基因序列。在一些实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个异源基因序列与第一启动
子可操作地连接。在其他实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个异源基因序列与第二启动子可操作地连接。在一个实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列直接与第二启动子可操作地连接。在另一个实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列间接与第二启动子可操作地连接。
[0197]
在一些实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的表达由与控制编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的表达由控制一种或多种草酸分解代谢酶表达的相同启动子控制。在一些实施方案中，编码草酸盐输入蛋白和草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列从启动子区域被差异地转录。在一些实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的基因序列和编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的每个基因的表达由不同的启动子控制。
[0198]
在一个实施方案中，启动子不与天然编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列可操作地连接。在一些实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列由其天然启动子控制。在一些实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列由诱导型启动子控制。在一些实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列由比其天然启动子更强的启动子控制。在一些实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列由组成型启动子控制。
[0199]
在另一个实施方案中，启动子是诱导型启动子。诱导型启动子在下文中有更详细的描述。
[0200]
在一个实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列位于细菌细胞中的质粒上。在另一个实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列位于细菌细胞的染色体中。在又另一个实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中，并且编码来自不同细菌物种的草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的拷贝位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的天然拷贝位于细菌细胞中的质粒上，并且编码来自不同细菌物种的草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的拷贝位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中，编码草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中，并且编码来自不同细菌物种的草酸盐输入蛋白的一个或多个基因序列的拷贝位于细菌细胞的染色体中。
[0201]
在一些实施方案中，细菌细胞中编码草酸盐输入蛋白的至少一个天然基因未被修饰，并且天然草酸盐输入蛋白的一个或多个附加拷贝被插入基因组中。在一个实施方案中，插入基因组中的一个或多个附加拷贝的天然输入蛋白处于控制编码草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列的表达的相同诱导型启动子(例如fnr响应性启动子)或与控制至少一种草酸分解代谢酶的表达的诱导型启动子不同的诱导型启动子、或组成型启动子的控制下。在替代性实施方案中，编码输入蛋白的至少一个天然基因未被修饰，并且来自不同细菌物种的输入蛋白的一个或多个附加拷贝被插入细菌细胞的基因组中。在一个实施方案中，插入细菌细胞基因组中的一个或多个附加拷贝的输入蛋白处于控制编码草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列的表达的相同诱导型启动子(例如fnr响应性启动子)或与控制编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列表达的诱导型启动子不同的诱导型启动子、或组成型
启动子的控制下。
[0202]
在一个实施方案中，当草酸盐输入蛋白在本发明的重组细菌细胞中表达时，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，当输入蛋白被表达时，细菌细胞将10％更多的草酸盐输入细菌细胞中。在另一个实施方案中，当草酸盐输入蛋白在本发明的重组细菌细胞中表达时，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，当输入蛋白被表达时，细菌细胞将20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％更多的草酸盐输入细菌细胞中。在又另一个实施方案中，当草酸盐输入蛋白在本发明的重组细菌细胞中表达时，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，当输入蛋白被表达时，细菌细胞将两倍更多的草酸盐输入细胞中。在又另一个实施方案中，当草酸盐输入蛋白在本发明的重组细菌细胞中表达时，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，当输入蛋白被表达时，细菌细胞将3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍更多的草酸盐输入细胞中。
[0203]
在一些实施方案中，细菌细胞在编码甲酸盐转运蛋白(输入蛋白)的一个或多个内源基因中包含遗传突变，其中所述遗传突变减少细菌细胞中甲酸盐的流入。不希望受理论所束缚，此类突变可以降低细胞内甲酸盐浓度并增加通过草酸分解代谢途径的流量。大肠埃希氏菌的foca催化双向甲酸盐转运，并且可能通过通道型机制起作用(flake等人,unexpected oligomeric structure of the foca formate channel of escherichia coli:a paradigm for the formate-nitrite transporter family of integral membrane proteins".fems microbiology letters.303(1):69
–
75)。foca可能能够将其操作模式从高外部ph下的被动输出通道转换为低ph下的次级主动甲酸盐/h输入通道。在非限制性实例中，遗传工程化细菌可能在foca中包含突变和/或缺失，使得其无功能。
[0204]
甲酸盐输出蛋白
[0205]
甲酸盐是许多肠道细菌厌氧发酵葡萄糖的主要代谢物。本领域已知几种类型的甲酸盐输入和输出蛋白。例如，在大肠埃希氏菌和其他肠杆菌科中，甲酸盐通过五聚体离子通道/转运蛋白foca移位穿过细胞膜。foca充当细胞质中产生的甲酸根阴离子的被动输出蛋白。在周质中，甲酸盐随后被甲酸脱氢酶还原成二氧化碳。另一种形式的甲酸脱氢酶和/或甲酸裂解酶也存在于大肠埃希氏菌的细胞质中。当生长培养基的ph降至6.8以下时，转运模式功能转换发生。由于周质中有充足的质子可用，细胞转换成主动输入甲酸盐，并再次使用foca来完成这一任务。
[0206]
在另一个实例中，如上文所述，已经发现厌氧细菌产甲酸草酸杆菌对草酸盐的摄取是通过草酸盐转运蛋白oxlt发生的。oxlt允许草酸盐与来源于草酸盐脱羧的细胞内甲酸盐进行交换。这些相关活动(交换和脱羧)的总体效果是产生支持膜功能的质子原动力，包括atp合成、生长底物的积聚和废物的挤出。因此，在一些实施方案中，“甲酸盐输出蛋白”还涵盖草酸盐转运蛋白，例如，在oxlt的情况下，甲酸盐:草酸盐反向转运蛋白。
[0207]
可以在细菌中表达或修饰甲酸盐输出蛋白和/或具有偶联草酸盐输入功能的甲酸盐输出蛋白，以便增强甲酸盐输出(以及在与草酸盐输入偶联时的情况下，从而增强草酸盐输入)。具体而言，在一些实施方案中，当甲酸盐输出蛋白在工程化细菌细胞中表达时，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，当输出蛋白被表达时细菌细胞将更多的甲酸盐输出到细胞外部。在一个实施方案中，细菌细胞包含编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列。在一个实施方案中，细菌细胞包含编码甲酸盐输出蛋白的异源基因和编码至少一
种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因或基因盒。
[0208]
因此，在一些实施方案中，本公开提供了细菌细胞，其包含与第一启动子可操作地连接的编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列以及编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列。在一些实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列与第一启动子可操作地连接。在另一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列与第一启动子可操作地连接，并且编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列与第二启动子可操作地连接。在一个实施方案中，第一启动子和第二启动子是相同启动子的独立拷贝。在另一个实施方案中，第一启动子和第二启动子是不同的启动子。
[0209]
在一个实施方案中，细菌细胞包含编码来自不同生物体(例如不同细菌物种)的甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列。在一个实施方案中，细菌细胞包含编码甲酸盐输出蛋白的至少一个天然基因序列。在一些实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的至少一个天然基因序列没有被修饰。在另一个实施方案中，细菌细胞包含多于一个拷贝的编码甲酸盐输出蛋白的至少一个天然基因序列。在又另一个实施方案中，细菌细胞包含一个拷贝的编码天然甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列、以及至少一个拷贝的编码来自不同细菌物种的甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因序列。在一个实施方案中，细菌细胞包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个拷贝的编码甲酸盐输出蛋白的至少一个异源基因序列。在一个实施方案中，细菌细胞包含多个拷贝的编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个异源基因序列。
[0210]
在一些实施方案中，甲酸盐输出蛋白由来源于以下细菌属或物种的甲酸盐输出蛋白基因编码，所述细菌属或物种包括但不限于双歧杆菌属、博德特菌属、慢生根瘤菌属、伯克霍尔德氏菌属、梭菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、真细菌属、乳杆菌属、磁螺菌属、分枝杆菌属、脉孢菌属、草酸杆菌属(例如，产甲酸草酸杆菌)、罗尔斯通氏菌属、红假单胞菌属、志贺氏菌属、热原体属和需氧去氮菌，例如，动物双歧杆菌、两岐双岐杆菌、婴儿双岐杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、支气管炎博德特菌、副百日咳博德特菌、真菌伯克霍尔德菌、burkholderia xenovorans、大豆慢生根瘤菌、丙酮丁醇梭菌、艰难梭菌、闪烁梭菌、产孢梭菌、破伤风梭菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、迟缓真杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、加氏乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、向磁磁螺菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、麻风分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、粗糙脉孢菌、产甲酸草酸杆菌、雷氏普罗威登斯菌、迟缓真杆菌、富养产碱菌、ralstonia metallidurans、沼泽红假单胞菌、弗氏志贺氏菌、火山热原体和芳香族需氧去氮菌。
[0211]
本公开还包含编码甲酸盐输出蛋白的功能片段或甲酸盐输出蛋白的功能变体的基因。如本文所用，甲酸盐输出蛋白的术语“其功能片段”或“其功能变体”涉及具有与所述片段或变体所来源的野生型甲酸盐输出蛋白共有的定性生物活性的元件。例如，突变的甲酸盐输出蛋白的功能片段或功能变体保留了与所述功能片段或功能变体所来源的输出蛋白基本相同的将甲酸盐输入细菌细胞中的能力。在一个实施方案中，工程化细菌细胞包含编码甲酸盐输出蛋白功能片段的至少一个异源基因。在另一个实施方案中，工程化细菌细胞包含编码甲酸盐输出蛋白功能变体的至少一个异源基因。
[0212]
用于测试甲酸盐输出蛋白、甲酸盐输出蛋白功能变体或甲酸盐输出蛋白功能片段的活性的测定是本领域普通技术人员熟知的。例如，可以通过在缺乏内源性甲酸盐输出蛋
白的工程化细菌细胞中表达所述蛋白质、其功能变体或片段，并且在蛋白质表达之后评估培养基中的甲酸盐水平来评估甲酸盐输出。测量甲酸盐输出的方法是本领域普通技术人员熟知的(参见例如，wraight等人,structure and mechanism of a pentameric formate channel nat struct mol biol.2010年1月；17(1):31
–
37)。
[0213]
在一个实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的基因已经被密码子优化以用于宿主生物体。在一个实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的基因已经被密码子优化以用于大肠埃希氏菌。
[0214]
本公开涵盖编码甲酸盐输出蛋白的基因，所述甲酸盐输出蛋白在其序列中包含与本文所述的氨基酸序列基本相同的氨基酸。与本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸取代以及氨基酸缺失和/或插入的序列。
[0215]
在一些实施方案中，诱变编码甲酸盐输出蛋白的至少一个基因；选择表现出甲酸盐转运增加的突变体；并且将诱变的编码甲酸盐输出蛋白的至少一个基因分离并插入细菌细胞中。在非限制性实例中，增加甲酸盐输出也可能允许草酸盐输入的增加。在一些实施方案中，诱变编码甲酸盐输出蛋白的至少一个基因；选择表现出甲酸盐转运减少的突变体；并且将诱变的编码甲酸盐输出蛋白的至少一个基因分离并插入细菌细胞中。本文所述的输出蛋白修饰可以存在于质粒或染色体上。
[0216]
在一个实施方案中，甲酸盐输出蛋白是oxlt。在一个实施方案中，oxlt基因与seq id no:11具有至少约80％的同一性。因此，在一个实施方案中，oxlt基因与seq id no:11具有至少约90％的同一性。因此，在一个实施方案中，oxlt基因与seq id no:11具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方案中，oxlt基因与seq id no:11具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一个实施方案中，oxlt基因包含seq id no:11的序列。在又另一个实施方案中，oxlt基因由seq id no:11的序列组成。
[0217]
在一个实施方案中，oxlt基因编码与seq id no:12具有至少约80％同一性的多肽。因此，在一个实施方案中，oxlt基因编码与seq id no:12具有至少约90％同一性的多肽。因此，在一个实施方案中，oxlt基因编码与seq id no:12具有至少约95％同一性的多肽。因此，在一个实施方案中，oxlt基因编码与seq id no:12具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽。在另一个实施方案中，oxlt基因编码包含seq id no:12的序列的多肽。在又另一个实施方案中，oxlt基因编码由seq id no:12的序列组成的多肽。
[0218]
在一些实施方案中，细菌细胞包含与第一启动子可操作地连接的编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个异源基因序列以及编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个异源基因序列。在一些实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个异源基因序列与第一启动子可操作地连接。在其他实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个异源基因序列与第二启动子可操作地连接。在一个实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个异源基因序列直接与第二启动子可操作地连接。在另一个实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个异源基因序列间接与第二启动子可操作地连接。
[0219]
在一些实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列的表达由与控制编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因的表达的启动子不同的启动子控制。在一些
实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列的表达由控制至少一种草酸分解代谢酶表达的相同启动子控制。在一些实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白和草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列从启动子区域被差异地转录。在一些实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列和编码至少一种草酸分解代谢酶的一个或多个基因序列的每个基因的表达由不同的启动子控制。
[0220]
在一个实施方案中，启动子不与天然编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列可操作地连接。在一些实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列由其天然启动子控制。在一些实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列由诱导型启动子控制。在一些实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列由比其天然启动子更强的启动子控制。在一些实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列由组成型启动子控制。
[0221]
在另一个实施方案中，启动子是诱导型启动子。诱导型启动子在下文中有更详细的描述。
[0222]
在一个实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列位于细菌细胞中的质粒上。在另一个实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列位于细菌细胞的染色体中。在另一个实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中，并且编码来自不同细菌物种的甲酸盐输出蛋白的至少一个基因的拷贝位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列的天然拷贝位于细菌细胞中的质粒上，并且编码来自不同细菌物种的甲酸盐输出蛋白的至少一个基因的拷贝位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中，编码甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中，并且编码来自不同细菌物种的甲酸盐输出蛋白的一个或多个基因序列的拷贝位于细菌细胞的染色体中。
[0223]
在一些实施方案中，细菌细胞中编码输出蛋白的至少一个天然基因未被修饰，并且天然输出蛋白的一个或多个附加拷贝被插入基因组中。在一个实施方案中，插入基因组中的一个或多个附加拷贝的天然输出蛋白处于控制编码草酸分解代谢酶的至少一个基因的表达的相同诱导型启动子(例如fnr响应性启动子)或与控制至少一种草酸分解代谢酶的表达的诱导型启动子不同的诱导型启动子、或组成型启动子的控制下。在替代性实施方案中，编码输出蛋白的至少一个天然基因未被修饰，并且来自不同细菌物种的输出蛋白的一个或多个附加拷贝被插入细菌细胞的基因组中。在一个实施方案中，插入细菌细胞基因组中的一个或多个附加拷贝的输出蛋白处于控制编码草酸分解代谢酶的至少一个基因的表达的相同诱导型启动子(例如fnr响应性启动子)或与控制编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因表达的诱导型启动子不同的诱导型启动子、或组成型启动子的控制下。
[0224]
在一个实施方案中，当甲酸盐输出蛋白在工程化细菌细胞中表达时，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，当输出蛋白被表达时细菌细胞将10％更多的甲酸盐输出到细菌细胞之外。在另一个实施方案中，当甲酸盐输出蛋白在工程化细菌细胞中表达时，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，当输出蛋白被表达时，细菌细胞将20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％更多的甲酸盐输出到细菌细胞之外。在又另一个实施方案中，当甲酸盐输出蛋白在工程化细菌细胞中表达时，与相同条件下相同细
菌亚型的未修饰细菌相比，当输出蛋白被表达时细菌细胞将两倍更多的甲酸盐输出到细胞之外。在又另一个实施方案中，当甲酸盐输出蛋白在工程化细菌细胞中表达时，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，当输出蛋白被表达时，细菌细胞将3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍更多的甲酸盐输出到细胞之外。
[0225]
在一个实施方案中，细菌细胞在草酸盐输出蛋白中包含突变或缺失，使得输出蛋白功能减弱或无功能。这种突变可能会阻止细胞内草酸盐被输出，并增加草酸盐的分解代谢。
[0226]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌还包含一种或多种内源性甲酸盐输出蛋白(例如foca)的突变或缺失。在非限制性实例中，这种包含foca突变的遗传工程化细菌包含编码甲酸盐:草酸盐反向转运蛋白(例如oxlt)的一个或多个基因序列。在非限制性实例中，一种或多种内源性甲酸盐输出蛋白被诱变或缺失，例如(例如foca)以减少或阻止甲酸盐的输出，而不同时通过甲酸盐:草酸盐反向转运蛋白(例如oxlt)输入草酸盐。这样的突变可以增加细菌细胞中草酸盐的摄取和分解代谢。
[0227]
在一些实施方案中，甲酸脱氢酶和/或甲酸裂解酶被突变或缺失，例如以阻止细菌细胞中甲酸盐的分解代谢。不希望受理论所束缚，此类突变可以增加细胞内甲酸盐浓度，允许通过甲酸盐草酸盐反向转运蛋白的流量增加，从而允许草酸盐摄取增加。
[0228]
诱导型启动子
[0229]
在一些实施方案中，细菌细胞包含携带编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒的稳定维持的质粒或染色体，所述一种或多种草酸分解代谢酶例如选自甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如frc(来自产甲酸草酸杆菌))、草酰辅酶a合成酶(例如scaae3(来自酿酒酵母))、草酰辅酶a脱羧酶(例如选自oxc(来自产甲酸草酸杆菌))、和/或乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如yfde(来自大肠埃希氏菌))基因，使得所述草酸分解代谢酶可以在宿主细胞中表达，并且所述宿主细胞能够在体外(例如在培养基中)和/或在体内(例如在肠道中)存活和/或生长。在一些实施方案中，细菌细胞包含两种或更多种不同的草酸分解代谢酶，例如甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如，frc(来自产甲酸草酸杆菌))、草酰辅酶a合成酶(例如，scaae3(来自酿酒酵母))、草酰辅酶a脱羧酶(例如，oxc(来自产甲酸草酸杆菌))、和/或乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如，yfde(来自大肠埃希氏菌))基因。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含多个拷贝的相同草酸分解代谢酶基因和/或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含多个拷贝的不同草酸分解代谢酶基因。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于质粒上，并且与直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于质粒上，并且与在低氧或厌氧条件下诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于染色体上，并且与直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于染色体中，并且与在低氧或厌氧条件下诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于质粒上，并且与通过暴露于四环素或阿拉伯糖诱导的启动子可操作地连接。
[0230]
在一些实施方案中，细菌细胞包含携带基因和/或基因盒的稳定维持的质粒或染色体，所述基因和/或基因盒编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的
oxlt)，使得所述转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)可以在宿主细胞中表达，并且宿主细胞能够在体外(例如在培养基中)和/或在体内(例如在肠道中)存活和/或生长。在一些实施方案中，细菌细胞包含两个或更多个不同拷贝的编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)的基因和/或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含多个拷贝的编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)的相同基因和/或基因盒。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)的至少一个基因和/或基因盒存在于质粒上，并且与直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)的基因和/或基因盒存在于质粒上，并且与在低氧或厌氧条件下诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)的基因和/或基因盒存在于染色体上，并且与直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)的基因和/或基因盒存在于染色体中，并且与在低氧或厌氧条件下诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)的基因和/或基因盒存在于质粒上，并且与通过暴露于四环素诱导的启动子可操作地连接。
[0231]
在一些实施方案中，与编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒可操作地连接的启动子和与编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒可操作地连接的启动子(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)被外源环境条件直接诱导。在一些实施方案中，与编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒可操作地连接的启动子和与编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒可操作地连接的启动子(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)被外源环境条件间接诱导。在一些实施方案中，启动子由对哺乳动物肠道特异的外源环境条件直接或间接诱导。在一些实施方案中，启动子由对哺乳动物小肠特异的外源环境条件直接或间接诱导。在一些实施方案中，启动子由低氧或厌氧条件诸如哺乳动物肠道环境直接或间接诱导。在一些实施方案中，启动子由对哺乳动物肠道特异的分子或代谢物(例如丙酸盐)直接或间接诱导。在一些实施方案中，启动子由与细菌细胞共同施用的分子直接或间接诱导。
[0232]
氧依赖性调节
[0233]
在某些实施方案中，细菌细胞包含编码在延胡索酸和硝酸还原酶调节因子(fnr)启动子的控制下表达的一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述一种或多种草酸分解代谢酶例如选自甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如frc(来自产甲酸草酸杆菌))、草酰辅酶a合成酶(例如scaae3(来自酿酒酵母))、草酰辅酶a脱羧酶(例如oxc(来自产甲酸草酸杆菌))、和/或乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如yfde(来自大肠埃希氏菌))。在某些实施方案中，细菌细胞包含编码在延胡索酸和硝酸还原酶调节因子(fnr)启动子的控制下表达的一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)的基因和/或基因盒。在大肠埃希氏菌中，fnr是控制有氧代谢向无氧代谢转换的主要转录激活因子(unden等人,1997)。在厌氧状态下，fnr二聚化为活性dna结合蛋白，其激活数百个负责适应厌氧生长的基因。在有氧状态下，fnr被氧气阻止二聚化并且是无活性的。
[0234]
fnr响应性启动子包括但不限于下表中列出的fnr响应性启动子。加下划线的序列
是预测的核糖体结合位点，并且粗体的序列是用于克隆的限制性位点。
[0235]
表5.fnr响应性启动子
[0236]
fnr响应性启动子seq id no seq id no:13 seq id no:14 seq id no:15 seq id no:16 seq id no:17
[0237]
在一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:13。在一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:14。在另一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:15。在另一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:16。在另一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:17。附加fnr响应性启动子如下表6所示。
[0238]
表6.fnr启动子序列
[0239][0240][0241]
在一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:18。在一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:19。在另一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:20。在另一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:21。在另一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:22。在一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:23。在一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:24。在另一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:25。在另一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:
26。在另一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:27。在另一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:28。在另一个实施方案中，fnr响应性启动子包含seq id no:29。
[0242]
在一些实施方案中，多个不同的fnr核酸序列被插入遗传工程化细菌中。在替代性实施方案中，遗传工程化细菌包含编码在替代性氧水平依赖性启动子(例如，dnr(trunk等人,2010)或anr(ray等人,1997))的控制下表达的一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒，所述一种或多种草酸分解代谢酶例如选自甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如frc(来自产甲酸草酸杆菌))、草酰辅酶a合成酶(例如scaae3(来自酿酒酵母))、草酰辅酶a脱羧酶(例如oxc(来自产甲酸草酸杆菌))、和/或乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如yfde(来自大肠埃希氏菌))或本文公开的其他酶。在替代性实施方案中，遗传工程化细菌包含在替代性氧水平依赖性启动子(例如，dnr(trunk等人,2010)或anr(ray等人,1997))的控制下表达的编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)的基因和/或基因盒。在这些实施方案中，草酸盐和/或其代谢物的分解代谢特别在低氧或厌氧环境中(例如在肠道中)被激活。在一些实施方案中，通过本领域已知的方法(例如，通过优化核糖体结合位点和/或增加mrna稳定性)进一步优化基因表达。在一个实施方案中，哺乳动物肠道是人类哺乳动物肠道。
[0243]
在一些实施方案中，细菌细胞包含氧水平依赖性转录调节因子(例如fnr、anr或dnr)、以及来自不同细菌物种的相应启动子。与相同条件下细菌中的天然基因和启动子相比，异源氧水平依赖性转录调节因子和启动子在低氧或厌氧环境中增加与所述启动子可操作地连接的基因(例如，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt))的基因和/或基因盒的转录。在某些实施方案中，非天然氧水平依赖性转录调节因子是来自淋病奈瑟氏菌(n.gonorrhoeae)的fnr蛋白(参见例如，isabella等人,2011)。在一些实施方案中，相应的野生型转录调节因子保持完整，并且保留了野生型活性。在替代性实施方案中，相应的野生型转录调节因子被缺失或突变，以降低或消除野生型活性。
[0244]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含野生型氧水平依赖性转录调节因子(例如fnr、anr或dnr)以及相对于来自相同亚型的细菌的野生型启动子而言发生突变的相应启动子。与相同条件下的野生型启动子相比，突变的启动子增强了与野生型转录调节因子的结合，并且增加了与所述启动子可操作地连接的基因(例如，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)的基因和/或基因盒)的转录。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含野生型氧水平依赖性启动子(例如，fnr、anr或dnr启动子)以及相对于来自相同亚型的细菌的野生型转录调节因子而言发生突变的相应转录调节因子。与相同条件下的野生型转录调节因子相比，突变的转录调节因子增强了与野生型启动子的结合，并且增加了与所述启动子可操作地连接的基因(例如，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码一种或多种草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)的基因和/或基因盒)的转录。在某些实施方案中，突变体氧水平依赖性转录调节因子是包含增强二聚化和fnr活性的氨基酸取代的fnr蛋白(参见例如，moore等人,2006)。
[0245]
在一些实施方案中，本文公开的细菌细胞包含多个拷贝的编码感知氧水平的转录
调节因子的内源基因，例如fnr基因。在一些实施方案中，编码感知氧水平的转录调节因子的基因存在于质粒上。在一些实施方案中，编码感知氧水平的转录调节因子的基因和编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒存在于不同的质粒上。在一些实施方案中，编码感知氧水平的转录调节因子的基因和编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码草酸盐转运蛋白的基因存在于不同的质粒上。在一些实施方案中，编码感知氧水平的转录调节因子的基因和编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒存在于同一质粒上。
[0246]
在一些实施方案中，编码感知氧水平的转录调节因子的基因存在于染色体上。在一些实施方案中，编码感知氧水平的转录调节因子的基因和编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒存在于不同的染色体上。在一些实施方案中，编码感知氧水平的转录调节因子的基因和编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒和/或编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒存在于同一染色体上。在一些情况下，在诱导型启动子的控制下表达感知氧水平的转录调节因子以增强表达稳定性可能是有利的。在一些实施方案中，转录调节因子的表达由与控制编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方案中，转录调节因子的表达由控制草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白表达的相同启动子控制。在一些实施方案中，转录调节因子和草酸分解代谢酶从启动子区域差异地转录。
[0247]
rns依赖性调节
[0248]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码在诱导型启动子的控制下表达的一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒。在一些实施方案中，表达一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的遗传工程化细菌处于由炎症条件激活的启动子的控制下。在一个实施方案中，用于产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒在炎症环境中被激活的炎症依赖性启动子(例如活性氮物质或rns启动子)的控制下表达。
[0249]
如本文所用，“活性氮物质”和“rns”可互换使用，指衍生自分子氮的高活性分子、离子和/或自由基。rns可以导致有害的细胞效应，诸如硝化应激(nitrosative stress)。rns包括但不限于一氧化氮(no
·
)、过氧亚硝酸盐或过氧亚硝酸根阴离子(onoo-)、二氧化氮(
·
no2)、三氧化二氮(n2o3)、过氧亚硝酸(onooh)和硝基过氧碳酸盐(onooco2-)(未配对电子表示为
·
)。细菌已经进化出能够感知rns水平的转录因子。不同的rns信号传导途径由不同的rns水平触发，并且以不同的动力学发生。
[0250]
如本文所用，“rns诱导调节区”是指一种或多种感知rns的转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合和/或激活会激活下游基因表达；在rns的存在下，转录因子结合和/或激活调节区。在一些实施方案中，rns诱导调节区包含启动子序列。在一些实施方案中，转录因子感知rns并随后与rns诱导调节区结合，从而激活下游基因表达。在替代性实施方案中，在不存在rns的情况下，转录因子与rns诱导调节区结合；在rns的存在下，转录因子经历构象变化，从而激活下游基因表达。rns诱导调节区可以与基因和/或基因盒(例如草酸分解代谢酶基因序列，例如本文所述的任何草酸分解代谢酶)可操作地连接。例如，在rns的存在下，转录因子感知rns并激活相应的rns诱导调节区，从而驱动可操作地连接的基
因序列的表达。因此，rns诱导基因或基因序列的表达。
[0251]
如本文所用，“rns去阻遏调节区”是指一种或多种感知rns的转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合阻遏下游基因表达；在rns的存在下，转录因子不结合也不抑制调节区。在一些实施方案中，rns去阻遏调节区包含启动子序列。rns去阻遏调节区可以与基因或基因盒(例如一个或多个草酸分解代谢酶基因序列和草酸盐转运蛋白序列)可操作地连接。例如，在rns的存在下，转录因子感知rns，并且不再结合和/或阻遏调节区，从而去阻遏可操作地连接的基因序列或基因盒。因此，rns去阻遏基因或基因盒的表达。
[0252]
如本文所用，“rns阻遏调节区”是指一种或多种感知rns的转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合阻遏下游基因表达；在rns的存在下，转录因子结合并阻遏调节区。在一些实施方案中，rns阻遏调节区包含启动子序列。在一些实施方案中，感知rns的转录因子能够结合与部分启动子序列重叠的调节区。在替代性实施方案中，感知rns的转录因子能够结合处于启动子序列上游或下游的调节区。rns阻遏调节区可以与基因序列或基因盒可操作地连接。例如，在rns的存在下，转录因子感知rns并与相应的rns阻遏调节区结合，从而阻断可操作地连接的一个或多个基因序列的表达。因此，rns阻遏基因或基因序列的表达。
[0253]
如本文所用，“rns响应性调节区”是指rns诱导调节区、rns阻遏调节区和/或rns去阻遏调节区。在一些实施方案中，rns响应性调节区包含启动子序列。每个调节区能够结合至少一个相应的感知rns的转录因子。感知rns的转录因子及其相应的rns响应性基因、启动子和/或调节区的实例包括但不限于表7中所示的那些。
[0254]
表7.感知rns的转录因子和rns响应性基因的实例
[0255][0256]
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含由能够感知至少一种活性氮物质的转录因子直接或间接控制的可调的调节区。可调的调节区与能够直接或间接驱动一种或多种草酸分解代谢酶、草酸盐转运蛋白表达的基因和/或基因盒可操作地连接，从而相对于rns水平控制草酸分解代谢酶、草酸盐转运蛋白的表达。例如，可调的调节区是rns诱导调节区，并且有效负载是一种或多种草酸分解代谢酶、草酸盐转运蛋白，诸如本文提供的任何草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白；当rns存在于例如炎症组织中时，感知rns的转录因子结合和/或激活调节区，并且驱动草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因或基因盒的表达。随后，当炎症得到缓解时，rns水平降低，并且草酸分解代谢酶和草酸盐转运蛋白的产生减少或消除。
[0257]
在一些实施方案中，可调的调节区是rns诱导调节区；在rns的存在下，转录因子感知rns并激活rns诱导调节区，从而驱动可操作地连接的基因或基因盒的表达。在一些实施方案中，转录因子感知rns并随后与rns诱导调节区结合，从而激活下游基因表达。在替代性
实施方案中，在不存在rns的情况下，转录因子与rns诱导调节区结合；当转录因子感知rns时，它经历构象变化，从而诱导下游基因表达。
[0258]
在一些实施方案中，可调的调节区是rns诱导调节区，并且感知rns的转录因子是norr。norr“是一种no响应性转录激活因子，其调节编码将no还原为氧化亚氮的黄素红素氧还蛋白(flavorubredoxin)和相关黄素蛋白的norvw基因的表达”(spiro 2006)。本发明的遗传工程化细菌可以包含来自被norr激活的基因的任何合适的rns响应性调节区。能够被norr激活的基因是本领域已知的(参见例如，spiro 2006；vine等人,2011；karlinsey等人,2012；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含来自norvw的rns诱导调节区，其可操作地连接到基因和/或基因盒，例如一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白。在rns的存在下，norr转录因子感知rns并激活norvw调节区，从而驱动可操作地连接的基因和/或基因盒的表达并产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白。
[0259]
在一些实施方案中，可调的调节区是rns诱导调节区，并且感知rns的转录因子是dnr。dnr(异化硝酸呼吸调节剂)在一氧化氮的存在下“促进nir、nor和nos基因的表达”(castiglione等人,2009)。本发明的遗传工程化细菌可以包含来自被dnr激活的基因的任何合适的rns响应性调节区。能够被dnr激活的基因是本领域已知的(参见例如，castiglione等人,2009；giardina等人,2008；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含来自norcb的rns诱导调节区，其与基因或基因盒(例如产丁酸基因盒)可操作地连接。在rns的存在下，dnr转录因子感知rns并激活norcb调节区，从而驱动可操作地连接的基因或基因盒的表达并产生一种或多种草酸分解代谢酶。在一些实施方案中，dnr是铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)dnr。
[0260]
在一些实施方案中，可调的调节区是rns去阻遏调节区，并且相应转录因子的结合阻遏下游基因表达；在rns的存在下，转录因子不再与调节区结合，从而去阻遏可操作地连接的基因或基因盒。
[0261]
在一些实施方案中，可调的调节区是rns去阻遏调节区，并且感知rns的转录因子是nsrr。nsrr是“一种可以感知no并控制负责no代谢的基因的表达的rrf2型转录阻遏物”(isabella等人,2009)。本发明的遗传工程化细菌可以包含来自被nsrr阻遏的基因的任何合适的rns响应性调节区。在一些实施方案中，nsrr是淋病奈瑟氏菌nsrr。能够被nsrr阻遏的基因是本领域已知的(参见例如，isabella等人,2009；dunn等人,2010；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含来自norb的rns去阻遏调节区，其与基因或基因盒(例如草酸分解代谢酶基因或基因盒)可操作地连接。在rns的存在下，nsrr转录因子感知rns，并且不再与norb调节区结合，从而解除阻遏可操作地连接的草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因或基因盒并产生编码草酸分解代谢酶的基因。
[0262]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌表达不调节细菌中大量天然基因的表达的感知rns的转录因子是有利的。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌表达来自不同细菌物种、菌株或亚株的感知rns的转录因子，其中所述转录因子不结合本发明的遗传工程化细菌中的调节序列。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌是大肠埃希氏菌，并且感知rns的转录因子是nsrr，例如来自淋病奈瑟氏菌，其中大肠埃希氏菌不包含所述nsrr的结合位点。在一些实施方案中，异源转录因子最小化或消除对遗传工程化细菌中的内源调节区和基因的脱靶效应。
[0263]
在一些实施方案中，可调的调节区是rns阻遏调节区，并且相应转录因子的结合阻遏下游基因表达；在rns的存在下，转录因子感知rns并结合rns阻遏调节区，从而阻遏可操作地连接的基因或基因盒的表达。在一些实施方案中，感知rns的转录因子能够结合与部分启动子序列重叠的调节区。在替代性实施方案中，感知rns的转录因子能够结合处于启动子序列上游或下游的调节区。
[0264]
在这些实施方案中，遗传工程化细菌可以包含用于表达草酸分解代谢酶的双阻遏物激活调节回路。双阻遏物激活调节回路包含第一感知rns的阻遏物和第二阻遏物，所述第二阻遏物与基因或基因盒(例如编码草酸分解代谢酶的基因或基因盒)可操作地连接。在这些实施方案的一个方面，感知rns的阻遏物抑制第二阻遏物的转录，所述第二阻遏物抑制基因或基因盒的转录。在这些实施方案中有用的第二阻遏物的实例包括但不限于tetr、c1和lexa。在不存在被第一阻遏物结合(其在不存在rns的情况下发生)的情况下，第二阻遏物被转录，其阻遏基因或基因盒的表达。在被第一阻遏物结合(其在rns的存在下发生)的存在下，第二阻遏物的表达被阻遏，并且基因或基因盒(例如一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因或基因盒)被表达。
[0265]
rns响应性转录因子可以诱导、去阻遏或阻遏基因表达，这取决于遗传工程化细菌中所使用的调节区序列。一种或多种类型的感知rns的转录因子和相应的调节区序列可能存在于遗传工程化细菌中。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含一种类型的感知rns的转录因子(例如nsrr)和一种相应的调节区序列(例如来自norb)。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含一种类型的感知rns的转录因子(例如nsrr)和两种或更多种不同的相应调节区序列(例如来自norb和ania)。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含两种或更多种类型的感知rns的转录因子(例如nsrr和norr)以及两种或更多种相应的调节区序列(例如分别来自norb和norr)。一个rns响应性调节区可能能够结合多于一个转录因子。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含两种或更多种类型的感知rns的转录因子和一个相应的调节区序列。几个rns调节的调节区的核酸序列是本领域已知的(参见例如，spiro 2006；isabella等人,2009；dunn等人,2010；vine等人,2011；karlinsey等人,2012)。
[0266]
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含编码感知rns的转录因子的基因(例如nsrr基因)，其由其天然启动子、诱导型启动子、比天然启动子更强的启动子(例如glnrs启动子或p(bla)启动子)或组成型启动子控制。在一些情况下，在诱导型启动子的控制下表达感知rns的转录因子以增强表达稳定性可能是有利的。在一些实施方案中，感知rns的转录因子的表达由与控制治疗性分子表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方案中，感知rns的转录因子的表达由控制治疗性分子表达的同一启动子控制。在一些实施方案中，感知rns的转录因子和治疗性分子从启动子区差异地转录。
[0267]
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含来自不同细菌物种、菌株或亚株的感知rns的转录因子的基因。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含来自不同细菌物种、菌株或亚株的rns响应性调节区。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含来自不同细菌物种、菌株或亚株的感知rns的转录因子和相应的rns响应性调节区。与相同条件下来自相同亚型的细菌的天然转录因子和调节区相比，异源感知rns的转录因子和调节区可以在rns的存在下增加与所述调节区可操作地连接的基因的转录。
[0268]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含来自淋病奈瑟氏菌的感知rns的转录因
子nsrr和相应的调节区nsrr。在一些实施方案中，天然感知rns的转录因子(例如nsrr)保持完整并保留了野生型活性。在替代性实施方案中，天然感知rns的转录因子(例如nsrr)被缺失或突变以降低或消除野生型活性。
[0269]
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含多个拷贝的编码感知rns的转录因子的内源基因，例如nsrr基因。在一些实施方案中，编码感知rns的转录因子的基因存在于质粒上。在一些实施方案中，编码感知rns的转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于不同的质粒上。在一些实施方案中，编码感知rns的转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于同一质粒上。在一些实施方案中，编码感知rns的转录因子的基因存在于染色体上。在一些实施方案中，编码感知rns的转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于不同的染色体上。在一些实施方案中，编码感知rns的转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于同一染色体上。
[0270]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码感知rns的转录因子的野生型基因(例如nsrr基因)和相对于来自相同亚型细菌的野生型调节区是突变的相应的调节区(例如norb调节区)。与相同条件下的野生型调节区相比，突变的调节区在rns的存在下增加了草酸分解代谢酶的表达。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含野生型rns响应性调节区(例如norb调节区)和相对于来自相同亚型细菌的野生型转录因子是突变的相应的转录因子(例如nsrr)。与相同条件下的野生型转录因子相比，突变体转录因子在rns的存在下增加了草酸分解代谢酶的表达。在一些实施方案中，感知rns的转录因子和相应的调节区两者相对于来自相同亚型细菌的野生型序列都被突变，以便在rns的存在下增加草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的表达。
[0271]
在一些实施方案中，用于产生抗炎症和/或肠屏障功能增强子分子的基因或基因盒存在于质粒上，并与由rns诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，通过本领域已知的方法进一步优化表达，例如，通过优化核糖体结合位点、操纵转录调节因子和/或增加mrna稳定性。
[0272]
在一些实施方案中，可以在一个或多个整合位点处将任何本公开的基因都整合到细菌染色体中。例如，可以将一个或多个拷贝的草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因整合到细菌染色体中。将多个拷贝的一个或多个基因整合到染色体中允许产生更多的草酸分解代谢酶，也允许对表达水平进行微调。可替代地，除了治疗性基因或基因盒之外，可以在一个或多个不同的整合位点处将本文所述的不同回路(诸如任何分泌或输出蛋白回路)整合到细菌染色体中，以执行多种不同的功能。
[0273]
ros依赖性调节
[0274]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含在诱导型启动子的控制下表达的用于产生一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒。在一些实施方案中，表达一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的遗传工程化细菌处于由细胞损伤条件激活的启动子的控制下。在一个实施方案中，用于产生一种或多种草酸分解代谢酶的基因和/或基因盒在存在细胞或组织损伤的环境中被激活的细胞损伤依赖性启动子(例如活性氧物质或ros启动子)的控制下表达。
[0275]
如本文所用，“活性氧物质”和“ros”可互换使用，是指衍生自分子氧的高活性分子、离子和/或自由基。ros可以作为有氧呼吸或金属催化氧化的副产物产生，并且可能引起
有害的细胞效应，诸如氧化损伤。ros包括但不限于过氧化氢(h2o2)、有机过氧化物(rooh)、羟基离子(oh-)、羟基自由基(
·
oh)、超氧化物或超氧阴离子(
·
o2-)、单线态氧(1o2)、臭氧(o3)、碳酸根、过氧化物或过氧自由基(
·
o2-2)、次氯酸(hocl)、次氯酸根离子(ocl-)、次氯酸钠(naocl)、一氧化氮(no
·
)和过氧亚硝酸根或过氧亚硝酸根阴离子(onoo-)(未配对电子表示为
·
)。细菌已经进化出能够感知ros水平的转录因子。不同的ros信号传导途径由不同的ros水平触发，并且以不同的动力学发生(marinho等人,2014)。
[0276]
如本文所用，“ros诱导调节区”是指一种或多种感知ros的转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合和/或激活会激活下游基因表达；在ros的存在下，转录因子结合和/或激活调节区。在一些实施方案中，ros诱导调节区包含启动子序列。在一些实施方案中，转录因子感知ros并随后与ros诱导调节区结合，从而激活下游基因表达。在替代性实施方案中，在不存在ros的情况下，转录因子与ros诱导调节区结合；在ros的存在下，转录因子经历构象变化，从而激活下游基因表达。ros诱导调节区可以与一个或多个基因序列(例如编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个序列)可操作地连接。例如，在ros的存在下，转录因子(例如oxyr)感知ros并激活相应的ros诱导调节区，从而驱动可操作地连接的一个或多个基因序列的表达。因此，ros诱导基因或基因盒的表达。
[0277]
如本文所用，“ros去阻遏调节区”是指一种或多种感知ros的转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合阻遏下游基因表达；在ros的存在下，转录因子不结合也不抑制调节区。在一些实施方案中，ros去阻遏调节区包含启动子序列。ros去阻遏调节区可以与基因或基因盒(例如编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因)可操作地连接。例如，在ros的存在下，转录因子(例如ohrr)感知ros，并且不再结合和/或阻遏调节区，从而去阻遏可操作地连接的基因序列或基因盒。因此，ros去阻遏基因或基因盒的表达。
[0278]
如本文所用，“ros阻遏调节区”是指一种或多种感知ros的转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合阻遏下游基因表达；在ros的存在下，转录因子结合并阻遏调节区。在一些实施方案中，ros阻遏调节区包含启动子序列。在一些实施方案中，感知ros的转录因子能够结合与部分启动子序列重叠的调节区。在替代性实施方案中，感知ros的转录因子能够结合处于启动子序列上游或下游的调节区。ros阻遏调节区可以与基因序列或基因盒可操作地连接。例如，在ros的存在下，转录因子(例如perr)感知ros并与相应的ros阻遏调节区结合，从而阻断可操作地连接的基因序列的表达。因此，ros阻遏基因或基因盒的表达。
[0279]
如本文所用，“ros响应性调节区”是指ros诱导调节区、ros阻遏调节区和/或ros去阻遏调节区。在一些实施方案中，ros响应性调节区包含启动子序列。每个调节区能够结合至少一个相应的感知ros的转录因子。感知ros的转录因子及其相应的ros响应性基因、启动子和/或调节区的实例包括但不限于表8中所示的那些。
[0280]
表8.感知ros的转录因子和ros响应性基因的实例
[0281][0282]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含由能够感知至少一种活性氧物质的转录因子直接或间接控制的可调的调节区。可调的调节区与能够直接或间接驱动草酸分解代谢酶的表达的基因和/或基因盒可操作地连接，从而相对于ros水平控制草酸分解代谢酶的表达。例如，可调的调节区是ros诱导调节区，并且分子是草酸分解代谢酶；当ros存在于例如炎症组织中时，感知ros的转录因子结合和/或激活调节区并驱动一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因序列和/或基因盒序列的表达，从而产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白。随后，当炎症得到缓解时，ros水平降低，并且草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的产生减少或消除。
[0283]
在一些实施方案中，可调的调节区是ros诱导调节区；在ros的存在下，转录因子感知ros并激活ros诱导调节区，从而驱动可操作地连接的基因或基因盒的表达。在一些实施方案中，转录因子感知ros并随后与ros诱导调节区结合，从而激活下游基因表达。在替代性实施方案中，在不存在ros的情况下，转录因子与ros诱导调节区结合；当转录因子感知ros时，它经历构象变化，从而诱导下游基因表达。
[0284]
在一些实施方案中，可调的调节区是ros诱导调节区，并且感知ros的转录因子是oxyr。oxyr“主要作为过氧化物应激反应的全局调节剂起作用”，并且能够调节数十种基因，例如，“参与h2o2解毒(kate、ahpcf)、血红素生物合成(hemh)、还原剂供应(grxa、gor、trxc)、硫醇-二硫化物异构化(dsbg)、fe-s中心修复(sufa-e、sufs)、铁结合(yaaa)、铁输入系统的阻遏(fur)的基因”和“oxys(一种小的调节性rna)”(dubbs等人,2012)。遗传工程化
细菌可以包含来自被oxyr激活的基因的任何合适的ros响应性调节区。能够被oxyr激活的基因是本领域已知的(参见例如，zheng等人,2001；dubbs等人,2012；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含来自oxys的ros诱导调节区，其可操作地连接到基因和/或基因盒，例如一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因。在ros(例如h2o2)的存在下，oxyr转录因子感知ros并激活oxys调节区，从而驱动可操作地连接的草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因和/或基因盒的表达并产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白。在一些实施方案中，oxyr由大肠埃希氏菌oxyr基因编码。在一些实施方案中，oxys调节区是大肠埃希氏菌oxys调节区。在一些实施方案中，ros诱导调节区选自katg、dps和ahpc的调节区。
[0285]
在替代性实施方案中，可调的调节区是ros诱导调节区，并且感知ros的相应转录因子是soxr。当soxr“被其[2fe
–
2s]簇的氧化激活时，其增加soxs的合成，soxs然后激活其靶基因表达”(koo等人,2003)。“已知soxr主要对超氧化物和一氧化氮作出响应”(koo等人,2003)，并且也能够对h2o2作出响应。本发明的遗传工程化细菌可以包含来自被soxr激活的基因的任何合适的ros响应性调节区。能够被soxr激活的基因是本领域已知的(参见例如，koo等人,2003；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含来自soxs的ros诱导调节区，其与基因和/或基因盒(例如草酸分解代谢酶)可操作地连接。在ros的存在下，soxr转录因子感知ros并激活soxs调节区，从而驱动可操作地连接的草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因或基因盒的表达并产生一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白。
[0286]
在一些实施方案中，可调的调节区是ros去阻遏调节区，并且相应转录因子的结合阻遏下游基因表达；在ros的存在下，转录因子不再与调节区结合，从而解除阻遏可操作地连接的基因或基因盒。
[0287]
在一些实施方案中，可调的调节区是ros去阻遏调节区，并且感知ros的转录因子是ohrr。ohrr“结合一对与ohra启动子位点重叠的反向重复dna序列，从而阻遏转录事件”，但氧化的ohrr“无法结合其dna靶标”(duarte等人,2010)。ohrr是“感知有机过氧化物和naocl两者的转录阻遏物”(dubbs等人,2012)，并且“被h2o2弱激活，但它对有机氢过氧化物表现出高得多的反应性”(duarte等人,2010)。本发明的遗传工程化细菌可以包含来自被ohrr阻遏的基因的任何合适的ros响应性调节区。能够被ohrr阻遏的基因是本领域已知的(参见例如，dubbs等人,2012；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含来自ohra的ros去阻遏调节区，其与基因或基因盒(例如草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因)可操作地连接。在ros(例如naocl)的存在下，ohrr转录因子感知ros，并且不再与ohra调节区结合，从而解除阻遏可操作地连接的草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因并产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白。
[0288]
ohrr是ros响应性调节因子的marr家族的成员。“marr家族的大多数成员都是转录阻遏物，并且通常与启动子中的-10或-35区域结合，导致rna聚合酶结合的空间抑制”(bussmann等人,2010)。该家族的其他成员是本领域已知的，并且包括但不限于ospr、mgra、rosr和sarz。在一些实施方案中，感知ros的转录因子是ospr、mgra、rosr和/或sarz，并且本发明的遗传工程化细菌包含来自被ospr、mgra、rosr和/或sarz阻遏的基因的一个或多个相应的调节区序列。能够被ospr、mgra、rosr和/或sarz阻遏的基因是本领域已知的(参见例
如，dubbs等人,2012)。
[0289]
在一些实施方案中，可调的调节区是ros去阻遏调节区，并且感知ros的相应转录因子是rosr。rosr是“一种marr型转录调节因子”，其与“具有共有序列ttgttgayryrtcaacwa(seq id no:64)的18-bp反向重复序列”结合并“被氧化剂h2o2可逆地抑制”(bussmann等人,2010)。rosr能够阻遏许多基因和推定的基因，包括但不限于“推定的聚类异戊二烯结合蛋白(cg1322，rosr上游和分支的基因)、感知组氨酸激酶(cgts9)、推定的crp/fnr家族转录调节因子(cg3291)、谷胱甘肽s-转移酶家族的蛋白(cg1426)、两个推定的fmn还原酶(cg1150和cg1850)和四个推定的单加氧酶(cg0823、cg1848、cg2329和cg3084)”(bussmann等人,2010)。本发明的遗传工程化细菌可以包含来自被rosr阻遏的基因的任何合适的ros响应性调节区。能够被rosr阻遏的基因是本领域已知的(参见例如，bussmann等人,2010；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含来自cgts9的ros去阻遏调节区，其与基因或基因盒(例如酶和/或草酸盐转运蛋白)可操作地连接。在ros(例如h2o2)的存在下，rosr转录因子感知ros，并且不再与cgts9调节区结合，从而解除阻遏可操作地连接的草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因并产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白。
[0290]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌表达不调节细菌中大量天然基因的表达的感知ros的转录因子是有利的。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌表达来自不同细菌物种、菌株或亚株的感知ros的转录因子，其中所述转录因子不结合本发明的遗传工程化细菌中的调节序列。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌是大肠埃希氏菌，并且感知ros的转录因子是rosr(例如来自谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum))，其中所述大肠埃希氏菌不包含所述rosr的结合位点。在一些实施方案中，异源转录因子最小化或消除对遗传工程化细菌中的内源调节区和基因的脱靶效应。
[0291]
在一些实施方案中，可调的调节区是ros阻遏调节区，并且相应转录因子的结合阻遏下游基因表达；在ros的存在下，转录因子感知ros并结合ros阻遏调节区，从而阻遏可操作地连接的基因或基因盒的表达。在一些实施方案中，感知ros的转录因子能够结合与部分启动子序列重叠的调节区。在替代性实施方案中，感知ros的转录因子能够结合处于启动子序列上游或下游的调节区。
[0292]
在一些实施方案中，可调的调节区是ros阻遏调节区，并且感知ros的转录因子是perr。在枯草芽孢杆菌中，perr“当与dna结合时，阻遏编码参与氧化应激反应(kata、ahpc和mrga)、金属稳态(hemaxcdbl、fur和zoaa)及其自身合成(perr)的蛋白质的基因”(marinho等人,2014)。perr是“主要对h2o2作出应答的全局调节因子”(dubbs等人,2012)，并且“在per盒处与dna发生相互作用，所述per盒是位于perr控制基因的启动子序列之内和附近的特定回文共有序列(ttataatnattataa(seq id no:65))”(marinho等人,2014)。perr能够结合“与启动子的一部分重叠或紧邻启动子下游”的调节区(dubbs等人,2012)。本发明的遗传工程化细菌可以包含来自被perr阻遏的基因的任何合适的ros响应性调节区。能够被perr阻遏的基因是本领域已知的(参见例如，dubbs等人,2012；表1)。
[0293]
在这些实施方案中，遗传工程化细菌可以包含用于表达草酸分解代谢酶的双阻遏物激活调节回路。双阻遏物激活调节回路包含第一感知ros的阻遏物(例如perr)和第二阻遏物(例如tetr)，所述第二阻遏物与基因或基因盒(例如草酸分解代谢酶)可操作地连接。在这些实施方案的一个方面，感知ros的阻遏物抑制第二阻遏物的转录，所述第二阻遏物抑
制基因或基因盒的转录。在这些实施方案中有用的第二阻遏物的实例包括但不限于tetr、c1和lexa。在一些实施方案中，感知ros的阻遏物是perr。在一些实施方案中，第二阻遏物是tetr。在该实施方案中，perr阻遏调节区驱动tetr的表达，并且tetr阻遏调节区驱动基因或基因盒(例如草酸分解代谢酶)的表达。在不存在perr结合(其在不存在ros的情况下发生)的情况下，tetr被转录，并且tetr阻遏基因或基因盒(例如，草酸分解代谢酶)的表达。在perr结合(其在ros存在下发生)存在时，tetr表达被阻遏，并且基因或基因盒(例如草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白)被表达。
[0294]
ros响应性转录因子可以诱导、去阻遏或阻遏基因表达，这取决于遗传工程化细菌中所使用的调节区序列。例如，虽然“oxyr主要被认为是氧化条件下的转录激活因子
……
但是oxyr在氧化和还原条件下可以充当阻遏物或激活物”(dubbs等人,2012)，并且oxyr“已被证明是其自身表达以及fhuf(编码铁离子还原酶)和flu(编码抗原43外膜蛋白)表达的阻遏物”(zheng等人,2001)。本发明的遗传工程化细菌可以包含来自被oxyr阻遏的基因的任何合适的ros响应性调节区。在一些实施方案中，如上所述，oxyr被用于双阻遏物激活调节回路。能够被oxyr阻遏的基因是本领域已知的(参见例如，zheng等人,2001；表1)。或者，例如，尽管rosr能够阻遏许多基因，但其也能够激活某些基因，例如narkghji操纵子。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含来自被rosr激活的基因的任何合适的ros响应性调节区。此外，“还观察到perr介导的正调节
……
并且似乎参与perr与远处上游位点的结合”(dubbs等人,2012)。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含来自被perr激活的基因的任何合适的ros响应性调节区。
[0295]
一种或多种类型的感知ros的转录因子和相应的调节区序列可能存在于遗传工程化细菌中。例如，“在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者中都发现了ohrr，并且其可以与oxyr或perr或两者共同定位”(dubbs等人,2012)。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含一种类型的感知ros的转录因子(例如oxyr)和一种相应的调节区序列(例如来自oxys)。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含一种类型的感知ros的转录因子(例如oxyr)和两种或更多种不同的相应调节区序列(例如来自oxys和katg)。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含两种或更多种类型的感知ros的转录因子(例如oxyr和perr)以及两种或更多种相应的调节区序列(例如分别来自oxys和kata)。一个ros响应性调节区可能能够结合多于一个转录因子。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含两种或更多种类型的感知ros的转录因子和一个相应的调节区序列。
[0296]
几个示例性oxyr调节性调节区的核酸序列如表5中所示。oxyr结合位点以下划线和粗体表示。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含与seq id no:46、47、48或49的dna序列或其功能片段至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源的核酸序列。
[0297]
表9.示例性oxyr调节性调节区的核苷酸序列
[0298]
调节序列seq id nokatgseq id no:30dpsseq id no:31ahpcseq id no:32oxysseq id no:33
[0299]
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含编码感知ros的转录因子的基因(例如oxyr基因)，其由其天然启动子、诱导型启动子、比天然启动子更强的启动子(例如glnrs启动子或p(bla)启动子)或组成型启动子控制。在一些情况下，在诱导型启动子的控制下表达感知ros的转录因子以增强表达稳定性可能是有利的。在一些实施方案中，感知ros的转录因子的表达由与控制治疗性分子表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方案中，感知ros的转录因子的表达由控制治疗性分子表达的同一启动子控制。在一些实施方案中，感知ros的转录因子和治疗性分子从启动子区差异地转录。
[0300]
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含来自不同细菌物种、菌株或亚株的感知ros的转录因子的基因。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含来自不同细菌物种、菌株或亚株的ros响应性调节区。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含来自不同细菌物种、菌株或亚株的感知ros的转录因子和相应的ros响应性调节区。与相同条件下来自相同亚型的细菌的天然转录因子和调节区相比，异源感知ros的转录因子和调节区可以在ros的存在下增加与所述调节区可操作地连接的基因的转录。
[0301]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含来自大肠埃希氏菌的感知ros的转录因子oxyr和相应的调节区oxys。在一些实施方案中，天然感知ros的转录因子(例如oxyr)保持完整并保留了野生型活性。在替代性实施方案中，天然感知ros的转录因子(例如oxyr)被缺失或突变以降低或消除野生型活性。
[0302]
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌包含多个拷贝的编码感知ros的转录因子的内源基因，例如oxyr基因。在一些实施方案中，编码感知ros的转录因子的基因存在于质粒上。在一些实施方案中，编码感知ros的转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于不同的质粒上。在一些实施方案中，编码感知ros的转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于同一质粒上。在一些实施方案中，编码感知ros的转录因子的基因存在于染色体上。在一些实施方案中，编码感知ros的转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于不同的染色体上。在一些实施方案中，编码感知ros的转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于同一染色体上。
[0303]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码感知ros的转录因子的野生型基因(例如soxr基因)和相对于来自相同亚型细菌的野生型调节区是突变的相应的调节区(例如soxs调节区)。与相同条件下的野生型调节区相比，突变的调节区在ros的存在下增加了草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的表达。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含野生型ros响应性调节区(例如oxys调节区)和相对于来自相同亚型细菌的野生型转录因子是突变的相应的转录因子(例如oxyr)。与相同条件下的野生型转录因子相比，突变体转录因子在ros的存在下增加了草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的表达。在一些实施方案中，感知ros的转录因子和相应的调节区两者相对于来自相同亚型细菌的野生型序列都被突变，以便在ros的存在下增加草酸分解代谢酶的表达。
[0304]
在一些实施方案中，用于产生草酸分解代谢酶的基因或基因盒存在于质粒上，并且与由ros诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，用于产生草酸分解代谢酶的基因或基因盒存在于染色体中，并且与由ros诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，用于产生草酸分解代谢酶的基因或基因盒存在于染色体上，并且与由暴露于四环素诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，用于产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运
蛋白的基因或基因盒存在于质粒上，并且与由暴露于四环素诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，通过本领域已知的方法进一步优化表达，例如，通过优化核糖体结合位点、操纵转录调节因子和/或增加mrna稳定性。
[0305]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌可以包含多个拷贝的能够产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因。在一些实施方案中，能够产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因存在于质粒上，并且与ros响应性调节区可操作地连接。在一些实施方案中，能够产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因存在于染色体中，并且与ros响应性调节区可操作地连接。
[0306]
因此，在一些实施方案中，遗传工程化细菌或遗传工程化病毒在氧水平依赖性启动子、活性氧物质(ros)依赖性启动子或活性氮物质(rns)依赖性启动子和相应转录因子的控制下产生一种或多种草酸分解代谢酶。
[0307]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含携带用于产生草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因的稳定维持的质粒或染色体，使得草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白可以在宿主细胞中表达，并且宿主细胞能够在体外(例如在培养基中和/或在体内)存活和/或生长。在一些实施方案中，细菌可以包含多个拷贝的编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒以低拷贝质粒表达。在一些实施方案中，低拷贝质粒可以用于增加表达的稳定性。在一些实施方案中，低拷贝质粒可以用于减少非诱导条件下的渗漏表达。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒以高拷贝质粒表达。在一些实施方案中，高拷贝质粒可以用于增加草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的表达。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒在染色体上表达。
[0308]
在一些实施方案中，细菌被遗传工程化以包括多种作用机制(moa)，例如产生多个拷贝的相同产物的回路(例如，以提高拷贝数)或执行多种不同功能的回路。例如，遗传工程化细菌可以包括插入在四个不同插入位点的四个拷贝的编码一种或多种特定草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因和/或基因盒。可替代地，遗传工程化细菌可以包括插入在三个不同插入位点的三个拷贝的编码特定草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因、以及插入在三个不同插入位点的三个拷贝的编码不同草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的基因。
[0309]
在一些实施方案中，在表达草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的条件下，如与相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比，本公开的遗传工程化细菌产生至少约1.5倍、至少约2倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍或至少约1,500倍更多的在操纵子中的草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白和/或基因转录物。
[0310]
在一些实施方案中，定量pcr(qpcr)用于扩增、检测和/或定量草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因的mrna表达水平。根据本领域已知的方法，可以设计对草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因特异的引物并将其用于检测样品中的mrna。在一些实施方案中，将荧光团添加到可能含有草酸分解代谢酶mrna的样品反应混合物中，并且使用热循
环仪用特定波长的光照射样品反应混合物并检测荧光团随后的发射。将反应混合物加热并冷却至预定温度并持续预定时间段。在某些实施方案中，加热和冷却重复预定数量的循环。在一些实施方案中，将反应混合物加热并冷却至90-100℃、60-70℃和30-50℃持续预定的循环次数。在某个实施方案中，将反应混合物加热并冷却至93-97℃、55-65℃和35-45℃持续预定的循环次数。在一些实施方案中，在qpcr的每个循环之后对积累的扩增子进行定量。荧光超过阈值的循环次数是阈值循环(ct)。产生每个样品的至少一个ct结果，并且ct结果可以用于确定草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因的mrna表达水平。
[0311]
在一些实施方案中，定量pcr(qpcr)用于扩增、检测和/或定量草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因的mrna表达水平。根据本领域已知的方法，可以设计对草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因特异的引物，并将其用于检测样品中的mrna。在一些实施方案中，将荧光团添加到可能含有草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白mrna的样品反应混合物中，并且使用热循环仪用特定波长的光照射样品反应混合物，并检测荧光团随后的发射。将反应混合物加热并冷却至预定温度并持续预定时间段。在某些实施方案中，加热和冷却重复预定数量的循环。在一些实施方案中，将反应混合物加热并冷却至90-100℃、60-70℃和30-50℃持续预定的循环次数。在某个实施方案中，将反应混合物加热并冷却至93-97℃、55-65℃和35-45℃持续预定的循环次数。在一些实施方案中，在qpcr的每个循环之后对积累的扩增子进行定量。荧光超过阈值的循环次数是阈值循环(ct)。产生每个样品的至少一个ct结果，并且ct结果可以用于确定草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因的mrna表达水平。
[0312]
在其他实施方案中，诱导型启动子是丙酸盐响应性启动子。例如，prpr启动子是丙酸盐响应性启动子。在一个实施方案中，丙酸盐响应性启动子包含seq id no:58。
[0313]
必需基因和营养缺陷型
[0314]
如本文所用，术语“必需基因”是指细胞生长和/或存活所必需的基因。细菌必需基因是本领域普通技术人员熟知的，并且可以通过基因的定向缺失和/或随机诱变和筛选来鉴定(参见例如，zhang和lin,2009,deg 5.0,a database of essential genes in both prokaryotes and eukaryotes,nucl.acids res.,37:d455-d458；以及gerdes等人,essential genes on metabolic maps,curr.opin.biotechnol.,17(5):448-456，其中每一篇参考文献的全部内容以引用的方式明确地并入本文)。
[0315]“必需基因”可能依赖于有机体生活的场景和环境。例如，必需基因的突变、修饰或切除可能导致本公开的重组细菌变成营养缺陷型。营养缺陷型修饰旨在导致细菌在没有外源添加的生存或生长所必需的营养素的情况下死亡，因为它们缺乏产生所述必需营养素所必需的基因。
[0316]
营养缺陷型修饰旨在导致细菌在没有外源添加的生存或生长所必需的营养素的情况下死亡，因为它们缺乏产生所述必需营养素所必需的基因。在一些实施方案中，本文所述的任何遗传工程化细菌还包含细胞存活和/或生长所必需的一个或多个基因中的缺失或突变。
[0317]
在一些实施方案中，细菌细胞在编码草酸生物合成基因的一个或多个内源基因中包含遗传突变，其中所述遗传突变减少细菌细胞中草酸盐的生物合成。
[0318]
在一个实施方案中，必需基因是寡核苷酸合成基因，例如thya。在另一个实施方案
中，必需基因是细胞壁合成基因，例如dapa。在又另一个实施方案中，必需基因是氨基酸基因，例如sera或meta。可以靶向细胞存活和/或生长所必需的任何基因，包括但不限于cyse、glna、ilvd、leub、lysa、sera、meta、glya、hisb、ilva、phea、proa、thrc、trpc、tyra、thya、uraa、dapa、dapb、dapd、dape、dapf、flhd、metb、metc、proab和thi1，只要相应的野生型基因产物不在细菌中产生即可。
[0319]
表10列出了可以被破坏或缺失以产生营养缺陷型菌株的示例性细菌基因。这些包括但不限于寡核苷酸合成、氨基酸合成和细胞壁合成所必需的基因。
[0320]
表10.可用于产生营养缺陷型的细菌基因的非限制性实例
[0321]
氨基酸寡核苷酸细胞壁cysethyadapaglnauraadapbilvd dapdleub dapelysa dapfsera
ꢀꢀ
meta
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glya
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tyra
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[0322]
表11显示了各种氨基酸营养缺陷型在小鼠肠道中的存活，如管饲后24小时和48小时所检测的。这些营养缺陷型是使用大肠埃希氏菌非尼氏菌株bw25113产生的。
[0323]
表11.氨基酸营养缺陷型在小鼠肠道中的存活
[0324][0325]
例如，胸腺嘧啶是细菌细胞生长所必需的核酸；没有它时，细菌会经历细胞死亡。thya基因编码胸苷酸合成酶，其是通过将dump转化为dtmp来催化胸腺嘧啶合成的第一步的酶(sat等人,2003)。在一些实施方案中，本公开的细菌细胞是thya营养缺陷型，其中thya基因被缺失和/或被不相关的基因替代。thya营养缺陷型仅在存在足够量的胸腺嘧啶时(例如，通过在体外将胸腺嘧啶添加到生长培养基中，或者在体内人类肠道中天然存在高水平胸腺嘧啶的情况下)才能够生长。在一些实施方案中，本公开的细菌细胞是当细菌存在于哺乳动物肠道中时得到补充的基因的营养缺陷型。在没有足够量的胸腺嘧啶时，thya营养缺陷型就会死亡。在一些实施方案中，将营养缺陷型修饰用于确保细菌细胞在不存在营养缺陷型基因产物的情况下(例如，在肠道外部)不能存活。
[0326]
二氨基庚二酸(dap)是在赖氨酸生物合成途径中合成的氨基酸，并且是细菌细胞壁生长所必需的(meadow等人,1959；clarkson等人,1971)。在一些实施方案中，本文所述的任何遗传工程化细菌都是dapd营养缺陷型，其中dapd被缺失和/或被不相关的基因替代。只有当存在足够量的dap时，例如通过在体外将dap添加到生长培养基中，dapd营养缺陷型才能够生长。在没有足够量的dap时，dapd营养缺陷型就会死亡。在一些实施方案中，将营养缺陷型修饰用于确保细菌细胞在不存在营养缺陷型基因产物的情况下(例如，在肠道外部)不
能存活。
[0327]
在其他实施方案中，本公开的遗传工程化细菌是uraa营养缺陷型，其中uraa被缺失和/或被不相关的基因替代。uraa基因编码uraa，一种促进嘧啶尿嘧啶的摄取和随后的分解代谢的膜结合转运蛋白(andersen等人,1995)。只有当存在足够量的尿嘧啶时，例如通过在体外将尿嘧啶添加到生长培养基中，uraa营养缺陷型才能够生长。在没有足够量的尿嘧啶时，uraa营养缺陷型就会死亡。在一些实施方案中，将营养缺陷型修饰用于确保细菌在不存在营养缺陷型基因产物的情况下(例如，在肠道外部)不能存活。
[0328]
在复杂的群落中，细菌共享dna是可能的。在非常罕见的场景中，营养缺陷型细菌菌株可能从非营养缺陷型菌株得到dna，其修复基因组缺失并永久拯救营养缺陷型。因此，工程化具有多于一种营养缺陷型的细菌菌株可以大大降低dna转移发生足够多的次数以拯救营养缺陷型的可能性。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含细胞存活和/或生长所必需的两个或更多个基因的缺失或突变。
[0329]
必需基因的其他实例包括但不限于yhbv、yagg、hemb、secd、secf、ribd、ribe、thil、dxs、ispa、dnax、adk、hemh、lpxh、cyss、fold、rplt、infc、thrs、nade、gapa、yeaz、asps、args、pgsa、yefm、metg、fole、yejm、gyra、nrda、nrdb、folc、accd、fabb、gltx、liga、zipa、dape、dapa、der、hiss、ispg、suhb、tada、acps、era、rnc、ftsb、eno、pyrg、chpr、lgt、fbaa、pgk、yqgd、metk、yqgf、plsc、ygit、pare、ribb、cca、ygjd、tdcf、yral、yiha、ftsn、muri、murb、bira、sece、nusg、rplj、rpll、rpob、rpoc、ubia、plsb、lexa、dnab、ssb、alsk、gros、psd、orn、yjee、rpsr、chps、ppa、vals、yjgp、yjgq、dnac、ribf、lspa、isph、dapb、fola、imp、yabq、ftsl、ftsi、mure、murf、mray、murd、ftsw、murg、murc、ftsq、ftsa、ftsz、lpxc、secm、seca、can、folk、heml、yadr、dapd、map、rpsb、infb、nusa、ftsh、obge、rpma、rplu、ispb、mura、yrbb、yrbk、yhbn、rpsi、rplm、degs、mred、mrec、mreb、accb、accc、yrdc、def、fmt、rplq、rpoa、rpsd、rpsk、rpsm、entd、mrdb、mrda、nadd、hlepb、rpoe、pssa、yfio、rpls、trmd、rpsp、ffh、grpe、yfjb、csra、ispf、ispd、rplw、rpld、rplc、rpsj、fusa、rpsg、rpsl、trps、yrff、asd、rpoh、ftsx、ftse、ftsy、frr、dxr、ispu、rfak、kdta、coad、rpmb、dfp、dut、gmk、spot、gyrb、dnan、dnaa、rpmh、rnpa、yidc、tnab、glms、glmu、wzye、hemd、hemc、yigp、ubib、ubid、hemg、secy、rplo、rpmd、rpse、rplr、rplf、rpsh、rpsn、rple、rplx、rpln、rpsq、rpmc、rplp、rpsc、rplv、rpss、rplb、cdsa、yael、yaet、lpxd、fabz、lpxa、lpxb、dnae、acca、tils、pros、yaff、tsf、pyrh、ola、rlpb、leus、lnt、glns、flda、cyda、infa、cydc、ftsk、lola、sers、rpsa、msba、lpxk、kdsb、mukf、muke、mukb、asns、faba、mvin、rne、yceq、fabd、fabg、acpp、tmk、holb、lolc、lold、lole、purb、ymfk、mine、mind、pth、rsa、ispe、lolb、hema、prfa、prmc、kdsa、topa、riba、fabi、racr、dica、ydfb、tyrs、ribc、ydil、phet、phes、yhhq、bcsb、glyq、yibj、和gpsa。其他必需基因是本领域普通技术人员已知的。
[0330]
在一些实施方案中，本公开的遗传工程化细菌是合成的配体依赖性必需基因(slide)细菌细胞。slide细菌细胞是在一个或多个必需基因中具有突变的合成营养缺陷型，其仅在特定配体的存在下生长(参见lopez和anderson“synthetic auxotrophs with ligand-dependent essential genes for a bl21(de3 biosafety strain,”acs synthetic biology(2015)doi:10.1021/acssynbio.5b00085，所述文献的全部内容以引用的方式明确并入本文)。
[0331]
在一些实施方案中，slide细菌细胞包含必需基因中的突变。在一些实施方案中，必需基因选自由以下组成的组：phes、dnan、tyrs、metg和adk。在一些实施方案中，必需基因是包含以下突变中的一个或多个的dnan：h191n、r240c、i317s、f319v、l340t、v347i和s345c。在一些实施方案中，必需基因是包含突变h191n、r240c、i317s、f319v、l340t、v347i和s345c的dnan。在一些实施方案中，必需基因是包含以下突变中的一个或多个的phes：f125g、p183t、p184a、r186a和i188l。在一些实施方案中，必需基因是包含突变f125g、p183t、p184a、r186a和i188l的phes。在一些实施方案中，必需基因是包含以下突变中的一个或多个的tyrs：l36v、c38a和f40g。在一些实施方案中，必需基因是包含突变l36v、c38a和f40g的tyrs。在一些实施方案中，必需基因是包含以下突变中的一个或多个的metg：e45q、n47r、i49g和a51c。在一些实施方案中，必需基因是包含突变e45q、n47r、i49g和a51c的metg。在一些实施方案中，必需基因是包含以下突变中的一个或多个的adk：i4l、l5i和l6g。在一些实施方案中，必需基因是包含突变i4l、l5i和l6g的adk。
[0332]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌由配体补充。在一些实施方案中，配体选自由以下组成的组：苯并噻唑、吲哚、2-氨基苯并噻唑、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸和l-组氨酸甲酯。例如，在metg中包含突变(e45q、n47r、i49g和a51c)的细菌细胞由苯并噻唑、吲哚、2-氨基苯并噻唑、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸或l-组氨酸甲酯补充。在dnan中包含突变(h191n、r240c、i317s、f319v、l340t、v347i和s345c)的细菌细胞由苯并噻唑、吲哚或2-氨基苯并噻唑补充。在phes中包含突变(f125g、p183t、p184a、r186a和i188l)的细菌细胞由苯并噻唑或2-氨基苯并噻唑补充。在tyrs中包含突变(l36v、c38a和f40g)的细菌细胞由苯并噻唑或2-氨基苯并噻唑补充。在adk中包含突变(i4l、l5i和l6g)的细菌细胞由苯并噻唑或吲哚补充。
[0333]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含使其成为配体的营养缺陷型的多于一个突变的必需基因。在一些实施方案中，细菌细胞在两个必需基因中包含突变。例如，在一些实施方案中，细菌细胞在tyrs(l36v、c38a和f40g)和metg(e45q、n47r、i49g和a51c)中包含突变。在其他实施方案中，细菌细胞在三个必需基因中包含突变。例如，在一些实施方案中，细菌细胞在tyrs(l36v、c38a和f40g)、metg(e45q、n47r、i49g和a51c)和phes(f125g、p183t、p184a、r186a和i188l)中包含突变。
[0334]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌是条件营养缺陷型，其必需基因使用本文所述的阿拉伯糖系统替代。
[0335]
在一些实施方案中，本公开的遗传工程化细菌是营养缺陷型的，并且还包含杀灭开关回路，诸如本文所述的任何杀灭开关组分和系统。例如，重组细菌可以包含细胞存活和/或生长所必需的必需基因的缺失或突变，所述必需基因例如dna合成基因(例如thya)、细胞壁合成基因(例如dapa)和/或氨基酸基因(例如sera或meta或ilvc)，并且还可以包含由响应于环境条件和/或信号而表达的一种或多种转录激活因子(诸如所述的阿拉伯糖系统)调节或者由在感知外源环境条件和/或信号时表达的一种或多种重组酶(诸如本文所述的重组酶系统)调节的毒素基因。其他实施方案描述于wright等人,“geneguard:amodular plasmid system designed for biosafety,”acs synthetic biology(2015)4:307-16，所述文献的全部内容以引用的方式明确并入本文。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化细菌是营养缺陷型，并且还包含杀灭开关回路(诸如本文所述的任何杀灭开关组分和系统)以及另一种生物安全系统(诸如条件性复制起点)(参见wright等人，同上)。
[0336]
遗传调节回路
[0337]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含用于表达本文所述构建体的多层遗传调节回路(参见例如，美国临时申请号62/184,811，其以引用的方式整体并入本文)。遗传调节回路可用于筛选产生一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白的突变细菌或拯救营养缺陷型。在某些实施方案中，本发明提供了用于选择产生一个或多个所关注的基因的遗传工程化细菌的方法。
[0338]
在一些实施方案中，本发明提供了遗传工程化细菌，其包含用于产生有效负载的基因或基因盒和t7聚合酶调节的遗传调节回路。例如，遗传工程化细菌包含编码t7聚合酶的第一基因，其中所述第一基因与延胡索酸和硝酸还原酶调节因子(fnr)响应性启动子可操作地连接；用于产生有效负载的第二基因或基因盒，其中所述第二基因或基因盒与由t7聚合酶诱导的t7启动子可操作地连接；和编码能够抑制t7聚合酶的抑制因子lysy的第三基因。在氧的存在下，fnr不结合fnr响应性启动子，并且有效负载不被表达。lysy组成型(p-lac组成型)表达并进一步抑制t7聚合酶。在不存在氧的情况下，fnr二聚化并与fnr响应性启动子结合，t7聚合酶以足以克服lysy抑制的水平表达，并且有效负载被表达。在一些实施方案中，lysy基因与附加fnr结合位点可操作地连接。在不存在氧的情况下，fnr二聚化以激活t7聚合酶表达，如上所述，并且还抑制lysy表达。
[0339]
在一些实施方案中，本发明提供了遗传工程化细菌，其包含用于产生有效负载的基因或基因盒和蛋白酶调节的遗传调节回路。例如，遗传工程化细菌包含编码mf-lon蛋白酶的第一基因，其中所述第一基因与fnr响应性启动子可操作地连接；与tet调节区(teto)可操作地连接的用于产生有效负载的第二基因或基因盒；和与tet阻遏物(tetr)连接的编码mf-lon降解信号的第三基因，其中所述tetr能够结合tet调节区并阻遏第二基因或基因盒的表达。mf-lon蛋白酶能够识别mf-lon降解信号并降解tetr。在氧的存在下，fnr不结合fnr响应性启动子，阻遏物不被降解，并且有效负载不被表达。在不存在氧的情况下，fnr二聚化并结合fnr响应性启动子，从而诱导mf-lon蛋白酶的表达。mf-lon蛋白酶识别mf-lon降解信号并降解tetr，并且有效负载被表达。
[0340]
在一些实施方案中，本发明提供了遗传工程化细菌，其包含用于产生有效负载的基因或基因盒和阻遏物调节的遗传调节回路。例如，遗传工程化细菌包含编码第一阻遏物的第一基因，其中所述第一基因与fnr响应性启动子可操作地连接；用于产生有效负载的第二基因或基因盒，所述第二基因或基因盒与包含组成型启动子的第一调节区可操作地连接；和编码第二阻遏物的第三基因，其中所述第二阻遏物能够结合第一调节区并阻遏第二基因或基因盒的表达。第三基因与包含组成型启动子的第二调节区可操作地连接，其中所述第一阻遏物能够结合第二调节区并抑制第二阻遏物的表达。在氧的存在下，fnr不结合fnr响应性启动子，第一阻遏物不被表达，第二阻遏物被表达，并且有效负载不被表达。在不存在氧的情况下，fnr二聚化并结合fnr响应性启动子，第一阻遏物被表达，第二阻遏物不被表达，并且有效负载被表达。
[0341]
这些实施方案中有用的阻遏物的实例包括但不限于argr、tetr、arsr、ascg、laci、cscr、deor、dgor、frur、galr、gatr、ci、lexa、rafr、qacr和ptxs(us20030166191)。
[0342]
在一些实施方案中，本发明提供了遗传工程化细菌，其包含用于产生有效负载的基因或基因盒和调节性rna调节的遗传调节回路。例如，遗传工程化细菌包含编码调节性
rna的第一基因，其中所述第一基因与fnr响应性启动子可操作地连接，以及用于产生有效负载的第二基因或基因盒。第二基因或基因盒与组成型启动子可操作地连接，并且还与能够产生抑制有效负载翻译的mrna发夹的核苷酸序列连接。调节性rna能够消除mrna发夹并且通过核糖体结合位点诱导有效负载翻译。在氧的存在下，fnr不结合fnr响应性启动子，调节性rna不被表达，并且mrna发夹阻止有效负载被翻译。在不存在氧的情况下，fnr二聚化并结合fnr响应性启动子，调节性rna被表达，mrna发夹被消除，并且有效负载被表达。
[0343]
在一些实施方案中，本发明提供了遗传工程化细菌，其包含用于产生有效负载的基因或基因盒和crispr调节的遗传调节回路。例如，遗传工程化细菌包含cas9蛋白；编码crispr指导rna的第一基因，其中所述第一基因与fnr响应性启动子可操作地连接；用于产生有效负载的第二基因或基因盒，其中所述第二基因或基因盒与包含组成型启动子的调节区可操作地连接；和与组成型启动子可操作地连接的编码阻遏物的第三基因，其中所述阻遏物能够结合调节区并阻遏所述第二基因或基因盒的表达。第三基因还与能够结合crispr指导rna的crispr靶序列连接，其中所述与crispr指导rna的结合诱导cas9蛋白的切割并抑制阻遏物的表达。在氧的存在下，fnr不结合fnr响应性启动子，指导rna不被表达，阻遏物被表达，并且有效负载不被表达。在不存在氧的情况下，fnr二聚化并结合fnr响应性启动子，指导rna被表达，阻遏物不被表达，并且有效负载被表达。
[0344]
在一些实施方案中，本发明提供了遗传工程化细菌，其包含用于产生有效负载的基因或基因盒和重组酶调节的遗传调节回路。例如，遗传工程化细菌包含编码重组酶的第一基因，其中所述第一基因与fnr响应性启动子可操作地连接，以及与组成型启动子可操作地连接的用于产生有效负载的第二基因或基因盒。第二基因或基因盒的方向是反向的(3'至5')，两侧为重组酶结合位点，并且重组酶能够与重组酶结合位点结合以通过回复其方向(5'至3')诱导第二基因或基因盒的表达。在氧的存在下，fnr不结合fnr响应性启动子，重组酶不被表达，有效负载保持在3'至5'方向，并且不产生功能性有效负载。在不存在氧的情况下，fnr二聚化并结合fnr响应性启动子，重组酶被表达，有效负载回复到5'至3'方向，并产生功能性有效负载。
[0345]
在一些实施方案中，本发明提供了遗传工程化细菌，其包含用于产生有效负载的基因或基因盒以及聚合酶和重组酶调节的遗传调节回路。例如，遗传工程化细菌包含编码重组酶的第一基因，其中所述第一基因与fnr响应性启动子可操作地连接；与t7启动子可操作地连接的用于产生有效负载的第二基因或基因盒；编码t7聚合酶的第三基因，其中所述t7聚合酶能够结合t7启动子并诱导有效负载的表达。编码t7聚合酶的第三基因的方向是反向的(3'至5')，侧翼为重组酶结合位点，并且重组酶能够结合重组酶结合位点以通过回复其方向(5'至3')诱导t7聚合酶基因的表达。在氧的存在下，fnr不结合fnr响应性启动子，重组酶不被表达，t7聚合酶基因保持在3'至5'方向，并且有效负载不被表达。在不存在氧的情况下，fnr二聚化并结合fnr响应性启动子，重组酶被表达，t7聚合酶基因回复到5'至3'方向，并且有效负载被表达。
[0346]
杀灭开关
[0347]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌还包含杀灭开关(参见例如，美国临时申请号62/183,935和62/263,329，所述申请每一个都以引用的方式整体明确并入本文)。杀灭开关旨在响应于外部刺激主动杀灭工程化微生物。与营养缺陷型突变相反(在营养缺陷型突变
中，细菌因为它们缺乏生存所需的必要营养素而死亡)，杀灭开关是由环境中诱导微生物内产生导致细胞死亡的有毒分子的特定因素触发的。
[0348]
出于体外研究的目的，已经对经工程化为具有杀灭开关的细菌进行了工程化，例如，以限制产生生物燃料的微生物在实验室环境之外的传播。经工程化用于体内施用以治疗疾病或病症的细菌也可以被编程为在表达和递送异源基因或基因盒(例如治疗性基因)之后或在受试者已经历治疗效果之后的特定时间死亡。例如，在一些实施方案中，杀灭开关在草酸分解代谢酶表达后的一段时间之后被激活以杀灭细菌。在一些实施方案中，在草酸分解代谢基因表达后，例如在产生草酸分解代谢酶之后，杀灭开关以延迟的方式被激活。可替代地，细菌可以被工程化为在细菌扩散到疾病部位之外之后死亡。具体而言，其可以用于防止微生物在受试者体内的长期定殖、微生物在受试者体内所关注的区域外部(例如，在肠道外部)的扩散、或微生物在受试者体外扩散到环境中(例如，通过受试者的粪便扩散到环境中)。
[0349]
可以用于杀灭开关的此类毒素的实例包括但不限于细菌素、溶素和通过溶解细胞膜、降解细胞dna或其他机制导致细胞死亡的其他分子。此类毒素可以单独或联合使用。控制其产生的开关可以基于例如转录激活(拨动开关；参见例如，gardner等人,2000)、翻译(核糖调节因子)或dna重组(基于重组酶的开关)，并且可以感知环境刺激，诸如厌氧生活或活性氧物质。这些开关可以由单一环境因素激活，或者可能需要呈and、or、nand和nor逻辑配置的几个激活因子来诱导细胞死亡。例如，and核糖调节因子开关被四环素、异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)和阿拉伯糖激活，以诱导溶素的表达，溶素使细胞膜通透并杀灭细胞。iptg诱导内溶素和holin mrna的表达，其然后通过添加阿拉伯糖和四环素去阻遏。所有三种诱导剂都必须存在才能导致细胞死亡。杀灭开关的实例在本领域中是已知的(callura等人,2010)。在一些实施方案中，杀灭开关在草酸分解代谢酶的氧水平依赖性表达后的一段时间之后被激活以杀灭细菌。在一些实施方案中，杀灭开关在草酸分解代谢酶的氧水平依赖性表达之后以延迟的方式被激活。
[0350]
杀灭开关可以被设计成使得响应于环境条件或外部信号而产生毒素(例如，细菌响应于外部信号而被杀灭；即基于激活的杀灭开关)，或者可替代地被设计成使得一旦环境条件不再存在或外部信号停止，就产生毒素(即基于阻遏的杀灭开关)。
[0351]
因此，在一些实施方案中，本公开的遗传工程化细菌被进一步编程为在感知外源环境信号之后(例如在低氧环境中)死亡。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化细菌(例如表达草酸分解代谢酶的细菌)包含编码一种或多种重组酶的一个或多个基因，其表达响应于环境条件或信号而被诱导并引起一个或多个重组事件，所述重组事件最终导致杀灭细胞的毒素的表达。在一些实施方案中，至少一个重组事件是翻转编码细菌毒素的反向异源基因，所述反向异源基因在被第一重组酶翻转之后组成型表达。在一个实施方案中，细菌毒素的组成型表达杀灭遗传工程化细菌。在这些类型的杀灭开关系统中，一旦工程化细菌细胞感知到外源环境条件并表达所关注的异源基因，重组细菌细胞就不再是活的。
[0352]
在另一个实施方案中，其中本公开的遗传工程化细菌(例如表达草酸分解代谢酶的细菌)响应于环境条件或信号而表达引起至少一个重组事件的一种或多种重组酶，所述遗传工程化细菌还响应于外源环境条件或信号而表达编码抗毒素的异源基因。在一个实施方案中，所述至少一个重组事件是被第一重组酶翻转的编码细菌毒素的反向异源基因的翻
转。在一个实施方案中，编码细菌毒素的反向异源基因位于第一正向重组酶识别序列和第一反向重组酶识别序列之间。在一个实施方案中，编码细菌毒素的异源基因在其被第一重组酶翻转之后组成型表达。在一个实施方案中，抗毒素抑制毒素的活性，从而延迟遗传工程化细菌的死亡。在一个实施方案中，当外源环境条件不再存在时，当编码抗毒素的异源基因不再被表达时，遗传工程化细菌被细菌毒素杀灭。
[0353]
在另一个实施方案中，所述至少一个重组事件是第一重组酶翻转编码第二重组酶的反向异源基因，接着第二重组酶翻转编码细菌毒素的反向异源基因。在一个实施方案中，编码第二重组酶的反向异源基因位于第一正向重组酶识别序列和第一反向重组酶识别序列之间。在一个实施方案中，编码细菌毒素的反向异源基因位于第二正向重组酶识别序列和第二反向重组酶识别序列之间。在一个实施方案中，编码第二重组酶的异源基因在其被第一重组酶翻转之后组成型表达。在一个实施方案中，编码细菌毒素的异源基因在其被第二重组酶翻转之后组成型表达。在一个实施方案中，遗传工程化细菌被细菌毒素杀灭。在一个实施方案中，遗传工程化细菌响应于外源环境条件进一步表达编码抗毒素的异源基因。在一个实施方案中，当外源环境条件存在时，抗毒素抑制毒素的活性，从而延迟遗传工程化细菌的死亡。在一个实施方案中，当外源环境条件不再存在时，当编码抗毒素的异源基因不再被表达时，遗传工程化细菌被细菌毒素杀灭。
[0354]
在一个实施方案中，至少一个重组事件是第一重组酶翻转编码第二重组酶的反向异源基因，接着第二重组酶翻转编码第三重组酶的反向异源基因，接着第三重组酶翻转编码细菌毒素的反向异源基因。因此，在一个实施方案中，本公开提供了至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种或20种可以连续使用的重组酶。
[0355]
在一个实施方案中，至少一个重组事件是第一种重组酶翻转编码第一切除酶的反向异源基因。在一个实施方案中，编码第一切除酶的反向异源基因位于第一正向重组酶识别序列和第一反向重组酶识别序列之间。在一个实施方案中，编码第一切除酶的异源基因在其被第一重组酶翻转之后组成型表达。在一个实施方案中，第一切除酶切除第一必需基因。在一个实施方案中，在切除第一必需基因之后，编程的重组细菌细胞不存活。
[0356]
在一个实施方案中，第一重组酶进一步翻转编码第二切除酶的反向异源基因。在一个实施方案中，其中编码第二切除酶的反向异源基因位于第二正向重组酶识别序列和第二反向重组酶识别序列之间。在一个实施方案中，编码第二切除酶的异源基因在其被第一重组酶翻转之后组成型表达。在一个实施方案中，当第一必需基因和第二必需基因都被切除时，遗传工程化细菌死亡或不再存活。在一个实施方案中，当第一必需基因被第一重组酶切除或第二必需基因被切除时，遗传工程化细菌死亡或不再存活。
[0357]
在一个实施方案中，第一切除酶是xis1。在一个实施方案中，第一切除酶是xis2。在一个实施方案中，第一切除酶是xis1，并且第二切除酶是xis2。
[0358]
在一个实施方案中，遗传工程化细菌在至少一个重组事件发生之后死亡。在另一个实施方案中，在至少一个重组事件发生之后，遗传工程化细菌不再存活。
[0359]
在这些实施方案中的任一个中，重组酶可以是选自由以下组成的组的重组酶：bxbi、phic31、tp901、bxbi、phic31、tp901、hk022、hp1、r4、int1、int2、int3、int4、int5、int6、int7、int8、int9、int10、int11、int12、int13、int14、int15、int16、int17、int18、
int19、int20、int21、int22、int23、int24、int25、int26、int27、int28、int29、int30、int31、int32、int33和int34或其生物活性片段。
[0360]
在上述杀灭开关回路中，在环境因素或信号的存在下产生毒素。在杀灭开关回路的另一个方面，毒素可能在环境因素存在下被阻遏(不产生)，然后一旦环境条件或外部信号不再存在时就产生。此类杀灭开关被称为基于阻遏的杀灭开关，并且代表其中细菌细胞仅在外部因素或信号(诸如阿拉伯糖或其他糖)的存在下才存活的系统。在pct公开号wo 2017/040719(代理人参考号：126046-00520)的图中示出了示例性的杀灭开关设计，其中毒素在外部因子或信号的存在下被阻遏(并且一旦外部信号被去除就被激活)。本公开提供了重组细菌细胞，其在感知外源环境中的阿拉伯糖或其他糖时表达一个或多个异源基因。在这一方面，重组细菌细胞含有编码arac转录因子的arac基因以及在arabad启动子的控制下的一个或多个基因。在不存在阿拉伯糖的情况下，arac转录因子采用在arabad启动子的控制下阻遏基因转录的构象。在存在阿拉伯糖的情况下，arac转录因子经历构象变化，这允许其结合并激活arabad启动子，这诱导阻遏毒素基因表达的所需基因(例如tetr)的表达。在该实施方案中，毒素基因在阿拉伯糖或其他糖的存在下被阻遏。在不存在阿拉伯糖的环境中，tetr基因不被激活，毒素被表达，从而杀灭细菌。阿拉伯糖系统也可以用于表达必需基因，其中必需基因仅在阿拉伯糖或其他糖的存在下表达，并且当环境中不存在阿拉伯糖或其他糖时不被表达。
[0361]
因此，在其中一个或多个异源基因在感知到外源环境中的阿拉伯糖时被表达的一些实施方案中，一个或多个异源基因直接或间接处于arabad启动子的控制下。在一些实施方案中，所表达的异源基因选自以下在的一种或多种：异源治疗基因、编码抗毒素的异源基因、编码阻遏蛋白或多肽(例如tetr阻遏物)的异源基因、编码细菌细胞中未发现的必需蛋白的异源基因和/或编码调节蛋白或多肽的异源基因。
[0362]
阿拉伯糖诱导型启动子是本领域已知的，包括p
ara
、p
arab
、p
arac
和p
arabad
。在一个实施方案中，阿拉伯糖诱导型启动子来自大肠埃希氏菌。在一些实施方案中，p
arac
启动子和p
arabad
启动子作为双向启动子运作，其中p
arabad
启动子控制异源基因在一个方向上的表达，而p
arac
(与p
arabad
启动子非常邻近并在其相反链上)控制异源基因在另一个方向上的表达。在阿拉伯糖的存在下，两个异源基因从两种启动子的转录被诱导。然而，在不存在阿拉伯糖的情况下，两个异源基因从两种启动子的转录不被诱导。
[0363]
在本公开的一个示例性实施方案中，本公开的工程化细菌包含具有至少以下序列的杀灭开关：与编码四环素阻遏蛋白(tetr)的异源基因可操作地连接的p
arabad
启动子、与编码arac转录因子的异源基因可操作地连接的p
arac
启动子以及与被四环素阻遏蛋白(p
tetr
)阻遏的启动子可操作地连接的编码细菌毒素的异源基因。在阿拉伯糖的存在下，arac转录因子激活p
arabad
启动子，其激活tetr蛋白的转录，tetr蛋白进而阻遏毒素的转录。然而，在不存在阿拉伯糖的情况下，arac抑制从p
arabad
启动子的转录，并且tetr蛋白不被表达。在这种情况下，异源毒素基因的表达被激活，毒素被表达。毒素在重组细菌细胞中积累，并且重组细菌细胞被杀灭。在一个实施方案中，编码arac转录因子的arac基因在组成型启动子的控制下，因此被组成型表达。
[0364]
在本公开的一个实施方案中，重组细菌细胞还包含在组成型启动子的控制下的抗毒素。在这种情况下，在阿拉伯糖的存在下，由于被tetr蛋白的阻遏，毒素不被表达，并且抗
毒素蛋白在细胞中积累。然而，在不存在阿拉伯糖的情况下，tetr蛋白不被表达，并且毒素的表达被诱导。毒素开始在重组细菌细胞内积累。一旦细胞中毒素蛋白的量等于或大于抗毒素蛋白的量，重组细菌细胞就不再存活，并且重组细菌细胞将被毒素杀灭。
[0365]
在本公开的另一个实施方案中，重组细菌细胞还包含在p
arabad
启动子的控制下的抗毒素。在这种情况下，在阿拉伯糖的存在下，tetr和抗毒素被表达，抗毒素在细胞中积累，并且由于被tetr蛋白阻遏，毒素不被表达。然而，在不存在阿拉伯糖的情况下，tetr蛋白和抗毒素都不被表达，而毒素的表达被诱导。毒素开始在重组细菌细胞内积累。一旦毒素蛋白被表达，重组细菌细胞就不再存活，并且重组细菌细胞将被毒素杀灭。
[0366]
在本公开的另一个示例性实施方案中，本公开的工程化细菌包含具有至少以下序列的杀灭开关：与编码重组细菌细胞中未发现的(且为存活所必需的)必需多肽的异源基因可操作地连接的p
arabad
启动子以及与编码arac转录因子的异源基因可操作地连接的p
arac
启动子。在阿拉伯糖的存在下，arac转录因子激活p
arabad
启动子，所述启动子激活编码必需多肽的异源基因的转录，使得重组细菌细胞存活。然而，在不存在阿拉伯糖的情况下，arac抑制从p
arabad
启动子的转录，并且存活所必需的必需蛋白不被表达。在这种情况下，重组细菌细胞在不存在阿拉伯糖的情况下死亡。在一些实施方案中，与编码重组细菌细胞中未发现的必需多肽的异源基因可操作地连接的p
arabad
启动子序列可以与上文直接描述的tetr/毒素杀灭开关系统一起存在于细菌细胞中。在一些实施方案中，与编码重组细菌细胞中未发现的必需多肽的异源基因可操作地连接的p
arabad
启动子序列可以与上文直接描述的tetr/毒素/抗毒素杀灭开关系统一起存在于细菌细胞中。
[0367]
在又其他实施方案中，细菌可以包含质粒稳定系统，所述质粒稳定系统具有产生短寿命抗毒素和长寿命毒素的质粒。在这个系统中，细菌细胞产生等量的毒素和抗毒素来中和毒素。然而，如果/当细胞失去质粒时，短寿命的抗毒素开始衰变。当抗毒素完全衰变时，由于较长寿命的毒素杀灭细胞，细胞死亡。
[0368]
在一些实施方案中，本公开的工程化细菌(例如表达草酸分解代谢酶的细菌)还包含编码任何上述杀灭开关回路的组分的基因。
[0369]
在任一上述实施方案中，细菌毒素选自由以下组成的组：溶素、hok、fst、tisb、ldrd、kid、syme、mazf、flma、ibs、xcv2162、dinj、ccdb、mazf、pare、yafo、zeta、hicb、relb、yhav、yoeb、chpbk、hipa、小菌素b、小菌素b17、小菌素c、小菌素c7-c51、小菌素j25、小菌素colv、小菌素24、小菌素l、小菌素d93、小菌素l、小菌素e492、小菌素h47、小菌素i47、小菌素m、大肠菌素a、大肠菌素e1、大肠菌素k、大肠菌素n、大肠菌素u、大肠菌素b、大肠菌素ia、大肠菌素ib、大肠菌素5、大肠菌素10、大肠菌素s4、大肠菌素y、大肠菌素e2、大肠菌素e7、大肠菌素e8、大肠菌素e9、大肠菌素e3、大肠菌素e4、大肠菌素e6、大肠菌素e5、大肠菌素d、大肠菌素m和阴沟肠道菌素df13，或它们的生物活性片段。
[0370]
在任一上述实施方案中，抗毒素选自由以下组成的组：抗溶素、sok、rnaii、istr、rdld、kis、symr、maze、flmb、sib、ptarna1、yafq、ccda、maze、pard、yafn、epsilon、hica、rele、prlf、yefm、chpbi、hipb、mcce、mcce
ctd
、mccf、cai、imme1、cki、cni、cui、cbi、iia、imm、cfi、im10、csi、cyi、im2、im7、im8、im9、im3、im4、imme6、阴沟肠道菌素免疫蛋白(cim)、imme5、immd和cmi，或它们的生物活性片段。
[0371]
在一个实施方案中，细菌毒素对遗传工程化细菌具有杀菌性。在一个实施方案中，
细菌毒素对遗传工程化细菌具有抑菌性。
[0372]
在一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二重组细菌细胞，其中所述第二重组细菌细胞包含异源报告基因，所述异源报告基因与由外源环境条件直接或间接诱导的诱导型启动子可操作地连接。在一个实施方案中，异源报告基因是荧光基因。在一个实施方案中，荧光基因编码绿色荧光蛋白(gfp)。在另一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二重组细菌细胞，其中所述第二重组细菌细胞表达lacz报告子构建体，所述报告子构建体切割底物以产生可在尿液中检测到的小分子(参见例如，danio等人,science translational medicine,7(289):1-12,2015，所述文献的全部内容以引用的方式明确并入本文)。
[0373]
分离的质粒
[0374]
在其他实施方案中，本公开提供了分离的质粒，其包含与第一诱导型启动子可操作地连接的编码第一有效负载的第一核酸、以及与第二诱导型启动子可操作地连接的编码第二有效负载的第二核酸。在其他实施方案中，本公开提供了分离的质粒，其还包含与第三诱导型启动子可操作地连接的编码第三有效负载的第三核酸。在其他实施方案中，本公开提供了包含与诱导型启动子可操作地连接的编码四个、五个、六个或更多个有效负载的四个、五个、六个或更多个核酸的质粒。在这里描述的任何实施方案中，第一、第二、第三、第四、第五、第六等“有效负载”可以是草酸分解代谢酶、草酸盐转运蛋白或本文所述的其他序列。在一个实施方案中，编码第一有效负载的核酸和编码第二有效负载的核酸与第一诱导型启动子可操作地连接。在一个实施方案中，编码第一有效负载的核酸与第一诱导型启动子可操作地连接，并且编码第二有效负载的核酸与第二诱导型启动子可操作地连接。在一个实施方案中，第一诱导型启动子和第二诱导型启动子是同一诱导型启动子的独立拷贝。在另一个实施方案中，第一诱导型启动子和第二诱导型启动子是不同的诱导型启动子。在包含第三核酸的其他实施方案中，编码第三有效负载的核酸和编码第一和第二有效负载的核酸全部都与相同的诱导型启动子可操作地连接。在其他实施方案中，编码第一有效负载的核酸与第一诱导型启动子可操作地连接，编码第二有效负载的核酸与第二诱导型启动子可操作地连接，并且编码第三有效负载的核酸与第三诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，第一、第二和第三诱导型启动子是同一诱导型启动子的独立拷贝。在其他实施方案中，第一诱导型启动子、第二诱导型启动子和第三诱导型启动子是不同的诱导型启动子。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子和任选的第三启动子，或者第一启动子和第二启动子和任选的第三启动子各自被低氧或厌氧条件直接或间接诱导。在其他实施方案中，第一启动子、第二启动子和任选的第三启动子，或者第一启动子和第二启动子和任选的第三启动子各自是富马酸和硝酸还原调节剂(fnr)响应性启动子。在其他实施方案中，第一启动子、第二启动子和任选的第三启动子，或者第一启动子和第二启动子和任选的第三启动子各自是ros诱导调节区。在其他实施方案中，第一启动子、第二启动子和任选的第三启动子，或者第一启动子和第二启动子和任选的第三启动子各自是rns诱导调节区。
[0375]
在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的异源基因和/或基因盒与组成型启动子可操作地连接。在一个实施方案中，组成型启动子是lac启动子。在另一个实施方案中，组成型启动子是tet启动子。在另一个实施方案中，组成型启动子是组成型大肠埃希氏菌σ
32
启动子。在另一个实施方案中，组成型启动子是组成型大肠埃希氏菌σ
70
启动
子。在另一个实施方案中，组成型启动子是组成型枯草芽孢杆菌σa启动子。在另一个实施方案中，组成型启动子是组成型枯草芽孢杆菌σb启动子。在另一个实施方案中，组成型启动子是沙门氏菌启动子。在其他实施方案中，组成型启动子是噬菌体t7启动子。在其他实施方案中，组成型启动子是噬菌体sp6启动子。在任一上述实施方案中，质粒还包含编码草酸盐转运蛋白的异源基因和/或杀灭开关构建体，其可以与组成型启动子或诱导型启动子可操作地连接。
[0376]
在一些实施方案中，分离的质粒包含与第一诱导型启动子可操作地连接的至少一个异源草酸分解代谢酶基因、与p
arabad
启动子可操作地连接的编码tetr蛋白的异源基因、与p
arac
启动子可操作地连接的编码arac的异源基因、与组成型启动子可操作地连接的编码抗毒素的异源基因、以及与p
tetr
启动子可操作地连接的编码毒素的异源基因。在另一个实施方案中，分离的质粒包含与第一诱导型启动子可操作地连接的编码一种或多种草酸分解代谢酶的至少一个异源基因和/或基因盒；与p
arabad
启动子可操作地连接的编码tetr蛋白和抗毒素的异源基因、与p
arac
启动子可操作地连接的编码arac的异源基因、以及与p
tetr
启动子可操作地连接的编码毒素的异源基因。
[0377]
在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的第一核酸包含甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如，frc)基因。在一个实施方案中，frc基因来自产甲酸草酸杆菌。在一个实施方案中，frc基因与seq id no:1具有至少约90％的同一性。在另一个实施方案中，frc基因包含seq id no:1。在其他实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的第一核酸包含草酸辅酶a连接酶(例如scaae3)基因。在一个实施方案中，scaae3基因来自酿酒酵母。在一个实施方案中，scaae3基因与seq id no:3具有至少约90％的同一性。在另一个实施方案中，scaae3基因包含seq id no:3。在其他实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的第一核酸包含乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如，yfde)基因。在一个实施方案中，yfde基因来自大肠埃希氏菌。在一个实施方案中，yfde基因与seq id no:4具有至少约90％的同一性。在另一个实施方案中，yfde基因包含seq id no:4。
[0378]
在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的第一核酸包含草酰辅酶a脱羧酶(例如oxc)基因。在一些实施方案中，frc和/或scaae3和/或yfde基因与草酰辅酶a脱羧酶(例如oxc)基因共表达。在一个实施方案中，oxc基因来自产甲酸草酸杆菌。在一个实施方案中，oxc基因与seq id no:2具有至少约90％的同一性。在另一个实施方案中，oxc基因包含seq id no:2。
[0379]
在一些实施方案中，编码草酸盐转运蛋白的第二核酸包含oxlt。在一个实施方案中，oxlt转运蛋白来自产甲酸草酸杆菌。在另一个实施方案中，oxlt转运蛋白与seq id no:11具有至少约90％的同一性。在另一个实施方案中，oxlt转运蛋白包含seq id no:11。
[0380]
在一个实施方案中，质粒是高拷贝质粒。在另一个实施方案中，质粒是低拷贝质粒。
[0381]
在另一个方面，本公开提供了包含本文所述的分离质粒的重组细菌细胞。在另一个实施方案中，本公开提供了包含重组细菌细胞的药物组合物。
[0382]
在一个实施方案中，细菌细胞还包含编码草酸盐输出蛋白的内源基因中的遗传突变，其中所述遗传突变减少了草酸盐从细菌细胞的输出。
[0383]
在一个实施方案中，细菌细胞还包含编码草酸盐生物合成基因的内源基因中的遗
传突变，其中所述遗传突变减少细菌细胞中草酸盐的生物合成。
[0384]
组合
[0385]
在一些实施方案中，将细菌遗传工程化以包括多种作用机制(moa)，例如产生多个拷贝的相同产物(例如，以提高拷贝数)的回路或执行多种不同功能的回路。插入位点的实例包括但不限于male/k、insb/i、arac/bad、lacz、dapa和cea。例如，遗传工程化细菌可以包括四个拷贝的草酸分解代谢基因或草酸分解代谢基因盒，或者插入四个不同的插入位点(例如male/k、insb/i、arac/bad和lacz)中的四个拷贝的草酸分解代谢基因。可替代地，遗传工程化细菌可以包括插入一个或多个不同插入位点(例如，male/k、insb/i和lacz)的一个或多个拷贝的草酸分解代谢基因或基因盒、插入一个或多个不同插入位点(例如，dapa、cea和arac/bad)的一个或多个拷贝的草酸分解代谢基因或基因盒、和/或插入一个或多个不同插入位点的一个或多个拷贝的草酸分解代谢基因或基因盒。
[0386]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含以下中的一者或多者：(1)编码呈野生型或突变形式(用于增加稳定性或代谢活性)的本文所述的一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因和/或基因盒；(2)编码呈野生型或突变形式(用于增加稳定性或代谢活性)的用于摄取草酸盐的一种或多种转运蛋白(其在一些实施方案中与甲酸盐输出偶联)的一个或多个基因和/或基因盒；(3)编码呈野生型或突变形式(用于增加稳定性或代谢活性)的用于输出甲酸盐的一种或多种输出蛋白(其在一些实施方案中与草酸盐输入偶联)的一个或多个基因和/或基因盒；(4)编码呈野生型或突变形式(用于增加稳定性或代谢活性)的一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白(其在一些实施方案中与草酸盐输入偶联)的一个或多个基因和/或基因盒；(5)编码本文所述的用于分泌和胞外降解草酸盐的一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个基因或基因盒；(6)编码如本文所述的一种或多种分泌机制组分的一个或多个基因或基因盒；(7)一种或多种营养缺陷型，例如δthya；(8)编码一种或多种抗生素抗性(包括但不限于卡那霉素或氯霉素抗性)的一个或多个基因或基因盒；(9)增加细菌细胞中草酸盐的输入的一个或多个修饰；(10)增加甲酸盐从细菌细胞中输出的一个或多个修饰；(11)减少细菌细胞中甲酸盐的输入的一个或多个修饰；(12)减少草酸盐从细菌细胞的输出的一个或多个修饰；(13)内源性草酸盐合成途径的基因中的突变/缺失；(14)甲酸盐输出蛋白中的导致通过草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的流量增加和草酸盐输入增加的突变和/或缺失。
[0387]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含含有草酸分解代谢酶的两个或更多个不同的途径盒或操纵子。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列，所述一种或多种草酸分解代谢酶选自甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)，和/或乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)。
[0388]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包
含编码草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)和草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)和草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)和乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)和草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)和乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)和乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)和草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)和乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)和乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)和乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)和乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。
[0389]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌还包含一种或多种草酸盐转运蛋白和/或反向转运蛋白(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxlt)。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白
oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的
草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。
[0390]
在一些实施方案中，包含一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒以及一种或多种草酸盐转运蛋白的遗传工程化细菌编码甲酸盐输出蛋白，例如如本文所述。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒以及一种或多种草酸盐转运蛋白(其也作为甲酸盐输出蛋白起作用，例如本文所述的oxlt)。在一些实施方案中，甲酸盐输出和草酸盐输入是分开的。在一些实施方案中，包含一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒的遗传工程化细菌包含甲酸盐输出蛋白。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)以及例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)以及例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)以及例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的
scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酸盐转运蛋白(例如，来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)、甲酸盐输出蛋白(例如本文所述的)的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酸盐转运蛋白(例如，来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包
含编码乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因
盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含编码甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的frc)、草酰辅酶a合成酶(包括但不限于来自酿酒酵母的scaae3)、草酰辅酶a脱羧酶(包括但不限于来自产甲酸草酸杆菌的oxc)、乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(包括但不限于来自大肠埃希氏菌的yfde)、草酸盐转运蛋白(例如来自产甲酸草酸杆菌的草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白oxlt)和例如本文所述的甲酸盐输出蛋白的一个或多个草酸分解代谢基因或基因盒。
[0391]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌还包含一种或多种营养缺陷型(例如δthya)；编码一种或多种抗生素抗性(包括但不限于卡那霉素或氯霉素抗性)的一个或多个基因或基因盒；增加甲酸盐从细菌细胞输出的一个或多个修饰；减少细菌细胞中甲酸盐的输入的一个或多个修饰；如本文所述的基因(例如草酸盐输出蛋白)突变/缺失；内源性草酸盐合成途径基因的突变/缺失。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含含有草酸分解代谢酶的两个或更多个不同的途径盒或操纵子。在一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列直接与第一启动子可操作地连接。在另一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列直接与第一启动子可操作地连接。在一个实施方案中，启动子不与天然编码草酸分解代谢酶的至少一个基因可操作地连接。
[0392]
在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在组成型启动子的控制下表达。在另一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在诱导型启动子的控制下表达。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在由外源环境条件直接或间接诱导的启动子的控制下表达。在一个实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在启动子的控制下表达，所述启动子由低氧或厌氧条件直接或间接诱导，其中所述编码所述一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的表达在低氧或厌氧环境(诸如哺乳动物肠道环境)下被激活。在一些实施方案中，所述编码所述一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在由炎症条件直接或间接诱导的启动子的控制下表达。本文所述的示例性诱导型启动子包括氧水平依赖性启动子(例如，fnr诱导型启动子)、由炎症或炎症反应诱导的启动子(rns、ros启动子)和由由可能天然地存在于或可能不天然地存在于(例如，可以外源地添加到)肠道中的代谢物(例如阿拉伯糖和四环素)诱导的启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于fnr响应性启动子、p
arac
启动子、p
arabad
启动子、p
tetr
启动子和p
laci
启动子，它们各自在本文中有更详细的描述。诱导型启动子在下文中有更详细的描述。
[0393]
所述编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因可以存在于细菌细胞中的质粒或染色体上。在一个实施方案中，所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列位于细菌细胞中的质粒上。在另一个实施方案中，所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列位于细菌细胞的染色体中。在又另一个实施方案中，所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中，并且编码来自不同细菌物种的至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中，
所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的天然拷贝位于细菌细胞中的质粒上，并且编码来自不同细菌物种的至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因位于细菌细胞中的质粒上。在又另一个实施方案中，所述编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的天然拷贝位于细菌细胞的染色体中，并且编码来自不同细菌物种的至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因位于细菌细胞中的染色体中。
[0394]
在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在低拷贝质粒上表达。在一些实施方案中，编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列在高拷贝质粒上表达。在一些实施方案中，高拷贝质粒可以用于增加所述至少一种草酸分解代谢酶的表达，从而增加对草酸盐、草酸和/或草酰辅酶a的分解代谢。
[0395]
在一些实施方案中，与重组细菌相比，包含在高拷贝质粒上表达的编码至少一种草酸分解代谢酶的至少一个基因的本发明的重组细菌细胞不增加草酸分解代谢或降低草酸盐和/或草酸水平包含在低拷贝质粒上表达的相同基因的细胞，不存在草酸盐的异源输入者和草酸的天然输入者的额外拷贝。此外，在将草酸盐转运蛋白(输入蛋白)掺入重组细菌细胞中的一些实施方案中，联合使用包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的低拷贝质粒以便增强草酸分解代谢酶表达的稳定性，同时保持高草酸分解代谢并降低对转化细菌的阴性选择压力可能具有附加的优势。在替代性实施方案中，草酸盐输入蛋白与高拷贝质粒联合使用。
[0396]
在一些实施方案中，上述遗传工程化细菌还包含本文所述的内源基因中的一个或多个修饰、突变和/或缺失。
[0397]
宿主-质粒相互依赖性
[0398]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌还包含已经被修饰以产生宿主-质粒相互依赖性的质粒。在某些实施方案中，相互依赖的宿主-质粒平台是geneguard(wright等人,2015)。在一些实施方案中，geneguard质粒包含(i)条件性复制起点，其中必需的复制起始蛋白以反式提供；(ii)通过基因组易位被宿主拯救并且也与在丰富培养基中使用相容的营养缺陷型修饰；和/或(iii)编码广谱毒素的核酸序列。毒素基因可以通过使质粒dna本身对不表达抗毒素的菌株(例如，野生型细菌)不利来用于选择对抗质粒传播。在一些实施方案中，geneguard质粒在没有抗生素选择的情况下稳定至少100代。在一些实施方案中，geneguard质粒不破坏宿主的生长。geneguard质粒用于大大减少本文所述遗传工程化细菌中无意的质粒繁殖。
[0399]
相互依赖的宿主-质粒平台可以单独使用或与其他生物安全机制(诸如本文所述的那些(例如，杀灭开关、营养缺陷型))联合使用。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含geneguard质粒。在其他实施方案中，遗传工程化细菌包含geneguard质粒和/或一个或多个杀灭开关。在其他实施方案中，遗传工程化细菌包含geneguard质粒和/或一种或多种营养缺陷型。在又其他实施方案中，遗传工程化细菌包含geneguard质粒、一个或多个杀灭开关和/或一种或多种营养缺陷型。
[0400]
在一些实施方案中，载体包含条件性复制起点。在一些实施方案中，条件性复制起点是r6k或cole2-p9。在质粒包含条件性复制起点r6k的实施方案中，宿主细胞表达复制起始蛋白π。在质粒包含条件性复制起点cole2的实施方案中，宿主细胞表达复制起始蛋白repa。本领域技术人员可以理解，可以调节复制起始蛋白的表达，以便在宿主细胞中达到所
必需的蛋白质表达水平，从而控制质粒的复制。例如，在一些实施方案中，编码复制起始蛋白的基因的表达可以置于强、中或弱启动子的控制下，以调节所述蛋白质的表达。
[0401]
在一些实施方案中，载体包含编码补充宿主细胞营养缺陷型所必需的蛋白质的基因，所述营养缺陷型优选为丰富培养基相容的营养缺陷型。在一些实施方案中，宿主细胞是胸苷的营养缺陷型(δthya)，并且载体包含胸苷酸合酶(thya)基因。在一些实施方案中，宿主细胞是二氨基庚二酸的营养缺陷型(δdapa)，并且载体包含4-羟基-四氢吡啶二羧酸合酶(dapa)基因。本领域技术人员可以理解，可以调节编码补充宿主细胞营养缺陷型所必需的蛋白质的基因的表达，以便在宿主细胞中达到所必需的蛋白质表达水平。
[0402]
在一些实施方案中，载体包含毒素基因。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码抗毒素和/或表达抗毒素所必需的抗毒素基因。在一些实施方案中，毒素是zeta，而抗毒素是epsilon。在一些实施方案中，毒素是kid，而抗毒素是kis。在优选的实施方案中，毒素是抑菌的。本文所述的任何毒素/抗毒素对均可以用于本公开的载体系统。本领域技术人员可以理解，可以使用本领域已知的方法调节编码毒素的基因的表达，以防止毒素的表达水平对表达抗毒素的宿主细胞有害。例如，在一些实施方案中，编码毒素的基因可以由中启动子调节。在其他实施方案中，可以将编码毒素的基因克隆到所关注的核糖体结合位点附近，以将基因的表达调节到所需的水平(参见例如，wright等人(2015))。
[0403]
整合
[0404]
在一些实施方案中，可以在一个或多个整合位点处将本公开的任何基因或基因盒整合到细菌染色体中。可以将基因(例如，草酸分解代谢基因、草酸盐转运蛋白基因和/或草酸盐结合蛋白基因)或基因盒(例如，包含草酸分解代谢基因和/或草酸盐转运蛋白基因的基因盒)的一个或多个拷贝整合到细菌染色体中。将多个拷贝的基因或基因盒整合到染色体中允许更大量地产生有效负载，例如一种或多种草酸分解代谢酶和/或草酸盐转运蛋白基因和基因盒中的其他酶，并且还允许对表达水平进行微调。可替代地，除了治疗性基因或基因盒之外，可以在一个或多个不同的整合位点处将本文所述的不同回路(诸如任何杀灭开关回路)整合到细菌染色体中，以执行多种不同的功能。
[0405]
分泌
[0406]
在一些实施方案中，遗传工程化细菌还包含能够从细菌细胞质中分泌草酸分解代谢酶的天然分泌机制(例如革兰氏阳性菌)或非天然分泌机制(例如革兰氏阴性菌)。许多细菌已经进化出复杂的分泌系统来转运底物穿过细菌细胞包膜。底物(诸如小分子、蛋白质和dna)可以释放到细胞外空间或周质(诸如肠腔或其他空间)，注射到靶细胞中，或与细菌膜缔合。
[0407]
在革兰氏阴性菌中，分泌机制可能跨越内膜和外膜之一或两者。在一些实施方案中，遗传工程化细菌还包含非天然的双膜跨越分泌系统。双膜跨越分泌系统包括但不限于i型分泌系统(t1ss)、ii型分泌系统(t2ss)、iii型分泌系统(t3ss)、iv型分泌系统(t4ss)、vi型分泌系统(t6ss)和多药物外排泵的抗性小结分裂区(rnd)家族(pugsley1993；gerlach等人,2007；collinson等人,2015；costa等人,2015；reeves等人,2015；wo2014138324a1，以引用的方式并入本文)。具有革兰氏阴性样细胞包膜的分枝杆菌也可以编码vii型分泌系统(t7ss)(stanley等人,2003)。除了t2ss之外，双膜跨越分泌物通常将底物从细菌细胞质直接转运到细胞外空间或靶细胞中。相比之下，仅跨越外膜的t2ss和分泌系统可能使用两步
机制，其中底物首先通过内膜跨越转运蛋白移位到周质，然后转移到外膜或分泌到细胞外空间。外膜跨越分泌系统包括但不限于v型分泌或自体转运蛋白系统(t5ss)、curli分泌系统和用于菌毛装配的分子伴侣-引领蛋白途径(saier,2006；costa等人,2015)。
[0408]
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌还包含来自志贺氏菌属、沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、bivrio、伯克霍尔德菌属、耶尔森氏菌属、衣原体属或假单胞菌属的iii型或iii型样分泌系统(t3ss)。t3ss能够通过针复合体(needle complex)将蛋白质从细菌细胞质转运到宿主细胞质中。可以将t3ss修饰以从细菌细胞质中分泌所述分子，但不将所述分子注射到宿主细胞质中。因此，所述分子被分泌到肠腔或其他细胞外空间。在一些实施方案中，遗传工程化细菌包含所述经修饰的t3ss，并且能够从细菌细胞质中分泌草酸分解代谢酶。在一些实施方案中，所分泌的分子(诸如异源蛋白质或肽，例如草酸分解代谢酶)包含允许草酸分解代谢酶从细菌中分泌的iii型分泌序列。
[0409]
在一些实施方案中，将鞭毛iii型分泌途径用于分泌所关注的分子，例如草酸分解代谢酶。在一些实施方案中，通过将肽重组融合到天然鞭毛成分的n末端鞭毛分泌信号，将不完全鞭毛用于分泌所关注的治疗性肽。以这种方式，细胞内表达的嵌合肽可以被动员穿过内膜和外膜进入周围宿主环境中。
[0410]
在一些实施方案中，将v型自体转运蛋白分泌系统用于分泌所关注的分子，例如治疗性肽。由于机器的简单性和处理相对大的蛋白质流的能力，v型分泌系统对于重组蛋白的细胞外生产是有吸引力的。在一些实施方案中，可以将治疗性肽(star)融合到自体转运蛋白的n末端分泌信号、接头和β结构域上。n末端信号序列将蛋白质导向seca-yeg机制，所述机制将蛋白质移动穿过内膜进入周质中，接着是信号序列的随后切割。β结构域被募集到bam复合物(“β桶装配机器”)中，其中β结构域被折叠并作为β桶结构插入外膜中。治疗性肽穿过接头序列前面的β桶结构的中空孔。一旦暴露于细胞外环境，治疗性肽就可以通过自动催化切割(bam复合物的左侧)或通过将膜缔合的肽酶(黑剪刀；bam复合物的右侧)靶向到接头中的互补蛋白酶切割位点而离开接头系统。因此，在一些实施方案中，所分泌的分子(诸如异源蛋白质或肽，例如草酸分解代谢酶)包含n末端分泌信号、接头和自体转运蛋白的β结构域，以便允许所述分子从细菌中分泌。
[0411]
在一些实施方案中，将基于溶血素的分泌系统用于分泌所关注的分子，例如治疗性肽。i型分泌系统提供的优点是将它们的过客肽直接从细胞质移位到细胞外空间，避免了其他分泌类型的两步过程。尿致病性大肠埃希氏菌的α溶血素(hlya)由以下物质分泌：hlyb(一种atp结合盒转运蛋白)；hlyd(一种膜融合蛋白)；和tolc(一种外膜蛋白)。这三种蛋白质的装配形成一个通过内膜和外膜两者的通道。天然地，将该通道用于分泌hlya，然而，为了分泌本公开的治疗性肽，将hlya的含有分泌信号的c末端部分融合到治疗性肽(star)的c末端部分以介导该肽的分泌。
[0412]
在替代性实施方案中，遗传工程化细菌还包含非天然的单膜跨越分泌系统。单膜跨越转运蛋白可以充当分泌系统的组分，或者可以独立地输出底物。此类转运蛋白包括但不限于atp结合盒移位酶、鞭毛/毒力相关移位酶、缀合相关移位酶、普通分泌系统(例如，大肠埃希氏菌中的secyeg复合物)、分枝杆菌和几种类型的革兰氏阳性菌中的辅助分泌系统(例如，炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis)、约翰逊乳杆菌(lactobacillus johnsonii)、谷氨酸棒状杆菌、格氏链球菌(streptococcus gordonii)、金黄色葡萄球菌)和双精氨酸移
位(tat)系统(saier,2006；rigel和braunstein,2008；albiniak等人,2013)。已知普通分泌系统和tat系统都可以将具有可切割n末端信号肽的底物输出到周质中，并且已经在生物药物生产的背景下进行了探索。然而，tat系统可以提供特殊的优点，因为它能够转运折叠的底物，因此消除了过早或不正确折叠的可能性。在某些实施方案中，遗传工程化细菌包含tat或tat样系统，并且能够从细菌细胞质中分泌草酸分解代谢酶。本领域普通技术人员将会理解，本文公开的分泌系统可以被修饰以在不同的细菌物种、菌株和亚型中起作用，和/或适于递送不同的有效负载。
[0413]
为了将蛋白质(例如治疗性多肽)移位到细胞外空间，多肽必须首先在细胞内翻译，移动穿过内膜，最后移动穿过外膜。许多效应蛋白(例如治疗性多肽)(特别是真核来源的那些)含有二硫键来稳定三级和四级结构。虽然这些键能够在周质分子伴侣的帮助下在氧化周质区室中正确形成，但为了使多肽移位跨越外膜，二硫键必须被还原并且蛋白质再次展开。
[0414]
在革兰氏阴性菌中分泌正确折叠的蛋白质的一种方式(特别是需要二硫键的那些)是靶向具有不稳定外膜的细菌中的周质。以这种方式，蛋白质被动员到氧化环境中，并被允许正确折叠。与精心设计的细胞外分泌系统相反，蛋白质然后能够通过膜渗漏以正确折叠的形式逃离周质空间。因此，这些“渗漏的”革兰氏阴性突变体能够分泌具有生物活性的、正确二硫键合的多肽。在一些实施方案中，遗传工程化细菌具有“渗漏的”或去稳定的外膜。通过缺失或诱变负责将外膜栓系到刚性肽聚糖骨架上的基因(包括例如lpp、ompc、ompa、ompf、tola、tolb、pal、degs、degp和nlpl)，可以实现细菌外膜去稳定以诱导渗漏。lpp是以每个细胞约500,000个拷贝存在于细菌细胞中的最丰富的多肽，并且作为细菌细胞壁与肽聚糖的主要
‘
肘钉’起作用。(silhavy,t.j.,kahne,d.和walker,s.the bacterial cell envelope.cold spring harb perspect biol 2,a000414(2010))。tola-pal和ompa复合物的功能与lpp类似，并且是产生遗漏表型的其他缺失靶标。此外，当周质蛋白酶失活时，观察到渗漏表型。周质中非常密集地塞满了蛋白质，因此编码几种周质蛋白以促进蛋白质周转。去除周质蛋白酶诸如degs、degp或nlpi可以通过促进周质蛋白的过度积累而诱导渗漏表型。蛋白酶的突变也可以通过防止这些蛋白酶的靶向降解来保存效应多肽。此外，这些突变的组合可以协同增强细胞的渗漏表型，而不显著牺牲细胞存活力。因此，在一些实施方案中，工程化细菌具有一个或多个缺失或突变的膜基因。在一些实施方案中，工程化细菌具有缺失或突变的lpp基因。在一些实施方案中，工程化细菌具有一个或多个缺失或突变的基因，选自ompa、ompa和ompf基因。在一些实施方案中，工程化细菌具有一个或多个缺失或突变的基因，选自tola、tolb和pal基因。在一些实施方案中，工程化细菌具有一个或多个缺失或突变的周质蛋白酶基因。在一些实施方案中，工程化细菌具有一个或多个缺失或突变的周质蛋白酶基因，选自degs、degp和nlpl。在一些实施方案中，工程化细菌具有选自lpp、ompa、ompa、ompf、tola、tolb、pal、degs、degp和nlpl基因的一个或多个缺失或突变的基因。
[0415]
为了最小化对细胞存活力的干扰，可以通过将一个或多个膜或周质蛋白酶基因(例如选自lpp、ompa、ompa、ompf、tola、tolb、pal、degs、degp和nlpl)置于诱导型启动子的控制下来使渗漏表型可诱导。例如，在需要递送(分泌)治疗性多肽的条件下，可以阻遏lpp或其他细胞壁稳定性蛋白质或周质蛋白酶的表达。例如，在诱导条件下，转录阻遏蛋白或设计的反义rna可以被表达，其减少靶膜或周质蛋白酶基因的转录或翻译。相反，某些肽的过
表达可能导致不稳定的表型，例如大肠菌素或tola第三拓扑结构域的过表达，所述肽的过表达可以在需要递送(分泌)治疗性多肽的条件下被诱导。这些种类的策略可以将脆弱的、渗漏的表型与生物量生产分离开来。因此，在一些实施方案中，工程化细菌具有在诱导型启动子控制下的一个或多个膜和/或周质蛋白酶基因。
[0416]
下表列出了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的分泌系统。
[0417]
表12.革兰氏阳性菌的分泌系统
[0418][0419]
表13.革兰氏阴性菌的分泌系统
[0420]
negative bacteria possess many protein secretion-membrane insertion systems that apparently evolved independently”中有综述，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。
[0423]
在一些实施方案中，本文所述的一种或多种草酸分解代谢酶被分泌。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种草酸分解代谢酶被进一步修饰以改善分泌效率、降低对蛋白酶的敏感性、稳定性和/或半衰期。在一些实施方案中，甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如frc(来自产甲酸草酸杆菌))单独或与其他草酸分解代谢酶组合被分泌，所述其他草酸分解代谢酶例如草酰辅酶a合成酶(例如scaae3(来自酿酒酵母))和/或草酰辅酶a脱羧酶(例如oxc(来自产甲酸草酸杆菌))、和/或乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如yfde(来自大肠埃希氏菌))。在一些实施方案中，草酰辅酶a合成酶(例如scaae3(来自酿酒酵母))单独或与其他草酸分解代谢酶组合被分泌，所述其他草酸分解代谢酶例如甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如frc(来自产甲酸草酸杆菌))和/或草酰辅酶a脱羧酶(例如oxc(来自产甲酸草酸杆菌))、和/或乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如yfde(来自大肠埃希氏菌))。在一些实施方案中，草酰辅酶a脱羧酶(例如oxc(来自产甲酸草酸杆菌))单独或与其他草酸分解代谢酶组合被分泌，所述其他草酸分解代谢酶例如草酰辅酶a合成酶，例如scaae3(来自酿酒酵母)和/或甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶，例如frc(来自产甲酸草酸杆菌)和/或、和/或乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶，例如yfde(来自大肠埃希氏菌)。在一些实施方案中，乙酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如yfde(来自大肠埃希氏菌))单独或与其他草酸分解代谢酶组合被分泌，所述其他草酸分解代谢酶例如草酰辅酶a脱羧酶(例如oxc(来自产甲酸草酸杆菌))和/或草酰辅酶a合成酶(例如scaae3(来自酿酒酵母))和/或甲酰辅酶a:草酸辅酶a转移酶(例如frc(来自产甲酸草酸杆菌))。
[0424]
在一些实施方案中，一种或多种草酸分解代谢酶单独被分泌或以各种组合被分泌或与本文所述的其他草酸分解代谢酶组合被分泌，所述一种或多种草酸分解代谢酶选自丙氨酸乙醛酸转氨酶(agt，由agxt基因编码，例如人类形式)和/或乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶(grhpr，具有乙醛酸还原酶(gr)、羟基丙酮酸还原酶(hpr)和d-甘油酸脱氢酶(dgdh)活性的酶，例如人类形式)和/或4-羟基2-酮戊二酸醛缩酶(例如，在人体中由hoga1基因编码)。
[0425]
药物组合物和制剂
[0426]
包含本发明的遗传工程化微生物的药物组合物可以用于治疗、管理、改善和/或预防受试者中草酸盐有害的疾病或病症。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是导致每日尿草酸盐排泄超过40mg/24小时的病症。提供了本发明的药物组合物，其包含单独或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的一种或多种遗传工程化细菌和/或一种或多种遗传工程化病毒。
[0427]
在某些实施方案中，药物组合物包含一种细菌物种、菌株或亚型，所述细菌物种、菌株或亚型被工程化以包含一个或多个本文所述的遗传修饰，例如选自至少一种草酸分解代谢酶、草酸盐输入蛋白/转运蛋白和/或甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的表达、营养缺陷型、杀灭开关、敲除等。在替代性实施方案中，药物组合物包含两种或更多种细菌物种、菌株和/或亚型，它们各自被工程化以包含本文所述的遗传修饰，例如一种草酸分解代谢酶、草酸盐输入蛋白/转运蛋白和/或甲酸盐输出蛋白和/或草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白、营养缺陷型、杀灭开关、敲除等。
[0428]
本公开的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述生理学上可接受的载体包括赋形剂和助剂，它们有助于将活性成分加工成用于药物用途的组合物。配制药物组合物的方法是本领域已知的(参见例如，"remington's pharmaceutical sciences,"mack publishing co.,easton,pa)。在一些实施方案中，对药物组合物进行压片、冻干、直接压缩、常规混合、溶解、造粒、磨细、乳化、包封、包埋或喷雾干燥，以形成片剂、颗粒剂、纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊、微型片剂、丹剂或粉剂，它们可以是肠溶包衣的或未包衣的。合适的制剂取决于施用途径。
[0429]
遗传工程化微生物可以被配制为呈任何合适剂型(例如，用于口服施用的液体、胶囊、小药囊、硬胶囊、软胶囊、片剂、肠溶衣片剂、悬浮粉剂、颗粒剂或基质缓释制剂)和用于任何合适施用类型(例如，口服、局部、注射、静脉内、皮下、立即释放、脉冲释放、延迟释放或持续释放)的药物组合物。遗传工程化细菌的合适剂量范围可以为约104至10
12
个细菌。所述组合物可以每天、每周或每月施用一次或多次。可以在膳食之前、期间或之后施用组合物。在一个实施方案中，在受试者进食膳食之前施用药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物通常与膳食一起施用。在一个实施方案中，在受试者进食膳食之后施用药物组合物。
[0430]
遗传工程化细菌或遗传工程化病毒可以被配制成药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体、增稠剂、稀释剂、缓冲液、缓冲剂、表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质复合物、脂质体、渗透促进剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或药剂。例如，药物组合物可以包括但不限于添加碳酸氢钙、碳酸氢钠、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂(包括例如聚山梨醇酯20)。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化细菌可以配制在碳酸氢钠溶液(例如1摩尔碳酸氢钠溶液)中(例如，以缓冲酸性细胞环境，诸如胃)。可以将遗传工程化细菌以中性或盐的形式施用和配制。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与阳离子形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
[0431]
遗传工程化微生物可以静脉内施用，例如通过输注或注射。
[0432]
本公开的遗传工程化微生物可以鞘内施用。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化微生物可以口服施用。可以将本文公开的遗传工程化微生物局部施用并且配制成软膏、乳膏、透皮贴剂、洗剂、凝胶、香波、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳剂或本领域技术人员熟知的其他形式。参见例如，“remington's pharmaceutical sciences,”mack publishing co.,easton,pa.在一个实施方案中，对于不可喷雾的局部剂型，使用包含载体或一种或多种与局部应用相容的赋形剂并且具有大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于溶液、悬浮液、乳液、乳膏、软膏、粉剂、搽剂、油膏等，它们可以被灭菌或与辅助剂(例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲剂或盐)混合用于影响各种性质(例如渗透压)。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中与固体或液体惰性载体组合的活性成分被包装在与加压挥发物(例如，气体推进剂，诸如氟利昂)的混合物中或在挤压瓶中。也可以将保湿剂或湿润剂添加到药物组合物和剂型中。此类附加成分的实例是本领域熟知的。在一个实施方案中，包含本发明重组细菌的药物组合物可以被配制成卫生产品。例如，卫生产品可以是抗菌制剂或发酵产品(诸如发酵液)。卫生产品可以是例如洗发水、护发素、面霜、软膏、洗液和润唇膏。
[0433]
可以将本文公开的遗传工程化微生物口服施用并且配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。可以使用固体赋形剂制备用于口服使用的药物组合物，任选地研磨所得混合物并加工颗粒混合物，之后如果需要添加合适的助剂以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂包括但不限于填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素组合物，诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)或聚乙二醇(peg)。也可以添加崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐诸如海藻酸钠。
[0434]
片剂或胶囊可以通过常规手段与以下物质一起制备：药学上可接受的赋形剂，诸如粘合剂(例如，预凝胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、淀粉、树胶、高岭土和黄蓍胶)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，钙、铝、锌、硬脂酸、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、淀粉、苯甲酸钠、l-亮氨酸、硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，淀粉、马铃薯淀粉、淀粉羟乙酸钠、糖、纤维素衍生物、二氧化硅粉末)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。可以通过本领域熟知的方法对片剂进行包衣。可以存在包衣壳，并且常见的膜包括但不限于聚交酯、聚乙醇酸、聚酸酐、其他可生物降解的聚合物、海藻酸盐-聚赖氨酸-海藻酸盐(apa)、海藻酸盐-聚甲烯-共-胍-海藻酸盐(a-pmcg-a)、羟甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸甲酯(hema-mma)、多层hema-mma-maa、聚丙烯腈-氯乙烯(pan-pvc)、丙烯腈/甲代烯丙基磺酸钠(an-69)、聚乙二醇/聚五甲基环五硅氧烷/聚二甲基硅氧烷(peg/pd5/pdms)、聚n,n-二甲基丙烯酰胺(pdmaam)、含硅胶囊、硫酸纤维素/海藻酸钠/聚甲烯-共-胍(cs/a/pmcg)、醋酸邻苯二甲酸纤维素、海藻酸钙、k-角叉菜胶-刺槐豆胶凝胶珠、胶凝糖-黄原胶珠、聚(丙交酯-共-乙交酯)、角叉菜胶、淀粉聚酸酐、淀粉聚甲基丙烯酸酯、聚氨基酸和肠溶包衣聚合物。
[0435]
在一些实施方案中，将遗传工程化微生物进行肠溶包衣以释放到肠道或肠道的特定区域(例如大肠)中。从胃到结肠的典型ph范围为约1-4(胃)、5.5-6(十二指肠)、7.3-8.0(回肠)和5.5-6.5(结肠)。在一些疾病中，ph范围可能会改变。在一些实施方案中，包衣在特定的ph环境中降解，以便指定释放的部位。在一些实施方案中，使用至少两层包衣。在一些实施方案中，外部包衣和内部包衣在不同的ph水平下降解。
[0436]
在一些实施方案中，可以在一个或多个包衣层(例如，外部、内部和/或中间包衣层)中使用肠溶包衣材料。肠溶包衣聚合物在低ph下保持未离子化，因此保持不溶。但是随着胃肠道中ph的增加，酸性官能团能够离子化，并且聚合物膨胀或变得可溶于肠液中。
[0437]
用于肠溶包衣的材料包括醋酸邻苯二甲酸纤维素(cap)、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)、醋酸偏苯三酸纤维素(cat)、聚(醋酸邻苯二甲酸乙烯酯)(pvap)和邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(hpmcp)、脂肪酸、蜡、虫胶(紫胶桐酸的酯)、塑料和植物纤维。此外，还使用玉米蛋白、水玉米蛋白(不含醇的含水玉米蛋白制剂)、直链淀粉和淀粉衍生物以及糊精(例如麦芽糖糊精)。其他已知的肠溶包衣包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、醋酸邻苯二甲酸直链淀粉、醋酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯。
[0438]
包衣聚合物还可以包含以下中的一种或多种：邻苯二甲酸酯衍生物、cat、hpmcas、聚丙烯酸衍生物、包含丙烯酸和至少一种丙烯酸酯的共聚物、eudragit
tm s(聚(甲基丙烯
酸、甲基丙烯酸甲酯)1:2)；eudragit l100
tm s(聚(甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯)1:1)；eudragit l30d
tm
(聚(甲基丙烯酸、丙烯酸乙酯)1:1)；和(eudragit l100-55)(聚(甲基丙烯酸、丙烯酸乙酯)1:1)(eudragit
tm l是由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯合成的阴离子聚合物)、与丙烯酸和丙烯酸酯共聚物共混的聚甲基丙烯酸甲酯、海藻酸、海藻酸氨、海藻酸钠、钾、镁或钙、醋酸乙烯酯共聚物、聚醋酸乙烯酯30d(30％水中分散体)、包含聚(二甲基氨基乙基丙烯酸酯)的中性甲基丙烯酸酯(“eudragit e
tm”)、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸乙酯与甲基丙烯酸三甲铵乙基酯氯化物的共聚物、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸乙酯的共聚物、玉米蛋白、虫胶、树胶或多糖或它们的组合。
[0439]
包衣层也可以包括含有以下物质的聚合物：羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羟丙基乙基纤维素(hpec)、羟丙基纤维素(hpc)、羟丙基乙基纤维素(hpec)、羟甲基丙基纤维素(hmpc)、乙基羟乙基纤维素(ehec)(ethulose)、羟乙基甲基纤维素(hemc)、羟甲基乙基纤维素(hmec)、丙基羟乙基纤维素(phec)、甲基羟乙基纤维素(m h ec)、疏水改性的羟乙基纤维素(nexton)、羧甲基羟乙基纤维素(cmhec)、甲基纤维素、乙基纤维素、水溶性醋酸乙烯酯共聚物、树胶、多糖诸如海藻酸和海藻酸盐诸如海藻酸氨、海藻酸钠、海藻酸钾、碳水化合物的酸性邻苯二甲酸酯、醋酸邻苯二甲酸直链淀粉、醋酸邻苯二甲酸纤维素(cap)、邻苯二甲酸纤维素酯、邻苯二甲酸纤维素醚、邻苯二甲酸羟丙基纤维素(hpcp)、邻苯二甲酸羟丙基乙基纤维素(hpecp)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(hpmcp)、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(hpmcas)。
[0440]
用于口服施用的液体制剂可以采取溶液、糖浆、悬浮液或干燥产品的形式，用于在使用前用水或其他合适的媒介物复原。此类液体制剂可通过常规方式用药学上可接受的药剂制备，所述药学上可接受的药剂诸如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水媒介物(例如，扁桃仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；以及防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。所述制剂还可以包含适当的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服施用的制剂可以适当地配制用于缓慢释放、受控释放或持续释放本文所述的遗传工程化微生物。
[0441]
在一个实施方案中，可以将本公开的遗传工程化微生物配制成适合于向儿科受试者施用的组合物。如本领域熟知的，儿童在许多方面不同于成人，包括不同的胃排空率、ph、胃肠渗透性等(ivanovska等人,pediatrics,134(2):361-372,2014)。此外，儿科制剂接受性和偏好(诸如施用途径和味道属性)对于实现可接受的儿科依从性是至关重要的。因此，在一个实施方案中，适合于向儿科受试者施用的组合物可以包括易于吞咽或可溶解的剂型，或更可口的组合物，诸如添加了调味剂、甜味剂或味觉阻断剂的组合物。在一个实施方案中，适合于向儿科受试者施用的组合物也可以适合于向成人施用。
[0442]
在一个实施方案中，适合于向儿科受试者施用的组合物可以包括溶液、糖浆、悬浮液、酏剂、重构为悬浮液或溶液的粉剂、可分散/泡腾片、咀嚼片、橡皮糖、棒棒糖、冰棒、锭剂、口香糖、口腔薄带、口腔崩解片、小药囊、软明胶胶囊、喷洒口服粉剂或颗粒剂。在一个实施方案中，组合物是橡皮糖，其由明胶基料制成，赋予糖果弹性、所必需的耐嚼稠度和更长的保存期。在一些实施方案中，橡皮糖还可以包含甜味剂或调味剂。
[0443]
在一个实施方案中，适合于向儿科受试者施用的组合物可以包括调味剂。如本文所用，“调味剂”是为制剂提供独特味道和香味的物质(液体或固体)。调味剂也有助于改善
制剂的适口性。调味剂包括但不限于草莓、香草、柠檬、葡萄、泡泡糖和樱桃。
[0444]
在某些实施方案中，遗传工程化微生物可以例如与惰性稀释剂或可同化的可食用载体一起口服施用。所述化合物也可以被包封在硬或软壳明胶胶囊中，压制成片剂，或直接掺入受试者的饮食中。对于口服治疗性施用，可以将化合物与赋形剂混合，并以可摄取片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、晶片等形式使用。为了通过除肠胃外施用以外的方式施用化合物，可能需要用防止其失活的材料对化合物进行包衣，或者将化合物与防止其失活的材料共同施用。
[0445]
在另一个实施方案中，包含本发明重组细菌的药物组合物可以是可食用产品，例如食品。在一个实施方案中，食品是奶、浓缩奶、发酵奶(酸奶、酸乳、冷冻酸奶、乳酸菌发酵饮料)、奶粉、冰淇淋、奶油干酪、干干酪、豆浆、发酵豆浆、蔬果汁、果汁、运动饮料、糕饼、糖果、婴儿食品(诸如婴儿蛋糕)、营养食品、动物饲料或膳食补充剂。在一个实施方案中，食品是发酵食品，诸如发酵乳制品。在一个实施方案中，发酵乳制品是酸奶。在另一个实施方案中，发酵乳制品是奶酪、奶、奶油、冰淇淋、奶昔或酸乳酒。在另一个实施方案中，将本发明的重组细菌组合在含有旨在用作益生菌的其他活细菌细胞的制剂中。在另一个实施方案中，食品是饮料。在一个实施方案中，饮料是基于果汁的饮料或含有植物或草药提取物的饮料。在另一个实施方案中，食品是果冻或布丁。适合于施用本发明的重组细菌的其他食品是本领域熟知的。例如参见u.s.2015/0359894和us 2015/0238545，其各自的全部内容以引用的方式明确并入本文。在又另一个实施方案中，将本发明的药物组合物注射到食品中、喷雾到或喷洒到食品上，所述食品诸如面包、酸奶或奶酪。
[0446]
在一些实施方案中，所述组合物被配制成用于肠内施用、空肠内施用、十二指肠内施用、回肠内施用、胃分流施用或结肠内施用，通过肠溶包衣或未包衣的纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊或微型片剂施用。也可以将药物组合物配制成直肠组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂，使用例如常规栓剂基质，诸如可可脂或其他甘油酯。组合物可以是在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
[0447]
本文所述的遗传工程化微生物可以鼻内施用，配制成气溶胶形式、喷雾、薄雾或滴剂形式，并且使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)从加压包装或喷雾器中以气溶胶喷雾的形式方便地递送。可以通过提供阀门输送计量的量来确定加压气溶胶剂量单位。可以将用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如，明胶的)配制成含有化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
[0448]
遗传工程化微生物可以作为迟效制剂施用和配制。此类长效制剂可以通过植入或通过注射施用，包括静脉内注射、皮下注射、局部注射、直接注射或输注。例如，可以用合适的聚合物或疏水材料(例如，作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或作为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)来配制组合物。
[0449]
在一些实施方案中，本文公开了单一剂型的药学上可接受的组合物。单一剂型可以是液体或固体形式。单一剂型可以不经修饰直接施用于患者，或者可以在施用之前稀释或重构。在某些实施方案中，可以将单一剂型以推注形式施用，例如，单次注射、单次口服剂量，包括含有多个片剂、胶囊、丸剂等的口服剂量。在替代性实施方案中，单一剂型可以在一段时间内施用，例如通过输注。
[0450]
在一些实施方案中，本发明提供了药学上可接受的组合物，其不是食物或可食用
产品的形式或未掺入到食物或可食用产品中。
[0451]
药物组合物的单一剂型可以通过将药物组合物分成较小的等份、单剂量容器、单剂量液体形式或单剂量固体形式(诸如片剂、颗粒剂、纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊、微型片剂、丹剂或粉剂，它们可以是肠溶包衣的或未包衣的)来制备。固体形式的单剂量可以在向患者施用之前通过添加液体(通常是无菌水或盐水溶液)来重构。
[0452]
在其他实施方案中，组合物可以在受控释放或持续释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵来实现受控释放或持续释放。在另一个实施方案中，聚合材料可以用于实现本公开的疗法的受控或持续释放(参见例如美国专利号5,989,463)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(plg)、聚酸酐、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(pla)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)和聚原酸酯。用于持续释放制剂的聚合物可以是惰性的、不含可浸出杂质、储存稳定、无菌和可生物降解的。在一些实施方案中，可将受控或持续释放系统置于预防或治疗靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的技术。
[0453]
可以调整剂量方案以提供治疗反应。剂量可能取决于几个因素，包括疾病的严重程度和响应性、施用途径、疗程(几天到几个月到几年)和疾病缓解的时间。例如，可以一次施用单次推注，可以在预定的时间段内施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况所指示减少或增加剂量。剂量规格由活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果决定。剂量值可以随着待缓解的病状的类型和严重程度而变化。对于任何特定受试者，可以根据个人需要和治疗临床医生的专业判断随时间调整具体的剂量方案。本文提供的化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或动物模型中的标准药学程序来确定。例如，可以确定ld50、ed50、ec50和ic50，并且可以计算毒性与治疗效果之间的剂量比(ld50/ed50)作为治疗指数。可以使用表现出毒副作用的组合物，并仔细修改以使潜在的损害最小化，从而减少副作用。最初可以从细胞培养测定和动物模型来估计剂量。从体外和体内测定以及动物研究中获得的数据可以用于配制用于人类的剂量范围。
[0454]
在一个实施方案中，以约1x10
11
个活重组细菌、约2x10
11
个活重组细菌、约3x10
11
个活重组细菌、约4x10
11
个活重组细菌、约5x10
11
个活重组细菌、约6x10
11
个活重组细菌、约1x10
12
个活重组细菌或约2x10
12
个活重组细菌的剂量施用重组细菌。在一个实施方案中，重组细菌以约6x10
11
个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中，重组细菌以约1x10
11
个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中，施用为约5x10
11
个活重组细菌。在一个实施方案中，重组细菌以约1x10
12
个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中，重组细菌以约2x10
12
个活重组细菌的剂量施用。在一个实施方案中，施用是将约5x10
11
个活重组细菌与膳食一起每天施用三次。在一个实施方案中，以约6x10
11
个活重组细菌的剂量每天三次与膳食一起施用重组细菌。在一个实施方案中，以约1x10
11
个活重组细菌的剂量每天三次与膳食一起施用重组细菌。在一个实施方案中，以约1x10
12
个活重组细菌的剂量每天三次与膳食一起施用重组细菌。在一个实施方案中，以约2x10
12
个活重组细菌的剂量每天三次与膳食一起施用重组细菌。
[0455]
所述成分以单位剂型(例如，作为在指示活性剂的量的密封容器诸如安瓿或小药囊中的冻干粉末或无水浓缩物)分开或混合在一起提供。如果施用方式是通过注射，可以提
供一安瓿无菌注射用水或生理盐水，以便在施用之前将成分混合。
[0456]
可以将药物组合物包装在密封容器中，诸如指示药剂的量的安瓿或小药囊。在一个实施方案中，一种或多种药物组合物作为密封容器中的干燥无菌冻干粉末或无水浓缩物提供，并且可以被重构(例如，用水或生理盐水)至合适的浓度，用于向受试者施用。在一个实施方案中，一种或多种预防剂或治疗剂或药物组合物作为在密封容器中的干燥无菌冻干粉末提供，储存在2℃与8℃之间并在重构后1小时内、3小时内、5小时内、6小时内、12小时内、24小时内、48小时内、72小时内或一周内施用。冻干剂型中可以包含冷冻保护剂，主要是0-10％蔗糖(最佳为0.5％-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。其他合适的增积剂包括甘氨酸和精氨酸(其任一者的浓度可以为0-0.05％)，以及聚山梨醇酯80(最佳浓度为0.005％-0.01％)。附加表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和brij表面活性剂。可以将药物组合物制备成可注射溶液，并且还可以包含可用作佐剂的药剂，诸如用于增加吸收或分散的那些药剂，例如透明质酸酶。
[0457]
在一些实施方案中，考虑到有效递送和克服宿主抗病毒免疫反应的需要，制备了用于递送的遗传工程化病毒。逃避抗病毒反应的方法包括施用不同的病毒血清型作为治疗方案的一部分(血清型转换)、制剂(诸如聚合物包衣以掩盖病毒免受抗体识别)、以及使用细胞作为递送媒介物。
[0458]
在另一个实施方案中，可以在受控或持续释放系统中递送组合物。在一个实施方案中，可以使用泵来实现受控释放或持续释放。在另一个实施方案中，聚合材料可以用于实现本公开的疗法的受控或持续释放(参见例如美国专利号5,989,463)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(plg)、聚酸酐、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(pla)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)和聚原酸酯。用于持续释放制剂的聚合物可以是惰性的、不含可浸出杂质、储存稳定、无菌和可生物降解的。在一些实施方案中，可将受控或持续释放系统置于预防或治疗靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的技术。
[0459]
可以将本发明的遗传工程化细菌以中性或盐的形式施用和配制。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与阳离子形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
[0460]
体内方法
[0461]
可以在体内(例如，在动物模型中)评估本发明的重组细菌。可以使用草酸盐有害的疾病或病状的任何合适的动物模型。例如，可以使用如salido等人所述的phi的丙氨酸乙醛酸转氨酶缺陷型(agxt-/-)小鼠模型(参见例如，salido等人,proc.natl.acad.sci.103:18249-54(2006))。也可以使用phii的乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶敲除(grhpr-/-)小鼠模型(参见例如，knight等人,am.j.physiol.renal.physiol.302:f688-93(2012))。也可以使用发展为高草酸尿症的草酸盐转运蛋白slc26a6缺陷型小鼠(slc26a6-无效小鼠)(参见例如，jiang等人nature gen.38:474-8(2006))。
[0462]
可替代地，可以使用大鼠模型。例如，canales等人描述了roux-en-y胃旁路术(rygb)手术的大鼠模型，其中高脂肪喂养导致脂肪泻、高草酸尿症和低尿ph。正常脂肪和无
草酸盐饮食的rygb动物排泄的草酸盐是年龄匹配的假对照组的两倍；通过降低膳食脂肪和草酸盐含量，高草酸尿症是部分可逆的(canales等人,steatorrhea and hyperoxaluria occur after gastric bypass surgery in obese rats regardless of dietary fat or oxalate；j urol.2013年9月；190(3):1102
–
1109)。
[0463]
本发明的重组细菌细胞可以例如通过口服管饲法施用于动物，并且例如通过测量治疗之前和之后的草酸尿水平来确定治疗功效。可以将动物处死，并且可以收集和分析组织样品。
[0464]
下表14包括可以用于评估遗传工程化细菌的体内活性的附加大鼠模型。
[0465]
表14.草酸钙肾结石大鼠模型
[0466]
[0467][0468]
筛选方法
[0469]
在本发明的一些实施方案中，任何输入蛋白、输出蛋白、反向转运蛋白和草酸分解代谢酶的功效或活性都可以通过任何这些基因的突变来改善。定向突变和筛选的方法是本领域已知的。
[0470]
产生转运所关注代谢物的能力增强的细菌菌株
[0471]
由于它们易于培养，世代时间短，非常高的种群密度和小的基因组，微生物可以在较短的时间尺度内进化成独特的表型。适应性实验室进化(ale)是在选择性压力下传代微生物以进化出具有优选表型的菌株的过程。最常见地，这被应用于增加碳/能量来源的利用或使菌株适应环境应激(例如，温度、ph)，由此更能在碳底物上或在应激下生长的突变菌株将在群体中胜过适应性较差的菌株并将最终在群体中占优势。
[0472]
通过创造营养缺陷型，该相同的过程可以扩展到任何必需的代谢物。营养缺陷型是一种不能合成必需代谢物的菌株，因此必须在培养基中提供代谢物才能生长。在这种情景下，通过制造营养缺陷型并使其在代谢物量减少的情况下传代，所得的优势菌株应该更有能力获得并掺入这种必需代谢物。
[0473]
例如，如果用于产生所关注的代谢物的生物合成途径被破坏，可以通过ale进化出能够高亲和力捕获所关注的代谢物的菌株。首先，菌株在不同浓度的所关注的营养缺陷型代谢物中生长，直到建立支持生长的最小浓度。然后菌株在该浓度下传代，并定期稀释成较低浓度的所关注代谢物。随着时间的推移，(在生长限制浓度下)对所关注的代谢物最具竞争力的细胞将在群体中占优势。这些菌株可能将在其所关注的代谢物—转运蛋白中具有突变，导致输入必需和限制性所关注代谢物的能力增加。
[0474]
类似地，通过使用不能利用上游代谢物形成所关注的代谢物的营养缺陷型，可以进化出不仅可以更有效地输入上游代谢物，而且可以将代谢物转化为必需下游所关注的代谢物的菌株。这些菌株也将进化出突变以增加上游代谢物的输入，但也可能含有增加下游酶的表达或反应动力学或减少竞争性底物利用途径的突变。
[0475]
微生物固有的代谢物可以通过突变的营养缺陷型和通过施加内源代谢物生长限制补充进行选择而变得必需。然而，可以通过将非天然化合物的消耗与必需化合物的产生联系起来而进化出能够消耗非天然化合物的表型。例如，如果从不同的生物体中分离出能够产生必需化合物或必需化合物前体的基因，则该基因可以被重组引入并在异源宿主中表达。这种新的宿主菌株现在将具有从先前不可代谢的底物合成必需营养素的能力。
[0476]
因此，类似的ale方法可以通过以下方式来应用：产生不能转化直接下游代谢物的
营养缺陷型，并在生长限制量的非天然化合物中进行选择，同时表达重组酶。这将导致非天然底物的转运、异源酶的表达和活性以及下游天然酶的表达和活性的突变。应该强调的是，该过程中的关键要求是将非天然代谢物的消耗与生长必需的代谢物的产生联系起来的能力。
[0477]
一旦选择机制的基础被建立并确定了补充的最低水平，实际的ale实验就可以进行了。在整个该过程中，必须密切监测几个参数。重要的是将培养物保持在指数生长期，并且不允许达到饱和/稳定期。这意味着在每次传代期间必须检查生长速率，并相应地调整随后的稀释度。如果生长速率提高到稀释度变大的程度，那么应该降低营养缺陷型补充物的浓度，使得生长速率减慢，选择压力增加，并且稀释不至于严重到在传代期间严重偏倚亚群。此外，应该定期稀释细胞，使其在固体培养基上生长，并测试单个克隆以确认在ale培养物中观察到的生长速率表型。
[0478]
预测何时停止ale实验也需要警惕。由于指导进化的成功与整个实验中“所筛选”的突变数量直接相关，并且突变通常是dna复制期间的错误的函数，所以累积细胞分裂(ccd)充当了已筛选的总突变体的代表。以前的研究表明，在约10
11.2
个ccd1中可以分离出在不同碳源上生长的有益表型。可以通过向培养物中添加化学诱变剂(诸如n-甲基-n-硝基-n-亚硝基胍(ntg)，其导致dna复制错误增加)来加快这一速率。然而，当连续传代导致生长速率的边际改善或没有改善时，群体已经收敛到某个适合度最大值，并且ale实验可以停止。
[0479]
在ale实验结束时，应将细胞稀释，在固体培养基上分离并测定与培养瓶匹配的生长表型。然后从所选择的那些中的最佳表现者中制备基因组dna并送去进行全基因组测序。测序显示基因组周围发生的突变能够提供改善的表型，但也将包含沉默突变(不提供益处但不减损所需表型的那些突变)。在ntg或其他化学诱变剂的存在下进化的培养物中，将会有显著更多的沉默的背景突变。如果对在其当前状态下表现最佳的菌株感到满意，用户可以继续推进使用该菌株。否则，通过基因组工程化技术将突变重新引入亲本菌株中，可以从进化的菌株中去卷积起作用的突变。参见lee,d.-h.,feist,a.m.,barrett,c.l.和palsson,b.cumulative number of cell divisions as a meaningful timescale for adaptive laboratory evolution of escherichia coli.plos one 6,e26172(2011)。
[0480]
类似的方法可以用于产生消耗或输入草酸盐的大肠埃希氏菌尼斯勒突变体。
[0481]
治疗方法
[0482]
本发明的另一个方面提供了治疗受试者的草酸盐有害的病症或与受试者的草酸盐有害的病症相关的症状的方法。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是与草酸盐水平升高相关的病症。在一个实施方案中，与草酸盐水平升高相关的病症是其中每日尿草酸盐排泄为每24小时40mg或更高水平的病症。与草酸盐水平升高相关的病症包括phi、phii、phiii、继发性高草酸尿症、肠道高草酸尿症、饮食性高草酸尿症、特发性高草酸尿症、细菌过度生长综合征、克罗恩病、炎性肠病、肾移植后高草酸尿症、因肥胖进行空肠回肠旁路术后高草酸尿症、胃溃疡手术后高草酸尿症、慢性肠系膜缺血、胃旁路术、囊性纤维化、短肠综合征、胆道/胰腺疾病(例如慢性胰腺炎)、高草酸尿症伴肾功能相对保留的复发性肾结石以及高草酸尿症伴严重肾功能不全的复发性肾结石(例如，包括血液透析的患者)。在一个实
施方案中，草酸盐有害的病症是phi。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是phii。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是phiii。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是继发性高草酸尿症。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是饮食性高草酸尿症。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是特发性高草酸尿症。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是肠道高草酸尿症。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是细菌过度生长综合征。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是克罗恩病。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是炎性肠病。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是肾移植后的高草酸尿症。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是因肥胖进行空肠回肠旁路术后的高草酸尿症。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是胃溃疡手术后的高草酸尿症。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是慢性肠系膜缺血。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是胃旁路术。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是囊性纤维化。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是短肠综合征。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是胆道/胰腺疾病。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是慢性胰腺炎。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是高草酸尿症伴肾功能相对保留的复发性肾结石。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是高草酸尿症伴严重肾功能不全的复发性肾结石(例如，包括血液透析的患者)。
[0483]
本公开令人惊讶地证明了包含本文公开的重组细菌细胞的药物组合物可以用于治疗草酸盐有害的病症，诸如phi和phi。
[0484]
在一个实施方案中，患有phi的受试者在agxt基因中有突变。在另一个实施方案中，患有phii的受试者在grhpr基因中有突变。在一个实施方案中，患有phiii的受试者在hoga1基因中有突变。在另一个方面，本发明提供了通过向受试者施用包含本发明的细菌细胞的药物组合物来降低受试者的草酸盐和/或草酸的血浆水平，从而降低受试者的草酸盐和/或草酸的血浆水平的方法。在一个实施方案中，受试者患有草酸盐有害的疾病或病症。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是phi。
[0485]
在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是phii。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是phiii。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是继发性高草酸尿症。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是饮食性高草酸尿症。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是特发性高草酸尿症。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是肠道高草酸尿症。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是细菌过度生长综合征。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是克罗恩病。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是炎性肠病。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是肾移植后的高草酸尿症。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是因肥胖进行空肠回肠旁路术后的高草酸尿症。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是胃溃疡手术后的高草酸尿症。在一个实施方案中，草酸盐有害的病症是慢性肠系膜缺血。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是胃旁路术。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是囊性纤维化。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是短肠综合征。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是胆道/胰腺疾病。在另一个实施方案中，草酸盐有害的病症是慢性胰腺炎。
[0486]
在一些实施方案中，本公开提供了用于减少、改善或消除与这些疾病相关的一种或多种症状的方法，所述症状包括但不限于发热、呕吐、恶心、腹泻、肾结石、草酸盐沉着、骨病、促红细胞生成素难治性贫血、皮肤溃疡、手指坏疽、心律失常和心肌病。在一些实施方案
中，所述疾病继发于其他病状，例如肝病。
[0487]
在某些实施方案中，本文公开的细菌细胞能够分解代谢受试者体内的草酸盐和/或草酸，以治疗草酸盐有害的病症。在这些实施方案中，患有草酸盐有害的病症(例如phi或phii)的患者能够重新开始基本正常的饮食或比不含草酸盐或草酸盐含量非常低的饮食限制更少的饮食。在一些实施方案中，细菌细胞能够分解代谢来自额外来源(例如血液)的草酸盐和/或草酸，以治疗草酸盐有害的病症。
[0488]
在一些实施方案中，通过提供本文所述的遗传工程化细菌来抑制草酸盐的饮食摄取。在一些实施方案中，例如在哺乳动物中通过代谢途径产生的草酸盐减少。
[0489]
所述方法可以包括制备含有至少一种本文所述的遗传工程化细菌物种、菌株或亚型的药物组合物，并且将所述药物组合物以治疗有效量施用于受试者。在一些实施方案中，治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列的工程化细菌或其药物组合物。在一些实施方案中，治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用包含编码一种或多种草酸盐转运蛋白的基因序列的工程化细菌或其药物组合物。在一些实施方案中，治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用包含编码一种或多种甲酸盐输入蛋白的基因序列的工程化细菌或其药物组合物。在一些实施方案中，治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用包含编码一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白的基因序列的工程化细菌或其药物组合物。在一些实施方案中，治疗与草酸盐升高相关的疾病或病症的方法包括向有需要的受试者施用工程化细菌，所述工程化细菌包含编码一种或多种草酸分解代谢酶的基因序列和编码以下中的一种或多种的基因序列：(i)一种或多种草酸盐转运蛋白；(ii)一种或多种甲酸盐输出蛋白；(iii)一种或多种草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白；和(iv)它们组合或它们的药物组合物。在一些实施方案中，将本文公开的细菌细胞口服施用，例如在液体悬浮液中。在一些实施方案中，本文公开的细菌细胞在凝胶帽中冻干并口服施用。在一些实施方案中，本文公开的细菌细胞通过饲管或胃分流管施用。在一些实施方案中，本文公开的细菌细胞通过直肠(例如通过灌肠)施用。在一些实施方案中，将遗传工程化细菌局部、肠内、空肠内、十二指肠内、回肠内和/或结肠内施用。
[0490]
在某些实施方案中，施用本文所述的药物组合物是为了降低受试者的草酸盐和/或草酸水平。在一些实施方案中，本公开的方法将受试者的草酸盐和/或草酸水平降低至少约10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在另一个实施方案中，本发明的方法将受试者的草酸盐和/或草酸水平降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在另一个实施方案中，本发明的方法将受试者的每日尿草酸盐排泄减少至每24小时少于40mg。在一些实施方案中，通过比较施用药物组合物之前和之后受试者的草酸盐和/或草酸水平来测量减少。在一个实施方案中，受试者肠道中的草酸盐和/或草酸水平降低。在一个实施方案中，受试者尿液中的草酸盐和/或草酸水平降低。在另一个实施方案中，受试者血液中的草酸盐和/或草酸水平降低。在另一个实施方案中，受试者血浆中的草酸盐和/或草酸水平降低。在另一个实施方案中，受试者粪便中的草酸盐和/或草酸水平降低。在另一个实施方案中，受试者脑中的草酸盐和/或草酸水平降低。
[0491]
在一个实施方案中，施用本文所述的药物组合物是为了将受试者的草酸盐和/或
草酸水平降低至正常水平。在另一个实施方案中，施用本文所述的药物组合物是为了将受试者的草酸盐和/或草酸水平降低至正常水平以下。在另一个实施方案中，施用本文所述的药物组合物是为了将受试者的每日尿草酸盐排泄减少至每24小时少于40mg。
[0492]
在某些实施方案中，施用本文所述的药物组合物是为了降低受试者的草酸盐水平。在一些实施方案中，与未治疗的或对照受试者中的水平相比，本公开的方法将受试者的草酸盐水平降低至少约10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在另一个实施方案中，本公开的方法将受试者的草酸盐水平降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方案中，通过比较施用药物组合物之前和之后受试者的草酸盐水平来测量减少。在一个实施方案中，受试者肠道中的草酸盐水平降低。在另一个实施方案中，受试者血液中的草酸盐水平降低。在另一个实施方案中，受试者血浆中的草酸盐水平降低。在另一个实施方案中，受试者肝脏中的草酸盐水平降低。在另一个实施方案中，受试者肾脏中的草酸盐水平降低。
[0493]
在一个实施方案中，施用本文所述的药物组合物是为了将受试者的草酸盐降低至正常水平。
[0494]
在一些实施方案中，治疗草酸盐有害的病症(例如phi或phii)的方法允许病状或病症的一种或多种症状改善至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，治疗草酸盐有害的病症(例如phi或phii)的方法允许病状或病症的一种或多种症状改善至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
[0495]
在施用药物组合物之前、期间和之后，可以在生物样品中测量受试者的草酸盐和/或草酸水平，所述生物样品诸如血液、血清、血浆、尿、腹膜液、脑脊液、粪便、肠粘膜碎屑、从组织收集的样品和/或从以下中的一种或多种的内容物收集的样品|：胃、肾、肝、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠和肛管。在一些实施方案中，所述方法可以包括施用本文公开的组合物以降低草酸盐和/或草酸的水平。在一些实施方案中，所述方法可以包括施用本发明的组合物，以将受试者的草酸盐和/或草酸降低至不可检测的水平。在一些实施方案中，所述方法可以包括施用本发明的组合物以将草酸盐和/或草酸浓度降低至不可检测的水平，或降低至治疗前受试者的草酸盐和/或草酸水平的少于约1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
[0496]
在一些实施方案中，与在相同条件下的相同类型的未经修饰的细菌相比，本文公开的重组细菌细胞在外源环境条件下(诸如哺乳动物肠道的低氧环境下)产生草酸分解代谢酶，以将尿液、血液或血浆中的草酸盐和/或草酸水平降低至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。
[0497]
在一个实施方案中，本文公开的细菌将草酸盐的血浆水平降低至低于4mg/dl。在一个实施方案中，本文公开的细菌将草酸盐的血浆水平降低至低于3.9mg/dl。在一个实施方案中，本文公开的细菌将草酸盐的血浆水平降低至低于3.8mg/dl、3.7mg/dl、3.6mg/dl、3.5mg/dl、3.4mg/dl、3.3mg/dl、3.2mg/dl、3.1mg/dl、3.0mg/dl、2.9mg/dl、2.8mg/dl、2.7mg/dl、2.6mg/dl、2.5mg/dl、2.0mg/dl、1.75mg/dl、1.5mg/dl、1.0mg/dl或0.5mg/dl。
[0498]
在一个实施方案中，在施用本文公开的药物组合物之前，受试者的血浆水平为至少4mg/dl草酸盐。在另一个实施方案中，在施用本文公开的药物组合物之前，受试者的血浆
水平为至少4.1mg/dl、4.2mg/dl、4.3mg/dl、4.4mg/dl、4.5mg/dl、4.75mg/dl、5.0mg/dl、5.5mg/dl、6mg/dl、7mg/dl、8mg/dl、9mg/dl或10mg/dl。
[0499]
某些未经修饰的细菌不具有可估量水平的草酸盐或草酰辅酶a加工。在使用这些细菌的遗传修饰形式的实施方案中，草酸盐和/或草酰辅酶a的加工在外源环境条件下将是可估量的。
[0500]
草酸盐和/或草酸水平可以通过本领域已知的方法来测量。例如，可以使用ladwig等人所述的分光光度血浆草酸盐测定来测量血浆草酸盐水平(ladwig等人,clin.chem.51:2377-80(2005))。此外，可以例如通过使用草酸氧化酶比色酶测定来测量尿草酸盐水平(kasidas和rose,ann.clin.biochem.22:412-9(1985))。在一些实施方案中，通过本领域已知的方法测量草酸分解代谢酶(例如frc)的表达。在另一个实施方案中，通过本领域已知的方法测量草酸分解代谢酶的活性，以评估frc活性(参见上文的草酸分解代谢酶部分)。
[0501]
在某些实施方案中，重组细菌是大肠埃希氏菌尼斯勒。可以例如通过肠道或血液血清中的防御因子(sonnenborn等人,2009)或通过在施用后几小时或几天激活杀灭开关来破坏重组细菌。因此，可以将包含重组细菌的药物组合物以治疗有效剂量和频率重新施用。在替代性实施方案中，重组细菌在施用后数小时或数天内不会被破坏，并且可以在肠道中繁殖和定殖。
[0502]
在一个实施方案中，将本文公开的细菌细胞向受试者每天施用一次。在另一个实施方案中，将本文公开的细菌细胞向受试者每天施用两次。在另一个实施方案中，将本文公开的细菌细胞与膳食联合施用于受试者。在另一个实施方案中，在膳食之前将本文公开的细菌细胞施用于受试者。在另一个实施方案中，在膳食之后将本文公开的细菌细胞施用于受试者。在另一个实施方案中，本发明的细菌细胞不以食物或可食用产品的形式施用或者不被掺入食物或可食用产品中。可以根据症状的严重程度和疾病的进展来选择药物组合物的剂量和施用频率。治疗临床医生可以选择适当的治疗有效剂量和/或施用频率。
[0503]
本文公开的方法可以包括将本文公开的组合物单独施用或与一种或多种附加疗法(例如，吡多辛、柠檬酸盐、正磷酸盐和镁、口服钙补充剂和胆汁酸螯合剂)或低脂肪和/或低草酸盐饮食联合施用。在选择一种或多种附加治疗剂时，一个重要的考虑因素是所述治疗剂应该与本文公开的细菌相容，例如所述治疗剂必须不干扰或杀灭所述细菌。在一些实施方案中，将遗传工程化细菌与低脂肪和/或低草酸盐饮食联合施用。在一些实施方案中，施用遗传工程化细菌提供了增加的耐受性，使得患者可以消耗更多的草酸盐和/或脂肪。
[0504]
本文公开的方法还可以包括在施用本文公开的组合物之前从受试者中分离血浆样品，并且确定样品中的草酸盐和/或草酸水平。在一些实施方案中，本文公开的方法还可以包括在施用本文公开的组合物之后从受试者中分离血浆样品，并且确定所述样品中的草酸盐和/或草酸水平。
[0505]
本发明的方法还可以包括在施用本发明的组合物之前从受试者中分离尿液样品，并且确定所述样品中的草酸盐和/或草酸水平。在一些实施方案中，本发明的方法还可以包括在施用本发明的组合物之后从受试者中分离尿液样品，并且确定所述样品中的草酸盐和/或草酸水平。
[0506]
在一个实施方案中，本文公开的方法还包括将在向受试者施用本文公开的组合物之后的受试者血浆样品中的草酸盐和/或草酸水平与在向受试者施用本文公开的组合物之
前的受试者血浆样品中的草酸盐和/或草酸水平进行比较。在一个实施方案中，在施用本文公开的组合物之后受试者血浆样品中的草酸盐和/或草酸水平的降低表明血浆草酸盐和/或草酸水平降低，从而治疗了受试者中的草酸盐有害的病症。在一个实施方案中，与在施用药物组合物之前的样品中的血浆水平相比，在施用药物组合物之后的样品中的血浆草酸盐和/或草酸水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个实施方案中，与在施用药物组合物之前的样品中的血浆水平相比，在施用药物组合物之后的样品中的血浆草酸盐和/或草酸水平降低至少2倍、3倍、4倍或5倍。
[0507]
在一个实施方案中，本发明的方法还包括将在向受试者施用本发明的组合物之后的受试者尿液样品中的草酸盐和/或草酸水平与在向受试者施用本发明的组合物之前的受试者尿液样品中的草酸盐和/或草酸水平进行比较。在一个实施方案中，在施用本发明的组合物之后受试者尿液样品中的草酸盐和/或草酸水平的降低表明尿草酸盐和/或草酸水平降低，从而治疗了受试者中的草酸盐有害的病症。在一个实施方案中，与在施用药物组合物之前的样品中的血浆水平相比，在施用药物组合物之后的样品中的尿草酸盐和/或草酸水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个实施方案中，与在施用药物组合物之前的样品中的尿水平相比，在施用药物组合物之后的样品中的尿草酸盐和/或草酸水平降低至少2倍、3倍、4倍或5倍。
[0508]
在一个实施方案中，本文公开的方法还包括将在施用本文公开的组合物之后的受试者血浆样品中的草酸盐/草酸水平与对照草酸盐和/或草酸水平进行比较。
[0509]
在另一个实施方案中，本发明的方法还包括将在施用本发明的组合物之后的受试者尿液样品中的草酸盐/草酸水平与对照草酸盐和/或草酸水平进行比较。
[0510]
实施例
[0511]
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被理解为以任何方式进行限制。在整个本技术中引用的所有引用参考文献(包括文献参考文献、授权专利和公开的专利申请)的内容以引用的方式整体明确并入本文。还应该理解的是，其所有附图和表格的内容也以引用的方式明确并入本文。
[0512]
实施例1.遗传工程化大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株随着时间的推移降低草酸盐浓度。
[0513]
进行了体外和体内两种实验，证明大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株随着时间的推移降低草酸盐浓度。
[0514]
具体而言，如图1所示进行功能性体外测定。该测定的结果证明，与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株相比，遗传工程化大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株随着时间的推移降低了草酸盐浓度(参见图1)。
[0515]
还进行了动物体内实验。在第0天，将小鼠称重、标记并随机分成4组。从第1天开始，使用以下方案。
[0516]
第1天：
[0517]
t0：
[0518]-po给药100μl(100μg)的13c-草酸盐
[0519]-po给药200μl治疗
[0520]
t1：
[0521]-po给药300μl治疗
[0522]
t6：收集尿液、粪便
[0523]
以3.12e10 cfu的高剂量、1.04e10 cfu的中剂量和3.46e9 cfu的低剂量(总cfu)向动物给药。
[0524]
图2a中所描绘的结果证明，与野生型菌株相比，遗传工程化大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株降低了治疗小鼠的尿液中检测到的急性
13
c-草酸盐水平。
[0525]
图2b中所描绘的结果证明，与野生型菌株相比，遗传工程化大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株降低了治疗小鼠的尿液中检测到的慢性草酸盐水平。
[0526]
表15.包含由tet响应性启动子驱动的草酸盐分解代谢盒的构建体
[0527][0528]
表16列出了在lacz基因座处的染色体整合的oxlt的构建体。表16.包含由tet诱导型启动子驱动的oxlt(草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的构建体
[0529][0530]
表17.包含在fnr启动子的控制下的草酸盐分解代谢盒(pfnrs-scaae3-oxc-frc)的构建体
[0531][0532]
表18.包含在fnr启动子的控制下的oxlt(草酸盐:甲酸盐反向转运蛋白)的构建体
[0533][0534]
表19.由fnrs启动子驱动的草酸盐分解代谢盒(oxc-frc)
[0535][0536]
表20.由fnrs启动子驱动的草酸盐分解代谢盒(yfde-oxc-frc)
[0537][0538]
样品制备
[0539]
在水中制备10mg/ml的草酸储备液，并将其等分到1.5ml微量离心管(100μl)中并储存在-20℃下。在水中制备标准品(1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml和0.8μg/ml)。在冰上，在v形底96孔板中将20μl样品(和标准品)与180μl h2o混合以在最终溶液含有10μg/ml草酸-d2。用clearaseal片热密封板并充分混合。
[0540]
lc-ms/ms方法
[0541]
使用thermo tsq quantum max三重四极杆质谱仪通过液相色谱偶联串联质谱(lc-ms/ms)来测量草酸盐。表21、表22和表23提供了lc-ms/ms方法的总结。
[0542]
表21.
[0543][0544]
表22.hplc方法：
[0545]
时间(分钟)流速(μl/min)a％b％0.050010000.550010001.05005952.55005952.5150010002.755001000
[0546]
表23.串联质谱
[0547]
离子源hesi-ii极性阴性srm转换草酸盐：90.5/61.2srm转换草酸盐-d2：92.5/62.2
[0548]
表24.引物序列
[0549]
名称描述seq id nosr36第1轮：在pkd3上结合seq id no:47sr38第1轮：在pkd3上结合seq id no:48sr33第2轮：与第1轮pcr产物结合seq id no:49sr34第2轮：与第1轮pcr产物结合seq id no:50sr43第3轮：与第2轮pcr产物结合seq id no:51sr44第3轮：与第2轮pcr产物结合seq id no:52
[0550]
表25.pfnr1-lacz构建体序列
[0551]
描述seq id nopfnr1-lacz构建体的核苷酸序列，低拷贝seq id no:53
[0552]
表26.pfnr2-lacz构建体序列
[0553]
描述seq id nopfnr2-lacz构建体的核苷酸序列，低拷贝seq id no:54
[0554]
表27.pfnr3-lacz构建体序列
[0555]
描述seq id nopfnr3-lacz构建体的核苷酸序列，低拷贝seq id no:55
[0556]
表28.pfnr4-lacz构建体序列
[0557]
描述seq id no
pfnr4-lacz构建体的核苷酸序列，低拷贝seq id no:56
[0558]
表29.pfnrs-lacz构建体序列
[0559]
描述seq id nopfnrs-lacz构建体的核苷酸序列，低拷贝seq id no:57
[0560]
实施例2.其他所关注的序列
[0561]
表30.prpr丙酸盐响应性启动子序列
[0562]
描述seq id noprp启动子seq id no:58
[0563]
表31.野生型clba和clba敲除
[0564]
描述seq id no野生型clbaseq id no:59clba敲除seq id no:60
[0565]
实施例3.急性小鼠模型和健康猴子中的草酸盐浓度的降低
[0566]
当在胃肠道(gi)中过量吸收草酸盐时，会发生肠道高草酸尿症，这导致草酸盐在肾脏中积聚，并可能导致复发性肾结石和肾衰竭。已经表明减少胃肠道中的草酸盐在临床上有益于患者。然而，目前没有可用的疗法，并且仅在美国就有超过80,0000名重症患者。这些患者可能具有复发性肾结石和肾衰竭风险。
[0567]
如本文所证明的，工程化细菌菌株具有在胃、小肠和结肠中运作以降低血液中草酸盐吸收的巨大潜力(图3)。
[0568]
在急性小鼠模型和健康猴子中进行的体内实验证明，大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株随着时间的推移降低草酸盐浓度。具体而言，已经构建了三种工程化大肠埃希氏菌尼斯勒菌株(syn5752、syn7169和synb8802)。syn7169衍生自syn5752，唯一的区别是thya和噬菌体3ko(序列包括在表33中)。基因型如下所示。
[0569]
syn5752:ha910::fnr_oxlt，ha12::fnr_scaae3-oxcd-frc
[0570]
syn7169:ha910::fnr_oxlt，ha12::fnr_scaae3-oxcd-frc，thya::kanr，噬菌体3::camr
[0571]
syn7169和synb8802具有相同的遗传修饰，但是syn7169也具有氯霉素和卡那霉素抗性盒以帮助在选择性培养基上的分离。
[0572]
相关序列包括在上文所示的表格和表33中。
[0573]
synb8802(图4a)包括在厌氧诱导型启动子(pfnrs)和厌氧响应性转录激活因子fnr的调节控制下的编码源自产甲酸草酸杆菌的草酸盐反向转运蛋白(oxlt)的一个基因的插入、以及编码在厌氧诱导型启动子(pfnrs)和厌氧响应性转录激活因子fnr的调节控制下的三个基因(源自酿酒酵母的草酰辅酶a合成酶(scaae3)、源自产甲酸草酸杆菌的草酸盐脱羧酶(oxdc)和源自产甲酸草酸杆菌的甲酰辅酶a转移酶)的一个操纵子的插入、编码胸苷酸合酶的thya基因的缺失以创造胸苷营养缺陷型，并且内源性尼斯勒噬菌体已经失活。相关序列包括在本文的表格中。
[0574]
如上所述进行体外实验。来自该测定的结果证明，与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株相比，遗传工程化大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株(synb8802)随着时间的推移降低
了草酸盐浓度(参见图4b)。
[0575]
此外，与野生型大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株相比，遗传工程化大肠埃希氏菌尼斯勒细菌菌株(synb8802)随着时间的推移增加甲酸盐浓度(图4c)。大肠埃希氏菌尼斯勒(对照)和synb8802在摇瓶中生长，并且随后在厌氧室中被激活，接着在基于甘油的配方缓冲液中浓缩并冷冻在≤
–
65℃下。在含有10mm 13
c-草酸盐的测定培养基中，光密度＝5的活化细胞在37℃下静态孵育。在30和60分钟时取出上清液样品，以确定
13
c-草酸盐和
13
c-甲酸盐的浓度。通过液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)确定
13
c-草酸盐和
13
c-甲酸盐的浓度。
[0576]
体外胃肠道模拟(ivs)
[0577]
胃和结肠模拟肠液都能够在模拟的体外激活synhox(图5a)。当与模拟结肠液中的草酸盐消耗相比时，模拟的胃液激活synhox(syn5752)草酸盐消耗活性超过两倍之多(图5a)。
[0578]
为了表征工程化细菌菌株的存活力和代谢活性，并预测它们在体内的功能，设计了体外胃肠道模拟(ivs)模型来模拟人类胃肠道的关键方面，包括氧浓度、胃酶和胰酶以及胆汁。ivs模型由设计用于模拟胃、小肠和结肠条件的一系列96孔微量板形式的孵育构成。ivs模型的胃、小肠、结肠部分改编自minekus等人,2014。
[0579]
简而言之，细菌细胞的冷冻等分试样首先在室温下解冻，并以5.0
×
109个活细胞/ml重悬于0.077m碳酸氢钠缓冲液中。然后将该溶液与相等份的含有10mm草酸盐的模拟胃液(sgf；minekus等人,2014)混合，并且在coy微需氧室中于37℃下振荡孵育2小时。微需氧室内的气氛最初被校准为7％氧，并在2小时内逐渐降低至2％氧。sgf中的细胞密度为2.5x109个活细胞/ml。2小时后，将细胞然后以1:1的体积与模拟肠液(sif；minekus等人,2014)混合，并在coy微需氧室中在37℃下再振荡孵育2小时。sif中的细胞密度为1.25x109个活细胞/ml。2小时后，将细胞移入厌氧室中，并与基于sgf的结肠模拟培养基(csm；minekus等人,2014)1:6混合。csm具有附加的10mm草酸盐，并在37℃下孵育3小时。csm中的细胞密度为2.08x106个活细胞/ml。
[0580]
为了确定随着时间的推移的菌株活性，定期收集等分试样，并使用台式离心机以4000rpm离心5分钟。在质谱分析草酸盐浓度之前，收集无细胞上清液并储存在-80℃。
[0581]
体内小鼠模型研究
[0582]
对于体内小鼠研究，在第0天，将小鼠称重、标记并随机分成4组。从第1天开始，使用以下方案。
[0583]
第1天：
[0584]
t0：
[0585]-po给药100μl(100μg)
13
c-草酸盐
[0586]-po给药200μl治疗
[0587]
t1：
[0588]-po给药300μl治疗
[0589]
t6：收集尿液、粪便
[0590]
以3e10 cfu的高剂量、1e10 cfu的中剂量和3e9 cfu的低剂量(总cfu)向动物给药。
[0591]
如图5b所示，在急性同位素模型中，syn-5752菌株展现出在肠道中的尿草酸盐消
耗。已经在多次急性小鼠研究中测量了
13
c-草酸盐消耗，并且菌株功效的范围在50％-75％之间(图5b)。在该模型中，syn7169的行为类似于syn5752。
[0592]
在不同的实验中，c57bl/6j雄性小鼠被分组饲养并口服施用一定剂量的
13
c-草酸盐(100μg)，接着施用一定剂量的媒介物(13.8％w/v海藻糖、68mm tris、55mm hcl、1
×
pbs)或synb8802。将小鼠立即放入代谢笼中(n＝3只/笼)，并在第一个剂量后1小时接受另一个剂量的媒介物或synb8802，每天总计4.7x108个、4.7x109个或4.7x10
10
个活细胞。在剂量1后6小时收集尿液，并且通过液相色谱/串联质谱(lc-ms/ms)对
13
c-草酸盐和肌酐水平进行定量。进行了两项研究，并将结果合并(图5c)。
[0593]
体内猴子模型研究
[0594]
对于体内猴子研究，将动物随机分配到2个组中，媒介物(配方缓冲液)和syn7169(5e11个细胞)。每个组中n＝6。禁食过夜后，每只动物接受相同量的菠菜冰沙(spinach smoothie)、
13
c-2标记的草酸盐、碳酸氢钠(1m)和媒介物或菌株(参见表32)。通过以60gm:40ml的菠菜:水的比率将嫩菠菜叶子混合在自来水中直到光滑来制备菠菜冰沙。
[0595]
具体而言，在第1天通过口服管饲法向适当的动物施用治疗。在每个剂量施用之前，将加盖的细菌管倒置3次。使用与塑料注射器连接的一次性导管通过口服管饲法施用剂量制剂。给药后，用5ml动物饮用水冲洗管饲管到动物胃中。每只动物都用干净的管饲管给药。给药的第一天被指定为第1天。
[0596]
表32：实验设计
[0597][0598]
po给药6小时后收集尿液。将动物分开，并且在给药前插入干净的收集盘以帮助在室温下进行尿液收集。在给药后6小时结束时，测量并记录尿液总量。将1ml样品的一个等分试样收集在独特标记的透明聚丙烯管中，并立即在干冰上冷冻。将大约100ul的第二等分试样收集在96深孔板中，并立即在干冰上冷冻。
[0599]
使用thermo vanquish-tsq altis lc-ms/ms系统，通过液相色谱(lc)串联质谱(ms/ms)和分析物特异性裂解产物的选择性反应监测(srm)测量猴子或非人类灵长类动物(nhp)尿液中的草酸盐、
13
c2-草酸盐和肌酐。用含肌酐-d5的10mm乙酸铵将尿液稀释十倍，注射2ul，并使用waters acquity hss t3柱(2.1x 100mm)以0.4ul/min和在50℃下在两分钟内从0％b到95％b进行分离(a：10mm乙酸铵；b：乙腈)。srm离子跃迁如下：在电喷雾负离子模式下：草酸盐89》61，
13
c2-草酸盐91》62；在电喷雾阳性模式下：肌酐114》44，肌酐-d5 199》
49。使用绝对峰面积和在nhp尿中构建的基于基质的标准曲线计算草酸盐和
13
c2-草酸盐的样品浓度。使用肌酐/肌酐-d5峰面积比和基于水的标准曲线计算肌酐浓度。
[0600]
如图6所示，虽然菠菜冰沙增加了治疗猴子中的尿草酸盐水平，但工程化ecn(syn7169)显著减弱了尿草酸盐的这些增加。与媒介物相比，在5x10
10
、1x10
11
、5x10
11
或1x10
12
cfu下，syn7169剂量依赖性地将尿草酸盐的回收分别降低了45％、37％、45％和75％(参见图7a)。syn7169对
13
c-草酸盐的作用遵循相同的趋势(参见图7b)。总之，这些研究表明，syn7169在患有急性高草酸尿症的猴子中能够消耗草酸盐。
[0601]
在第二项研究中，12只雄性食蟹猴接受媒介物和synb8802两者。在研究的前一天晚上，动物禁食大约16-18小时。在实验的早晨，将每只猴子从其笼子中取出，并施用媒介物(水)或菠菜悬浮液(39g)、碳酸氢钠(1.8mmol)、
13
c-草酸盐(50mg)和媒介物(13.8％w/v海藻糖、68mm tris、55mm hcl、1
×
pbs)或synb8802(1x10
12
个活细胞)。然后将动物放回其笼子，并且在每个笼子的底部放置一个干净的尿液收集盘。在给药后6小时收集尿液，并通过液相色谱/串联质谱(lc-ms/ms)对草酸盐、
13
c-草酸盐和肌酐的水平进行定量(图7c)。
[0602]
粪便样品中的活synhox
[0603]
在向小鼠和非人灵长类动物(nhp)两者施用口服剂量后6小时和24小时，在粪便中回收了活的synhox。在两个时间点都回收了大量的活的synhox(syn7169)和synb8802。
[0604]
从小鼠粪便中回收了活的synb8802和野生型大肠埃希氏菌，并且在摄入后72小时内的多个时间点是存活的(图8a)。synb8802在24小时后从粪便中清除，而野生型菌株在摄入后72小时清除。简而言之，c57bl/6j小鼠被分组饲养，并且基于平均笼体重被分配到各个组(n＝16)。小鼠接受单次口服剂量的治疗(1.3x10
10
cfu)，并通过自由捕获收集新鲜粪便，并置于含有500ml pbs的预先称重的beadbug管中，称重，然后处理以进行系列稀释铺板，以在收集后立即确定活的菌落形成单位(cfu)。将数据表示为平均细菌菌株粪便回收
±
平均值的标准误差。cfu＝集落形成单位，synb8802*＝抗生素抗性synb8802。
[0605]
在一项单独的实验中，十二只雄性猴子在研究前一天晚上禁食。在研究的早晨，将每只猴子从其笼子中取出，并施用菠菜悬浮液、碳酸氢钠、
13
c-草酸盐和制剂缓冲液或细菌。给药后6小时和24小时收集粪便，并记录总重量。将粪便样品用磷酸盐缓冲盐水(pbs；10倍样品重量)进行同质化，并记录所添加的缓冲液的最终体积。粪便样品悬浮液在pbs中进行系列稀释，并铺板在选择性lb琼脂培养基上，以计数syn7169或synb8802菌落形成单位(cfu)(图8b)。
[0606]
实施例4：制剂和人类治疗
[0607]
如图9-10中所示，分别测试了sybnb8802和syn7169冻干制剂相对于冷冻液体制剂的草酸盐消耗。将雄性食蟹猴(大约2-5岁，并且平均体重3.3kg)禁食过夜。食蟹猴(n＝12)接受了含有大约400mg草酸盐(包括标记的
13
c-草酸盐)的菠菜制剂。一个组接受synb8802冷冻液的5x 10
11
个活细胞(n＝6)，并且另一个组接受synb8802冻干物质的5x 10
11
个活细胞(n＝6)。收集尿液持续6小时，并且通过液相色谱/质谱测量累积的尿草酸盐和肌酐水平。在下面表33中公开了上文公开的nhp“菠菜冰沙”模型中所测试的菌株和量。活细胞确定至少如标题为“通过活细胞计数技术对遗传工程化微生物进行计数(enumeration of genetically engineered microorganisms by live cell counting techniques)”的pct国际申请号pct/us2020/030468中所描述进行计算，所述申请的全部内容以引用的方式明
确并入本文。
[0608]
表33.
[0609][0610][0611]
如图11a中所示，模型预测synb8802在目标剂量范围内具有实现20％-50％尿草酸盐降低的潜力。建模包括在模拟条件下在不同肠道区室内的菌株活性评估、已知的饮食草酸盐消耗水平、胃肠道的草酸盐吸收水平和尿草酸盐排泄。因此，在一个实施方案中，synb8802的剂量为5x10
11
个细胞。在一个实施方案中，synb8802的剂量为2x10
11
个细胞。在一个实施方案中，synb8802的剂量为1x10
11
个细胞。
[0612]
计算机模拟(iss)将体外菌株活性知识与宿主和疾病生物学联系起来。菌株侧模型模拟了胃肠道生理学中synb8802对草酸盐的消耗(图11b)。宿主侧模型(整体示意图)模拟了synb8802的消耗对草酸盐在全身分布的影响(图11b)。所述模型假设synb8802与膳食一起给药，并预测肠道草酸盐的消耗及其在血液中的吸收的减少。iss预测，在剂量大于1x10
11
个细胞下，synb8802具有使患者的尿草酸盐降低大于20％的潜力。
[0613]
iss预测尿草酸盐的剂量依赖性降低(图11c)。将数据呈现为hox患者的饮食草酸盐吸收增加的基线假设(4x健康吸收)；有界区域代表假设的范围(3x-5x健康吸收)。
[0614]
实施例5：临床试验
[0615]
临床试验第i部分被设计成在健康志愿者(hv)的住院、双盲、随机化、安慰剂对照的多剂量递增(mad)研究中测试synb8802。synb8802将以多个递增剂量(例如1x10
11
个细胞、3x10
11
个细胞和1x10
12
个细胞，优选地以6x10
11
个细胞和2x10
12
个细胞的剂量，或安慰剂)施用。synb8802的剂量优选地将不超过2x10
12
个细胞。将每天三次(tid)施用剂量，持续5天。在四天前，将施用多个递增剂量以达到最终剂量浓度。第i部分中的可选群组将包括以根据每天施用三次持续5天所测试的第一群组的数据确定的剂量接受synb8802的健康志愿者。
[0616]
临床试验第ii部分被设计成在患有肠道高草酸尿症的患者的门诊、双盲(主办方开放)、随机化、安慰剂对照的交叉研究中测试synb8802。为了确定第1期的基线uox水平，将在研究药物产品(imp)首次剂量的7天内收集3天的24小时尿液样品(图12)。将imp以1x10
11
、3x10
11
或1x10
12
且不超过2x10
12
的剂量tid施用。受试者将服用质子泵抑制剂(ppi；埃索美拉唑)，在他们选择的膳食前60-90分钟每天一次，从每个周期的第一个imp剂量前四天开始，直到每个周期的最后一个imp剂量。受试者将在第1天随机化以接受第1部分中确定的最大耐受剂量(mtd)或以下的synb8802或者安慰剂，然后在第1-6天与膳食一起每天三次(tid)进行给药。四天前，将施用多个递增剂量以达到最终剂量浓度。将在第4-6天收集用于确定24小时草酸盐水平的尿液样品。在至少2周且不超过4周的清除期后，受试者将交叉并开始第二个周期。为了确定第2期的基线uox水平，将在第2期imp的首次剂量的7天内收集3天的24小时尿液样品。然后，受试者将交叉给药synb8802或安慰剂，持续6天。将在第2期的第四天、第五天和第六天再次收集24小时草酸盐水平的尿液样品。最后一个剂量的imp后7天将进行安全性随访(或远程医疗)。受试者将在最后一次剂量的imp后的4周内每周收集粪便样品。
[0617]
[0618][0619]
主要结果量度为治疗突发不良事件的受试者的数量。将根据美国国家癌症研究所不良事件通用术语(national cancer institute common terminology for adverse event，ctcae0，版本5.0)对毒性进行分级。从签署知情同意书的时间到安全性随访期结束，根据临床实验室测试、生命体征、身体检查、心电图和其他医学指征评估报告不良事件(ae)。如果在第一个剂量的研究治疗之后发生或严重程度恶化，则ae被视为治疗突发事件(teae)。如果与研究药物的关系可能相关、很可能相关或肯定相关，则teae被认为是治疗相关的。
[0620]
资格标准
[0621]
第i部分：纳入标准
[0622]
1.年龄≥18岁至≤64岁。
[0623]
2.身体质量指数(bmi)为18.5至28kg/m2。
[0624]
3.能够并愿意自愿完成知情同意程序。
[0625]
4.可用于并同意所有研究程序，包括粪便、尿液和血液采集以及遵守饮食控制、住院监测、随访就诊和依从所有研究程序。
[0626]
5.禁欲或手术绝育(输精管结扎术)的男性受试者，或在知情同意后、在整个研究过程中和在最后一个剂量的imp后至少3个月内与女性伴侣有性活动并同意使用可接受的避孕方法(诸如含杀精剂的避孕套)结合其非怀孕女性伴侣可接受的避孕方法(如纳入标准#6所定义)的男性受试者，以及在从筛查直至施用研究药物产品后3个月的时期内不打算捐献精子的男性受试者。
[0627]
6.符合以下中的1项的女性受试者：
[0628]
a.具有生育能力的妇女(wocbp)必须在筛查时和在开始imp前的基线时具有阴性妊娠试验(人绒毛膜促性腺激素)，并且必须同意
[0629]
在知情同意后、在整个研究过程中和在最后一个剂量的imp后至少3个月内使用一种或多种可接受的避孕方法，结合其男性伴侣可接受的避孕方法(如纳入标准#5所定义)。可接受的避孕方法包括激素避孕、激素或非激素宫内节育器、双侧输卵管阻塞、完全禁欲、手术后3个月有记录的无精子症的输精管结扎伴侣、含杀精剂的隔膜、含杀精剂的宫颈帽、含杀精剂的阴道海绵或含或不含杀精剂的男性或女性避孕套。
[0630]
b.有以下中的至少1项的绝经前妇女：
[0631]
i.有记录的子宫切除术ii.有记录的双侧输卵管切除术iii.有记录的双侧卵巢切除术iv.有记录的输卵管结扎/阻塞v.禁欲是受试者的首选或惯常生活方式
[0632]
c.绝经后妇女(通过促卵泡激素[fsh]评估证实且年龄在45岁以上无其他生物学或生理学原因的12个月或以上的闭经)。
[0633]
第i部分：排除标准
[0634]
1.可能增加与研究参与相关的受试者风险，损害对研究程序和要求的遵守或者可能混淆研究安全性或pd结果的解释并且根据研究者的判断会使受试者不适合入组的急性或慢性医学(包括covid-19感染)、手术、精神病学或社会病状或实验室异常。
[0635]
2.身体质量指数(bmi)《18.5或》28kg/m2。
[0636]
3.产甲酸草酸杆菌携带者。
[0637]
4.怀孕(自己或伴侣)或哺乳期。
[0638]
5.不能或不愿意在研究持续期间停止维生素c补充。
[0639]
6.免疫缺陷病症的病史或现状，包括自身免疫性病症和人类免疫缺陷病毒(hiv)抗体阳性。
[0640]
7.乙型肝炎表面抗原阳性(不排除乙型肝炎表面抗体阳性和乙型肝炎核心抗体阳性的受试者，前提是乙型肝炎表面抗原呈阴性)。
[0641]
8.丙型肝炎抗体阳性，除非进行丙型肝炎病毒核糖核酸检测并且结果呈阴性。
[0642]
9.在预期的第一个剂量的imp之前30天内，有发热性疾、确诊的菌血症或研究者认为具有临床意义的其他活动性感染的病史。
[0643]
10.(过去一个月内)每天稀便3次或以上的病史；其中“稀便”在布里斯托尔粪便图表(bristol stool chart)上被定义为6型或7型(参见附录1：布里斯托尔粪便图表)。
[0644]
11.肾结石、肾脏或胰腺疾病史。
[0645]
12.可能与uox水平升高相关的胃肠道病症(包括任何级别的炎症性或过敏性肠病以及手术切除肠段)。
[0646]
13.通过一种或多种住院相关事件证实的在筛查访视前60天内有胃肠道出血的活动史或既往史或呕血或便血的医学史
[0647]
14.对一般ecn、埃索美拉唑或ppi或在synb8802或安慰剂制剂中的任一种成分的不耐受或过敏反应。
[0648]
15.可能潜在影响药物或营养素吸收的任何病状(例如，乳糜泻、胃切除术、旁路手术、回肠造口术)、处方药或非处方药品。
[0649]
16.在第1天之前的30天内直到住院监测的最后一天，当前正在服用或计划服用任何类型的全身性(例如口服或静脉内)抗生素。例外：允许使用局部抗生素。
[0650]
17.筛查前的过去3个月内的重大手术(在颅、胸、腹或盆腔内的器官上的手术)或住院期。
[0651]
18.在筛查和最后一次预期就诊之间可能需要抗生素的计划的手术、住院、牙科工作或介入研究。
[0652]
19.在第-1天之前的30天内以及在参与和随访期间服用或计划服用益生菌补充剂(不包括强化营养食品)。
[0653]
20.酒精依赖或药物滥用。
[0654]
21.在筛查访视前30天或5个半衰期(以较长者为准)内施用或摄入研究药物；或当前正在入组一项调查研究。
[0655]
22.筛查实验室参数(例如，化学参数、血液学、凝血)和ecg，它们超出基于标准范围的正常限值或如下表所定义或被研究者判定为
[0656]
具有临床意义。单次重复评价是可接受的。
[0657]
第ii部分：纳入标准
[0658]
1.年龄≥18岁至≤74岁。
[0659]
2.能够并愿意自愿完成知情同意程序。
[0660]
3.可用于并同意所有研究程序，包括粪便、尿液和血液采集以及遵守饮食控制、随访就诊和依从所有研究程序。
[0661]
4.继发于roux-en-y减肥手术的肠道高草酸尿症(术后至少12个月)。
[0662]
5.尿草酸盐≥70mg/24小时(筛查期间收集至少2次尿液的平均值)。
[0663]
6.禁欲或手术绝育(输精管结扎术)的男性受试者，或在知情同意后、在整个研究过程中和在最后一个剂量的imp后至少3个月内与女性伴侣有性活动并同意使用可接受的避孕方法(诸如含杀精剂的避孕套)结合其非怀孕女性伴侣可接受的避孕方法(如纳入标准#7所定义)的男性受试者，以及在从筛查直至施用研究药物产品后3个月的时期内不打算捐献精子的男性受试者。
[0664]
7.符合以下中的1项的女性受试者：
[0665]
a.具有生育能力的妇女(wocbp)必须在筛查时和在开始imp前的基线时具有阴性妊娠试验(人绒毛膜促性腺激素)，并且必须同意在知情同意后、在整个研究过程中和在最后一个剂量的imp后至少3个月内使用可接受的避孕方法，结合其男性伴侣可接受的避孕方法(如纳入标准#6所定义)可接受的避孕方法包括激素避孕、激素或非激素宫内节育器、双侧输卵管阻塞、完全禁欲、手术后3个月有记录的无精子症的输精管结扎伴侣、含杀精剂的隔膜、含杀精剂的宫颈帽、含杀精剂的阴道海绵或含或不含杀精剂的男性或女性避孕套。
[0666]
b.有以下中的至少1项的绝经前妇女：
[0667]
i.有记录的子宫切除术ii.有记录的双侧输卵管切除术iii.有记录的双侧卵巢切除术iv.有记录的输卵管结扎/阻塞v.禁欲是受试者的首选或惯常生活方式
[0668]
c.绝经后妇女(通过fsh评估证实且年龄在45岁以上无其他生物学或生理学原因的12个月或以上的闭经)。
[0669]
8.筛查实验室评价(例如，化学参数、全血细胞计数和分类、凝血酶原时间[pt]/激活部分促凝血酶原激酶时间[aptt]、尿液分析)和心电图(ecg)必须在正常限值内，或者被研究者判定为无临床意义。
[0670]
第ii部分：排除标准
[0671]
1.可能增加与研究参与相关的受试者风险，损害对研究程序和要求的遵守或者可能混淆研究安全性或pd结果的解释并且根据研究者的判断会使受试者不适合入组的急性或慢性医学(包括covid-19感染)、手术、精神病学或社会病状或实验室异常。
[0672]
2.急性肾衰竭或egfr《45ml/min/1.73m2。单次重复评价是可接受的。
[0673]
3.不能或不愿意在研究持续期间停止维生素c补充。
[0674]
4.原发性高草酸尿症或任何其他原因的高草酸尿症的诊断。
[0675]
5.产甲酸草酸杆菌携带者。
[0676]
6.怀孕(自己或伴侣)或哺乳期。
[0677]
7.在第1天之前的30天内直到最终安全性评估，当前正在服用或计划服用任何类型的全身性(例如口服或静脉内)抗生素。例外：允许使用局部抗生素。
[0678]
8.筛查前的过去3个月内的重大手术(在颅、胸、腹或盆腔内的器官上的手术)或住院期。
[0679]
9.在筛查和最后一次预期就诊之间计划的手术、住院、牙科工作或介入研究。
[0680]
10.在第-1天之前的30天内以及在参与期间服用或计划服用益生菌补充剂(不包括强化营养食品)。
[0681]
11.对一般ecn、埃索美拉唑或ppi或在synb8802或安慰剂制剂中的任何成分的不耐受或过敏反应。
[0682]
12.酒精依赖或药物滥用。
[0683]
13.免疫缺陷病症的病史或现状，包括自身免疫性病症和hiv抗体阳性。
[0684]
14.乙型肝炎表面抗原阳性(不排除乙型肝炎表面抗体阳性和乙型肝炎核心抗体阳性的受试者，前提是乙型肝炎表面抗原呈阴性)。
[0685]
15.丙型肝炎抗体阳性，除非进行丙型肝炎病毒核糖核酸测试并且结果呈阴性。
[0686]
16.在筛查访视前30天或5个半衰期(以较长者为准)内施用或摄入研究药物；或当前正在入组一项调查研究。
[0687]
17.在预期第一个剂量的imp前30天内的菌血症史。
[0688]
18.炎性肠病的病史。
[0689]
表34.与syn7169和synb8802相关的其他序列
[0690][0691]
等效方案
[0692]
本领域技术人员仅仅使用常规试验将认识到或者能够确定本文所述的具体实施方案和方法的很多等效方案。此类等效方案旨在被以下权利要求的范围所涵盖。
再多了解一些
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