与小麦条锈病抗性QTLQYr.sicau-6B紧密连锁的分子标记及应用

与小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b紧密连锁的分子标记及应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种与小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b紧密连锁的分子标记kasp-txk-6及应用。


背景技术：

2.小麦(triticum aestivum l.)是世界上重要的粮食作物之一，超过40％的人口以小麦作为主食原料。小麦不管是在农业生产部分还是食品加工领域都占有及其重要的地位，是最主要的粮食作物之一。小麦条锈病是由条锈菌(puccinia striiformis westend.f.sp.tritici eriks)引起的一种毁灭性的病害，其发生较为普遍且比较严重。条锈病是由真菌引起的一种病害，危害主要分为三个阶段，分别为侵染、扩展和发病阶段，它可以随着空气进行远距离的传播，小麦感染条锈病后，叶片会逐渐变黄、变黑，从而降低光合作用，使产量下降。小麦条锈病涉及的范围极其广泛，具有传播范围广、爆发性强和危害性大等显著特点。因此，研究小麦条锈病抗性的遗传机制，对提高小麦产量具有重要意义。
3.迄今为止，在小麦中报道了81个正式命名的和许多临时命名的条锈病抗性基因(yr)和数量性状位点(qtl)。其中，yr5、yr7、yr10、yr15、yr18、yr36、yr46和yrsp已被克隆和鉴定。除了一些仍具有抗性的基因，如yr5、yr15、yr18、yr30、yr32、yr36、yr39、yr46、yr52-yr54、yr59、yr61、yr62、yr65和yr69，其他许多基因包括yr1-yr4、yr6-yr10、yr17、yr20-yr22、yr24-yr29和yr43已经对中国目前流行或正在出现的条锈病病原小种失去了抗性(krattinger s,lagudah e,spielmeyer w,et al.a putative abc transporter confers durable resistance to multiple fungal pathogens in wheat[j].science,2009,323:1360-1363；liu w,frick m,huel r,et al.the stripe rust resistance gene yr10encodes an evolutionary-conserved and unique cc
–
nbs
–
lrr sequence in wheat[j].molecular plant,2014,7:1740-1755；moore j,herrera-foessel s,lan c,et al.arecently evolved hexose transporter variant confers resistance to multiple pathogens in wheat[j].nature genetics,2015,47:1494.)。所以，使用不同的小麦品种研究并筛选得到更多的抗条锈病基因对小麦抗病育种起到了极其关键的作用。
[0004]
小麦材料n2496相对于小麦品种川农16(国审品种)具有抗条锈、寡分蘖、多穗粒数等特性。同时，小麦品种川农16的条锈病抗性现如今显著低于n2496。因此，利用n2496和川农16构建遗传研究群体，进一步验证小麦n2496的条锈病抗性，定位控制高抗条锈病的基因，寻找紧密连锁的分子标记，促进条锈病抗性基因的图位克隆，同时为小麦高抗条锈病材料的创制及高产育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将提高小麦条锈病抗性预测的准确性，提高育种效率，加速实现增加小麦单产的目标。
[0005]
分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr)，可在广泛的基因组dna样
品中，对snp和特定位点上的indel进行精准的双等位基因检测。这种检测方法具有操作简便、特异性好、高通量、快速、检测成本低、结果准确等优势，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。因此，筛选出与条锈病抗性qtl紧密连锁的，且适用于荧光定量pcr平台kasp技术的分子标记，不仅能对小麦条锈病抗性基因进行选择，有效调控小麦抗病性，塑造合理的抗病群体，同时提高了选择通量、速度和准确性，解决了大规模推广应用的技术瓶颈，对规模化改良小麦育种群体质量和产量具有重要意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种与小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b紧密连锁的分子标记，并且提供所述分子标记在小麦育种中的应用。
[0007]
第一方面，本发明提供一种与小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b紧密连锁的分子标记kasp-txk-6，所述分子标记kasp-txk-6的核苷酸序列如seq id no.1所示，(5
’‑
agacacagtcatataacctgacagncatagttatgtagcctggcagacatagtc-3’；其中，n为a或g。)在所核苷酸述序列的第25位碱基多态性为a或g，该多态性与小麦条锈病抗性相关。
[0008]
本发明提供的分子标记kasp-txk-6与小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b共定位于小麦6b染色体上标记kasp-txk-10～kasp-txk-6区段内，所述分子标记kasp-txk-6位于小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b置信区间上。
[0009]
具体地，所述小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b能显著提高小麦条锈病抗性，lod值大于3，解释17.00％的表型变异。
[0010]
更具体地，分子标记kasp-txk-6的单碱基差异位点为a，对应小麦条锈病抗性强；分子标记kasp-txk-6的单碱基差异位点为g，对应小麦条锈病抗性弱。
[0011]
在本发明中，小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b及分子标记kasp-txk-6是通过以下方法获得的：
[0012]
(1)利用高抗小麦条锈病的小麦n2496作为母本，以小麦川农16为父本杂交，得到杂种f1，f1代单株自交获得f2，采用单粒传法获得含有123个株系的f7代ril群体构成遗传群体。
[0013]
(2)小麦成熟期田间鉴定所述f7群体植株的条锈病抗病等级。
[0014]
(3)用rna提取试剂盒提取极端抗感材料rna，用bsr-seq技术定位小麦条锈病抗性基因目标区段，获得小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b位点染色体目标区段。
[0015]
(4)用ctab法提取所述的遗传群体的各株系的dna，用已公布的ssr标记和开发的kasp标记以亲本n2496和川农16的dna为模板，进行基因分型，获得所述ril群体的基因型资料。亲本n2496的带型记为a，亲本川农16的带型记为b。f7群体株系带型来源于n2496的记为a，来源于川农16的记为b。
[0016]
(5)利用joinmap4.0作图软件将获得的所述ril群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件mapqtl6.0的区间作图法(interval mapping)，并结合f7群体条锈病抗性表型数据将小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b定位于6b染色体上kasp-txk-10～kasp-txk-6的区段内，kasp-txk-6标记与小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b紧密连锁。
[0017]
(6)将目标区段内snp位点转换为荧光定量pcr引物，用于后续筛选。利用
polymarker网站设计荧光定量pcr引物4对(表1)。荧光定量pcr引物设计标准：扩增引物长度18～30bp，扩增产物长度45-70bp，退火温度57-62℃，gc含量在40％～60％之间。
[0018]
合成引物序列为：
[0019]
正向引物1：f探针 扩增引物序列
[0020]
正向引物2：h探针 扩增引物序列
[0021]
反向引物：扩增引物序列
[0022]
f探针：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3’(可结合fam荧光基团)；h探针：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3’(可结合hex荧光基团)。
[0023]
表1 4对kasp引物序列及扩增片段长度
[0024][0025]
(7)竞争性等位基因特异性pcr(kasp)分析
[0026]
a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的4对引物，以亲本n2496和川农16的dna为模板，进行pcr扩增，共获得1对效果良好的分子标记引物，命名为kasp-txk-6-1/2/3(核苷酸序列分别如seq id no.2-4所示)。扩增产物为具有多态性的分子标记kasp-txk-6，核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0027]
b)f7群体的kasp分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记kasp-txk-6的pcr引物，扩增亲本n2496、川农16和f7群体植株的dna，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本n2496的类型记为a，扩增片段大小长54bp，单碱基差异位点为a。亲本川农16的类型记为b，扩增片段长54bp，单碱基差异位点为g。f7群体株系类型来源于n2496的记为a，来源于川农16的记为b。
[0028]
第二方面，本发明还提供用于扩增上述分子标记kasp-txk-6的特异性引物组。
[0029]
本发明提供的特异性引物组包括序列如seq id no.2-4所示的引物。
[0030]
在本发明提供的特异性引物组中，seq id no.2与seq id no.3所示的引物的5’端分别连有不同的荧光探针。
[0031]
本领域技术人员可以基于kasp检测平台技术设计用于扩增分子标记kasp-txk-6的引物，优选地，所述特异性引物对包括序列如seq id no.2-4所示的引物。其中，seq id no.2与seq id no.3所示的引物的5’端分别连有不同的荧光探针。
[0032]
kasp-txk-6-1:5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctagacacagtcatataacctgacaga
[0033]-3’；(seq id no.2)
[0034]
kasp-txk-6-2:5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctagacacagtcatataacctgacagg
[0035]-3’；(seq id no.3)kasp-txk-6-3:5
’‑
gactatgtctgccaggctaca
[0036]-3’；(seq id no.4)
[0037]
并且，引物kasp-txk-6-1和kasp-txk-6-2的5’端分别连有不同的荧光探针；
[0038]
所述荧光探针的序列如下：
[0039]
f探针：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3’(seq id no.5)，本发明的实施例中该探针结合fam荧光基团。
[0040]
h探针：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3’(seq id no.6)本发明的实施例中该探针结合hex荧光基团。
[0041]
根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护，分子标记kasp-txk-6或上述特异性引物的如下任一种应用：
[0042]
(1)在鉴定小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b中的应用；
[0043]
(2)在筛选或鉴定高抗条锈病的小麦品种中的应用；
[0044]
(3)在小麦分子标记辅助育种中的应用；
[0045]
(4)在小麦种质资源改良中的应用。
[0046]
第三方面，本发明提供一种鉴定小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b的方法以待测小麦的基因组dna为模板，采用上述的特异性引物组进行荧光定量pcr扩增，根据pcr扩增结果对待测小麦进行基因分型。
[0047]
优选地，所述荧光定量pcr扩增的反应体系：2
×
kasp mastermix 5μl，kasp assay mix 0.14μl，模板dna 50ng、dnase/rnase-free去离子水加至总量为10μl；其中，kasp assay mix中含有引物的核苷酸序列如seq id no.2-4所示，三条引物体积比为2:2:5。
[0048]
本发明的实施例中，荧光定量pcr程序：95℃活化15min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环30次；37℃60s，采集荧光信号。
[0049]
本发明提供的鉴定小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b方法的判断标准为：含有小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b的小麦品种均出现与seq id no.2所示引物连接的荧光探针相同的荧光信号，而不含有小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b的小麦品种均出现与seq id no.2所示引物连接的荧光探针明显不同的荧光信号
[0050]
本发明的有益效果在于：
[0051]
本发明首次公开了来自小麦n2496的条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b，位于小麦6b染色体，显著提高了小麦条锈病抗性。该qtl在小麦产量(调控条锈病抗性)育种中具有较高
的利用价值。本发明首次公开了基于荧光定量pcr平台精确检测小麦n2496新条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b的分子标记kasp-txk-6，检测准确高效、扩增方便稳定。本发明公开的分子标记kasp-txk-6与条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b显著相关，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦高抗条锈病品种的选择鉴定效率，且成功率高。
附图说明
[0052]
图1为本发明小麦n2496条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b在6b染色体上的位置及与分子标记kasp-txk-6之间的连锁遗传图谱。
[0053]
图2为本发明实施例2中利用荧光定量pcr引物对n2496、川农16、川麦107三叶期的叶片dna做基因型分型的结果。
[0054]
图3为本发明实施例2中n2496
×
川麦107的f7 ril群体后代利用荧光定量pcr引物进行基因型分型的结果。
具体实施方式
[0055]
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0056]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0057]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0058]
实施例1小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b及分子标记kasp-txk-6的获得
[0059]
在本发明中，小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b及分子标记kasp-txk-6是通过以下方法获得的：
[0060]
(1)利用高抗小麦条锈病的小麦n2496作为母本，以小麦川农16为父本杂交，得到杂种f1，f1代单株自交获得f2，采用单粒传法获得含有123个株系的f7代ril群体构成遗传群体。
[0061]
(2)小麦成熟期田间鉴定所述f7群体植株的条锈病抗病等级。
[0062]
(3)用rna提取试剂盒提取极端抗感材料rna，用bsr-seq技术定位小麦条锈病抗性基因目标区段，获得小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b位点染色体目标区段。
[0063]
(4)用ctab法提取所述的遗传群体的各株系的dna，用已公布的ssr标记和开发的kasp标记以亲本n2496和川农16的dna为模板，进行基因分型，获得所述ril群体的基因型资料。亲本n2496的带型记为a，亲本川农16的带型记为b。f7群体株系带型来源于n2496的记为a，来源于川农16的记为b。
[0064]
(5)利用joinmap4.0作图软件将获得的所述ril群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件mapqtl6.0的区间作图法(interval mapping)，并结合f7群体条锈病抗性表型数据将小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b定位于6b染色体上kasp-txk-10～kasp-txk-6的区段内，kasp-txk-6标记与小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b紧密连锁。
[0065]
(6)将目标区段内snp位点转换为荧光定量pcr引物，用于后续筛选。利用polymarker网站设计荧光定量pcr引物4对(表1)。荧光定量pcr引物设计标准：扩增引物长
度18～30bp，扩增产物长度45-70bp，退火温度57-62℃，gc含量在40％～60％之间。
[0066]
合成引物序列为：
[0067]
正向引物1：f探针 扩增引物序列
[0068]
正向引物2：h探针 扩增引物序列
[0069]
反向引物：扩增引物序列
[0070]
f探针：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3’(可结合fam荧光基团)
[0071]
h探针：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3’(可结合hex荧光基团)
[0072]
(7)竞争性等位基因特异性pcr(kasp)分析
[0073]
a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的4对引物，以亲本n2496和川农16的dna为模板，进行pcr扩增，共获得1对效果良好的分子标记引物，命名为kasp-txk-6-1/2/3(核苷酸序列分别如seq id no.2-4所示)。扩增产物为具有多态性的分子标记kasp-txk-6，核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0074]
b)f7群体的kasp分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记kasp-txk-6的pcr引物，扩增亲本n2496、川农16和f7群体植株的dna，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本n2496的类型记为a，扩增片段大小长54bp，单碱基差异位点为a。亲本川农16的类型记为b，扩增片段长54bp，单碱基差异位点为g。f7群体株系类型来源于n2496的记为a，来源于川农16的记为b。
[0075]
c)利用软件mapqtl6.0的区间作图法(interval mapping)，并结合f7群体条锈病抗性表型数据，发现分子标记kasp-txk-6与条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b位点紧密连锁，结果如图1所示。由图1可知，条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b定位在标记kasp-txk-10和kasp-txk-6之间的1.31cm的区段上，而分子标记kasp-txk-6与条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b紧密连锁。
[0076]
小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b在6b染色体上的位置及与分子标记kasp-txk-6之间的连锁遗传图谱见图1。
[0077]
实施例2与小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b紧密连锁的分子标记kasp-txk-6的应用
[0078]
1、dna提取
[0079]
试验材料选取n2496、川农16及川麦107，其中川农16、川麦107为感条锈病的品种，n2496为高抗条锈病品种。采用ctab法提取小麦样品三叶期的叶片dna。
[0080]
2、检测小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b的引物的筛选
[0081]
2.1引物设计
[0082]
开发荧光定量pcr引物，用于后续筛选。利用polymarker网站设计荧光定量pcr引物4对(见表1)。荧光定量pcr引物设计标准：扩增引物长度18～30bp，扩增产物长度45-70bp，退火温度57-62℃，gc含量在40％～60％之间。合成引物序列为：
[0083]
正向引物1：f探针 扩增引物序列
[0084]
正向引物2：h探针 扩增引物序列
[0085]
反向引物：扩增引物序列
[0086]
f探针：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3’(可结合fam荧光基团)
[0087]
h探针：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3’(可结合hex荧光基团)
qyr.sicau-6b的小麦品种均出现与小麦n2496明显不同的荧光信号，记为b型，结果如图3所示。随机抽检94株株系，47株能扩增出与n2496相同类型的片段，为小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b的植株，预测株系植株在成熟期高抗条锈病。47株能扩增出与川农16、川麦107相同的b型片段，为不含有小麦条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b的植株，预测这些植株在预测株系植株在成熟期条锈病感病严重。
[0108]
(6)小麦成熟期田间鉴定该94个f7植株的条锈病抗病等级，结果见表2，条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b的分子标记kasp-txk-6预测遗传群体条锈病抗性的结果。与n2496类型相同的植株平均病情分级为1.87，显著低于与川农16、川麦107类型的植株平均病情分级为3.17。实际结果与预期结果一致，说明本发明的条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b确实具有显著提高条锈病抗性的作用，且分子标记kasp-txk-6可以用于跟踪鉴定条锈病抗性qtl qyr.sicau-6b。
[0109]
表2
[0110]
[0111]
[0112]
[0113][0114]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。