LncRNADLEU2作为生物标志物的应用的制作方法

lncrnadleu2作为生物标志物的应用
技术领域
1.本发明涉及疾病分子生物学领域，涉及lncrnadleu2作为生物标志物的应用，尤其涉及lncrna dleu2作为血管平滑肌细胞异常增生的生物标志物的应用。


背景技术：

2.动脉粥样硬化是一种在大动脉中发生的疾病，是心血管疾病中疾病和死亡的主要原因。血管平滑肌细胞(vsmcs)异常增生是公认的促进动脉粥样硬化的关键因素。根据最新的研究证据，vsmcs参与动脉粥样硬化形成大致概括为以下内容：收缩型vsmcs从血管基质迁移到血管内膜，转换为合成型vsmcs，并大量增殖，导致血管内膜增厚、脂质沉积，最终形成动脉粥样硬化。因此，开发一种特异性高、灵敏度好的生物标记物，从而高效的识别血管平滑肌细胞异常增生，阻止动脉粥样硬化进程具有重要意义。
3.长链非编码rna(lncrna)是一种在生物基因转录本中占据多数地位，且能够调节众多生命活动的生物分子。随着研究的深入，科学家们证实了lncrna 在体内与肿瘤疾病、内分泌疾病、神经系统疾病等多种疾病均具有紧密联系。在心血管疾病中，lncrna在动脉粥样硬化斑块异常改变、内皮功能障碍、平滑肌细胞增殖、泡沫细胞形成、脂质代谢等密切相关，最终参与调节动脉粥样硬化的发生与发展。
4.研究表明lncrna dleu2参与了多种癌症的发展，促进了胰腺癌，喉癌、肝癌等癌细胞的癌变进程。这些研究提示lncrna dleu2具有调控基本生物学过程的潜力，能够作为临床诊断的生物标志物。但是现有技术中未有针对lncrna dleu2调节vsmcs异常增生，从而影响动脉粥样硬化的应用。


技术实现要素：

5.鉴于背景技术存在的不足，本发明涉及lncrna dleu2作为血管平滑肌细胞异常增生的生物标志物的应用，本发明提供了长链非编码rna作为血管平滑肌细胞异常增生的生物标志物的应用。
6.进一步的，所述长链非编码rna作为血管平滑肌细胞异常增生的生物标志物的应用具体为长链非编码rna在血管平滑肌细胞异常增生中应用。
7.进一步的，所述长链非编码rna为lncrna dleu2。
8.进一步的，所述的血管平滑肌细胞异常增生为pdgf-bb诱导的vsmcs。
9.进一步的，所述长链非编码rna作为血管平滑肌细胞异常增生的生物标志物的应用指lncrna dleu2具有增加vsmcs损伤、加速动脉粥样硬化的应用。
10.本发明还提供了lncrna dleu2与mir-212-5p竞争性结合，并抑制mir-212-5p表达的应用。
11.本发明还提供了lncrna dleu2抑制mir-212-5p表达后促进ywhaz的应用。
12.本发明的主要有益效果：
1、本发明为lncrna dleu2在血管平滑肌异常增生中的特异性调控提供了应用方案；2、本发明提供了血管平滑肌异常增生和转移的标志性基因lncrna dleu2的应用。
附图说明
13.图1为本发明实施例1的dleu2过表达质粒促进pdgf-bb诱导的vsmcs的生物表型；图2为本发明实施例1的dleu2与mir-212-5p竞争性结合；图3为本发明实施例1的mir-212-5p mimic抵消了dleu2过表达质粒对pdgf-bb诱导的vsmcs的刺激作用；图4为本发明实施例1的ywhaz是mir-212-5p的下游靶基因；图5为本发明实施例1的dleu2通过mir-212-5p/ywhaz轴调节pdgf-bb诱导的vsmcs活力、迁移和侵袭。
具体实施方式
14.以下将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述和讨论，显然，这里所描述的仅仅是本发明的一部分实例，并不是全部的实例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
15.为了便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以具体实施例为例作进一步的解释说明，且各个实施例不构成对本发明实施例的限定。
16.本发明的实施例1，涉及lncrna dleu2作为生物标志物的应用，尤其涉及lncrna dleu2作为血管平滑肌细胞异常增生的生物标志物的应用，具体实验方法如下：一、材料与方法1、研究对象:血管平滑肌细胞(vsmcs)。
17.2、主要试剂：血小板源性生长因子-bb（pdgf-bb），购自美国biovision公司；lipofectamine 3000、trizol rna提取试剂，购自美国invitrogen公司；lncrna cdna 试剂盒、mirna cdna 试剂盒、rt-pcr 试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；cck-8试剂盒，购自中国索莱宝生物有限公司；双荧光素酶检测试剂盒，购自美国promega公司；ripa裂解液，购自美国sigma-aldrich公司；ywhaz、pcna、α-sma、calponin 1、β-actin抗体、二抗，购自英国abcam公司；3、vsmcs的转染和给药：使用lipofectamine 3000 (l3000015, invitrogen, usa)将合成好的dleu2过表达质粒和dleu2沉默（sidleu2）质粒转染到vsmcs中。48小时后，转染的vsmcs接受20 ng/ml的pdgf-bb溶液处理24 h。
18.4、cck-8检测：
vsmcs被收集并调整为1
×
10
4 /ml的细胞悬液。不同组细胞悬液被分别加入96孔板并孵育12、24或36小时。将cck-8溶液（10 μl/孔）加入细胞，继续孵育2小时。通过酶标仪检测每组细胞在450nm处的吸光度，实验重复3次。
19.5、伤口愈合实验：处理过的vsmcs（1
×
10
5 /孔）被接种在6孔板中培养24小时。当vsmcs的融合度达到后，使用灭菌的移液器吸头划出划痕，划痕横穿过孔。vsmcs再次培养24小时，并利用尼康eclipse ts2显微镜（日本；放大100
×
）获得划痕的宽度。
20.6、transwell实验：处理后的vsmcs（1
×
10
3 /孔）被接种在预先铺有基质胶的transwell小室（3422，corning，usa）上层。小室下层加入含有10％fbs的培养基。细胞孵育24小时后，收集下层的vsmcs，并用0.1％的结晶紫染色液染色。最终在显微镜（放大100
×
）下计数侵袭细胞数量。
21.7、qrt-pcr：本实验采用qrt-pcr的方法检测不同处理条件对vsmcs中dleu2、mir-212-5p、pcna、α-sma、calponin 1和ywhaz表达的影响。实验流程严格按照试剂盒说明书的操作进行。
22.表1、引物序列表：8、western blot：根据提取试剂的说明书进行vsmcs蛋白提取。从细胞中提取蛋白质后，依次进行定量，分离，转膜和封闭的步骤。然后膜与一抗（ywhaz, β-actin）在4℃下孵育过夜，tbst清洗后再与二抗孵育2h。通过ecl试剂盒进行显色。
23.9、双荧光素酶实验：合成的dleu2（dleu2-wt/dleu2-mut）或ywhaz（ywhaz-wt/ywhaz-mut）的野生型和突变型荧光素酶报告质粒分别与mir-212-5p mimic和阴性对照质粒共转染到293t细胞中。接下来根据双荧光素酶检测试剂盒说明书进行荧光素酶活性的检测。
24.10、数据分析：使用graphpad prism 8.0进行统计分析。数据按照平均值
±
标准偏差的形式表示。两组或多组之间的差异比较通过独立样本t检验或单因素方差分析法获得。p 《0.05即为差异具有统计学意义。
25.11、检测结果：（1）上调dleu2促进pdgf-bb诱导的vsmcs的生物表型。
26.pdgf-bb诱导的vsmc可用于研究动脉粥样硬化的进展。因此，本发明应用pdgf-bb诱导vsmc进行研究。pdgf-bb上调了vsmcs中dleu水平，dleu过表达质粒进一步上调了pdgf-bb诱导的vsmcs中dleu2的水平，而dleu2沉默质粒的效果却相反（图1a）。上调后的dleu增强了细胞活力（图1b）、促进了pdgf-bb诱导的vsmcs迁移（图1c-d）和侵袭（图1e-f）。
27.（2）dleu2与mir-212-5p竞争性结合。
28.如图2a-b所示，dleu2与mir-212-5p之间存在结合位点，mir-212-5p mimic降低了野生型dleu2的荧光素酶活性。
29.（3）mir-212-5p mimic抵消了dleu2过表达质粒对pdgf-bb诱导的vsmcs的刺激作用。
30.如图3a所示，mir-212-5p mimic上调了mir-212-5p的表达，并减轻了dleu2过表达质粒对mir-212-5p的抑制作用。接下来对细胞活力、迁移和侵袭功能的测试显示，mir-212-5p mimic阻止了pdgf-bb刺激引起的vsmcs活力、迁移和侵袭，同时部分抵消了dleu2过表达的促进作用（图3b-f）。
31.（4）ywhaz是mir-212-5p的下游靶基因。
32.如图4a和4b显示的，ywhaz与mir-212-5p靶向结合，是mir-212-5p的下游靶基因。mir-212-5p mimic明显抑制pdgf-bb诱导的vsmcs中ywhaz的表达（图4c-d），并且抵消dleu2过表达质粒产生的ywhaz促进作用（图4c-d）。
33.（5）dleu2通过mir-212-5p/ywhaz轴调节pdgf-bb诱导的vsmcs损伤。
34.过表达的ywhaz部分抵消mir-212-5p对ywhaz表达、细胞活力、迁移和侵袭的抑制作用（图5）。5从而证明了dleu2通过mir-212-5p/ywhaz轴增强了pdgf-bb诱导的vsmcs损伤。
35.最后应说明的是：以上所述实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。