膜融合组合物、及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及药物递送系统领域，具体涉及一种膜融合组合物、及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着生物制药发展，核酸分子作为治疗剂具有生理活性功能，通过递送至靶细胞中并表达以发挥作用，但向细胞内的递送过程中，核酸的转染效率、均匀性、安全性是核酸分子进行临床应用的限制步骤。
3.核酸分子的有效性在包括肌肉注射、皮下注射或皮内注射中已经得到证实。将核酸分子直接递送至细胞内可以避免其他与系统性施用核酸分子相关的障碍，例如通过肝脏、肾脏和脾脏从血流中清除。
4.为将外源核酸分子(例如裸mrna)递送至细胞内，常用物理手段如电穿孔，但采用物理手段进行递送的细胞致死率高、核酸和细胞用量大，且需根据不同细胞类型优化递送条件。载体手段中的病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒等多种病毒，但是由于存在感染性、免疫原性、生产率等问题，在临床应用中存在风险。因此，需要开发一种能克服病毒载体的缺陷，且可保护核酸分子的非病毒载体。
5.目前为止，作为促进核酸向胞内转运的非病毒载体，例如阳离子脂质体，其通过内吞途径形成胞内体，完成溶酶体逃逸过后才能将核酸释放至细胞质以发挥作用，存在摄取效率有限、细胞毒性大等缺点，此外这类纳米颗粒的制备方法比较复杂，存在生产规模化问题。
6.因此，需要开发一种可提高摄取效率、低细胞毒性的核酸分子载体和简单高效的制备方法。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术缺少高递送效率、低细胞毒性的核酸递送系统的缺陷，提供一种膜融合组合物、及其制备方法和应用。采用本发明的膜融合组合物制备得到的膜融合纳米粒可通过膜融合机制递送核酸，具有更高的递送效率，同时保持良好的包封率及较低的细胞毒性。
8.发明人在对核酸递送系统的研究中偶然发现，采用特殊比例的组分制得的纳米粒采用膜融合机制递送核酸，有别于现有脂基纳米粒通过内吞作用进入细胞，再通过溶酶体逃逸释放核酸的机制。发明人基于该发现进一步研究了特殊比例的组分对纳米粒的递送性能的影响，从而获得在保持良好的包封率及较低的细胞毒性的同时具有更高的递送效率的纳米粒。
9.本发明通过以下技术方案解决上述问题：
10.本发明的目的之一是提供一种膜融合组合物，所述膜融合组合物包括组分a和组分b；所述组分a为芳香族化合物，所述组分b为两亲性脂质分子；其中：
11.相对于1摩尔份的组分a，以20-150摩尔份的比例含有组分b。
12.较佳地，相对于1摩尔份的组分a，以25-100摩尔份的比例含有组分b。
13.更佳地，相对于1摩尔份的组分a，以26.7-80摩尔份的比例含有组分b。
14.在本发明一具体实施方案中，相对于1摩尔份的组分a，以40摩尔份的比例含有组分b。
15.在本发明一较佳实施方案中，所述芳香族化合物选自1,1
’‑
二十八烷基-3,3,3’,3
’‑
四甲基吲哚三羰花青碘化物(dir)、3,3
’‑
二十八烷基氧杂碳菁高氯酸盐(dio)、1,1
’‑
二十八烷基-3,3,3’,3
’‑
四甲基吲哚羰花青(did)、4-(4-(二十六烷基)苯乙烯基)-n-甲基吡啶鎓碘化物(dia)和1,1
’‑
二十八烷基-3,3,3’,3
’‑
四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(dii)的一种或多种。
16.较佳地，所述芳香族化合物为1,1
’‑
二十八烷基-3,3,3’,3
’‑
四甲基吲哚三羰花青碘化物(dir)、3,3
’‑
二十八烷基氧杂碳菁高氯酸盐(dio)、1,1
’‑
二十八烷基-3,3,3’,3
’‑
四甲基吲哚羰花青(did)、4-(4-(二十六烷基)苯乙烯基)-n-甲基吡啶鎓碘化物(dia)或1,1
’‑
二十八烷基-3,3,3’,3
’‑
四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(dii)；优选为1,1
’‑
二十八烷基-3,3,3’,3
’‑
四甲基吲哚三羰花青碘化物(dir)或1,1
’‑
二十八烷基-3,3,3’,3
’‑
四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(dii)。这些物质虽然在本领域中常规被认为是起到荧光探针作用，但在本发明中显示，该组份为介导膜融合的重要的一类结构。
17.在本发明一较佳实施方案中，所述两亲性脂质分子包括二油酰基三甲基铵丙烷(dotap)和/或n-(1-(2,3-双(油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基铵盐盐酸盐(dotma)。
18.较佳地，所述两亲性脂质分子还包括二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)。
19.在本发明一具体实施方案中，所述两亲性脂质分子包括二油酰基三甲基铵丙烷(dotap)和二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)。
20.所述二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)和所述二油酰基三甲基铵丙烷(dotap)的摩尔比优选≤1，例如为1:3。
21.在本发明一较佳实施方案中，所述膜融合组合物还包括组分c和/或组分d；所述组分c为阳离子聚合物分子，所述组分d为核酸；其中：相对于100重量份组分a和组分b的总重量，以2-100重量份的比例含有组分c，所述组分c与所述组分d的正负电荷比为(0.5-2):1。
22.较佳地，所述阳离子聚合物分子选自聚乙烯亚胺、鱼精蛋白(prtm)或其组合，所述核酸包括mrna、dna或sirna。
23.较佳地，相对于100重量份组分a和组分b的总重量，以2.5-10重量份例如5重量份的比例含有组分c。
24.较佳地，所述组分c与所述核酸的正负电荷比为1：1。
25.在某一优选实施例中，所述膜融合组合物由组分a、组分b、组分c和组分d组成，组分a为dir(即dirc
18
(3))，组分b为dotap和dope，两者摩尔比为1:1，组分c为prtm，组分d为mrna。其中，组分a:组分b的摩尔比为1:20，组份c与组份a、b总量的重量比为1:10，组分c和组份d的正负电荷比为1。
26.本发明的目的之二是提供一种如目的之一所述的膜融合组合物制得的膜融合纳米粒。
27.在本发明一较佳实施方案中，所述膜融合纳米粒的制备方法如本发明的目的之三
所述。
28.本发明的目的之三是提供一种如目的之二所述的膜融合纳米粒的制备方法，所述制备方法包括：将组分a的醇溶液与组分b的醇溶液混合得到膜融合载体溶液的步骤，混合后组分a和组分b的总浓度为1-5mg/ml；所述组分a和所述组分b独立地如目的之一所述。
29.本发明中采用微通道法来制备膜融合载体和膜融合纳米粒时，通量更高，并且制得的膜融合载体和膜融合纳米粒包载更均匀，纳米颗粒分散性、一致性更好，批间差异更小，重复性更好，更有利于实际应用。
30.较佳地，所述混合后所述组分a和所述组分b的总浓度为2-4mg/ml。
31.较佳地，所述混合以0.05-2ml/min的流速混合。
32.更佳地，所述混合后所述组分a和所述组分b的总浓度为2.5mg/ml。
33.更佳地，所述混合以0.5-1.5ml/min的流速混合。
34.在本发明一具体实施方案中，所述混合以1ml/min的流速混合。
35.在本发明一较佳实施方案中，所述制备方法还包括：
36.将组分c的水溶液与组分d的水溶液混合得到混合液与所述膜融合载体溶液混合的步骤；所述组分c和组分d独立地如目的之一所述。
37.较佳地，所述混合液中所述组分c的浓度为0.01-0.1mg/ml，所述组分d的浓度为0.05-0.2mg/ml。
38.更佳地，所述混合液以0.1-20ml/min的流速混合。
39.更佳地，所述混合液中所述组分c的浓度为0.02-0.08mg/ml，和/或，所述组分d的浓度为0.08-0.15mg/ml。
40.进一步更佳地，所述混合液以3-10ml/min的流速混合。
41.进一步更佳地，所述混合液中所述组分c的浓度为0.05mg/ml，和/或，所述组分d的浓度为0.1mg/ml。
42.在本发明一具体实施方案中，所述混合液以5ml/min的流速混合。
43.在本发明一较佳实施方案中，所述组分a的醇溶液与所述组分b的醇溶液通过微通道混合，形成第一混合流。
44.在本发明另一较佳实施方案中，所述组分c的水溶液与所述组分d的水溶液通过微通道混合，形成第二混合流。
45.在本发明一具体实施方案中，所述第一混合流与所述第二混合流通过微通道混合。
46.在某一较佳实施例中，所述制备方法包括以下步骤：称取组分a:组分b的摩尔比为1:20的组分a(dirc
18
(3))与组分b(dotap:dope＝1:1，mol/mol)，分别溶解于乙醇中并调节组分a和组分b的总浓度为2.5mg/ml，将组分c(prtm，组份c与组份a、b总量的重量比为1:10)溶于水中，调整浓度为0.05mg/ml，将组分d(mrna，组分c和组份d的正负电荷比为1)溶于水中，调整浓度为0.1mg/ml。将组分c和组分d的水溶液分别以5ml/min的流速通过微通道混合，得到第一混合流；同时将组分a和组分b的乙醇溶液以1ml/min的流速通过微通道混合，得到第二混合流；将第一混合流与第二混合流以各自原有的流速混合制备得到膜融合纳米粒。
47.本发明的目的之四是提供一种如目的之三所述的制备方法制备得到的膜融合载
体。
48.本发明的目的之五是如目的之四所述的膜融合载体在制备药物递送系统中的应用。其中，所述药物优选为核酸例如mrna、dna或sirna。
49.本发明的目的之七是如目的之二所述的膜融合纳米粒在制备药物递送系统中的应用。其中，所述药物优选为核酸例如mrna、dna或sirna。
50.本发明中涉及的递送效率可为本领域常规，例如是指所述膜融合载体负载的物质(例如核酸)进入细胞的效率。而当采用转染效果来体现所述递送效率时，可认为与转染效率等同。以核酸为例，所述转染效率是指核酸进入细胞并表达的效率，比如：转染效率＝(表达荧光蛋白的细胞/总细胞)*100％。
51.本发明中涉及的包封率可为本领域常规，优选为所述膜融合载体包载的物质(例如核酸)载入的百分率，可按以下方式计算：包封率＝(包封量/总投量)*100％，其中：包封量＝总投量-游离量。
52.以核酸为例，本发明中所述膜融合载体载入核酸的效率为核酸结合效率，与包封率等同。
53.本发明中，所述“包括或包含”可以是指除了包括后面所列举的成分，还存在其他成分；也可以是指“由
……
组成”，即只包括后面所列举的成分而不存在其他成分。
54.本发明中，所述的芳香族化合物可为本领域常规，其通常是指一类具有芳环结构的化合物。它们结构稳定，不易分解，可能会对环境造成严重的污染。历史上曾将一类从植物胶中取得的具有芳香气味的物质称为芳香族化合物。现代芳香族通常是指碳氢化合物分子中至少含有一个带离域键的苯环，具有与开链化合物或脂环烃不同的独特性质(称芳香性，aromaticity)的一类有化合物。如苯、萘、蒽、菲及其衍生物。但现代芳香族化合物存在不含有苯环的例子。芳香族化合物均具有“芳香性”。
55.本发明中，所述的两亲性脂质分子可为本领域常规，其通常指同时具有亲水性和亲油性的脂质分子，亲水性和亲油性是特定基团的性质。如构成细胞膜的磷脂双分子层中，单个磷脂的顶部由磷的官能团和甘油构成，呈亲水性；而尾部含饱和及不饱和脂肪酸，呈疏水性或亲油性，故磷脂分子整体呈两亲性。物质的两亲性通常与它的化学结构有关。
56.本发明中，所述的阳离子聚合物可为本领域常规，其通常是指带有众多正离子的聚合物。
57.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
58.本发明所用试剂和原料均市售可得。
59.本发明的积极进步效果在于：
60.本发明的膜融合组合物可及性好，制备得到的膜融合载体可包载mrna等多种核酸分子、小分子化合物、肽类等活性剂，包载形成的膜融合纳米粒可与生物膜(例如细胞膜、囊泡膜)以膜融合机制高效、定量递送上述活性剂，不涉及细胞内吞机制和溶酶体逃逸过程，可将上述活性剂直接导入细胞质中而不受分解，且同时保持良好的包封率和较低的细胞毒性，具有有利的转染特性，摄取效率高，安全性好，制备过程简单方便。
附图说明
61.图1为实施例3组分b组成比例对核酸递送膜融合纳米粒细胞膜融合效率的影响；
62.图中：a为共聚焦显微镜观察纳米粒膜融合效率；b为流式细胞仪检测细胞膜融合效率和强度；c为流式细胞仪检测细胞荧光分布。
63.图2为实施例4组分b组成成分对核酸递送膜融合纳米粒细胞膜融合效率的影响；
64.图中：a为共聚焦显微镜观察纳米粒膜融合效率；b为流式细胞仪检测细胞荧光分布。
65.图3为实施例6核酸递送膜融合纳米粒细胞核酸递送效率。
66.图4为实施例8琼脂糖凝胶电泳测定核酸包封和结合能力。
67.图5为实施例9共聚焦显微镜观察核酸递送纳米粒膜融合过程。
68.图6为实施例10内吞抑制剂对内吞型和核酸递送膜融合纳米粒摄取的影响。
69.图7为细胞安全性评价示意图；
70.图中：a为cck-8法测定细胞增殖毒性；b为ctl发光法测定细胞atp活力影响。
具体实施方式
71.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
72.实施例使用的部分试剂和材料如表1所示。
73.表1部分试剂和材料
74.试剂/材料供应商货号dc2.4细胞上海酶研生物cc-y2117胎牛血清gibco10099141opti-mem培养基gibco31985070rpmi 1640培养基gibco11875093egfp mrnaapexbior1001肝素钠国药集团63007131genisteinsigma-aldrichg6649cck-8试剂盒abcam228554胰酶gibco25300120lipo2kthermofisher11668019diithermofisherd282dir，又称为dirc
18
(3)thermofisherd12731prtmsigma-aldrichp4005dopeavanti850725dotapavanti890890dppcavanti850355
75.实施例使用的共聚焦显微镜为徕卡tcs sp8。
76.实施例中egfp mrna的使用浓度为2μg/μl。
77.实施例使用的含血清培养基为含10％(v/v)胎牛血清的rpmi 1640培养基。
78.实施例1细胞膜融合效率检测方法
79.取对数增长期dc2.4细胞，以5
×
105/皿密度接种四分格共聚焦皿，铺满玻璃面，待2h细胞完全贴壁后，加入0.5ml含血清培养基，继续培养待细胞融合度至60％左右。同时以2.5μl/cm
2 egfp mrna给药量以pbs稀释配制各工作浓度的核酸递送膜融合纳米粒，孵育15min后弃去，d-pbs洗3次，共聚焦显微镜he-ne激发模块观察细胞荧光。同时以2.5
×
105/孔密度接种24孔板，培养24h后待细胞融合度至70-80％左右，以5μl/cm2给药量以pbs稀释配制各工作浓度的核酸递送膜融合组合物，孵育15min后弃去试剂，d-pbs洗3次，流式细胞仪fl4通道检测细胞荧光，观察细胞荧光分布和平均荧光强度。
80.实施例2核酸递送效率检测方法
81.取对数增长期dc2.4细胞，以2.5
×
105/孔密度接种24孔板，培养24h后待细胞融合度至70-80％，以opti-mem培养基稀释核酸递送膜融合纳米粒至1μg/cm
2 mrna给药量给药，孵育15min后更换为完全培养基，对照组按同给药量给药，37℃孵育4h后更换为完全培养基。继续培养一段时间，荧光显微镜观察egfp绿色荧光蛋白表达。设置无mrna组fl组为阴性对照组。
82.实施例3
83.根据实施例7中所述的制备方法制备下述如表2所示组成的核酸递送膜融合纳米粒，组分(b)为dotap/dope，两者摩尔比dotap:dope为20:0-0:20，组分a为dirc
18
(3)(即dir)，与组分b的摩尔比组分a:组分b为1:20，组分c为prtm，与组分a 组分b的总重量的重量比组分c:组分a 组分b为1:10，组分d为egfp mrna，组分c和组分d的正负电荷比为1。按实施例1所述的方法检测细胞膜融合效率。如图1和表2所示，结果表明当组合物的组分b中不含有dotap时，膜融合效率为0，随着dotap和dope摩尔比增大，膜融合效率增大，且在dotap/dope摩尔比为10:10时达到高值，之后融合率趋于平稳。
84.表2不同摩尔比组分b条件组成纳米粒的融合率和平均荧光强度(mfi)
85.编号dopedotapdirc
18
(3)融合率/％mfi12001012521551248043101019515394515194154250201961603
86.实施例4
87.根据实施例7中所述的制备方法制备下述如表3所示组成的核酸递送膜融合纳米粒，组分b为摩尔比分别为1的dotap/dope或dotap/dppc，组分a为dirc
18
(3)，与组分b的摩尔比组分a:组分b为0.1:20-1:20，组分c为prtm，与组分a 组分b的总重量的重量比为组分c:(组分a 组分b)＝1:10，组分d为egfp mrna，组分c和组分d的正负电荷比为1。按实施例1所述的方法检测细胞膜融合效率。如图2和表3所示，结果表明组分b的组成为dotap/dope时，平均荧光强度高于dotap/dppc；并且当组分a与组分b的摩尔比为1:200时，制得的纳米粒基本还是通过内吞形式进入细胞的，而当组分a与组分b摩尔比为1:20时，膜融合效率最高。
88.表3与组分b不同摩尔比的组分a条件组成的纳米粒
[0089][0090][0091]
实施例5
[0092]
根据实施例7中所述的制备方法制备下述如表4所示组成的核酸递送膜融合纳米粒，组分b为dotap/dope，两者摩尔比为1，组分a为dirc18(3)，与组分b的摩尔比组分a:组分b为1:20，组分c为prtm，与组分a 组分b的总重量的重量比为组分c:(组分a 组分b)＝1:0.5、1:1、1:10、1:20、1:40，组分d为egfp mrna，组分c和组分d的正负电荷比为1:1。按实施例1所述的方法检测细胞膜融合效率，按如实施例11所述的方法评价5μl/cm2给药量时的细胞安全性，使用马尔文激光粒度仪zetasizer nano zs90稀释10倍测定粒径。结果表明当该重量比大于1:1时，可能无法形成稳定纳米粒，当小于1:20时，相同mrna给药浓度下细胞存活率可能低于50％，当重量比在1:1-1:20之间时，具有大于等于70％的膜融合效率，且细胞存活率高于80％。
[0093]
表4不同重量比组分c/(a/b)条件组成纳米粒
[0094]
编号w(c)w(a b)融合率/％细胞存活率/％粒径/nm110.5//》1μm2117198213311094981084120938212151409648126
[0095]
实施例6
[0096]
根据实施例7中所述的制备方法制备下述如表5所示组成的核酸递送膜融合纳米粒，组分b为dotap/dope，两者摩尔比为1，组分a为dirc
18
(3)，与组分b的摩尔比组分a:组分b为1:20，组分c为prtm，与组分a 组分b的总重量的重量比为组分c:(组分a 组分b)＝1:10，组分d为egfp mrna，组分c和组分d的正负电荷比为0.5:1-4:1。按实施例2所述的方法检测细胞核酸递送效率。如图3和表5所示，结果表明1h时核酸递送膜融合纳米粒组即有荧光蛋
白表达，此时对照组无表达(对照组以1μg egfp mrna每2μl lipo2k的比例，分别取适量lipo2k及mrna溶液稀释至等体积，充分混匀后室温静置5min后按实施例2所述的方法检测细胞核酸递送效率)，且组分c和组分d的正负电荷比为1:1时，12h时可达到93％的转染效率，与对照组有显著差异。
[0097]
表5不同正负电荷比的组分c和组分d条件组成纳米粒
[0098]
分组编号prtmegfp mrna1h/％12h/％组10.514270组2117693组3214755组441131组5(对照)lipo2k1033
[0099]
实施例7
[0100]
精密称取组分a:组分b的摩尔比为1:20的组分a(dirc
18
(3))与组分b(dotap:dope＝1:1，mol/mol)，分别溶解于乙醇中并调节组分a和组分b的总浓度为2.5mg/ml，将组分c(prtm，组份c与组份a、b总量的重量比为1:10)溶于depc处理水中，调整浓度为0.05mg/ml，将组分d(egfp mrna，组分c和组份d的正负电荷比为1)溶于depc处理水中，调整浓度为0.1mg/ml。将组分c和组分d的depc水溶液分别以5ml/min的流速通过微通道混合，得到第一混合流；同时将组分a和组分b的乙醇溶液以1ml/min的流速通过微通道混合，得到第二混合流；将第一混合流与第二混合流以各自原有的流速混合制备得到纳米粒。马尔文激光粒度仪zetasizer nano zs90稀释10倍测定粒径，稀释100倍测定电位，重复试验3次，结果如表6所示。结果表明所制备核酸递送膜融合纳米粒粒径为(107.20
±
2.04)nm，pdi为0.1857
±
0.0117，电位为( 43.97
±
3.70)mv。
[0101]
表6核酸递送膜融合纳米粒粒径电位测定
[0102]
编号粒径pdi电位1107.90.17347.72108.80.18843.93104.90.19640.3
[0103]
实施例8核酸包封率及结合能力测定
[0104]
取对应的核酸含量(1μg)与上样缓冲液(6
×
溴酚蓝)混合均匀，1.5％琼脂糖，150v，凝胶电泳30min，建立核酸电泳标准曲线。将正负电荷比为0.5:1-4:1的组分c和组分d(相对应于每1mg/ml的组分d，组分c为0.25-2mg/ml)制备得核酸递送用膜融合纳米粒。每4μl膜融合纳米粒溶液和1μl上样缓冲液混合均匀，同时取一部分作为样品溶液，各组加入1μl的1％肝素钠溶液，充分混匀，室温静置孵育30min，设置泳道考察试剂对核酸的结合能力。如图4所示，结果表明加入组分a和组分b能够更好的包载核酸并保护核酸不被肝素钠置换(图中a/b/c/d的组成同实施例7)。
[0105]
实施例9递送机制
[0106]
取对数增长期dc2.4细胞，以5
×
105/皿密度接种四分格共聚焦皿，铺满玻璃面，待2h细胞完全贴壁后，加入0.5ml含血清培养基，继续培养待细胞融合度至60％左右。同时以2.5μl/cm
2 egfp mrna给药量以pbs稀释配制如实施例7所述的核酸递送膜融合纳米粒
(dirc
18
/dotap/dope/prtm/egfp mrna)，孵育15min后弃去试剂，d-pbs洗3次，共聚焦显微镜he-ne激发模块观察细胞荧光。如图5所示，结果表明纳米粒不进入细胞质，只分布在细胞膜上，且焦平面上细胞周长和面积逐渐增大。
[0107]
实施例10细胞内吞抑制实验
[0108]
取对数增长期dc2.4细胞，以2.5
×
105/孔密度接种24孔板，培养24h后待细胞密度至70-80％，分别以0.1、1、10、25、50μm浓度给予genistein抑制内吞作用，再分别给予内吞组合物(dotap/dppc/dii)(摩尔份数比为10:10:1)和膜融合载体组合物(dotap/dope/dii)(摩尔份数比为10:10:1)，荧光显微镜观察制剂摄取情况。如图6所示，结果表明内吞抑制剂无法抑制核酸递送膜融合纳米粒的摄取，说明了膜融合载体组合物是通过膜融合而非内吞进入细胞(图中a、b、c仅表示计算周长和面积所任选的部位，表明膜融合后细胞的周长和面积增加)。
[0109]
实施例11细胞安全性评价
[0110]
取对数增长期dc2.4细胞，以5
×
104/孔密度接种96孔板，培养24h后待细胞融合度至80-90％，将按如实施例7所述制备方法制备的核酸递送膜融合纳米粒及对照组(对照组的处理如实施例6所述)按10、20、50、100、200、400mm的组分b的浓度给药，对应转染时间(膜融合纳米粒组为15min，对照组为4小时)后更换完全培养培养12h，使用试剂盒按照cck-8法考察细胞增殖毒性，每孔加入10μlcck-8，继续孵育2-4h，酶标仪450nm处测定吸光度，此外，celltiter-lumi
tm
发光法考察细胞atp活力，取出细胞培养板在室温下平衡10min，加入相应试剂，室温振荡2min促进细胞裂解，室温孵育10min使发光信号趋于稳定，酶标仪进行化学发光检测。设置无细胞空白组为阴性对照。如图7所示，结果表明纳米粒相比lipo2k对照组，细胞毒性显著降低。
[0111]
实施例12
[0112]
按实施例7的微流控法制备得到纳米粒，精密称取相同对应量的组分a、b、c、d，通过常用分批法制备得到相同处方的纳米粒，具体方法为：将组分a和组分b分别溶解于乙醇中并调节组分a和组分b的总浓度为3mg/ml，抽真空40℃，125rpm旋转蒸发2h至有机溶剂完全挥干，20mm hepes缓冲液37℃，150rpm条件下水合10min，冰浴探头超声100w功率，单次超声1s，间隔2s，超声6min得到初液，同时将组分c和组分d分别用depc处理水稀释并混合，室温静置10min后与对应体积的初液混合，1％功率冰浴超声5min得到纳米粒。使用马尔文激光粒度仪zetasizer nano zs90稀释10倍测定粒径，稀释100倍测定电位，重复试验3次，结果如表4所示。结果表明相同处方下分批法制备得到纳米粒粒径为(262.75
±
0.35)nm，pdi为0.2005
±
0.0035，电位为( 43.0
±
5.12)mv。而实施例7中微流控法所制备核酸递送膜融合纳米粒粒径为(107.20
±
2.04)nm，pdi为0.1857
±
0.0117，电位为( 43.97
±
3.70)mv。说明微流控法与常用分批法相比，颗粒结构更为紧密且大小相对均匀。
[0113]
实施例13
[0114]
按实施例7所述的微流控法及实施例12所述的常用分批法分别制备得到纳米粒，同批制备所得纳米粒取6个样品，并重复该法制备6次，分别各取1个样品，使用马尔文激光粒度仪zetasizer nano zs90稀释10倍测定粒径，稀释100倍测定电位，计算粒径和电位的相对标准偏差rsd。结果表明微流控法的粒径批内差异rsd为1.21％，批间差异rsd为1.90％，电位的批内差异rsd为0.94％，批间差异rsd为1.43％，而常用分批法的粒径批内差
异rsd为4.70％，批间差异rsd为8.32％，电位的批内差异rsd为2.16％，批间差异rsd为9.14％。结果表明微流控制备法相比常用分批法，批内和批间差异均小，可重复性好，颗粒更均匀。