用于降解丙烯酰胺的酶的制作方法

1.本发明属于食品和高档食品，尤其是咖啡和咖啡替代品的生产领域。提供一种能够降解丙烯酰胺的新型酶——优选在50℃以上的温度下，特别是在咖啡/咖啡替代品生产过程中出现的温度范围内，和/或在ph 4和ph 7之间的ph值，这与咖啡/咖啡替代品生产中常见的情况一样。此外，本发明提供了从选自半成品和成品的制剂降解丙烯酰胺的方法。此外，本发明还涉及与未采用通过根据本发明的酶去除根据本发明的丙烯酰胺的方法的制剂相比，丙烯酰胺含量降低的制剂。


背景技术：

2.最终消费者对始终安全且消费安全的食品和高档食品的需求一直很高，这对生产商提出了特殊要求。2018年欧盟的一项新法规(第2017/2158号欧盟法规)将丙烯酰胺归类为加工过程污染物并对最终消费者存在潜在的健康风险。因此，食品和高档食品生产商有义务将食品和高档食品中的丙烯酰胺含量保持在一定水平以下或降低该含量。在动物研究中，丙烯酰胺具有致癌性和致突变性。丙烯酰胺是在含有淀粉的原料的所有油煎、烘焙和油炸过程中形成的，是天冬酰胺与还原糖(如葡萄糖和果糖)加热的产物，作为所谓美拉德反应的一部分。
3.在咖啡和咖啡替代品生产的特殊情况下，这些过程涉及烘焙和研磨的咖啡豆及其替代品如菊苣、大麦或黑麦的烘焙或提取。在烘焙过程中，咖啡豆通常经受145℃至250℃的温度，会发生复杂的化学反应、美拉德反应、焦糖化和热解。这些反应改变了烘焙产品的化学、物理和感官特性，这些特性对饮料的味道至关重要。另外，还形成了对最终产品很重要的其他物质，如抗氧化剂(jin et al.“relationship between antioxidants and acrylamide formation：a review，”food research international，2013，p.611-620)。通过烘焙咖啡和咖啡替代品，也形成了作为不良加工过程污染物的丙烯酰胺(anese，m.“acrylamide in coffee and coffee substitutes，acrylamide in food，2016，p.181-195)。欧盟的新法规中丙烯酰胺的指导值为：烘焙咖啡400μg/kg，可溶性咖啡850μg/kg，纯谷类咖啡替代品500μg/kg，菊苣制品4000μg/kg。
4.在食品和食品奢侈品行业的大量(其他)加工过程中也会形成丙烯酰胺。例如，油炸土豆时会形成丙烯酰胺。从半成品或成品中部分地或完全去除丙烯酰胺是有利的，甚至是必要的，特别是为了一方面符合欧盟法规(第2017/2158号欧盟法规)的要求，另一方面获得对消费者无害的安全最终产品。
5.尽管有大量尝试去降低食品和高档食品中的丙烯酰胺含量，但这些都无法以经济合理的成本几乎完全或完全且温和地去除丙烯酰胺。例如，在专利申请ep 3254568a1中，通过使用阳离子树脂吸收丙烯酰胺，在咖啡提取后降低丙烯酰胺含量。该工艺需要额外的处理步骤，并且耗时，因为吸收是动力学上缓慢的步骤。此外，只能去除50％的丙烯酰胺，而且阳离子树脂是该工艺中的额外成本。
6.减少丙烯酰胺的另一种方法是减少前体。这是专利申请wo 2013/005145 a1的主
题。该专利公开了一种在焙烧处理之前开始的减少天冬酰胺和天冬氨酸的工艺。在烘烤前降低天冬酰胺含量会降低最终产品的丙烯酰胺含量，但最终产品的风味特性会发生改变。此外，该工艺对用户来说成本高昂，因为需要额外的新设备来进行该工艺。
7.专利ep 1745702 b1的作者采取了另一种方法，其还涉及酶辅助生产咖啡。此处，咖啡豆的淀粉被酶降解，并已分解为其单独的构造块，以便在最终产品中获得改进的风味特性。在此过程中，单糖的高可用性导致丙烯酰胺含量高于标准咖啡产品。这清楚地表明，酶工艺的正确时机对于降低丙烯酰胺含量至关重要。
8.wo 2004/083423 a1涉及从嗜热生物体分离的热稳定酰胺酶，特别是来自嗜热放线菌诸如嗜热假诺卡氏菌的酰胺酶。根据其中公开的序列列表，声称是源自嗜热假诺卡氏菌的酰胺酶的氨基酸序列在wo 2004/083423a1中公开为seq id no.3(对应于本技术的seq id no.42)。此后，嗜热假诺卡氏菌的基因组已被完全测序，并以genbank编号frap01000003.1保藏(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/frap01000003)。该基因组具有50704-52245的范围内的酰胺酶基因位点；蛋白质以genbank shk14489.1保藏。与seq id no.2(非根据本发明)的野生型酰胺酶相比，保藏的酰胺酶的序列比对显示在蛋白质的整个长度上具有100％的同一性。然而，根据wo 2004/083423 a1的氨基酸序列似乎不正确，尤其是在前大约100个n-末端氨基酸残基的序列部分。这些序列的不准确可能主要是由于当时可用的测序方法引起的，因此从当今的角度来看，wo 2004/083423 a1的seq id no.3是错误的。因此，来自嗜热假诺卡氏菌的野生型酰胺酶的正确氨基酸序列是目前(非发明性)的seq id no.2。与根据目前的seq id no.2的来自嗜热假诺卡氏菌的野生型酰胺酶相比，根据wo 2004/083423 a1的seq id no.3的序列比对的结果为：528个相同位置中仅447个(同一性：84.7％)以及528个类似位置中的458个(相似性：86.7％)；比对如图1所示。
9.汉堡工业大学关于该项目的最终报告包含补充信息，该报告显然与申请wo 2004/083423有关，其申请自2005年12月，标题为“use of amidases from extremophilic microorganisms for the enantioselective synthesis of amino and carboxylic acids az 13107”(https：//www.dbu.de/projekt_13107/01_db_2409.html)。根据该项目描述，wo 2004/083423 a1的发明人合作了该项目。因此，对从嗜热假诺卡氏菌分离的酰胺酶的部分蛋白质序列进行测序，并用于通过pcr扩增和测序生物体中推定的酰胺酶基因。在通过在大肠杆菌宿主系统中表达以生产重组酰胺酶的实验中，通过pcr扩增的基因序列被克隆到阿拉伯糖诱导的表达载体pbad-thio-topo中。通过sds-page可以检测到大小为54kda的蛋白的表达，但在用天然蛋白转化的底物进行酶测定时，无法检测到来自嗜热假诺卡氏菌的重组酰胺酶的活性。因此，wo 2004/083423 a1的公开内容对于本领域的技术人员不可行。
10.ep 0 272 024 a2涉及使用酰胺酶分解丙烯酰胺的工艺。
11.m.cha，eur food res technol(2013)236：567-571涉及使用来自罗尔斯通氏菌和热葡糖苷酶地芽孢杆菌的酶对咖啡中丙烯酰胺含量进行酶控制。该出版物没有命名特定的酶序列；在每种情况下与来自嗜热假诺卡氏菌中的酶相比，目前已知的来自罗尔斯通氏菌的酶具有约36.4％的最大同一性，目前已知的来自热葡糖苷酶地芽孢杆菌的酶具有约53.3％的最大同一性。
12.s.raghavan等人，microb cell fact(2019)18：139涉及转录传感器检测大肠杆菌
中丙烯酸异源生产的开发和应用。该论文将来自苍白地芽胞杆菌的酰胺酶命名为rapc8，其与来自嗜热假诺卡氏菌的酶相比具有为约14％的同一性，且与后者无关。
13.t.k.cheong等人，enzyme and microbial technology 26(2000)152-158涉及在大肠杆菌中克隆来自嗜热脂肪芽孢杆菌br388的酰胺酶。来自嗜热脂肪芽孢杆菌br388的酰胺酶与来自嗜热假诺卡氏菌的酶相比具有为约14％的同一性，且与后者无关。
14.a.karmali等人，molecular biotechnology，vol.17，2001 211-212涉及来自铜绿假单胞菌的酰胺酶中thr-103-ile和trp-138-gly的交换。来自铜绿假单胞菌的酰胺酶与来自嗜热假诺卡氏菌的酶相比具有为约15％的同一性，且与后者无关。
15.n.j.silman等人，j gen microbiol(1991)137169-178涉及通过生长选择和化学诱变，表达酰胺酶的食甲基嗜甲基菌的非定向进化。该酰胺酶与来自嗜热假诺卡氏菌的酶相比具有为约14％的同一性，且与后者无关。
16.m.s.nawaz等人，j bacteriol 1996 2397-2401涉及来自肺炎克雷伯菌的耐热酰胺酶的物理、生化和免疫学表征。该出版物没有命名特定的酶序列；目前已知的来自肺炎克雷伯菌的酶与来自嗜热假诺卡氏菌的酶相比具有为约51.2％的最大同一性。
17.在所有使用酶的工艺中，酶的使用与过程变量的精确设置有关。对于所有酶，都有一个温度和ph范围(包括各自的最佳值)，在该范围内，各自反应的催化作用发生或可能发生。超出这些范围的使用通常会导致酶不能发挥其催化功能，或达不到预期的程度。例如，在高于42℃的温度且具有非嗜热酶以及在基本酸性或明显碱性ph值的情况下，通常会出现这种情况。因此，酶工艺中的一个困难始终在于正确选择或修改酶，以使其适应过程条件。
18.本发明的主要目的是提供用于处理含有丙烯酰胺的制剂的合适的酶和方法，其能够降低制剂中的丙烯酰胺含量，与处理前的制剂相比，优选降低至少80wt.％，所述酶优选地保持其酶活性和/或即使在高温下也表现出高稳定性，诸如那些在食品和高档食品的煮沸、油煎、烘焙步骤后和/或在ph 4和ph 7之间的ph值下普遍存在的酶。构成本发明的进一步的目的来自以下说明和所附权利要求。


技术实现要素：

19.本发明的问题主要通过提供酶(如本文所述，特别是在权利要求中所述)来解决，优选酰胺酶，其的确能够显著减少制剂中丙烯酰胺的量，并且这还是在对许多酰胺酶不利的温度和ph值下。
20.此外，根据一个优选的实施方式，本发明涉及此类酶(如本文所述，特别是在权利要求中所述)，优选酰胺酶，其在高达50℃或更高的温度下，并且(也)在ph 4至ph 7的ph范围内具有催化活性。
21.另外，本发明提供了一种使用根据本发明的酶(如本文所述，特别是在权利要求书中所述)降解制剂中的丙烯酰胺的合适方法，以及一种制备丙烯酰胺含量降低的制剂的方法。
22.本发明进一步提供了通过根据本发明的工艺获得的丙烯酰胺含量降低的制剂。
23.本发明的细节、优选的和替代的实施方式以及方面将根据以下说明、所附序列，特别是所附权利要求而显而易见。
附图说明
24.图1示出了seq id no.42(第“65”行)和seq id no.2(第“02”行)的比对：同一性：447/528(84.7％)，相似性：458/528(86.7％)，空位：41/528(7.8％)，序列覆盖率：507/513(98.8％)。
25.序列的简要描述
26.seq id no.1描述了根据本发明的酶的氨基酸的共有序列。
27.seq id no.2描述了来自嗜热假诺卡氏菌的野生型酰胺酶的氨基酸序列(非根据本发明)。
28.seq id no.3描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置68处包含突变(d68n)。
29.seq id no.4描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置74处包含突变(a74y)。
30.seq id no.5描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置445处包含突变(g445a)。
31.seq id no.6描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33处包含突变(s33f)。
32.seq id no.7描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33处包含突变(s33r)。
33.seq id no.8描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置445处包含突变(g445s)。
34.seq id no.9描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、74、445和453处包含四个突变(s33r、a74y、s225t、g445s、a453c)。
35.seq id no.10描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、445和453处包含五个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、g445s，a453c)。
36.seq id no.11描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225和445处包含五个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、g445a)。
37.seq id no.12描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置68、74、445和453处包含四个突变(d68n、a74y、g445s、a453c)。
38.seq id no.13描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74和225处包含四个突变(s33h，d68n，a74y，s225t)。
39.seq id no.14描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、41、68、74、94、201、225、424、445、448、453和507处包含十二个突变(s33r、w41y、d68n、a74y、v94i、y201f、s225t、l424v、g445a、m448h、a453d、a507p)。
40.seq id no.15描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、94、201、225、424、445、448、453和507处包含十一个突变(s33r、d68n、a74y、v94i、y201f、s225t、l424v、g445a、m448h、a453d、a507p)。
41.seq id no.16描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、41、68、74、94、201、225、424、445、448和453处包含十一个突变(s33y、w41y、d68n、a74y、v94i、y201f、s225t、l424v、g445a、m448h、a453d)。
42.seq id no.17描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、41、68、74、201、225、424、445和448处包含九个突变(s33r、w41y、d68n、a74y、y201f、s225t、l424v、g445a、m448h)。
43.seq id no.18描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、41、68、74、94、201、225、424、445、448、453和507处包含十二个突变(s33r、w41y、d68n、a74y、v94i、y201f、s225t、l424v、g445a、m448h、a453c、a507p)。
44.seq id no.19描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、41、68、74、94、201、225、424、445、448和453处包含十一个突变(s33y、w41y、d68n、a74y、v94i、y201f、s225t、l424v、g445a、m448h、a453n)。
45.seq id no.20描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、41、68、74、94、201、225、424、445、448和453处包含十一个突变(s33y、w41y、d68n、a74y、v94i、y201f、s225t、l424v、g445a、m448h、a453q)。
46.seq id no.21描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、41、68、74、94、201、225、424、445、448和453处包含十一个突变(s33y、w41y、d68n、a74y、v94i、y201f、s225t、l424v、g445a、m448h、a453e)。
47.seq id no.22描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、41、68、74、94、201、225、424、445、448和453处包含十一个突变(s33y、w41y、d68n、a74y、v94i、y201f、s225t、l424v、g445a、m448h、a453k)。
48.seq id no.23描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225、445和454处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、g445a、p454n)。
49.seq id no.24描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225、445和457处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、g445a、v457g)。
50.seq id no.25描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225、424和445处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、l424v、g445a)。
51.seq id no.26描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225、445和453处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、g445a、a453d)。
52.seq id no.27描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225和445处包含五个突变(s33y、d68n、a74y、s225t、g445a)。
53.seq id no.28描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、175和445处包含五个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、g175a、g445a)。
54.seq id no.29描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225、445和507处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、g445a、a507p)。
55.seq id no.30描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225、445和453处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、g445a、a453s)。
56.seq id no.31描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、94、225和445处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、v94i、s225t、g445a)。
57.seq id no.32描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225、317和445处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、v317i、g445a)。
58.seq id no.33描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位
置33、68、74、201、225和445处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、y201f、s225t、g445a)。
59.seq id no.34描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、445和448处包含五个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、g445a、m448h)。
60.seq id no.35描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225、445和453处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、g445a、a453r)。
61.seq id no.36描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、221、225和445处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、p221g、s225t、g445a)。
62.seq id no.37描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、217、225和445处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、t217r、s225t、g445a)。
63.seq id no.38描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225、328和445处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、d328r、g445a)。
64.seq id no.39描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225和445处包含五个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、g445s)。
65.seq id no.40描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、68、74、225、229和445处包含六个突变(s33r、d68n、a74y、s225t、l229c、g445a)。
66.seq id no.41描述了根据本发明的氨基酸序列，与seq id no.2相比，该序列在位置33、41、68、74、225和445处包含六个突变(s33r、w41y、d68n、a74y、s225t、g445a)。
67.seq id no.42对应于wo 2004/083423中公开为“seq id no.3”的嗜热假诺卡氏菌的蛋白质序列。
具体实施方式
68.在本发明的第一方面中，提供一种用于减少制剂中丙烯酰胺含量的酶，所述酶包含根据seq id no.1的氨基酸共有序列或由根据seq id no.1的氨基酸共有序列组成，其中所述氨基酸共有序列不是根据seq id no.2的序列，并且其中所述酶包含与选自由seq id no.3至seq id no.41中所述的序列组成的组的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列或由与选自由seq id no.3至seq id no.41中所述的序列组成的组的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。
69.如上所述，seq id no.1描述了根据本发明的酶的氨基酸共有序列。共有序列描述了根据本发明的所有酶所拥有的氨基酸序列。可变位置由xaa指示，并表示根据本发明的酶可能彼此不同的位置。
70.酶是催化特定化学反应的生物催化剂。在本例中，丙烯酰胺被酰胺酶降解，丙烯酰胺的酰胺键通过水解发生裂解以形成丙烯酸和氨。在咖啡制备过程中，丙烯酸和氨或者，如适用，其产生的物质(在丙烯酸或氨进一步反应的情况下)的浓度非常低，因此对最终用户没有负面影响。例如，氨立即反应生成无害的铵，其对最终产品没有影响。
71.每当本发明以百分比的形式提及氨基酸序列的序列同一性时，此类引用指的是下述值：对于核酸序列可使用emboss water双序列比对(核苷酸)计算(http：//www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_water/nucleotide.html)，或对于氨基酸序列可使用emboss water双序列比对(蛋白质)计算(http：//www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_water/)。在欧洲分子生物学实验室(embl)欧洲生物信息学研究所(ebi)提供的局部序列比
对工具的情况下，使用了改进的smith-waterman算法(见http：//www.ebi.ac.uk/tools/psa/and smith，t.f.&waterman，m.s.“identification of common molecular subsequences”journal of molecular biology，1981147(1)：195-197)。此外，在此，当使用改进的smith-waterman算法执行两个序列的各自的双序列比对时，参考了embl-ebi当前给出的默认参数。这些是(i)对于氨基酸序列：matrix＝blosum62，空位开放罚分＝10和空位拓展罚分＝0.5以及(ii)对于核酸序列：matrix＝dnafull，空位开放罚分＝10和空位拓展罚分＝0.5。除了默认参数外，当将兴趣序列(“查询序列”，用于emboss第一个序列)与参考序列(“目标序列”，用于emboss第二个序列)比对时，目标序列必须在单个比对长度上以至少93％表示(“序列覆盖率”为至少93％)；出于本技术的目的，在确定序列同一性时，排除了目标序列的序列覆盖率较低的比对。然而，查询序列可能长于比对的长度，查询序列的比对中表示的序列可能高于或低于93％。例如，目标序列共513个氨基酸中的507个氨基酸发生在作为查询序列的seq id no.56与作为目标序列的seq id no.2的比对中(图1)；因此，序列覆盖率为507/513(98.8％)。
72.因此，在本发明的上下文中，术语“序列同一性”可以与“序列同源性”互换使用。后者总是指与确定了序列同一性或序列同源性的酶的总长度相比的根据本发明的酶的总长度。
73.在本发明的上下文中，制剂是指任何生的、半成品或成品食品、高档食品或化妆品，举例来说，其包括油煎或油炸土豆制品、烤谷类或含有它们的产品、玉米制品、咖啡制品例如固体或液体咖啡提取物和生咖啡、菊苣提取物、谷物咖啡制品、咖啡替代品、零食、小麦制品、化妆品、烘焙食品或糕点例如饼干、曲奇、脆饼干、谷物棒、司康饼、冰淇淋甜筒、华夫饼、松脆饼、姜饼、薄脆饼干和面包替代品、意大利面、大米、鱼制品、肉制品、谷物、啤酒、坚果、儿童和婴儿辅食、发型产品、个人护理产品、头发护理产品和面部护理产品。
74.在本发明的上下文中，根据本发明的酶不包含根据seq id no.2的序列或不由根据seq id no.2的序列组成。seq id no.2描述了衍生根据本发明的酶的来自嗜热假诺卡氏菌的野生型酶的氨基酸序列。
75.建立根据seq id no.2的氨基酸序列的同源性模型，即来自嗜热假诺卡氏菌的野生型酶的同源性模型。yasara结构版本20.10.4.l.64软件用于该目的，包括macro hm_build.mcr。保留默认设置。晶体结构3a1k、3a1i、3ip4和2gi3(https：//www.rcsb.org/)用作最终同源模型的模板，其主要基于构成来自红球菌n-771的酰胺酶的同源二聚体结构3a1k，该结构以其催化活性形式作为同源二聚体存在(https：//www.rcsb.org/structure/3a1k)。在不希望受到任何科学理论约束的情况下，假设根据seq id no.2的氨基酸序列，即来自嗜热假诺卡氏菌的野生型酶，具有pdb 3a1k型的折叠结构。对于催化丝氨酸(194)的α-c原子，以下氨基酸残基具有以下空间距离：a74、d68、a507、g445、l424和s33。其中，以下残基具有以下空间距离：g445至l424、g445至s33、d68至a74、d68至a507。因此，在半径为约的g445周围的空间球体内存在活性中心以及l424和s33。残基d68和a74位于半径为(从两个氨基酸的几何中心)的空间球体内的环状结构中或位于从a74的c-α原子开始的半径为的空间球体内。所有命名的距离均指氨基酸的c-α原子。
76.此外，根据优选的实施方式，在本发明的上下文中，通常不需要使用来自嗜热假诺卡氏菌的野生型酶。即，根据一个优选的实施方式，根据seq id no.1的序列不仅不是根据seq id no.2的序列，而且通常不是来自嗜热假诺卡氏菌的野生型酰胺酶的序列。
77.例如，在ep 1608746b1中描述了来自嗜热假诺卡氏菌的其他(耐热)酰胺酶，但这些不是根据本发明的酶。此外，ep 1608746未证明其中所述的酶可有利地用于本发明意义上的食品或高档食品行业，特别是不在本文所述的温度和/或ph值条件下。
78.根据本发明的酶可以从野生型酶开始，通过执行一个或多个步骤(优选定向突变、或可选的非定向突变、或定向和非定向突变)获得。定向突变是酶基因的一个或多个dna碱基的靶向改变，会对氨基酸序列产生一个或多个靶向效应。与此相对，非定向突变是在整个dna序列中未精确选择的部分中的随机诱变。在非定向诱变后，对产生的蛋白质进行检测，以确定其是否具有所需特性。待修饰的酶可以是野生型酶。这是导致本发明的考虑和调查中的情况。在本发明的上下文中，野生型酶被理解为一种天然存在的、技术上未经修饰的酶，其已作为功能酶或其序列从自然界中分离出来，其中该序列以及因此也是功能酶未经人手修饰。在一个实施方式中，所述酶可以是迭代非定向诱变的产物。在另一个实施方式中，所述酶可以是迭代定向诱变的产物。
79.在本发明的研究过程中，从野生型酶开始产生了2000多个不同的突变体，所有突变体在酶基因的不同位点都有不同的突变。然后测试这些突变体在不同ph值和温度下的活性和稳定性。由此，在进一步的诱变步骤中，可以以这样的方式对酶进行修饰，与野生型酶相比提高了活性和稳定性。与催化相关的氨基酸残基未发生突变，特别是由位置95处的赖氨酸、位置170处的丝氨酸和位置194处的丝氨酸组成的酶的催化三联体未发生突变。
80.在本发明的上下文中，其通常适用于根据本发明的酶，在其氨基酸序列中，这三个位置中的一个、几个或全部、优选全部未突变，分别在本文所述的根据本发明的序列的位置95处优选赖氨酸，和/或在本文所述的根据本发明的序列的位置170处优选丝氨酸，和/或在本文所述的根据本发明的序列的位置194处优选丝氨酸，优选在位置95处为赖氨酸，在位置170处为丝氨酸，在位置194处为丝氨酸。
81.在本发明的上下文中，活性是指酶在单位时间内催化酰胺键的水解裂解的能力，而稳定性是指酶在各种环境条件下，如ph值和温度，经过一定时间后的剩余活性。技术人员充分了解合适的诱变方法以及必要的条件和试剂。突变发生在基因水平，例如，通过替换(置换)、移除(删除)或添加碱基。这些突变对产生的蛋白质的氨基酸序列有不同的影响。在置换的情况下，可能会发生所谓的“无义”突变，导致蛋白质生物合成提前停止，使得产生的蛋白质功能失调。在所谓的“错义”突变中，只有编码的氨基酸发生变化；这些突变导致产生的蛋白质的功能变化，在最好的情况下，可能导致产生的蛋白质的稳定性或活性提高。在一般命名法中，氨基酸置换突变是基于其位置和被取代的氨基酸来指定的，例如，为a143g。该符号表示在n-端至c-端氨基酸序列的位置143处，氨基酸丙氨酸已被交换为鸟嘌呤。
82.在本发明的一个优选的实施方式中，氨基酸序列(即，由根据本发明的酶组成或构成根据本发明的酶的氨基酸序列与根据seq id no.1的序列或根据seq id no.1的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中所述氨基酸序列不是根据seq id no.2的序列)具有至少一个、多个或全部选自由以下氨基酸的位置33、41、68、74、94、175、201、217、221、225、229、317、328、424、445、448、453、454、457和
507组成的组的位置，所述氨基酸不对应于根据seq id no.2的氨基酸序列的相应一个或多个位置的氨基酸。
83.在本发明的另一个实施方式中，氨基酸序列具有至少一个、多个或全部选自由以下氨基酸的位置33、68、74、201、225、424、445、448和453组成的组的位置，所述氨基酸不是根据seq id no.2的氨基酸序列的相应一个或多个位置的氨基酸。
84.在本发明的另一个实施方式中，氨基酸序列
85.在位置33处具有精氨酸或酪氨酸或组氨酸或苯丙氨酸，和/或
86.在位置41处具有酪氨酸，和/或
87.在位置68处具有天冬酰胺，和/或
88.在位置74处具有酪氨酸，和/或
89.在位置94处具有异亮氨酸，和/或
90.在位置175处具有丙氨酸，和/或
91.在位置201处具有苯丙氨酸，和/或
92.在位置217处具有精氨酸，和/或
93.在位置221处具有甘氨酸，和/或
94.在位置225处具有苏氨酸，和/或
95.在位置229处具有半胱氨酸，和/或
96.在位置317处具有异亮氨酸，和/或
97.在位置328处具有精氨酸，和/或
98.在位置424处具有缬氨酸，和/或
99.在位置445处具有精氨酸或丝氨酸，和/或
100.在位置448处具有组氨酸，和/或
101.在位置453处具有天冬氨酸或半胱氨酸或天冬酰胺或谷氨酰胺或谷氨酸或赖氨酸或精氨酸或丝氨酸，和/或
102.在位置454处具有天冬酰胺，和/或
103.在位置457处具有甘氨酸，和/或
104.在位置507处具有脯氨酸。
105.在本发明的另一个实施方式中，氨基酸序列，
106.在位置33处具有精氨酸或酪氨酸，和/或
107.在位置68处具有天冬酰胺，和/或
108.在位置74处具有酪氨酸，和/或
109.在位置201处具有苯丙氨酸，和/或
110.在位置225处具有苏氨酸，和/或
111.在位置424处具有缬氨酸，和/或
112.在位置445处具有丙氨酸，和/或
113.在位置448处具有组氨酸，和/或
114.在位置453处具有天冬氨酸或半胱氨酸。
115.由上述位置处的优选氨基酸，当从根据seq id no.2的野生型序列开始时，出现以下优选的实施方式或氨基酸置换。
116.在本发明的一个实施方式中，氨基酸序列具有至少一个选自由s33r、s33y、s33h、s33f组成的组的氨基酸置换，特别优选氨基酸置换s33r和s33y。
117.在本发明的另一个实施方式中，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换w41y。
118.在本发明的优选实施方式中，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换d68n。
119.根据本发明的另一优选实施方式，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换a74y。
120.在本发明的另一个实施方式中，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换v94i。
121.在本发明的另一个实施方式中，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换g175a。
122.在本发明的另一个实施方式中，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换y201f。
123.根据本发明的另一个实施方式，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换t217r。
124.在本发明的另一个实施方式中，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换p221g。
125.在本发明的另一优选实施方式中，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换s225t。
126.根据本发明的另一个实施方式，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换l229c。
127.在本发明的又一个实施方式中，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换v317i。
128.在本发明的另一个实施方式中，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换d328r。
129.根据本发明的另一个实施方式，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换l424v。
130.在本发明的另一个实施方式中，氨基酸序列具有至少一个选自由g445a和g445s组成的组的氨基酸置换，优选氨基酸置换g445a。
131.根据本发明的另一个实施方式，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换m448h。
132.在本发明的另一个实施方式中，氨基酸序列具有至少一个选自由a453d、a543c、a453n、a453q、a453e、a453k、a453r和a453s组成的组的氨基酸置换，特别优选氨基酸置换a453d或a453c。
133.根据本发明的另一个实施方式，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换p454n。
134.根据本发明的又一个实施方式，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换v457g。
135.在本发明的另一个实施方式中，氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换a507p。
136.从本文中，本领域技术人员自然认为，本文所述的一种或多种氨基酸置换，特别是上述置换，或优选地存在于各位置的氨基酸，可以以任何期望的方式彼此结合，以获得根据本发明的酶，如有必要，结合本文未描述的其它置换或根据seq id no.1的氨基酸以外的氨基酸(在这方面，参见根据本发明所描述的“与根据seq id no.1的序列为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性”)。在本发明的上下文中，此处优选位于功能区之外，特别是催化区(参见上文)之外的那些氨基酸置换。
137.尽管wo 2006/040345中已提及在食品生产工艺中使用其他酶(非根据本发明)，但不可能证明其在生产丙烯酰胺减少的产品中的有效性。此外，使用根据本发明的酶，可以高效且快速地降解制剂中的丙烯酰胺。这在连续或半连续的大规模工艺中特别有利，例如在食品和高档食品行业，因为这确保酶处理的停留时间短，以及任何易腐半成品的快速的进一步加工。非常优选且有利地，根据本发明的酶可用于咖啡产品/咖啡替代品生产，因为丙烯酰胺的降解是获得安全无害的最终食品的必要过程。
138.根据本发明的一个优选的实施方式，所述酶是酰胺酶。酰胺酶或酰胺水解酶是一类催化酰胺键的水解的酶。酰胺酶在自然界中大量存在，用于例如洗涤剂和家用清洁剂等传统产品中。已经证明，在本发明的上下文中使用至少一种酰胺酶是有利的，因为它通过非
常简单的机制断裂丙烯酰胺的酰胺键，不需要任何额外的试剂或辅因子。
139.在另一优选的实施方式中，所述酶适合在高达50℃或更高的温度、优选至少高达60℃的温度、更优选至少高达70℃的温度、进一步优选至少高达80℃的温度下具有催化活性，和/或在该温度下用于本发明的上下文中。在本发明的上下文中，催化活性意味着丙烯酰胺的酰胺键发生可检测的断裂。在本发明的上下文中，特别优选在高达80℃的温度下的活性，因为大多数不耐热的蛋白质和酶在超过42℃的温度时失去其活性。借助根据本发明的酶，即使在高达80℃的温度时也可以有利地获得酶的催化活性。食品和高档食品行业的许多工艺都需要如此高的温度，因为重要的烹饪、煮沸和加工过程都是在50℃以上的温度下进行的，在某些情况下，温度高达80℃或更高。
140.在又一个优选的实施方式中，所述酶适合在ph 4至ph 7的范围内表现出催化活性和/或在这种ph范围内在本发明的上下文中使用。根据另一优选的实施方式，所述酶(至少)在ph 4至ph 6.5的范围内表现出催化活性，优选在ph 4.5至ph 5.5的范围内。当然，所述酶也可以在这些ph范围之外表现出催化活性，或者可以在本发明范围内的这些范围内使用。ph对酶的稳定性和活性起着至关重要的作用。高于或低于最佳ph的ph通常会导致活性的部分或完全丧失。因此，更令人惊讶的是，根据本发明的酶可以在具有微酸ph的制剂中有效地用于丙烯酰胺降解步骤。
141.在一个实施方式中，所述酶在(至少)ph 4至ph 7的范围内、优选在ph 4至ph 6.5的范围内，更优选在ph 4.5至ph 5.5的范围内，在高达50℃或更高的温度、优选至少高达60℃的温度、更优选至少高达70℃的温度、更优选至少高达80℃的温度下表现出催化活性至少24小时、优选至少48小时、更优选至少72小时。
142.在另一优选的实施方式中，所述酶在(至少)ph 4至ph 7的范围内、优选在ph 4至ph 6.5的范围内、更优选在ph 4.5至ph 5.5的范围内，在高达50℃或更高的温度、优选至少高达60℃的温度、更优选至少高达70℃的温度、进一步优选至少高达80℃的温度下表现出催化活性。当然，所述酶也可以在这些ph范围之外、在高达所述温度时表现出催化活性，因此可以在此类范围内使用。
143.结合构成本发明的研究，令人惊讶的是，可以识别在酸性ph范围和高温下也存在或保留其催化活性的酶。使用这种酶在咖啡/咖啡替代品生产中用于丙烯酰胺降解，例如用于处理烘焙咖啡/咖啡替代品的提取物方面非常有利。提取后，此类制剂的温度超过50℃，通常甚至超过70℃或甚至超过80℃。众所周知，此类提取物具有微酸的ph。在这些条件下，天然存在的酶通常不会表现出足够的催化活性。因此，在此类制剂中使用根据本发明的酶以在这些条件下有效地降解丙烯酰胺更为有利。
144.根据本发明的一个优选的实施方式，所述酶包含与选自由根据seq id no.3至seq id no.41的序列组成的组的序列，优选地选自根据seq id no.14、seq id no.15、seq id no.16、seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20、seq id no.21和seq id no.22的序列，特别优选地选自根据seq id no.19、seq id no.20、seq id no.21和seq id no.22的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
145.在本发明的另一优选的实施方式中，所述酶是来自嗜热假诺卡氏菌的改性酰胺酶。生物体嗜热假诺卡氏菌的特点是其分布在温度相当高的环境中，如粪堆、温泉等。该生
物体属于耐热原核生物；它可以在40℃至50℃之间的温度生长。由于其适应更温暖的环境，其酶也更耐热，但从野生型开始，不超过50℃。令人惊讶的是，在酸性ph范围内的耐受性可以从生物体嗜热假诺卡氏菌的一种酶开始实现，因为嗜热假诺卡氏菌本质上不耐酸。
146.本发明的另一方面涉及降解丙烯酰胺的方法，优选地涉及减少制剂中丙烯酰胺的量的方法，包括以下步骤或由以下步骤组成：
147.(i)提供本发明的酶(如本文所述，优选如本文所述作为优选的或特别有利的)，
148.(ii)提供含有丙烯酰胺的混合物，优选制剂，并添加步骤(i)的酶，
149.(iii)将步骤(ii)产生的混合物优选在40℃至80℃的温度范围内、更优选在45℃至75℃的温度范围内孵育至少20分钟，
150.(iv)任选地，加热步骤(iii)产生的孵育后的混合物以使酶失活，优选通过加热至至少90℃的温度并将温度保持为90℃以上至少15分钟，并任选地冷却所述混合物，
151.以获得一种丙烯酰胺含量低于步骤(ii)中提供的混合物或制剂的产品。
152.本发明意义上的孵育是指来自步骤(ii)的所提供混合物在特定温度下保持预定时间。本发明意义上的保持温度是指步骤(iii)中孵育后的混合物的温度在限定的持续时间内没有变化或没有显著变化。在这方面，温度的微小波动是可以接受的，并且可以由本领域技术人员进行评估。
153.在本发明的一个实施方式中，所述酶可以重组生产，具有本领域技术人员熟悉的适当表达生物体和条件。此外，所述酶可未经纯化作为裂解物存在、或部分纯化或高度纯化。本领域技术人员已知合适的纯化工艺。
154.在另一实施方式中，根据本发明的酶可以作为溶液存在或被固定化。技术人员充分了解合适的固定化过程。
155.失活是指由于极高的温度以及酶的氨基酸链的展开而导致的酶活性的丧失。在另一个实施方式中，之后可以通过本领域技术人员常用的方法，例如过滤、吸收或吸附，从制剂中去除失活的酶。
156.在本发明方法的一个实施方式中，最初提供的混合物或制剂中包含的丙烯酰胺是美拉德反应的产物。例如，在油炸或油煎食物的过程中可以观察到美拉德反应，且其本身表现为典型的褐变。在烘焙咖啡产品以获得典型的烘焙味道时，美拉德反应也是必不可少的。美拉德反应的产物是丙烯酰胺，在本发明过程中使用本发明的酶裂解丙烯酰胺。
157.根据本发明方法的另一优选的实施方式，所提供制剂所含的丙烯酰胺是美拉德反应的产物，并且所述制剂是用于愉悦或营养的制剂或化妆品制剂，或用于制备所述制剂的半成品，优选地其中所述制剂选自由油煎或油炸土豆制品、烤谷类或含有它们的产品、玉米制品、咖啡制品例如固体或液体咖啡提取物和生咖啡、菊苣提取物、谷物咖啡制品、咖啡替代品、零食、小麦制品、化妆品、烘焙食品或糕点例如饼干、曲奇、脆饼干、谷物棒、司康饼、冰淇淋甜筒、华夫饼、松脆饼、姜饼、薄脆饼干和面包替代品、意大利面、大米、鱼制品、肉制品、谷物、啤酒、坚果、儿童和婴儿辅食、发型产品、个人护理产品、头发护理产品和面部护理产品组成的组。
158.半成品和成品的区别在于其加工程度不同。半成品是经过进一步加工的所有产品。它们可以是，例如，烘焙咖啡提取物、面团、生咖啡、土豆制品等。另一方面，成品不会进一步加工，而是以其形式包装并交付给消费者。成品的实例包括速溶咖啡、即用咖啡粉、薯
片、面条等。
159.根据本发明方法的另一优选的实施方式，在每种情况下，基于产品的总重量，获得的产品中的丙烯酰胺含量＜2000μg/kg、优选＜850μg/kg、特别优选＜500μg/kg。每当本公开中提及小于(“＜”)的值时，该值范围——尽可能且有用的——优选地还包括0。例如，＜2000μg/kg的指示是0至2000μg/kg的值的范围。
160.在根据本发明的方法的另一实施方式中，与未经根据本发明的方法处理的制剂相比，丙烯酰胺含量可以减少或减少60％、优选65％、特别优选70％、进一步优选75％、特别优选80％、进一步优选85％、特别优选90％、进一步优选95％和非常特别优选100％。
161.本发明的另一方面涉及一种制备丙烯酰胺含量降低的用于娱乐或营养的制剂或化妆品制剂的方法，优选地其中所述制剂选自由油煎或油炸土豆制品、烤谷类或含有它们的产品、玉米制品、咖啡制品例如固体或液体咖啡提取物和生咖啡、菊苣提取物、谷物咖啡制品、咖啡替代品、零食、小麦制品、化妆品、烘焙食品或糕点例如饼干、曲奇、脆饼干、谷物棒、司康饼、冰淇淋甜筒、华夫饼、松脆饼、姜饼、薄脆饼干和面包替代品、意大利面、大米、鱼制品、肉制品、谷物、啤酒、坚果、儿童和婴儿辅食、发型产品、个人护理产品、头发护理产品和面部护理产品组成的组，该方法由下步骤组成或包括以下步骤：
162.(i)(a)提供通过根据本发明的方法获得的产品(如本文所述，优选如本文所述作为优选的或特别有利的)，和
163.(b)进一步加工产品和/或添加一种或多种其他成分，以获得用于娱乐或营养的制剂或化妆品制剂，
164.或
165.(ii)(i)提供本发明的酶(如本文所述，优选如本文所述作为优选的或特别有利的)，
166.(ii)提供含有丙烯酰胺的用于娱乐或营养的制剂或化妆品制剂并添加步骤(i)的本发明的酶，
167.(iii)将步骤(ii)产生的制剂优选在40℃至80℃的温度范围内、更优选在45℃至75℃的温度范围内孵育至少20分钟，
168.(iv)任选地，加热步骤(iii)产生的孵育后的制剂以使酶失活，优选通过加热至至少90℃的温度并将温度保持为90℃以上至少15分钟，并任选地冷却该经孵育的制剂，以获得一种丙烯酰胺含量低于步骤(ii)中提供的制剂的制剂。在根据本发明方法的一个实施方式中，将丙烯酰胺含量已降低的半成品进一步加工成最终产品，以获得用于愉悦或营养的制剂或化妆品制剂。在另一实施方式中，用根据本发明的酶处理半成品以获得丙烯酰胺含量降低的制剂。然后将该制剂加热至90℃以上以使所述酶失活。在又一个实施方式中，之后可以通过本领域技术人员常用的方法，例如过滤、吸收或吸附，从制剂中去除失活的酶。
169.根据另一方面，本发明涉及根据本发明的酶用于降解丙烯酰胺和/或用于制备具有降低的丙烯酰胺含量的用于娱乐或营养的制剂或化妆品制剂的用途在每种情况下，基于所述制剂的总重量，丙烯酰胺含量优选＜2000μg/kg、优选＜850μg/kg、特别优选＜500μg/kg。在另一实施方式中，与未使用根据本发明的酶的制剂相比，丙烯酰胺含量可以减少或减少60％、优选65％、特别优选70％、进一步优选75％、特别优选80％、进一步优选85％、特别优选90％、进一步优选95％和非常特别优选100％。
170.本发明的另一方面涉及一种通过或可通过根据本发明的方法制备的用于愉悦或营养的制剂或化妆品制剂(优选上述制剂)，其中丙烯酰胺含量在每种情况下基于制剂的总重量为＜2000μg/kg、优选＜850μg/kg、特别优选＜500μg/kg(和/或其中丙烯酰胺含量如上所述减少，优选如上所述作为优选的)。
171.下面借助于选定的非限制性实施例更详细地解释本发明。
172.实施例
173.1.降解咖啡中丙烯酰胺的酶的研制：
174.1.1制造酶制剂
175.编码酰胺酶及其变体的基因被克隆到表达质粒ple1a17(novagen)中。然后用这些质粒转化大肠杆菌bl21(de3)的细胞。
176.细胞在37℃下在添加卡那霉素(50mg/l)的zym505培养基(f.william studier，protein expression and purification 41(2005)207-234))中培养，并在达到对数生长期时用iptg诱导酶表达至0.1mm最终浓度。诱导后，细胞在30℃下进一步培养约20小时。
177.通过离心收集细胞并在裂解缓冲液(50mm磷酸钾，ph 7.2；2mm mgcl2；0.5mg/ml溶菌酶；0.02u/μl核酸酶)中消化。消化是通过在液氮中多次冷冻和解冻或通过超声波以机械方式进行的。离心并分离不溶性成分后，获得含有可溶性酶的粗提取物。
178.1.2测定酶活性
179.对于酰胺酶活性的标准测定，遵循ph 5.5和40℃下丙烯酰胺中氨的释放。一个酰胺酶单元对应于在40℃下从ph 5.5的50mm醋酸钠缓冲液中的25mm丙烯酰胺每分钟释放1μmol氨。例如，使用megazymes的氨快速检测试剂盒对释放的氨进行定量。以u/ml给出的活性指的是光密度(在600nm处测量)为100的粗提取物的ml。
180.在其他ph值(ph 5.0)和温度(50℃/60℃)下类似地测定活性。与标准活度相比发生变化的参数单独显示。
181.1.3测定酶稳定性
182.1.3.1测定不同ph值下的tm值
183.为了记录酰胺酶的温度稳定性，确定tm 50值。为此，在25℃至85℃的不同温度下，将含有酶的粗提取物在50mm醋酸钠缓冲液(ph 4.5至ph 5.5)中孵育15分钟。然后将该粗提取物在冰上孵育15分钟，离心，然后使用上清液在第1.2节所述的标准条件下进行活性测定。未处理样本的活性值设置为100％，所有其他值均标准化为该值。tm 50值对应于酶仍有50％活性的温度。
184.1.3.2测定不同ph值和温度下的稳定性
185.为了研究酶的长期稳定性，将粗提取物在特定ph(例如ph 4.5至5.5)和特定温度(例如50℃至75℃)下孵育较长时间。在24小时内进行定期采样，在此期间，将样品与1体积当量的100mm ph 5.5的naac缓冲液混合，并立即在液氮中冷冻。解冻后，对样品进行离心，并使用上清液在第1.2节所述的标准条件下进行活性测定。通过将孵育后测定的活性值与未经处理样品在时间为0小时时的活性进行比较，计算残余活性百分比，其中未经处理样品的活性值设置为100％，孵育后测定的活性值作为与之相关的残余活性百分比给出。
186.1.4检查酶变体
187.基于seq id no.2的野生型序列，生成单突变体，并从这些突变体中组合选出的氨
基酸置换。
188.表1：稳定性和活性测定结果(标准测定)
[0189][0190][0191]
如果表中未给出数据或使用术语n.d.(表示“未确定”)，则不会记录相应的酶变体。
[0192]
可以看出，本发明的酶可以实现在50℃以上的温度下的稳定性，以及在高温和酸性ph下的活性。
[0193]
进一步的研究表明，根据本发明的酶，特别是本文所述的作为优选的酶，在其他方面也特别适合于本文所述的目的和要求，特别是通过引入的方式。
[0194]
1.5研究不同氨基酸置换及其对酶稳定性和活性的影响
[0195]
seq id no.11的酶用作模板，并在此基础上生成单突变体。个别氨基酸置换对酶的活性和稳定性有不同的影响。对于该表征，基于稳定性和活性两个标准选择突变体。其各自的特性在很大程度上取决于置换的氨基酸及其位置。特别是，这些研究产生了依据本发明特别适合本的酶(如本文所述)。
[0196]
表2：与seq id no.11的酶相比的氨基酸置换的结果(根据本发明，但不是特别优
选)。hit标准描述了在每种情况下进行选择的特性。这在一方面与seq id no.11的酶相比具有更高的稳定性，另一方面，与seq id no.11的酶相比具有更高的活性。
[0197][0198][0199]
1.6研究不同突变组合及其对酶变体的活性和稳定性的影响。
[0200]
从seq id no.11开始产生数个单突变体，并在重组库中组合选择的氨基酸置换。然后对选择的合适的变体进行稳定性和活性筛选。
[0201]
表3：氨基酸置换的不同组合的结果及其对根据本发明的酶的稳定性和活性的影
响。
[0202][0203][0204]
1.7位置453处的饱和诱变
[0205]
检查seq id no.16的变体中位置453处的所有氨基酸置换。获得了活性增强的变体，这是在大肠杆菌中可溶性表达增强的结果。酶的稳定性得以保持。
[0206]
表4：饱和诱变的结果及其对根据本发明的酶的稳定性和活性的影响。
[0207][0208]
2.生产根据本发明的示例性产品：
[0209]
2.1生产丙烯酰胺减少的咖啡产品的方法
[0210]
2.1.1生产咖啡提取物
[0211]
根据neuhaus neotec colortest ii，将巴西阿拉比卡咖啡品种的咖啡豆烘焙至色值为110。通过在145℃至230℃之间的温度烘焙咖啡豆，形成丙烯酰胺。烘焙的咖啡在13级的vt6咖啡研磨机上研磨。首先将磨碎的咖啡倒入提取装置的渗滤器中，然后注入70l温度为85℃的水。使混合物溶胀一小时。然后在85℃下开始提取。在85℃和6bar超压下，100l水通过渗滤器进入收集容器。热水溶解了咖啡中的可溶性成分，包括丙烯酰胺。
[0212]
2.1.2咖啡提取物的酶处理
[0213]
提取后，将获得的咖啡提取物在收集容器中加热至70℃的温度，并保持在该温度。然后添加根据本发明的酶，例如根据seq id no.22的酶。添加酶的量应使用1000u/l的酶浓度。
[0214]
将所述酶添加到所述提取物中，搅拌并在70℃孵育30分钟。孵育后，将该提取物加热至95℃，保持15分钟以使酰胺酶失活。然后冷却该提取物并准备冷冻干燥。
[0215]
根据咖啡提取物的ph，可以实现与丙烯酰胺量相关的不同减少率。根据使用的酶量，丙烯酰胺浓度也可以达到低于检测极限的水平。然而，本发明的目的是提供一种从经济角度来看也适用于咖啡基质的酶。例如，在ph 4.8和所用的酶为1000u/l时，丙烯酰胺减少了60％。在ph 5.3和所用的酶为1000u/l时，丙烯酰胺减少了90％。因此，获得了丙烯酰胺含量分别为554μg/kg和129μg/kg的丙烯酰胺减少的产品。
[0216]
2.1.3酶处理后进一步加工咖啡提取物
[0217]
在提取和酶处理后，使用冷冻浓缩或蒸发来浓缩咖啡提取物。浓缩是增加提取物中固体含量的中间步骤，因为提取后获得的提取物的固体含量为约2wt.％至6wt.％。对于流化床干燥，要求固体含量为至少20wt％。对于冷冻干燥，较高的固体含量是有利的，但并非绝对必要。
[0218]
浓缩的提取物之后通过冷冻干燥或流化床干燥进行干燥以获得丙烯酰胺减少的最终产品(干燥的溶解咖啡)，其固体含量通常为以重量计约96％。
[0219]
2.2制备丙烯酰胺减少的咖啡替代品的方法
[0220]
例如，菊苣可以作为咖啡替代品使用。菊苣的根用于此目的。它像咖啡一样在150℃至200℃的温度下干燥、压碎和烘焙，然后研磨。以与实施例2.1.2中描述的用于咖啡的相同的方式进行进一步加工以获得可溶的丙烯酰胺减少的提取物。
[0221]
干燥的可溶性菊苣提取物可以用作最终产品或用于混合添加剂，例如用于谷物咖啡或咖啡混合产品。
[0222]
3.测定丙烯酰胺含量以及丙烯酰胺减少：
[0223]
通过用热水提取特定烘焙咖啡的样品来测定丙烯酰胺减少。然后将提取物分为两部分，只有一部分用酰胺酶处理并孵育。除添加酰胺酶外，第二部分经相同的处理，并用作参考样品。在孵育期结束时，通过加热一次至使酶安全变性的温度来停止反应。根据din en iso 18862，采用lc-ms/ms对两种提取物中的丙烯酰胺进行分析。减少率根据经处理样品和参考样品中的丙烯酰胺含量计算得出。
[0224]
4.感官评价：
[0225]
由经训练的感官小组对不同咖啡提取物和咖啡替代品提取物进行的比较感官测试表明，未经处理和经处理的提取物之间无明显的感官差异。