一种氧化节杆菌G6-4B及其在产右旋糖酐酶中的应用的制作方法

一种氧化节杆菌g6
‑
4b及其在产右旋糖酐酶中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种氧化节杆菌g6
‑
4b及其在产右旋糖酐酶中的应用。


背景技术：

2.右旋糖酐酶(dextranase，ec.3.2.1.11)是专一性水解右旋糖酐中α
‑
(1,6)糖苷键的一种葡聚糖水解酶，在制糖工业、口腔龋齿的防治和靶向药物治疗等方面应用广泛。根据氨基酸序列同源性，右旋糖酐酶被列入糖苷水解酶gh49和gh66家族；根据水解方式的不同，右旋糖酐酶被分为外切型(exodextranase)和内切型(endodextranase)。在制糖工业中右旋糖酐的积累会增加糖汁的粘度，导致蔗糖流失，抑制糖分结晶从而影响蔗糖的回收率，右旋糖酐酶能水解糖汁中的右旋糖酐，降低糖汁的粘度，从而提高产物的合格率。同时，利用右旋糖酐酶水解右旋糖酐生成的异麦芽糖类寡聚糖可作为一种益生元，能显著提高肠道内有益微生物(如双歧杆菌)的群落数量。右旋糖酐酶和非水溶性葡聚糖酶的混合使用能有效抑制非水溶性葡聚糖的形成和链球菌的附着，具有抑制牙菌斑生物膜形成的作用。


技术实现要素：

3.本发明提供一种氧化节杆菌g6
‑
4b，该菌可以在温和的条件下产右旋糖酐酶，且本发明还优化了其产右旋糖酐酶的条件。一种氧化节杆菌g6
‑
4b(arthrobacter oxydans)，所述氧化节杆菌g6
‑
4b的保藏编号为cgmcc no.19882。
4.优选的，所述氧化节杆菌g6
‑
4b的生长培养基为2216e培养基，所述氧化节杆菌g6
‑
4b 适宜的生长条件为：15℃～45℃，培养基中nacl的浓度为0～20g/l，所述培养基ph为5～9。
5.进一步优选的，所述氧化节杆菌g6
‑
4b的生长培养基为2216e培养基，所述氧化节杆菌 g6
‑
4b适宜的生长条件为：25℃～35℃，培养基中nacl的浓度为10g/l，所述培养基ph为 6～8。
6.更进一步优选的，所述氧化节杆菌g6
‑
4b的生长培养基为2216e培养基，所述氧化节杆菌g6
‑
4b适宜的生长条件为：30℃，所述培养基ph为7。
7.一种右旋糖酐酶，是使用前述所述的氧化节杆菌g6
‑
4b发酵得到。
8.前述所述的氧化节杆菌g6
‑
4b(arthrobacter oxydans)在产右旋糖酐酶中的应用。
9.前述所述的应用的方法，包括如下步骤：
10.将前述所述的氧化节杆菌g6
‑
4b在发酵培养基中进行培养后离心，提取上清液，得到右旋糖酐酶。
11.优选的，前述所述氧化节杆菌g6
‑
4b先接种到种子培养基中得到种子液，后再将种子液接种至发酵培养基中进行培养。
12.优选的，所述种子培养基为：大豆蛋白胨5g/l，酵母粉1g/l，陈海水配制，ph7.5。
13.优选的，所述发酵培养基包括：碳源1g/l，氮源5g/l，诱导剂8g/l～12g/l，nacl 10g/l， ph 6～8.5，所述碳源选自酵母粉、麸皮或乳糖；所述氮源选自大豆蛋白胨或硝酸钠；所述诱导剂选自右旋糖酐t20、右旋糖酐t40、右旋糖酐t70或右旋糖酐t500。
14.优选的，所述发酵培养基的培养条件为：温度20℃～30℃，发酵时间为42h～54h，接种量为2％～4％。
15.进一步优选的，所述发酵培养基的培养条件为：温度25℃，发酵时间为48h，接种量为 4％。
16.有益效果
17.本发明提供了一种氧化节杆菌g6
‑
4b，经过试验验证，该菌种可以在温和的条件下对其培养后产生右旋糖酐酶，整个发酵过程操作简单，发酵条件容易控制，适合工业化。而且本菌株所产生的右旋糖酐酶具有特殊的理化性质。
附图说明
18.图1为本发明氧化节杆菌g6
‑
4b电镜扫描形态图；
19.图2为本发明氧化节杆菌g6
‑
4b蓝色葡聚糖透明圈图；
20.图3为本发明菌株g6
‑
4b系统发育进化树；
21.图4为温度对菌株g6
‑
4b生长的影响；
22.图5为nacl浓度对菌株g6
‑
4b生长的影响；
23.图6为ph对菌株g6
‑
4b生长的影响；
24.图7为碳源对菌株g6
‑
4b产右旋糖酐酶的影响；
25.图8为氮源对菌株g6
‑
4b产右旋糖酐酶的影响；
26.图9为发酵温度对菌株g6
‑
4b产右旋糖酐酶的影响；
27.图10为发酵培养基初始ph对菌株g6
‑
4b产右旋糖酐酶的影响；
28.图11为发酵时间对菌株g6
‑
4b产右旋糖酐酶的影响；
29.图12为接种量(％)对菌株g6
‑
4b产右旋糖酐酶的影响；
30.图13为右旋糖酐浓度(g/l)对菌株g6
‑
4b产右旋糖酐酶的影响；
31.图14为反应温度对右旋糖酐酶的影响；
32.图15为温度对右旋糖酐酶热稳定性的影响；
33.图16为反应ph对右旋糖酐酶的影响；
34.图17为ph对右旋糖酐酶稳定性的影响；
35.图18为低聚糖标准高效液相色谱图和不同右旋糖酐水解产物高效液相色谱图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.下面结合附图对本发明进行详细说明，以方便本领域技术人员理解本发明。
38.本发明所涉及的菌株g6
‑
4b是在中国江苏省连云港市海州湾高公岛的海泥中分离到的海洋细菌（氧化节杆菌arthrobacteroxydans），该菌株已于2020年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.19882，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话：010
‑
64807355。
39.1、本发明菌株的筛选方法
40.1.1本发明下述实施例中涉及的培养基：
41.2216e培养基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，琼脂2％，陈海水配制，ph8.0。
42.初筛培养基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，蓝色葡聚糖2000 0.2％，右旋糖酐t20 1％，琼脂2％，陈海水配制，ph8.0。
43.种子培养基：大豆蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，陈海水配制，ph7.5。
44.发酵培养基：大豆蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，右旋糖酐t20 1％，nacl 1％，蒸馏水配置， ph7.5。
45.上述所述的百分含量的含义为每g/100ml的含义，例如蛋白胨0.5％指的是蛋白胨的含量是0.5g/100ml，也即5g/l。
46.1.2菌株的筛选方法：
47.称取1g海泥放入50ml 2216e培养基中，30℃、180rpm培养1
‑
2d。根据菌体生长状况设置合适的稀释梯度，涂布于初筛培养基，30℃培养2
‑
4d，观察菌落周围是否出现透明圈。挑取有透明圈的单菌落接入发酵培养基，30℃、180rpm培养2d，12000rpm离心5min取上清液，根据dns法测定酶活力大小。结合菌落透明圈和酶活力选取产右旋糖酐酶的菌株，即菌株g6
‑
4b。
48.2、本发明菌株g6
‑
4b的形态特征与生理生化特征。
49.2.1形态特征：
50.菌株g6
‑
4b为革兰氏阴性杆菌(见图1)，菌株g6
‑
4b无芽孢，无鞭毛，在2216e固体培养基中培养48h后，菌落呈边缘整齐光滑、浅白湿润。在含有蓝色葡聚糖的固体培养基中，能产生透明圈(见图2)。
51.2.2生理生化特征：
52.该菌株甲基红反应呈阳性，精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶实验呈阴性，能利用葡萄糖、麦芽二糖、蔗糖。部分生理生化结果见表1。
53.表1氧化节杆菌g6
‑
4b生理生化特征
[0054][0055]
注： ：阳性；
‑
：阴性
[0056]
2.3菌株g6
‑
4b的分子生物学鉴定
[0057]
用天根试剂盒提取菌株g6
‑
4b的基因组，选用扩增原核微生物16s rdna序列的通用引物(27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag
‑3’
和1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgctt
‑3’
)。反应体系50μl，taq酶，反应条件为94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃退火30s， 72℃延伸90s，72℃延伸5min。将pcr产物电泳纯化回收构建克隆载体，选阳性克隆子提取质粒送至上海生工测序，将测得序列互补反向拼接，获得长度约1500bp的碱基片段序列。将菌株g6
‑
4b的16s rdna基因序列如seqid no 1所示，通过16s rdna序列同源性比较，可以初步确定该菌株为氧化节杆菌(arthrobacter oxydans)。将亲缘关系较近的菌株16s rdna 运用mega6软件进行多重比较，用中邻接法(neibor
‑
joing method)建系统进化树，从进化树表明菌株g6
‑
4b与arthrobacter oxydans亲缘关系最近(参见图3)。
[0058]
seqid no 1：
[0059]
agagtttgatcctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgatgaagc cagcttgctggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactctgggataagc ctgggaaactgggtctaataccggatatgactgatcatcgcatggtggttggtggaaagcttttgcggttttg gatggactcgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctga gagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatatt gcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctcttt cagtagggaagaagccgcaaggtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccg cggtaatacgtagggcgcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtct gccgtgaaagtccggggctcaactccggatctgcggtgggtacgggcagactagagtgatgtaggggagac tggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccgatggcgaaggcaggtctctgg gcattaactgacgctgaggagcgaaagcatggggagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgta aacgttgggcactaggtgtgggggacattccacgttttccgcgccgtagctaacgcattaagtgccccgcct ggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcgg attaattcgatgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatgaaccggaaacgcctggaaacaggtgccc cacttgtggtcggtttacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgc aacgagcgcaaccctcgttctatgttgccagcacgtgatggtggggactcataggagactgccggggtcaac tcggaggaaggtggggacgacgtcaaatcatcatgccccttatgtcttgggcttcacgcatgctacaatggcc ggtacaaagggttgcgatactgtgaggtggagctaatcccaaaaagccggtctcagttcggattggggtctg caactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccggg ccttgtacacaccgcccgtcaagtcacgaaagttggtaacacccgaagccggtggcctaacccttgtggggg gagccgtcgaaggtgggactggcgattgggactaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctg gatcacct
[0060]
3、本发明菌株g6
‑
4b的生长特性
[0061]
本发明提供的菌株g6
‑
4b，对其生长特性进行了细致地研究，获得了该菌株的生长条件。
[0062]
3.1种子液的制备：将菌株g6
‑
4b斜面种子接种到种子培养基中，30℃，180rpm，装液量20％，培养12h。此处的装液量20％指的是装液量为摇瓶总体积的20％。
[0063]
3.2温度对菌株g6
‑
4b生长的影响：
[0064]
以2216e作为菌株的生长培养基，将种子液以2％接种量(也即接种量为培养基体积的2 ％)于2216e液体培养基中，ph8.0，转数180rpm，装液量20％，分别在不同温度下培养
12 h，选择在600nm波长下测定od值，可以看出该菌株的生长温度范围为15℃
‑
45℃，最适生长温度为30℃，如图4所示。
[0065]
3.3nacl对菌株g6
‑
4b生长的影响：
[0066]
按照3.1方法制备种子液，在2216e液体培养基(将陈海水改用蒸馏水)中加入nacl，质量体积浓度为0
‑
8％(也即0～80g/l)，在30℃培养12h，测定细胞浓度，适宜生长的nacl 质量体积浓度为0
‑
2％(也即0
‑
20g/l)，最适生长nacl浓度为1％(也即10g/l)，如图5 所示。
[0067]
3.4ph对菌株g6
‑
4b生长的影响：
[0068]
在2216e液体培养基(将陈海水改用蒸馏水)加入终浓度为10mmol/l的不同ph的缓冲液(mes、pipes、hepes、naoh)，使培养基ph分别为4.0
‑
10.0之间，再加入浓度为 1％的nacl，30℃培养12h，测定细胞浓度，生长ph范围为5.0
‑
9.0，最适生长ph为7.0，见图6。
[0069]
4、菌株g6
‑
4b产右旋糖酐酶的方法
[0070]
氧化节杆菌g6
‑
4b在发酵培养基中进行培养后离心，提取上清液，得到右旋糖酐酶。
[0071]
所述发酵培养基选自：大豆蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，右旋糖酐t20 1％，nacl 1％，蒸馏水配置，ph7.5。
[0072]
上述所述的百分含量的含义为每g/100ml的含义，如大豆蛋白胨0.5％指的是大豆蛋白胨的含量是0.5g/100ml，也即5g/l。
[0073]
4.1碳氮源种类对菌株g6
‑
4b产酶的影响：
[0074]
碳源：0.1％(即为1g/l)的碳源(酵母粉、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、麸皮、蔗糖)和0.5％(即为5g/l)的氮源(大豆蛋白胨、尿素、氯化铵、硝酸钠、硫酸铵)分别依次替换上述发酵培养基中的酵母粉和大豆蛋白胨，30℃，180rpm，培养48h。分别测定不同碳氮源培养基中的菌株酶活力。结果如图7和图8所示，酵母粉作为培养基碳源时，可显著促进产右旋糖酐酶，麸皮的效果其次，乳糖效果排名第三；大豆蛋白胨作为氮源时对产酶的促进也较为可观，硝酸钠的促进效果其次。因此选择酵母粉和大豆蛋白胨分别作为发酵培养基的碳源和氮源。
[0075]
4.2发酵温度对菌株g6
‑
4b产酶影响：
[0076]
将接种培养18h的种子液以2％接种量接种至上述最优的发酵培养基，于15℃
‑
40℃分别培养48h后分别测酶活力，结果见图9。菌株g6
‑
4b最佳产酶温度为25℃，低于20℃或高于30℃，产酶量均有大幅度下降。
[0077]
4.3发酵培养基初始ph对菌株g6
‑
4b产酶的影响：
[0078]
以2％接种量接种至不同初始ph的发酵培养基，于25℃，180rpm培养48h后分别测酶活力。初始ph调节范围为5.5
‑
9.0。培养基初始ph对产酶的研究结果表明，培养48h，该菌株产酶的最适初始ph为7.5。随着ph的升高和下降，酶活力均受到较大影响，见图10。
[0079]
4.4发酵时间对菌株g6
‑
4b产酶的影响：
[0080]
将菌株g6
‑
4b发酵60h且每隔6h取样测酶活力，结果表明48h为产酶高峰，在48h之前菌株随着发酵时间延长产酶逐渐升高，而继续监控酶活力发现没有太大的变化趋势，结果如图11所示。
[0081]
4.5接种量对菌株g6
‑
4b产酶的影响：
[0082]
按照1％
‑
6％体积的接种量分别转接培养18h的种子液至50ml的发酵培养基，25℃， 180rpm培养48h后分别测酶活力。图12显示最适接种量为4％。
[0083]
4.6不同诱导剂浓度对菌株g6
‑
4b产酶的影响：
[0084]
将右旋糖酐t20作为产酶诱导剂，将不同浓度(0
‑
12g/l)的右旋糖酐t20加入发酵培养基中，25℃，180rpm培养48h后分别测酶活力。随着诱导剂浓度增大，酶活力显著提升，如图13所示。因此选取10g/l的右旋糖酐t20为最佳产右旋糖酐酶诱导剂浓度，不添加右旋糖酐t20检测不到酶活力。
[0085]
5菌株g6
‑
4b所产右旋糖酐酶的性质
[0086]
5.1粗酶液的制备
[0087]
将菌株g6
‑
4b接种至种子培养基，30℃，180rpm，装液量20％，培养18h，得到种子液。将种子液以4％的体积接种至发酵培养基，180rpm，25℃，培养48h，收集酶液，12000 rpm离心5min，取上清液，4℃保藏备用。
[0088]
5.2温度对酶活性的影响
[0089]
将粗酶液稀释适当倍数后置于不同温度下与底物3％的右旋糖酐t70发生反应，测定酶活力，结果见图14，酶的最适作用温度为55℃，在40℃
‑
65℃温度范围时有较高的催化活力，在70℃仍有酶活力。
[0090]
5.3酶的热稳定性
[0091]
将粗酶液稀释适当倍数后置于不同温度(40℃、50℃、60℃)下保温5h，每隔1h取一组样品，于4℃保存，待保温结束后统一标准条件下测定残余酶活力，以未处理酶液的酶活力设为100％，结果见图15，在50℃下保温5h后仍具有85％以上的酶活力。
[0092]
5.4ph对酶活性的影响
[0093]
将粗酶液稀释适当倍数，分别在不同ph的3.0％右旋糖酐t70底物中55℃下进行酶活力的测定，不同ph的缓冲液为：50mm乙酸钠缓冲液(ph 4.0
‑
5.5)、50mm磷酸钠缓冲液(ph5.5
‑
7.5)和50mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.5
‑
9.0)。结果见图16，该酶液的最适作用ph为7.5。
[0094]
5.5酶的ph稳定性：
[0095]
将粗酶液稀释适当倍数与不同ph的缓冲液(按照5.4中的缓冲液)混合，于55℃保温 1h取出测酶活，将未处理酶液的酶活设为100％。结果见图17，结果表明在55℃保温1h后，右旋糖酐酶的酶活力在ph7.0
‑
8.0范围内稳定，残余酶活力保持在80％以上。
[0096]
5.6金属离子对酶的作用：
[0097]
将粗酶液稀释适当倍数后与金属离子混合，使金属离子的终浓度分别达到1mm、5 mm、10mm，然后在55℃，处理30min后，测定酶活力并以不含化学试剂(也即金属离子) 的粗酶液对照计算相对酶活力，结果见表2，结果发现ni
2
、fe
3
、co
2
、cu
2
、zn
2
能显著降低酶的稳定性，其他金属离子如：ca
2
、li

、mn
2
、ba
2
、mg
2
、si
2
、na

、k

和nh
4
对酶活力在一定程度上有抑制作用。结果如表2所示。
[0098]
表2金属离子对右旋糖酐酶酶活力的影响
[0099][0100]
相对酶活力指的是以不含化学试剂的粗酶液的酶活力为100％，添加化学试剂的粗酶液的酶活力为上述不添加的百分比。
[0101]
上表中的control组为空白对照组，即为不添加化学试剂的粗酶液的空白组。
[0102]
5.7菌株g6
‑
4b对右旋糖酐酶底物的特异性：
[0103]
将多种不同底物(右旋糖酐t20、右旋糖酐t40、右旋糖酐t70、右旋糖酐t500、可溶性淀粉、普鲁兰多糖、几丁质)于50mmol/l tris
‑
hcl缓冲液(ph7.5)中，在标准条件下测量酶活力，结果如表3，菌株g6
‑
4b右旋糖酐酶能特异催化由α
‑
1,6糖苷键组成的化合物
‑
不同分子量的右旋糖酐，对由α
‑
1，4和α
‑
1，6糖苷键组成的可溶性淀粉有大约3％的催化活力。
[0104]
表3右旋糖酐酶的底物特异性
[0105]
[0106]
5.8菌株g6
‑
4b右旋糖酐酶水解产物分析：
[0107]
分别以3％右旋糖酐t20、t40、t70为水解底物，在右旋糖酐酶最适作用温度55℃条件下，反应30min，沸水浴5min使右旋糖酐酶失活，过0.22μm滤膜，4℃保存待用。使用 sugar
‑
pak1糖柱对右旋糖酐酶水解产物进行分析；图18(a)为低聚糖标准的hplc图，g1
‑
g7 分别表示葡萄糖、蔗糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽五糖、异麦芽六糖和异麦芽七糖； 3％右旋糖酐t20、t40、t70为水解底物所得产物的高效液相色谱法(hplc)实验分别为图18 (b)～(d)所示，水解聚合度不同的右旋糖酐产生的水解产物种类一致。根据高效液相色谱法测定水解产物的峰面积，水解产物约70％以上为异麦芽三糖，还有少量的异麦芽四糖。
[0108]
5.9右旋糖酐酶活的测定：
[0109]
右旋糖酐酶活测定方法：取20μl适当倍数稀释后的粗酶液加入到180μl 3％的右旋糖酐 t70的tris
‑
hcl缓冲液(0.1mol/l，ph7.5)中，在55℃水浴中反应20min，加入200μl dns，沸水浴中煮沸5min，终止反应并显色，加入3ml去离子水震荡混匀，取200μl与96孔酶标板上与540nm下进行吸光值测定。
[0110]
酶活力单位定义(u/ml)：在一定温度和ph下，每分钟催化产1μmol还原糖的酶量为一个活力单位。
[0111]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。