用于补体抑制的rna
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求保护2020年2月14日提交的美国临时申请第62/977,012号，2020年2月21日提交的美国临时申请第62/980,100号，以及2020年8月6日提交的美国临时申请第63/062,321号的利益，每个临时申请的内容均特此通过引用整体并入本文。
背景技术：
3.补体是由30多种血浆和细胞结合蛋白组成的系统，在先天免疫和获得性免疫中发挥重要作用。补体系统的蛋白通过多种蛋白相互作用和裂解事件在一系列酶促级联中起作用。补体激活经由三种主要途径发生：抗体依赖性经典途径、旁路途径和甘露糖结合凝集素(mbl)途径。不适当或过度的补体激活是许多严重疾病和病状的潜在原因或促成因素，并且在过去几十年中已经投入了相当大的努力来探索各种补体抑制剂作为治疗剂。
技术实现要素：
4.在一个方面，本公开的特征在于包含反义链和有义链的sirna，其中所述反义链和与seq id no：76-100中的任一者具有至少90％同一性的核苷酸序列互补。
5.在一些实施方案中，所述反义链和包含与seq id no：76-100中的任一者相差不超过1、2、3或4个核苷酸的序列的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链和包含seq id no：76-100中的任一者的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链包含含有seq id no：101-125中的任一者的核苷酸序列。
6.在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链中的一者或两者包含至少一个突出端区域。在一些实施方案中，所述至少一个突出端包括1、2、3、4或5个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，所述至少一个突出端包括3’突出端。在一些实施方案中，所述突出端区域与seq id no：75的片段互补。在一些实施方案中，sirna的3’突出端包括2个核苷酸的突出端。
7.在一些实施方案中，sirna包含有义链和反义链，所述反义链在5’末端、3’末端或5’末端和3’末端两处包含至少一个附加核苷酸，所述附加核苷酸与seq id no：75的片段不互补。
8.在一些实施方案中，sirna的有义链和反义链中的一者或两者包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个经修饰的核苷酸包括包含2
’‑
o-甲基的核苷酸、包含2
’‑
氟基团的核苷酸和/或与相邻核苷酸的硫代磷酸酯键。
9.在一些实施方案中，sirna的有义链包含seq id no：76-100、126-150、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、255、259、264、268、272、276、325、326和327中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，sirna的反义链包含seq id no：101-125、151-200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、257、258、260、261、262、263、265、266、267、269、270、271、273、274、275、277、278和300-324中的任一者的核苷酸序列。
10.在一些实施方案中，所述sirna包含以下有义/反义序列组中的任一者的有义链核苷酸序列/反义链核苷酸序列：seq id no：201/202、203/204、205/206、207/208、209/210、211/212、213/214、215/216、217/218、219/220、221/222、223/224、225/226、227/228、229/230、231/232、233/234、235/236、237/238、239/240、241/242、243/244、245/246、247/248、249/250、251/252、253/254、201/256、255/256、255/257、201/258、255/258、207/260、259/260、259/261、207/262、259/262、217/263、264/263、264/265、217/266、264/266、219/267、268/267、268/269、219/270、268/270、231/271、272/271、272/273、231/274、272/274、243/275、276/275、276/277、243/278、276/278、325/275、326/260和327/258。
11.在一些实施方案中，所述sirna包含至少一个配体，所述至少一个配体附接至所述有义链的5’末端、所述有义链的3’末端、所述反义链的5’末端和所述反义链的3’末端中的一个或所有。在一些实施方案中，所述配体包含至少一个galnac部分。在一些实施方案中，所述配体包含三个galnac部分。
12.在另一方面，本公开特征在于一种治疗患有补体介导的病症或处于补体介导的病症风险中的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含有效量的sirna的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用包含编码sirna的核酸的组合物。在一些实施方案中，所述受试者是人。
13.在一些实施方案中，在施用所述组合物之后，所述受试者或来自所述受试者的生物样品(例如，血液、血清或血浆样品，和/或包含肝细胞的样品)中的c3转录物或c3蛋白的水平相对于施用所述组合物之前的水平降低。在一些实施方案中，所述c3转录物或c3蛋白的水平相对于所述施用之前的水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
14.在一些实施方案中，将所述组合物静脉内或皮下施用给受试者。在一些实施方案中，将所述组合物施用于所述受试者的肝细胞。在一些实施方案中，将所述组合物离体施用于肝细胞。在一些实施方案中，将所述组合物体内施用于肝细胞。
15.在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用第二药剂。在一些实施方案中，所述第二药剂是抗c3抗体或坎普他汀(compstatin)类似物。
16.在一些实施方案中，所述受试者在补体调控方面具有缺陷，任选地其中所述缺陷包括所述受试者的细胞中的至少一些细胞对一种或多种补体调控蛋白的异常低表达。在一些实施方案中，所述补体介导的病症是慢性病症。在一些实施方案中，所述补体介导的病症牵涉对红细胞的补体介导的损伤，任选地其中所述病症是阵发性夜间血红蛋白尿症或非典型溶血性尿毒症综合征。在一些实施方案中，所述补体介导的病症是自身免疫性疾病，任选地其中所述病症是多发性硬化。在一些实施方案中，所述补体介导的病症牵涉肾脏，任选地其中所述病症是膜增生性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、iga肾病(igan)、原发性膜性肾病(原发性mn)、c3肾小球病(c3g)或急性肾损伤。在一些实施方案中，所述补体介导的病症牵涉中枢神经系统或外周神经系统或肌神经接点，任选地其中所述病症是视神经脊髓炎、格林-巴利综合征、多灶性运动神经病或重症肌无力。
17.在一些实施方案中，所述组合物包含载剂和/或赋形剂。
18.在另一方面，本公开特征在于一种表达载体，所述表达载体包含编码本文所述的
一种或多种sirna的一种或多种核苷酸序列。在一些实施方案中，所述表达载体包含编码c3抑制剂(例如，适体、抗c3抗体、抗c3b抗体、哺乳动物补体调控蛋白或微型因子h)的核苷酸序列。
19.另一方面，本公开特征在于一种反义核酸，所述反义核酸包含seq id no：101-125、151-200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、257、258、260、261、262、263、265、266、267、269、270、271、273、274、275、277、278和300-324中的任一者的核苷酸序列。
20.在另一方面，本公开特征在于一种降低或抑制细胞中的补体c3表达的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与包含反义链和有义链的sirna接触，其中所述反义链和与seq id no：76-100中的任一者具有至少90％同一性的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链和包含与seq id no：76-100中的任一者相差不超过1、2、3或4个核苷酸的序列的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链和包含seq id no：76-100中的任一者的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链包含含有seq id no：101-125中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链中的一者或两者包含至少一个突出端区域。在一些实施方案中，所述至少一个突出端包括1、2、3、4或5个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，所述至少一个突出端包括3’突出端。在一些实施方案中，所述突出端区域与seq id no：75的片段互补。在一些实施方案中，sirna的3’突出端包括2个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，sirna包含有义链和反义链，所述反义链在5’末端、3’末端或5’末端和3’末端两处包含至少一个附加核苷酸，所述附加核苷酸与seq id no：75的片段不互补。在一些实施方案中，sirna的有义链和反义链中的一者或两者包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个经修饰的核苷酸包括包含2
’‑
o-甲基的核苷酸、包含2
’‑
氟基团的核苷酸和/或与相邻核苷酸的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，sirna的有义链包含seq id no：76-100、126-150、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、255、259、264、268、272、276、325、326和327中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，sirna的反义链包含seq id no：101-125、151-200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、257、258、260、261、262、263、265、266、267、269、270、271、273、274、275、277、278和300-324中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述sirna包含以下有义/反义序列组中的任一者的有义链核苷酸序列/反义链核苷酸序列：seq id no：201/202、203/204、205/206、207/208、209/210、211/212、213/214、215/216、217/218、219/220、221/222、223/224、225/226、227/228、229/230、231/232、233/234、235/236、237/238、239/240、241/242、243/244、245/246、247/248、249/250、251/252、253/254、201/256、255/256、255/257、201/258、255/258、207/260、259/260、259/261、207/262、259/262、217/263、264/263、264/265、217/266、264/266、219/267、268/267、268/269、219/270、268/270、231/271、272/271、272/273、231/274、272/274、243/275、276/275、276/277、243/278、276/278、325/275、326/260和327/258。在一些实施方案中，所述sirna包含至少一个配体，所述至少一个配体附接至所述有义链的5’末端、所述有义链的3’末端、所述反义链的5’末端和所述反义链的3’末端中的一个或所有。在一些实施方案中，所述配体包含至少一个galnac部分。在一些实施方案中，所述配体包含三
个galnac部分。
21.在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与反义核酸接触，所述反义核酸包含seq id no：101-125、151-200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、257、258、260、261、262、263、265、266、267、269、270、271、273、274、275、277、278和300-324中的任一者的核苷酸序列。
22.在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与本文所述的组合物或表达载体接触。
23.在一些实施方案中，在所述接触步骤之后，所述c3转录物或c3蛋白的水平相对于所述接触步骤之前的水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。在一些实施方案中，所述方法包括将细胞维持足够长的时间，以获得补体c3基因的mrna转录物的降解，从而抑制补体c3基因在细胞中的表达。
24.在一些实施方案中，所述细胞是在受试者中的。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者患有补体介导的病症。
25.在另一方面，本公开特征在于一种降低或抑制受试者中的c3表达的方法，所述方法包括使受试者的细胞与包含反义链和有义链的sirna接触，其中所述反义链和与seq id no：76-100中的任一者具有至少90％同一性的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链和包含与seq id no：76-100中的任一者相差不超过1、2、3或4个核苷酸的序列的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链和包含seq id no：76-100中的任一者的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链包含含有seq id no：101-125中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链中的一者或两者包含至少一个突出端区域。在一些实施方案中，所述至少一个突出端包括1、2、3、4或5个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，所述至少一个突出端包括3’突出端。在一些实施方案中，所述突出端区域与seq id no：75的片段互补。在一些实施方案中，sirna的3’突出端包括2个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，sirna包含有义链和反义链，所述反义链在5’末端、3’末端或5’末端和3’末端两处包含至少一个附加核苷酸，所述附加核苷酸与seq id no：75的片段不互补。在一些实施方案中，sirna的有义链和反义链中的一者或两者包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个经修饰的核苷酸包括包含2
’‑
o-甲基的核苷酸、包含2
’‑
氟基团的核苷酸和/或与相邻核苷酸的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，sirna的有义链包含seq id no：76-100、126-150、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、255、259、264、268、272、276、325、326和327中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，sirna的反义链包含seq id no：101-125、151-200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、257、258、260、261、262、263、265、266、267、269、270、271、273、274、275、277、278和300-324中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述sirna包含以下有义/反义序列组中的任一者的有义链核苷酸序列/反义链核苷酸序列：seq id no：201/202、203/204、205/206、207/208、209/210、211/212、213/214、215/216、217/218、219/220、221/222、223/224、225/226、227/228、229/230、231/232、233/234、235/236、237/238、239/240、241/242、243/244、245/246、247/248、
249/250、251/252、253/254、201/256、255/256、255/257、201/258、255/258、207/260、259/260、259/261、207/262、259/262、217/263、264/263、264/265、217/266、264/266、219/267、268/267、268/269、219/270、268/270、231/271、272/271、272/273、231/274、272/274、243/275、276/275、276/277、243/278、276/278、325/275、326/260和327/258。在一些实施方案中，所述sirna包含至少一个配体，所述至少一个配体附接至所述有义链的5’末端、所述有义链的3’末端、所述反义链的5’末端和所述反义链的3’末端中的一个或所有。在一些实施方案中，所述配体包含至少一个galnac部分。在一些实施方案中，所述配体包含三个galnac部分。
26.在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与反义核酸接触，所述反义核酸包含seq id no：101-125、151-200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、257、258、260、261、262、263、265、266、267、269、270、271、273、274、275、277、278和300-324中的任一者的核苷酸序列。
27.在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与本文所述的组合物或表达载体接触。
28.在一些实施方案中，在所述接触步骤之后，所述c3转录物或c3蛋白的水平相对于所述接触步骤之前的水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
29.在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者患有补体介导的病症。
30.在另一方面，本公开特征在于一种降低或抑制受试者中的c3表达的方法，所述方法包括向受试者施用包含反义链和有义链的sirna，其中所述反义链和与seq id no：76-100中的任一者具有至少90％同一性的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链和包含与seq id no：76-100中的任一者相差不超过1、2、3或4个核苷酸的序列的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链和包含seq id no：76-100中的任一者的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链包含含有seq id no：101-125中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链中的一者或两者包含至少一个突出端区域。在一些实施方案中，所述至少一个突出端包括1、2、3、4或5个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，所述至少一个突出端包括3’突出端。在一些实施方案中，所述突出端区域与seq id no：75的片段互补。在一些实施方案中，sirna的3’突出端包括2个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，sirna包含有义链和反义链，所述反义链在5’末端、3’末端或5’末端和3’末端两处包含至少一个附加核苷酸，所述附加核苷酸与seq id no：75的片段不互补。在一些实施方案中，sirna的有义链和反义链中的一者或两者包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个经修饰的核苷酸包括包含2
’‑
o-甲基的核苷酸、包含2
’‑
氟基团的核苷酸和/或与相邻核苷酸的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，sirna的有义链包含seq id no：76-100、126-150、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、255、259、264、268、272、276、325、326和327中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，sirna的反义链包含seq id no：101-125、151-200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、
232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、257、258、260、261、262、263、265、266、267、269、270、271、273、274、275、277、278和300-324中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述sirna包含以下有义/反义序列组中的任一者的有义链核苷酸序列/反义链核苷酸序列：seq id no：201/202、203/204、205/206、207/208、209/210、211/212、213/214、215/216、217/218、219/220、221/222、223/224、225/226、227/228、229/230、231/232、233/234、235/236、237/238、239/240、241/242、243/244、245/246、247/248、249/250、251/252、253/254、201/256、255/256、255/257、201/258、255/258、207/260、259/260、259/261、207/262、259/262、217/263、264/263、264/265、217/266、264/266、219/267、268/267、268/269、219/270、268/270、231/271、272/271、272/273、231/274、272/274、243/275、276/275、276/277、243/278、276/278、325/275、326/260和327/258。在一些实施方案中，所述sirna包含至少一个配体，所述至少一个配体附接至所述有义链的5’末端、所述有义链的3’末端、所述反义链的5’末端和所述反义链的3’末端中的一个或所有。在一些实施方案中，所述配体包含至少一个galnac部分。在一些实施方案中，所述配体包含三个galnac部分。
31.在一些实施方案中，所述方法包括施用反义核酸，所述反义核酸包含seq id no：101-125、151-200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、257、258、260、261、262、263、265、266、267、269、270、271、273、274、275、277、278和300-324中的任一者的核苷酸序列。
32.在一些实施方案中，所述方法包括施用本文所述的组合物或表达载体。
33.在一些实施方案中，在所述施用步骤之后，所述c3转录物或c3蛋白的水平相对于所述施用步骤之前的水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
34.在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者患有补体介导的病症。
35.在另一方面，本公开特征在于一种降低或抑制受试者中的补体的方法，所述方法包括向受试者施用包含反义链和有义链的sirna，其中所述反义链和与seq id no：76-100中的任一者具有至少90％同一性的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链和包含与seq id no：76-100中的任一者相差不超过1、2、3或4个核苷酸的序列的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链和包含seq id no：76-100中的任一者的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，所述反义链包含含有seq id no：101-125中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链中的一者或两者包含至少一个突出端区域。在一些实施方案中，所述至少一个突出端包括1、2、3、4或5个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，所述至少一个突出端包括3’突出端。在一些实施方案中，所述突出端区域与seq id no：75的片段互补。在一些实施方案中，sirna的3’突出端包括2个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，sirna包含有义链和反义链，所述反义链在5’末端、3’末端或5’末端和3’末端两处包含至少一个附加核苷酸，所述附加核苷酸与seq id no：75的片段不互补。在一些实施方案中，sirna的有义链和反义链中的一者或两者包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个经修饰的核苷酸包括包含2
’‑
o-甲基的核苷酸、包含2
’‑
氟基团的核苷酸和/或与相邻核苷酸的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，sirna的有义链包含
seq id no：76-100、126-150、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、255、259、264、268、272、276、325、326和327中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，sirna的反义链包含seq id no：101-125、151-200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、257、258、260、261、262、263、265、266、267、269、270、271、273、274、275、277、278和300-324中的任一者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述sirna包含以下有义/反义序列组中的任一者的有义链核苷酸序列/反义链核苷酸序列：seq id no：201/202、203/204、205/206、207/208、209/210、211/212、213/214、215/216、217/218、219/220、221/222、223/224、225/226、227/228、229/230、231/232、233/234、235/236、237/238、239/240、241/242、243/244、245/246、247/248、249/250、251/252、253/254、201/256、255/256、255/257、201/258、255/258、207/260、259/260、259/261、207/262、259/262、217/263、264/263、264/265、217/266、264/266、219/267、268/267、268/269、219/270、268/270、231/271、272/271、272/273、231/274、272/274、243/275、276/275、276/277、243/278、276/278、325/275、326/260和327/258。在一些实施方案中，所述sirna包含至少一个配体，所述至少一个配体附接至所述有义链的5’末端、所述有义链的3’末端、所述反义链的5’末端和所述反义链的3’末端中的一个或所有。在一些实施方案中，所述配体包含至少一个galnac部分。在一些实施方案中，所述配体包含三个galnac部分。
36.在一些实施方案中，所述方法包括施用反义核酸，所述反义核酸包含seq id no：101-125、151-200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、257、258、260、261、262、263、265、266、267、269、270、271、273、274、275、277、278和300-324中的任一者的核苷酸序列。
37.在一些实施方案中，所述方法包括施用本文所述的组合物或表达载体。
38.在一些实施方案中，在所述施用步骤之后，补体活性相对于对照，例如所述施用步骤之前的补体活性对照水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
39.在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者患有补体介导的病症。
40.定义
41.抗体：如本文所用，术语“抗体”是指含有能够与抗原结合的免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白或其衍生物。抗体可以是任何物种的，例如人、啮齿动物、兔、山羊、鸡等。抗体可以是任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何人类类别：igg、igm、iga、igd和ige，或其亚类诸如igg1、igg2等中的任一种。在本发明的各种实施方案中，抗体是片段，诸如fab’、f(ab’)2、scfv(单链可变)或保留抗原结合位点的其他片段，或重组产生的scfv片段，包括重组产生的片段。参见例如allen，t.，nature reviews cancer，第2卷，750-765，2002，以及其中的参考文献。抗体可以是单价的、二价的或多价的。抗体可以是嵌合抗体或“人源化”抗体，其中，例如，啮齿类动物来源的可变结构域融合到人类来源的恒定结构域，从而保留了啮齿类动物抗体的特异性。人类来源的结构域不需要直接起源于人类，从某种意义上说它首先是在人类中合成的。取而代之的是，“人”结构域可在基因组并入了人免疫球蛋白基因的啮齿类
ramakrishnan，v.，nature structural and molecular biology 11：1251-1252(2004))。例如，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，在本文描述的抑制性rna的核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如肌苷的核苷酸取代。应当理解，术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可以关于任何两个核酸之间的碱基匹配使用，例如dsrna的有义链与反义链之间的碱基匹配，或者双链抑制性rna(例如sirna)的反义链与靶序列之间的碱基匹配，或者反义寡核苷酸与靶序列之间的碱基匹配，正如将从上下文中显而易见。如本文所用，“杂交”是指包含互补部分或由互补部分组成的两个核酸序列之间的相互作用，从而形成在特定目标条件下稳定的双链体结构，正如普通技术人员所理解的。
44.补体组分：如本文所用，术语“补体组分”或“补体蛋白”是牵涉于补体系统的激活或参与一种或多种补体介导的活性的分子。经典补体途径的组分包括，例如，c1q、c1r、c1s、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9和c5b-9复合物，也称为膜攻击复合物(mac)和前述任一者的活性片段或酶促裂解产物(例如，c3a、c3b、c4a、c4b、c5a等)。旁路途径的组分包括例如因子b、d、h和i以及备解素，其中因子h是该途径的负调控因子。凝集素途径的组分包括例如mbl2、masp-1和masp-2。补体组分也包括可溶性补体组分的细胞结合受体。此类受体包括，例如，c5a受体(c5ar)、c3a受体(c3ar)、补体受体1(cr1)、补体受体2(cr2)、补体受体3(cr3)等。应当认识到，术语“补体组分”不旨在包括那些充当补体激活“触发物”的分子和分子结构，例如抗原-抗体复合物、在微生物或人工表面上发现的外来结构等。
45.宿主细胞：如本文所用，术语“宿主细胞”是指外源dna(重组的或其他的)已经引入其中的细胞。技术人员在阅读本公开内容后将理解，此类术语不但指特定的受试细胞，而且指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响在下一代中可能出现某些修饰，所以事实上此类后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞包括选自适于表达外源dna(例如，重组核酸序列)的任何生命界的原核和真核细胞。示例性细胞包括原核生物和真核生物的细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌(e.coli)、芽孢杆菌(bacillus spp.)、链霉菌(streptomyces spp.)菌株等)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(s.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(s.pombe)、巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)、甲醇毕赤酵母(p.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，sf-9、sf-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(trichoplusia ni)等)、非人类动物细胞、人类细胞或细胞融合物，例如杂交瘤或四源杂交瘤。在一些实施方案中，细胞是人类、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞并且选自以下细胞：cho(例如，cho k1、dxb-1 1 cho、素食者-cho)、cos(例如，cos-7)、视网膜细胞、vero、cv1、肾(例如，hek293、293 ebna、msr 293、mdck、hak、bhk)、hela、hepg2、wi38、mrc 5、colo205、hb 8065、hl-60、(例如，bhk21)、jurkat、daudi、a431(表皮)、cv-1、u937、3t3、l细胞、c127细胞、sp2/0、ns-0、mmt 060562、塞尔托利氏细胞(sertoli cell)、brl 3 a细胞、ht1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和源自前述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一种或多种病毒基因。
46.同一性：如本文所用，术语“同一性”是指多聚分子之间，例如核酸分子(例如，dna分子和/或rna分子)之间和/或多肽分子之间的整体关联性。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、
mirna序列的信息可在mirna数据库中获得，诸如mirbase(griffiths-jones等人2008 nucl acids res 36，(database issue：d154-d158))和ncbi人类基因组数据库。
49.可操作地联接：如本文所用，术语“可操作地联接”是指其中所描述的组分的关系允许它们以其预期方式起作用的并置。“可操作地联接”至功能元件的控制元件以这样的方式缔合，即功能元件的表达和/或活性在与控制元件相容的条件下实现。在一些实施方案中，“可操作地联接”的控制元件与目标编码元件是连续的(例如，共价联接的)；在一些实施方案中，控制元件反式或以其他方式作用于目标功能元件。
50.重组：如本文所用，术语“重组”意图是指通过重组手段设计、工程改造、制备、表达、产生、制造和/或分离的多肽，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽；从重组、组合的人类多肽文库中分离的多肽；从是转基因的或另外已经进行操纵以表达编码多肽或其一个或多个组分、部分、元件或结构域和/或指导其表达的一个或多个基因或基因组分的动物(例如，小鼠、兔、绵羊、鱼等)分离的多肽；和/或通过任何其他手段制备、表达、产生或分离的多肽，所述手段牵涉将选定的核酸序列元件彼此剪接或连接，化学合成选定的序列元件，和/或以其他方式生成编码所述多肽或其一个或多个组分、部分、元件或结构域和/或指导其表达的核酸。在一些实施方案中，在自然界中发现一种或多种此类选定序列元件。在一些实施方案中，经由电脑模拟设计一种或多种此类选定序列元件。在一些实施方案中，一种或多种此类选定序列元件由例如来自于天然或合成来源，例如在目标来源生物体(例如，人、小鼠等)的种系中的已知序列元件的诱变(例如，体内或体外)产生。
51.rna干扰：如本文所用，术语“rna干扰”或“rnai”通常是指双链rna分子或短发夹rna分子降低或抑制与该双链或短发夹rna分子具有基本或完全同源性的核酸序列的表达的过程。不希望受任何理论的束缚，据信在自然界中，rnai途径是由称为dicer的iii型核酸内切酶启动的，该酶将长的双链rna(dsrna)裂解成通常具有21-23个碱基对和2个碱基的3’突出端的双链片段(但是也考虑到了长度和突出端的变化)，该双链片段称为“短干扰rna”(“sirna”)。此类sirna包含两条单链rna(ssrna)，包含与靶序列基本上互补的区域的一条“反义链”或“引导链”，和包含与反义链区域基本上互补的区域的一条“有义链”或“过客链”。本领域的普通技术人员将认识到，引导链可以与靶rna的靶区域完全互补，或者可以与靶rna的靶区域不完全互补。
52.受试者：如本文所用，术语“受试者”或“测试受试者”是指例如为了实验、诊断、预防和/或治疗目的根据本发明施用所提供的化合物或组合物的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如、哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人；昆虫；蠕虫；等)和植物。在一些实施方案中，受试者可患有疾病、病症和/或病状，和/或对疾病、病症和/或病状敏感。
53.基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或性质的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(即使有)完成和/或继续进行到完成或实现或避免绝对结果。因此术语“基本上”在本文用于捕获许多生物和/或化学现象中固有的完全性的潜在缺乏。
54.患有：“患有”疾病、病症和/或病状的个体已被诊断出具有和/或展示出疾病、病症和/或病状的一种或多种症状。
55.靶基因：如本文所用，“靶基因”是指其表达将被调节，例如抑制的基因。如本文所
用，术语“靶rna”是指要使用一种或多种mirna进行降解或翻译阻遏或以其他方式抑制的rna。靶rna也可以称为靶序列或靶转录物。rna可以是从靶基因(例如pre-mrna)转录的初级rna转录物或经过加工的转录物，例如编码多肽的mrna。如本文所用，术语“靶部分”或“靶区域”是指靶rna核苷酸序列的连续部分。在一些实施方案中，mrna的靶部分至少足够长，以在存在合适的抑制性rna的情况下，在该部分内充当rna干扰(rnai)介导的裂解的底物。靶部分的长度可以是约8-36个核苷酸，例如，长度为约10-20个或约15-30个核苷酸。靶部分长度可以具有在上述范围内的具体值或子范围。例如，在某些实施方案中，靶部分的长度可以介于约15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸之间。
56.治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”是指当施用给受试者时，具有治疗效果和/或引起所需的生物学和/或药理学效果的任何药剂。在一些实施方案中，治疗剂是可以用于使疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟其发作，降低其严重程度和/或降低其发病率的任何物质。
57.治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指当作为治疗方案的一部分施用时，引起所需生物应答的物质(例如，治疗剂、组合物和/或配制剂)的量。在一些实施方案中，物质的治疗有效量是当施用于患有疾病、病症和/或病状或对疾病、病症和/或病状敏感的受试者时，足以治疗、诊断、预防和/或延迟该疾病、病症和/或病状的发作的量。正如本领域普通技术人员将认识到的，物质的有效量可以根据诸如所需生物学终点、待递送的物质、靶细胞或组织等因素而变化。例如，配制剂中用于治疗疾病、病症和/或病状的化合物的有效量是使该疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或体征减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟其发作，降低其严重程度和/或降低其发病率的量。在一些实施方案中，治疗有效量以单剂量给药；在一些实施方案中，需要多个单位剂量来递送治疗有效量。
58.治疗：如本文所用，术语“治疗”是指提供治疗，即提供对受试者的任何类型的医疗或手术治疗。可以提供治疗以便逆转、减轻、抑制疾病、病症或病状的发展，预防或降低疾病、病症或病状的可能性，或者以便逆转、减轻、抑制或预防疾病、病症或病状的一种或多种症状或表现的进展，预防或降低疾病、病症或病状的一种或多种症状或表现的可能性。“预防”是指使疾病、病症、病状或此类疾病、病症、病状的症状或表现在至少一些个体中至少一段时间内不发生。治疗可以包括在指示补体介导的病状的一种或多种症状或表现发展之后，向受试者施用药剂，例如，以便逆转、减轻、降低病状的严重程度和/或抑制或预防病状的进展和/或逆转、减轻、降低病状的严重程度，和/或抑制病状的一种或多种症状或表现。可以将本公开的组合物施用给已经发展补体介导的病症或相对于普通群体中的成员而言发展此类病症的风险增加的受试者。本公开的组合物可以预防性施用，即在病状的任何症状或表现发展之前施用。通常在这种情况下，受试者将处于发展该病状的风险中。
59.核酸：术语“核酸”包括任何核苷酸、其类似物及其聚合物。如本文所用的术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸(rna)或脱氧核糖核苷酸(dna))的聚合形式。这些术语是指分子的一级结构，因此，包括双链和单链dna，以及双链和单链rna。这些术语
包括作为等效物的由核苷酸类似物产成的rna或dna类似物，和经修饰的多核苷酸，诸如但不限于甲基化、受保护的和/或封端的核苷酸或多核苷酸。所述术语涵盖多核糖核苷酸或寡核糖核苷酸(rna)和多脱氧核糖核苷酸或寡脱氧核糖核苷酸(dna)；源自核碱基和/或经修饰的核碱基的n-糖苷或c-糖苷的rna或dna；源自糖和/或经修饰的糖的核酸；以及源自磷酸桥和/或经修饰的磷原子桥(本文也称为“核苷酸间联接”)的核酸。该术语涵盖含有核碱基、经修饰的核碱基、糖、经修饰的糖、磷酸桥或经修饰的磷原子桥的任何组合的核酸。实例包括但不限于，含有核糖部分的核酸，含有脱氧核糖部分的核酸，含有核糖和脱氧核糖部分的核酸，含有核糖和经修饰的核糖部分的核酸。在一些实施方案中，前缀“多”是指含有2至约10,000个、2至约50,000个或2至约100,000个核苷酸单体单元的核酸。在一些实施方案中，前缀“寡”是指含有2至约200个核苷酸单体单元的核酸。
60.载体：如本文所用，术语“载体”是指能够转运已经与之联接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”是指其中可以连接附加dna区段的环状双链dna环。另一种类型的载体是其中另外的dna片段可连接至病毒基因组的病毒载体。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(如，具有细菌复制起点和附加体哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞基因组中，从而连同宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导与之操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
61.标准技术可用于重组dna、寡核苷酸合成及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可根据生产商的说明或如本领域通常所实现的那样或如本文所述进行。前述技术和程序通常可以根据本领域熟知的常规方法以及如本说明书通篇引用和讨论的许多通用和更具体的参考文献所述进行。参见例如，sambrook等人，molecular cloning：a laboratory manual(第2版，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.(1989))，其通过引用并入本文用于任何目的。
附图说明
62.图1示出了公开抑制性rna(例如，sirna)的双链体的有义链和反义链的示例修饰模式1-5的图表。在图1中，“2om”表示2
’‑
o-甲基修饰，“2f”表示2
’‑
氟修饰，并且“ps”表示与相邻3’核苷酸的硫代磷酸酯键。
63.图2示出了培可他普兰(pegcetacoplan)(“apl-2”)的结构，假设n为约800至约1100且peg为约40kd。
64.图3示出了非人灵长类动物体内研究的结果。通过皮下注射施用剂量为3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg的sirna 58或媒介物。该图示出了每个组给药后长达67天的血清c3蛋白水平的时间过程。使用elisa测定法测量血清中的c3蛋白水平。将第-1天的值用作基线。
65.图4呈现了非人灵长类动物体内研究的数据。通过皮下注射施用剂量为3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg的sirna 58或媒介物。该图描绘注射后第15天取自非人灵长类动物的肝活检中的c3 mrna表达。使用定量pcr测定法测量样品中的c3 mrna水平。在这些实验中，将c3 mrna水平归一化为actb mrna水平。
66.图5呈现了非人灵长类动物体内研究的数据。通过皮下注射施用剂量为3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg的sirna 58或媒介物。该图描绘注射后第46天取自非人灵长类动物的肝
活检中的c3 mrna表达。使用定量pcr测定法测量样品中的c3 mrna水平。在这些实验中，将c3 mrna水平归一化为actb mrna水平。
67.图6呈现从注射了不同剂量的sirna 58(3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg或媒介物)的非人灵长类动物到第29天收集的血清中的旁路途径(ah50)活性水平的时间过程。使用elisa测定法测定旁路途径活性(ah50)。将第-1天的值用作基线。
68.图7示出了以单次推注(a)或每日3次推注(b)皮下施用sirna 59后，血浆c3浓度相对于基线的百分比变化。描绘为零的值低于测定的lloq。数据表示平均值
±
sem(n＝3)。
69.图8示出了在用媒介物(a)、sirna(-)对照(b)、3mg/kg的sirna 59(c)、10mg/kg的sirna 59(d)和30mg/kg的sirna 59(e)皮下处理的动物血清中通过使用elisa(光密度测量；od)检测和量化可溶性c5b-9复合物对旁路途径活性的测量。数据表示平均值
±
sem(n＝3)。
70.图9示出了sirna 59单次施用(a和b)或每日三次施用(c)后3天(a)和30天(b和c)肝组织中c3 mrna的水平。数据表示平均值
±
sem(n＝3)。
具体实施方式
71.i.补体系统
72.为了便于理解本公开，并且不打算以任何方式限制本发明，该部分提供了补体及其激活途径的概述。例如在kuby immunology，第6版，2006；paul，w.e.，fundamental immunology，lippincott williams&wilkins；第6版，2008；和walport mj.，complement.两部分中的第一部分。n engl j med.，344(14)：1058-66，2001中找到更多细节。
73.补体是先天免疫系统的一个分支，在防御感染因子方面发挥着重要作用。补体系统包含30多种血清蛋白和细胞蛋白质，这些蛋白牵涉于三种主要途径，称为经典途径、旁路途径和凝集素途径。经典途径通常由抗原和igm或igg抗体的复合物与c1的结合触发(但某些其他激活因子也可以启动该途径)。除c2a和c2b外，激活的c1裂解c4和c2以产生c4a和c4b。c4b和c2a组合形成c3转化酶，该酶裂解c3以形成c3a和c3b。c3b与c3转化酶结合产生c5转化酶，c5转化酶将c5裂解成c5a和c5b。c3a、c4a和c5a是过敏毒素并且在急性炎症应答中介导多种反应。c3a和c5a也是吸引免疫系统细胞诸如嗜中性粒细胞的趋化因子。应当理解，最初使用的名称“c2a”和“c2b”随后在科学文献中被颠倒。
74.旁路途径由例如微生物表面和各种复合多糖启动并在那里扩增。在该途径中，c3水解为c3(h2o)，以低水平自发发生，导致因子b的结合，因子b被因子d裂解，生成液相c3转化酶，c3转化酶通过将c3裂解成c3a和c3b来激活补体。c3b与靶标诸如细胞表面结合，并与因子b形成复合物，稍后因子b被因子d裂解，产生c3转化酶。表面结合的c3转化酶裂解并激活另外的c3分子，引起c3b非常接近于激活位点快速沉积并导致另外的c3转化酶的形成，c3转化酶进而生成另外的c3b。该过程导致c3裂解和c3转化酶形成的循环，该循环使应答显著放大。c3的裂解和另一c3b分子与c3转化酶的结合产生c5转化酶。该途径的c3转化酶和c5转化酶受细胞分子cr1、daf、mcp、cd59和fh调控。这些蛋白质的作用模式牵涉加速衰变的活性(即分解转化酶的能力)，在因子i降解c3b或c4b中作为辅因子的能力，或两者。通常细胞表面存在补体调控蛋白防止在细胞表面出现显著的补体激活。
75.两种途径中产生的c5转化酶裂解c5以产生c5a和c5b。c5b然后与c6、c7和c8结合以
形成c5b-8，c5b-8催化c9聚合形成c5b-9膜攻击复合物(mac)。mac将其自身插入靶细胞膜中并导致细胞溶解。细胞膜上少量的mac可具有除细胞死亡以外的多种后果。
76.凝集素补体途径由甘露糖结合凝集素(mbl)和mbl相关丝氨酸蛋白酶(masp)与碳水化合物的结合启动。mb1-1基因(在人类中称为lman-1)编码位于内质网与高尔基体之间的中间区域中的i型整合膜蛋白。mbl-2基因编码在血清中发现的可溶性甘露糖结合蛋白。在人凝集素途径中，masp-1和masp-2牵涉于c4和c2的蛋白水解，产生上述c3转化酶。
77.补体活性由称为补体控制蛋白(ccp)或补体激活调控因子(rca)的各种哺乳动物蛋白调控(美国专利第6,897,290号)。这些蛋白质关于配体特异性和补体抑制机制有所不同。它们可以加速转化酶的正常衰变和/或充当因子i的辅因子，以将c3b和/或c4b酶促裂解成更小的片段。ccp的特征在于存在多个(通常为4-56个)同源基序，称为短共有重复序列(scr)、补体控制蛋白(ccp)模块或sushi结构域，长度约50-70个氨基酸，含有包括四个二硫键连接的半胱氨酸(两个二硫键)、脯氨酸、色氨酸和许多疏水残基的保守基序。ccp家族包括补体受体1型(cr1；c3b：c4b受体)、补体受体2型(cr2)、膜辅因子蛋白(mcp；cd46)、衰变加速因子(daf)、补体因子h(fh)和c4b结合蛋白(c4bp)。cd59是一种在结构上与ccp无关的膜结合补体调控蛋白。补体调控蛋白通常用于限制补体激活，否则补体激活可能发生在哺乳动物(例如人类宿主)的细胞和组织上。因此，“自身”细胞通常受到保护免受补体激活对这些细胞产生的有害影响。补体调控蛋白的缺乏或缺陷牵涉于多种补体介导的病症的发病机理，例如，如本文所讨论的。
78.ii.c3的抑制性rna
79.本公开包括与一个或多个核苷酸序列有关的组合物和方法，所述核苷酸序列是、包含或编码与靶基因(例如c3)产生的信使rna(mrna)结合并抑制该信使rna的表达的抑制性rna。抑制性rna可以是单链(例如，反义寡核苷酸)或双链核酸。在一些实施方案中，抑制性rna包括双链rna双链体，诸如微rna(mirna)或小干扰rna(sirna)。在一些实施方案中，抑制性rna是sirna或mirna，或包含编码sirna或mirna的核苷酸序列的载体。
80.在一些实施方案中，除了人c3以外，抑制性rna还能够抑制一个或多个非人物种的c3，例如非人灵长类c3，例如食蟹猴(macaca fascicularis)c3，或者例如绿猴(chlorocebus sabaeus)c3的表达。食蟹猴c3基因已经分配ncbi基因id：102131458并且食蟹猴c3的预测氨基酸和核苷酸序列分别列在ncbi refseq登录号xp_005587776.1和xm_005587719.2下。在一些实施方案中，抑制性rna包含与人和食蟹猴c3转录物中相同的靶部分互补的反义链。在一些实施方案中，抑制性rna包含与人c3转录物的靶部分互补的反义链，该靶部分与食蟹猴c3转录物中的序列相差1、2或3个核苷酸。应当认识到，抑制人c3表达的抑制性rna也可以抑制非灵长类c3(例如大鼠或小鼠c3)的表达，特别是如果c3转录物的保守区域被靶向时。
81.人c3的氨基酸和核苷酸序列是本领域已知的并且可以在公开可用的数据库，例如国家生物技术信息中心(ncbi)参考序列(refseq)数据库中找到，其中它们分别列在refseq登录号np_000055(登录版本号np_000055.2)和nm_000064(登录版本号nm_000064.4)列出(其中“氨基酸序列”是指c3多肽的序列并且该上下文中“核苷酸序列”是指如基因组dna中表示的c3mrna序列，应理解实际mrna核苷酸序列含有u而不是t)。本领域的普通技术人员将会认识到，上述序列是针对补体c3前体蛋白的，该前体蛋白包括被裂解掉的信号序列，因此
不存在于成熟蛋白中。人c3基因已经分配ncbi基因id：718，并且基因组c3序列具有refseq登录号ng_009557(登录版本号ng_009557.1)。下面呈现了人c3 mrna的核苷酸序列(来自refseq登录号nm_000064.3，其中t被u置换；从位置94开始aug起始密码子带下划线)。
82.83.84.85.[0086][0087]
在一些实施方案中，抑制性rna包含与c3转录物的靶部分互补的核酸链，例如c3 mrna(例如，和与seq id no：75的靶部分有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列互补)。该靶部分可以是15-30个核苷酸长，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长，但是也考虑了更短或更长的靶部分。在一些实施方案中，该靶部分包含与下表1中列出的序列中的任一者具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
[0088]
表1：
[0089]
seq id no：靶序列(5’至3’)76ucaacucaccuguaauaa77aggaugccacuaugucua78cuugaagccaacuacaug79uccaagccuuggcucaau80agucaaggucuacgccua81aaacuguggcuguucgca82ugagaucuguaccaggua83cuuuguucucaucucgcu84aucggaucuucaccguca85ucaacuuccuccugcgaa86cgugcugcccaguuucga87auaggaacacccucauca88uggucaaggucuucucuc
89gcaacuccaacaauuacc90ccuuugucaucuucggga91caaugacuuugacgagua92acgacuucccaggcaaaa93gaacagagauacuacggu94guuucgaggucauagugg95aaugaacagagauacuac96agcuaaaagacuuugacu97ccaacuacaugaaccuac98cuacucuguuguucgaaa99gugcguuggcucaaugaa100cuccugcgaauggaccgc
[0090]
施用抑制性rna可以使受试者或来自受试者的生物样品(例如，血液、血清或血浆样品，或包含肝细胞的样品)中的c3转录物或c3蛋白的水平相对于施用所述组合物之前的水平降低。在一些实施方案中，c3转录物或c3蛋白的水平相对于所述施用之前的水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。可以测量例如血液(血清或血浆)样品中的c3蛋白水平。
[0091]
iii.微rna
[0092]
本公开还包括与一种或多种寡核苷酸有关的组合物和方法，所述寡核苷酸是、包含或编码微rna。微rna(微rna)是一类高度保守的小rna分子，其从植物和动物基因组中的dna转录但不会翻译成蛋白质。天然存在的mirna首先转录为含有长发夹的初级转录物(pri-mirna)。初级转录物被drosha核糖核酸酶iii酶裂解以产生大约70个核苷酸的茎环前体mirna(pre-mirna)，茎环前体mirna包括“反义链”或“引导链”(包括与靶序列基本上互补的区域)和“有义链”或“过客链”(包括与反义链区域基本上互补的区域)。pre-mirna然后被主动输出到细胞质中，在细胞质它被dicer核糖核酸酶裂解以形成成熟mirna。经过加工的微rna掺入到rna诱导的沉默复合物(risc)中以形成成熟的基因沉默复合物，诱导靶mrna降解和/或翻译阻遏。迄今为止鉴定的mirna序列的数目很大并且还在增长，其说明性实例可以在例如：
″
mirbase：microriva sequences，targets and gene nomenclature
″
griffiths-jones s，grocock rj，van dongen s，bateman a，enright aj.nar，2006，34，database issue，d140-d144；
″
the microrna registry
″
griffiths-jones s.nar，2004，32，database issue，d109-d111中找到。
[0093]
在一些实施方案中，可以合成mirna并局部或全身施用给受试者，例如，用于治疗目的。mirna可以设计和/或合成为成熟分子或前体(例如，pri-mirna或pre-mirna)。在一些实施方案中，pre-mirna包括长度相同的引导链和过客链(例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸)。在一些实施方案中，pre-mirna包括不同长度的引导链和过客链(例如，一条链约19个核苷酸，另一条约21个核苷酸)。在一些实施方案中，mirna可以靶向内源mrna的编码区、5’非翻译区和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，mirna包含含有核苷酸序列的引导链，该核苷酸序列具有与受试者的内源mrna互补的足够序列，以与内源mrna杂
交并抑制其表达。
[0094]
在一些实施方案中，mirna包含核酸链，该核酸链包含与seq id no：75的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸(例如，seq id no：76-100中的任一者)完全互补的区域。在一些实施方案中，mirna包含具有与靶部分完全互补的核苷酸序列的成熟引导链，该靶部分包含与seq id no：76-100中的任一者具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
[0095]
iv.sirna
[0096]
在一些实施方案中，抑制性rna是双链rna(dsrna)，并通过rna干扰(rnai)抑制c3表达。rnai是序列特异性转录后基因沉默的过程，通过该过程，例如与靶基因座同源的双链rna(dsrna)可以特异性灭活基因功能(hammond等人，nature genet.2001；2：110-119；sharp，genes dev.1999；13：139-141)。这种dsrna诱导的基因沉默可以由通过核糖核酸酶iii裂解从较长的dsrna生成的短的双链小干扰rna(sirna)介导(bernstein等人，nature 2001；409：363-366 and elbashir等人，genes dev.2001；15：188-200)。rnai介导的基因沉默被认为是经由序列特异性rna降解发生的，其中序列特异性由sirna与靶rna内它的互补序列的相互作用决定(参见，例如，tuschl，chem.biochem.2001；2：239-245)。rnai可以牵涉使用例如sirna(elbashir等人，nature 2001；411：494-498)或带有折回茎环结构的短发夹rna(shrna)(paddison等人，genes dev.2002；16：948-958；sui等人，proc.natl.acad.sci.usa 2002；99：5515-5520；brummelkamp等人，science 2002；296：550-553；paul等人，nature biotechnol.2002；20：505-508)。
[0097]
本公开包括靶向c3转录物，例如c3 mrna(seq id no：75)的sirna分子。在一些实施方案中，sirna分子包含与靶区域互补的序列，该靶区域包含seq id no：76-100中的任一者。在一些实施方案中，sirna分子包含(i)与seq id no：76-100中的任一者具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列(或其一部分)和/或(ii)和与seq id no：76-100中的任一者具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列(或其一部分)互补的核苷酸序列。
[0098]
在一些实施方案中，本公开的sirna是包含退火的互补单链核酸分子的双链核酸双链体(例如，具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个碱基对)。在一些实施方案中，sirna是包含退火的互补单链rna的短dsrna。在一些实施方案中，sirna包含退火的rna：dna双链体，其中该双链体的有义链是dna分子且该双链体的反义链是rna分子。在一些实施方案中，sirna包含与seq id no：76-100中的任一者具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列(或其一部分)的有义链。
[0099]
在一些实施方案中，sirna包含与下表2中的seq id no：101-125中的任一者具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的反义链。
[0100]
表2：
[0101][0102][0103]
在一些实施方案中，sirna包含与靶标的错配、双链体内的错配或其组合。错配可发生在突出端区域和/或双链体部分。碱基对可以基于它们促进解离或解链的倾向来分级(例如，基于特定配对的缔合或解离的自由能，最简单的方法是在单个配对的基础上检查配对，但是也可以使用次近邻或类似分析)。在促进解离方面：a∶u比g∶c优选；g∶u比g∶c优选；并且i∶c比g∶c优选(i＝肌苷)。
[0104]
在一些实施方案中，sirna包含双链体部分内从反义链5’末端开始前1、2、3、4或5个碱基对中的至少一个并且独立地选自下组：a∶u、g∶u、i∶c以及错配对。在一些实施方案中，双链体部分内反义链中从5’末端开始的1位置的核苷酸选自由a、da、du、u和dt组成的组。另外或可替代地，双链体部分内从反义链5’末端开始前1、2或3个碱基对中的至少一个是au碱基对。例如，双链体部分内从反义链5’末端开始第一个碱基对是au碱基对。
[0105]
在一些实施方案中，有义链可以在3’和/或5’末端包含一个或多个(例如2、3、4或5个)与靶序列不相同的核苷酸，和/或反义链可以在3’和/或5’末端包含一个或多个(例如2、3、4或5个)与靶序列不互补的核苷酸。例如，在一些实施方案中，双链体sirna包含含有下表3中所列的序列的有义链。表3中的序列在3’末端含有腺嘌呤(a)核苷酸，在一些序列中，与靶序列互补(例如，与靶序列的下一个相邻核苷酸互补)。在表3的一些序列中，3’末端的腺嘌呤(a)核苷酸与靶序列不互补(例如，与靶序列的下一个相邻核苷酸不互补)。
[0106]
表3：
[0107][0108][0109]
在一些实施方案中，双链体sirna在两个末端都包含平端。在一些实施方案中，双链体sirna包含至少一个突出端区域。在一些实施方案中，双链体sirna在双链体的有义链和/或反义链上包含1、2、3、4、5或6个核苷酸的3’突出端。在一些实施方案中，双链体sirna在双链体的有义链和/或反义链上包含1、2、3、4、5或6个核苷酸的5’突出端。
[0110]
在一些实施方案中，反义链包含含有一个或多个与c3 mrna转录物(seq id no：75)互补的核苷酸的突出端。在一些实施方案中，反义链包含含有1、2、3、4、5或6个与c3 mrna转录物(seq id no：75)互补的核苷酸的突出端。例如，在一些实施方案中，双链体sirna包含含有seq id no：300-324中的任一者的序列的反义链。
[0111]
表4
[0112][0113][0114]
在一些实施方案中，双链体sirna包含含有seq id no：300-324中的任一者的序列，但在5’末端缺乏“u”的反义链。
[0115]
在一些实施方案中，反义链包含含有一个或多个与c3 mrna转录物(seq id no：75)不互补的核苷酸的突出端。在一些实施方案中，反义链包含含有1、2、3、4、5或6个与c3 mrna转录物(seq id no：75)不互补的核苷酸的突出端。在一个实例中，突出端包括在反义链和/或有义链上包含1、2或3个尿嘧啶核苷酸的3’突出端。在一个实例中，突出端包括在反义链和/或有义链上包含1、2或3个腺嘌呤核苷酸的3’突出端。
[0116]
在一些实施方案中，双链体sirna包含含有下表5中列出的序列的反义链：
[0117]
表5：
[0118]
[0119][0120]
在一些实施方案中，双链体sirna包含含有下表6中列出的序列的反义链：
[0121]
表6
[0122][0123][0124]
在一些实施方案中，sirna包含5
’‑
磷酸基团和/或3
’‑
羟基基团(例如，在有义链的一端或两端和/或在反义链的一端或两端)，和/或可以包含一个或多个本文所述的附加修饰。
[0125]
v.修饰
[0126]
在一些实施方案中，本公开的抑制性rna(例如，sirna或mirna)包括一个或多个天然核碱基和/或一个或多个衍生自天然核碱基的经修饰的核碱基。实例包括但不限于尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤(它们各自的氨基基团受酰基保护基团保护)、2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、氮杂胞嘧啶、嘧啶类似物(诸如假异胞嘧啶和假尿嘧啶)以及其他经修饰的核碱基(诸如8-取代的嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤)(后两种是天然降解产物)。示例性的经修饰的核碱基公开于chiu和rana，rna，2003，9，1034-1048，limbach等人nucleic acids research，1994，22，2183-2196 and revankar and rao，comprehensive natural products chemistry，第7卷，313中。
[0127]
经修饰的核碱基还包括已经添加了一个或多个芳基环(诸如苯环)的大小扩大的核碱基。glen研究目录(www.glenresearch.com)；krueger at等人，acc.chem.res.，2007，40，141-150；kool，et，acc.chem.res.，2002，35，936-943；benner s.a.等人，nat.rev.genet.，2005，6，553-543；romesberg，f.e.等人，curr.opin.chem.biol.，2003，7，723-733；hirao，i.，curr.opin.chem.biol.，2006，10，622-627中描述的核碱基置换，被认为可用于本文所述的sirna分子。经修饰的核碱基还涵盖不被认为是核碱基而是其他部分的结构，诸如但不限于，咕啉或卟啉衍生环。卟啉衍生的碱基置换已经在morales-rojas，h和kool，et，org.lett.，2002，4，4377-4380中进行了描述。
[0128]
在一些实施方案中，经修饰的核碱基具有以下任选被取代的结构中的任何一种：
[0129][0130]
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是荧光的。示例性的此类经修饰的荧光核碱基包括菲、芘、芪(stillbene)、异黄嘌呤(isoxanthine)、异黄蝶呤(isozanthopterin)、三联苯、三噻吩、苯并噻吩、香豆素、二氧四氢蝶啶(lumazine)、拴系芪、苯并尿嘧啶和萘并尿嘧啶，如下所示：
[0131][0132]
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是未取代的。在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经取代的。在一些实施方案中，经修饰的核碱基经取代，使其含有例如杂原子、烷基基团、或连接到荧光部分、生物素或抗生物素蛋白部分、或其他蛋白质或肽的联接部分。在一些实施方案中，经修饰的核碱基是“通用碱基”，在最经典意义上不是核碱基，但其功能类似于核碱基。此类通用碱基的一个代表性实例是3-硝基吡咯。
[0133]
在一些实施方案中，本文所述的sirna包括掺入了经修饰的核碱基和/或共价结合到经修饰的糖上的核碱基的核苷。掺入经修饰的核碱基的核苷的一些实例包括4-乙酰胞苷；5-(羧基羟甲基)尿苷；2
′‑
o-甲基胞苷；5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷；5-羧甲基氨基甲基尿苷；二氢尿苷；2
′‑
o-甲基假尿苷；β，d-半乳糖基辫苷；2
′‑
o-甲基鸟苷；n
6-异戊烯腺苷；1-甲基腺苷；1-甲基假尿苷；1-甲基鸟苷；1-甲基肌苷；2，2-二甲基鸟苷；2-甲基腺苷；2-甲基鸟苷；n
7-甲基鸟苷；3-甲基胞苷；5-甲基胞苷；5-羟甲基胞苷；5-甲酰胞嘧啶；5-羧基胞嘧啶；n
6-甲基腺苷；7-甲基鸟苷；5-甲基氨基乙基尿苷；5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷；β，d-甘露糖基辫苷；5-甲氧羰基甲基尿苷；5-甲氧基尿苷；2-甲硫基-n
6-异戊烯腺苷；n-((9-β，d-呋喃核糖基-2-甲硫基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸；n-((9-β，d-呋喃核糖基嘌呤-6-基)-n-甲基氨基甲酰基)苏氨酸；尿苷-5-氧乙酸甲酯；尿苷-5-氧乙酸(v)；假尿苷；辫苷；2-硫胞苷；5-甲基-2-硫尿苷；2-硫尿苷；4-硫尿苷；5-甲基尿苷；2
′‑
o-甲基-5-甲基尿苷；和2
′‑
o-甲基尿苷。
[0134]
在一些实施方案中，核苷包括在6
′‑
位置具有(r)或(s)手性的6
′‑
修饰的双环核苷类似物并且包括美国专利第7,399,845号中描述的类似物。在其他实施方案中，核苷包括在5
′‑
位置具有(r)或(s)手性的5
′‑
修饰的双环核苷类似物并且包括美国公布第20070287831号中描述的类似物。在一些实施方案中，核碱基或经修饰的核碱基是5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶或2，6-二氨基嘌呤。在一些实施方案中，核碱基或经修饰的核碱基通过用荧光部分取代
进行修饰。
[0135]
制备经修饰的核碱基的方法在例如美国专利第3,687,808号；第4,845,205号；第5,130,30号；第5,134,066号；第5,175,273号；第5,367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,457,191号；第5,459,255号；第5,484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,594,121号；第5,596,091号；第5,614,617号；第5,681,941号；第5,750,692号；第6,015,886号；第6,147,200号；第6,166,197号；第6,222,025号；第6,235,887号；第6,380,368号；第6,528,640号；第6,639,062号；第6,617,438号；第7,045,610号；第7,427,672号；和第7,495,088号中有描述。
[0136]
在一些实施方案中，本文所述的sirna包括一个或多个经修饰的核苷酸，其中核苷酸中的磷酸基团或联接磷联接到糖或经修饰的糖的不同位置。作为非限制性实例，磷酸基团或联接磷可以联接到糖或经修饰的糖的2
′
、3
′
、4
′
或5
′
羟基部分。该上下文中也考虑了掺入如本文所述的经修饰的核碱基的核苷酸。
[0137]
其他经修饰的糖也可以掺入sirna分子内。在一些实施方案中，经修饰的糖在2’位置含有一个或多个取代基，包括以下之一：-f、-cf3、-cn、-n3、-no、-no2、-or’、-sr’或-n(r’)2，其中每个r
′
独立地如以上所定义和如本文所述；-o-(c
1-c
10
烷基)、-s-(c
1-c
10
烷基)、-nh-(c
1-c
10
烷基)或-n(c
1-c
10
烷基)2；-o-(c
2-c
10
烯基)、-s-(c
2-c
10
烯基)、-nh-(c
2-c
10
烯基)或-n(c
2-c
10
烯基)2；-o-(c
2-c
10
炔基)、-s-(c
2-c
10
炔基)、-nh-(c
2-c
10
炔基)或-n(c
2-c
10
炔基)2；或-o-(c
1-c
10
亚烷基)-o-(c
1-c
10
烷基)、-o-(c
1-c
10
亚烷基)-nh-(c
1-c
10
烷基)或-o-(c
1-c
10
亚烷基)-nh(c
1-c
10
烷基)2、-nh-(c
1-c
10
亚烷基)-o-(c
1-c
10
烷基)或-n(c
1-c
10
烷基)-(c
1-c
10
亚烷基)-o-(c
1-c
10
烷基)，其中烷基、亚烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未取代的。取代基的实例包括但不限于-o(ch2)noch3和-o(ch2)nnh2(其中n为1至约10)、moe、dmaoe、dmaeoe。本文还考虑了wo 2001/088198；以及martin等人，helv.chim.acta，1995，78，486-504中描述的经修饰的糖。在一些实施方案中，经修饰的糖包含一个或多个选自以下的基团：经取代的甲硅烷基、rna裂解基团、报告因子基团、荧光标记、嵌入剂、用于改善核酸药代动力学性质的基团、用于改善核酸药效学性质的基团或具有类似性质的其他取代基。在一些实施方案中，在糖或经修饰的糖的2
′
、3
′
、4
′
、5
′
或6
′
位置中的一个或多个位置进行修饰，包括在3’端核苷酸上的糖的3’位置或在5’端核苷酸的5’位置。
[0138]
在一些实施方案中，核糖的2
’‑
oh被包括以下之一的取代基取代：-h、-f、-cf3、-cn、-n3、-no、-no2、-or’、-sr’或-n(r’)2，其中每个r
′
独立地如以上所定义和如本文所述；-o-(c
1-c
10
烷基)、-s-(c
1-c
10
烷基)、-nh-(c
1-c
10
烷基)或-n(c
1-c
10
烷基)2；-o-(c
2-c
10
烯基)、-s-(c
2-c
10
烯基)、-nh-(c
2-c
10
烯基)或-n(c
2-c
10
烯基)2；-o-(c
2-c
10
炔基)、-s-(c
2-c
10
炔基)、-nh-(c
2-c
10
炔基)或-n(c
2-c
10
炔基)2；或-o-(c
1-c
10
亚烷基)-o-(c
1-c
10
烷基)、-o-(c
1-c
10
亚烷基)-nh-(c
1-c
10
烷基)或-o-(c
1-c
10
亚烷基)-nh(c
1-c
10
烷基)2、-nh-(c
1-c
10
亚烷基)-o-(c
1-c
10
烷基)或-n(c
1-c
10
烷基)-(c
1-c
10
亚烷基)-o-(c
1-c
10
烷基)，其中烷基、亚烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未取代的。在一些实施方案中，2
’‑
oh被-h置换(脱氧核糖)。在一些实施方案中，2
’‑
oh被-f置换。在一些实施方案中，2
’‑
oh被-or’置换。在一些实施方案中，2
’‑
oh被-ome置换。在一些实施方案中，2
’‑
oh被-och2ch2ome置换。
[0139]
经修饰的糖还包括锁核酸(lna)。在一些实施方案中，锁核酸具有如下标示的结构。标示了具有以下结构的锁核酸，其中ba表示如本文所述的核碱基或经修饰的核碱基，并
且其中r
2s
是-och2c4
’‑
[0140][0141]
在一些实施方案中，经修饰的糖是ena，诸如在例如seth等人，j am chem soc.2010年10月27日；132(42)：14942-14950中描述的那些。在一些实施方案中，经修饰的糖是在xna(异种核酸(xenonucleic acid))中发现的那些糖中的任一种，例如阿拉伯糖、失水己糖醇、苏糖、2’氟阿拉伯糖或环己烯。
[0142]
经修饰的糖包括糖模拟物，诸如代替呋喃戊糖的环丁基或环戊基部分(参见，例如，美国专利第4,981,957号；第5,118,800号；第5,319,080号；和第5,359,044号)。考虑到的一些经修饰的糖包括核糖环内的氧原子被氮、硫、硒或碳置换的糖。在一些实施方案中，经修饰的糖是经修饰的核糖，其中核糖环内的氧原子被氮置换，并且其中氮任选被烷基基团(例如，甲基、乙基、异丙基等)取代。
[0143]
经修饰的糖的非限制性实例包括甘油，其形成甘油核酸(gna)类似物。gna类似物的一个实例在zhang，r等人，j.am.chem.soc.，2008，130，5846-5847；zhang l等人，j.am.chem.soc.，2005，127，4174-4175和tsai ch等人，pnas，2007，14598-14603中有描述。gna衍生的类似物的另一实例，即基于甲酰甘油的混合缩醛胺的柔性核酸(fna)在joyce gf等人，pnas，1987，84，4398-4402及heuberger bd和switzer c，j.am.chem.soc.，2008，130，412-413中有描述。经修饰的糖的其他非限制性实例包括吡喃己糖基(6’至4’)、吡喃戊糖基(4’至2’)、吡喃戊糖基(4’至3’)或四呋喃糖基(3’至2’)糖。
[0144]
经修饰的糖和糖模拟物可以通过本领域已知的方法制备，包括但不限于：a.eschenmoser，science(1999)，284：2118；m.bohringer等人，helv.chim.acta(1992)，75：1416-1477；m.egli等人，j.am.chem.soc.(2006)，128(33)：10847-56；a.eschenmoser in chemical synthesis：gnosis to prognosis，c.chatgilialoglu和v.sniekus编辑，(kluwer academic，netherlands，1996)，第293页；k.-u.schoning等人，science(2000)，290：1347-1351；a.eschenmoser等人，helv.chim.acta(1992)，75：218；j.hunziker等人，helv.chim.acta(1993)，76：259；g.otting等人，helv.chim.acta(1993)，76：2701；k.groebke等人，helv.chim.acta(1998)，81：375；和a.eschenmoser，science(1999)，284：2118。对2’修饰的修饰可以在verma，s.等人annu.rev.biochem.1998，67，99-134及其中的所有参考文献中找到。对核糖的特定修饰可以在以下参考文献中找到：2
’‑
氟(kawasaki等人，j.med.chem.，1993，36，831-841)、2
′‑
moe(martin，p.helv.chim.acta 1996，79，1930-1938)、“lna”(wengel，j.acc.chem.res.1999，32，301-310)；pct公布第wo2012/030683号。
[0145]
根据某些实施方案，可以在本文所述的抑制性rna(例如，sirna)的有义链或反义链中选择性地使用各种核苷酸修饰或核苷酸修饰模式。例如，在一些实施方案中，可以在反义链中(至少在其双链体部分内)利用未修饰的核糖核苷酸，同时在有义链的一些或所有位置采用经修饰的核苷酸和/或经修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，在sirna的任一条或两条链的一部分或全部中采用特定修饰模式。核苷酸修饰可以多种模式
中的任一种发生。例如，可以使用交替模式。例如，反义链、有义链或两者都可以在每隔一个核苷酸上具有2
’‑
o-甲基或2
’‑
氟修饰。在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)包含具有至少一个未修饰的核苷酸的有义链和/或反义链。
[0146]
在一些实施方案中，有义链和/或反义链包含在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序。例如，在一些实施方案中，双链sirna在有义链、反义链或两者中包含在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序。在一些实施方案中，此类基序可以出现在任一条或两条链的裂解位点处或附近。此类基序的实例在美国专利申请公布20150197746、20150247143和20160298124中有描述。
[0147]
在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)是长度为19个核苷酸的平端体(bluntmer)，其中有义链含有在从5’末端开始的位置7、8、9的三个连续核苷酸上具有三个2
’‑
f修饰的至少一个基序，并且其中反义链含有在从5’末端开始的位置11、12、13的三个连续核苷酸上具有三个2
’‑
o-甲基修饰的至少一个基序。在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)是长度为20个核苷酸的双末端平端体，其中有义链含有在从5’末端开始的位置8、9、10的三个连续核苷酸上具有三个2
’‑
f修饰的至少一个基序，并且其中反义链含有在从5’末端开始的位置11、12、13的三个连续核苷酸上具有三个2
’‑
o-甲基修饰的至少一个基序。在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)是长度为21个核苷酸的双末端平端体，其中有义链含有在从5’末端开始的位置9、10、11的三个连续核苷酸上具有三个2
’‑
f修饰的至少一个基序，并且其中反义链含有在从5’末端开始的位置11、12、13的三个连续核苷酸上具有三个2
’‑
o-甲基修饰的至少一个基序。
[0148]
在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)包含19个核苷酸的有义链和21个核苷酸的反义链，其中有义链含有在从5’末端开始的位置7、8、9的三个连续核苷酸上具有三个2
’‑
f修饰的至少一个基序；反义链含有在从5’末端开始的位置11、12、13的三个连续核苷酸上具有三个2
’‑
o-甲基修饰的至少一个基序，其中抑制性rna(例如，sirna)的一个末端是平端，而另一末端包含2个核苷酸的突出端。优选地，2个核苷酸的突出端处于反义链的3’末端。当2个核苷酸的突出端处于反义链的3’末端时，在末端三个核苷酸之间可以有两个硫代磷酸酯核苷酸间联接，其中三个核苷酸中的两个核苷酸是突出端核苷酸，第三个核苷酸是紧接于突出端核苷酸的配对核苷酸。在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)在有义链的5’末端和反义链的5’末端的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间联接。在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)的有义链和反义链中的每个核苷酸，包括作为基序的一部分的核苷酸，都是经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，例如在交替基序中每个残基独立地被2
’‑
o-甲基或3
’‑
氟修饰。
[0149]
在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)包含19个核苷酸的有义链和21个核苷酸的反义链，其中(i)有义链在从5’末端开始的位置3、7、8、9、12和17处含有2
’‑
f修饰；(ii)有义链在从5’末端开始的位置1、2、4、5、6、10、11、13、14、15、16、18和19处含有2
’‑
o-甲基修饰；(iii)反义链在从5’末端开始的位置2和14处含有2
’‑
f修饰；以及(iv)反义链在从5’末端开始的位置1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20和21处含有2
’‑
o-甲基修饰；其中抑制性rna(例如，sirna)的一个末端是平端，而另一末端在反义链的3’末端包含2个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)包括反义链，该反义链包含介于3’末端处的末端三个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯核苷酸间联接，其中三个核
苷酸中的两个核苷酸是突出端核苷酸，第三个核苷酸是紧接于突出端核苷酸的配对核苷酸。在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)在有义链的5’末端和反义链的5’末端的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间联接。
[0150]
在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)的有义链和反义链中的每个核苷酸，包括作为基序的一部分的核苷酸，可以都是经修饰的。每个核苷酸可以用相同或不同的修饰进行修饰，所述修饰可以包括一个或两个非连接性磷酸氧和/或一个或多个连接性磷酸氧的一个或多个改变；核糖组成成分的改变，例如核糖上2’羟基的改变；用“脱磷酸”接头大规模置换磷酸部分；天然存在的碱基的修饰或置换；以及核糖-磷酸骨架的置换或修饰。
[0151]
在一些实施方案中，有义链和反义链的至少50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如100％)的残基独立地被lna、crn、cet、una、hna(1，5-失水己糖醇核酸)、cena(环己烯基核酸-一种dna模拟物，其中脱氧核糖被六元环己烯环置换)、2
′‑
甲氧基乙基、2
′‑
o-甲基、2
′‑
o-烯丙基、2
′‑
c-烯丙基、2
′‑
脱氧、2
′‑
羟基或2
′‑
氟修饰。所述链可以含有一个以上的修饰。在一些实施方案中，有义链和反义链的至少50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如100％)的残基独立地被2
’‑
o-甲基或2
’‑
氟修饰。在一些实施方案中，有义链和反义链上存在至少两种不同的修饰。那两种修饰可以是2
’‑
o-甲基或2
’‑
氟修饰，或其他修饰。
[0152]
在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)的双链体的有义链和反义链包含如图1中模式1-5所描绘的修饰模式中的任一种。在图1中，在任何给定位置，“2om”表示2
’‑
o-甲基修饰，“2f”表示2
’‑
氟修饰。“ps”表示注释“ps”的位置的核苷酸与注释“ps”的位置的3’的相邻核苷酸之间的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，seq id no：176-200和300-324中公开的反义链中的任一者，可以根据图1中公开的反义链(“as”)的修饰模式1-5中的任一种进行修饰。在一些实施方案中，seq id no：126-150中公开的有义链中的任一者，可以根据图1中公开的有义链(“ss”)的修饰模式1-5中的任一种进行修饰。在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)的双链体的有义链和/或反义链包含如图1中模式1-5所描绘的修饰模式中的任一种，但是其中有义链和/或反义链的任何1、2、3或4个位置不包括模式1-5之一中的此类1、2、3或4个位置所描绘的修饰。
[0153]
在一些实施方案中，sirna包含修饰模式1-5(图1中描绘的)中的任一种，并且还包括介于(i)有义链的5’端；(ii)有义链的3’端；(iii)反义链的5’端，和/或(iv)反义链的3’端的最后两个、三个或四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。例如，在一些实施方案中，sirna包括：(i)有义链，该有义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)有义链，该有义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)反义链，该反义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；和/或(iv)反义链，该反义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
[0154]
在一些实施方案中，sirna可以根据图1中修饰模式1-5中的任一种进行修饰，并且也可以缀合至配体，例如，如本文所述。在一些此类情况下，配体可以附接到有义或反义链的3’端或5’端中的任一者。在一些实施方案中，sirna(例如，表10和表15中列出的sirna：1-57中的任一者，例如，sirna 22、32和53)包含缀合至端部(例如，有义链或反义链的3’端或
5’端)的配体(例如，galnac配体，例如，本文所述的式xd或式xe的galnac)，并且所述sirna不包括介于缀合至配体的端部的末端处的两个、三个或四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。例如，在一些实施方案中，sirna(例如，表10和表15中列出的sirna：1-57中的任一者，例如，sirna 22、32和53)包括缀合至有义链的5’末端的配体(例如，galnac配体，例如，本文所述的式xd或式xe的galnac)，并且该sirna包括(i)有义链，该有义链不包括介于从5’末端开始的位置1、2、3或4的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)有义链，该有义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)反义链，该反义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；和(iv)反义链，该反义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
[0155]
在一些实施方案中，sirna(例如，表10和表15中列出的sirna：1-57中的任一者，例如，sirna 22、32和53)包括缀合至有义链的3’末端的配体(例如，galnac配体，例如，本文所述的式xd或式xe的galnac)，并且该sirna包括：(i)有义链，该有义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)有义链，该有义链不包括介于从3’末端开始的位置1、2、3或4的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)反义链，该反义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；和(iv)反义链，该反义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
[0156]
在一些实施方案中，sirna(例如，表10和表15中列出的sirna：1-57中的任一者，例如，sirna 22、32和53)包括缀合至反义链的5’末端的配体(例如，galnac配体，例如，本文所述的式xd或式xe的galnac)，并且该sirna包括(i)有义链，该有义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)有义链，该有义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)反义链，该反义链不包括介于从5’末端开始的位置1、2、3或4的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；和(iv)反义链，该反义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
[0157]
在一些实施方案中，sirna(例如，表10和表15中列出的sirna：1-57中的任一者，例如，sirna 22、32和53)包括缀合至反义链的3’末端的配体(例如，galnac配体，例如，本文所述的式xd或式xe的galnac)，并且该sirna包括(i)有义链，该有义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)有义链，该有义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)反义链，该反义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；和(iv)反义链，该反义链不包括介于从3’末端开始的位置1、2、3或4的核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
[0158]
在一些实施方案中，sirna(例如，表10和表15中列出的sirna：1-57中的任一者，例
如，sirna 22、32和53)包含缀合至端部(例如，有义链或反义链的3’端或5’端)的配体(例如，galnac配体，例如，本文所述的式xd或式xe的galnac)，并且所述sirna包括介于缀合至配体的端部的末端处的两个、三个或四个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
[0159]
例如，在一些实施方案中，sirna(例如，表10和表15中列出的sirna：1-57中的任一者，例如，sirna 22、32和53)包括缀合至有义链的5’末端的配体(例如，galnac配体，例如，本文所述的式xd或式xe的galnac)，并且该sirna包括(i)有义链，该有义链包括介于从5’末端开始的位置1、2、3或4的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)有义链，该有义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)反义链，该反义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；和(iv)反义链，该反义链包括介于从3’末端开始的位置l和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
[0160]
在一些实施方案中，sirna(例如，表10和表15中列出的sirna：1-57中的任一者，例如，sirna 22、32和53)包括缀合至有义链的3’末端的配体(例如，galnac配体，例如，本文所述的式xd或式xe的galnac)，并且该sirna包括：(i)有义链，该有义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)有义链，该有义链包括介于从3’末端开始的位置1、2、3或4的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)反义链，该反义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；和(iv)反义链，该反义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
[0161]
在一些实施方案中，sirna(例如，表10和表15中列出的sirna：1-57中的任一者，例如，sirna 22、32和53)包括缀合至反义链的5’末端的配体(例如，galnac配体，例如，本文所述的式xd或式xe的galnac)，并且该sirna包括(i)有义链，该有义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)有义链，该有义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)反义链，该反义链包括介于从5’末端开始的位置1、2、3或4的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；和(iv)反义链，该反义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
[0162]
在一些实施方案中，sirna(例如，表10和表15中列出的sirna：1-57中的任一者，例如，sirna 22、32和53)包括缀合至反义链的3’末端的配体(例如，galnac配体，例如，本文所述的式xd或式xe的galnac)，并且该sirna包括(i)有义链，该有义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(ii)有义链，该有义链包括介于从3’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从3’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；(iii)反义链，该反义链包括介于从5’末端开始的位置1和2的核苷酸之间以及介于从5’末端开始的位置2和3的核苷酸之间的硫代磷酸酯键；和(iv)反义链，该反义链包括介于从3’末端开始的位置1、2、3或4的核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
[0163]
在一些实施方案中，有义链和/或反义链包含交替模式的修饰。如本文所用的术语“交替基序”是指具有一个或多个修饰的基序，每个修饰发生在一条链的一个或多个核苷酸的交替基团上。例如，交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个，或每三个核苷酸一个，或类似的模式。例如，如果a、b和c各自表示对核苷酸的一种修饰类型，则交替基序可以是“abababababab...”、“aabbaabbaabb...”、“aabaabaabaab...”、“aaabaaabaaab...”、“aaabbbaaabbb...，”或“abcabcabcabc...”等。
[0164]
交替基序中所含的修饰类型可以相同或不同。例如，如果a、b、c、d各自表示核苷酸上的一种修饰类型，则交替模式，即每隔一个核苷酸上的修饰，可以是相同的，但是有义链或反义链中的每条链可以选自交替基序内的几种修饰可能性，诸如“ababab...”、“acacac...”“bdbdbd...”或“cdcdcd...”等。
[0165]
在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)包含的有义链上交替基序的修饰模式相对于反义链上交替基序的修饰模式是移位的。移位可以是这样的，有义链的经修饰的核苷酸组对应于反义链的经不同修饰的核苷酸组，反之亦然。例如，当与dsrna双链体中的反义链配对时，在双链体部分内，有义链中的交替基序可以从该链的5
’‑3’
以“ababab”开始并且反义链中的交替基序可以从该链的5
’‑
3以“bab aba”开始。作为另一个实例，在双链体部分内，有义链中的交替基序可以从该链的5
’‑3’
以“aabbaabb”开始并且反义链中的交替基序可以从该链的5
’‑3’
以“bbaabbaa”开始，使得在有义链与反义链之间存在修饰模式的完全或部分移位。
[0166]
在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)包含有义链上的2
′‑
o-甲基修饰和2
′‑
f修饰的交替基序模式，相对于反义链上的2
′‑
o-甲基修饰和2
′‑
f修饰的交替基序模式具有移位，即有义链上2
′‑
o-甲基修饰的核苷酸与反义链上2
′‑
f修饰的核苷酸碱基配对，并且反之亦然。有义链的1位置可以以2
’‑
f修饰开始，并且反义链的1位置可以以2
’‑
o-甲基修饰开始。
[0167]
在一些实施方案中，可以在有义链和/或反义链的三个连续核苷酸上引入具有三个相同修饰的一个或多个基序，以中断有义链和/或反义链中存在的初始修饰模式。在一些实施方案中，当三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序引入任何链中时，紧接于该基序的核苷酸的修饰是与该基序的修饰不同的修饰。例如，含有该基序的序列部分是“...nayyynb...”，其中“y”表示三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序的修饰，而“na”和“nb”表示对紧接于该基序“yyy”的核苷酸的修饰，该修饰不同于y的修饰，并且其中na和nb可以是相同或不同的修饰。
[0168]
抑制性rna(例如，sirna)还可以包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间联接。在一些实施方案中，核苷酸间联接修饰可以发生在有义链和/或反义链上的每个核苷酸上；每个核苷酸间联接修饰可以在有义链和/或反义链上以交替模式出现；或者有义链或反义链可以含有交替模式的两种核苷酸间联接修饰。有义链上核苷酸间联接修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上核苷酸间联接修饰的交替模式可以相对于反义链上核苷酸间联接修饰的交替模式具有移位。在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)包含6-8个硫代磷酸酯核苷酸间联接。在一些实施方案中，反义链在5’端包含两个硫代磷酸酯核苷酸间联接并且在3’端包含两个硫代磷酸酯核苷酸间联接，有义链在5’端或3’端包含至少两个硫代磷酸酯核苷酸间联接。
[0169]
在某些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)可以具有wo/2015/089368的第59页(第20行)至第65页(第15行)或美国专利申请公布第20160298124号的相应段落[0469]-[0537]或在所述公布中的任一者或两者的权利要求中描述的构型和/或修饰模式中的任一者。例如，在一些实施方案中抑制性rna(例如，sirna)包含有义链和反义链，其中所述有义链与所述反义链互补，其中所述反义链包含与编码c3的mrna的一部分互补的区域(例如，本文所述的靶区域)，其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸，其中所述试剂由式(iii)表示：
[0170]
有义链：5
′np-n
a-(xxx)
i-n
b-yyy-n
b-(zzz)
j-n
a-n
q 3
′
[0171]
反义链：3
′np
′-na′-(x
′
x
′
x
′
)
k-nb′-y
′y′y′‑
nb′-(z
′z′z′
)
1-na′-nq′ 5
′
[0172]
其中：i、j、k和l各自独立地为0或1；p、p
′
、q和q
′
各自独立地为0-6；每个na和na′
独立地表示包含0-25个经修饰或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；每个nb和nb′
独立地表示包含0-10个经修饰或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列；每个n
p
、n
p
′
、nq和nq′
(其中每一个可能存在或者可能不存在)独立地表示突出端核苷酸；xxx、yyy、zzz、x
′
x
′
x
′
、y
′y′y′
和z
′z′z′
各自独立地表示三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；nb上的修饰不同于y上的修饰并且n
b’上的修饰不同于y’上的修饰；并且其中有义链缀合到至少一个配体。在一些实施方案中，i为0；j为0；i为1；j为1；i和j均为0；或者i和j均为1。在一些实施方案中，xxx与x
′
x
′
x
′
互补，yyy与y
′y′y′
互补，且zzz与z
′z′z′
互补。应当理解，每个x可以包含不同的碱基，只要每个x包含相同的修饰。例如，xxx可以表示agc，其中每个核苷酸均包含2-f修饰。类似地，每个x
′
、每个y、每个y
′
、每个z和每个z可以是不同的。
[0173]
在一些实施方案中，式(iii)由式(iiia)表示：
[0174]
有义链：5
′np-n
a-yyy-n
a-n
q 3
′
[0175]
反义链：3
′np
′-na′-y
′y′y′‑
na′-nq′ 5
′
[0176]
或者其中式(iii)由式(iiib)表示：
[0177]
有义链：5
′np-n
a-yyy-n
b-zzz-n
a-n
q 3
′
[0178]
反义链：3
′np
′-na′-y
′y′y′‑
nb′-z
′z′z′‑
na′-nq′ 5
′
[0179]
其中每个nb和nb′
独立地表示包含1-5个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；或者其中式(iii)由式(iiic)表示：
[0180]
有义链：5
′np-n
a-xxx-n
b-yyy-n
a-n
q 3
′
[0181]
反义链：3
′np
′-na′-x
′
x
′
x
′‑
nb′-y
′y′y′‑
na′-nq′ 5
′
[0182]
其中每个nb和nb′
独立地表示包含1-5个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；或者其中式(iii)由式(iiid)表示：
[0183]
有义链：5
′np-n
a-xxx-n
b-yyy-n
b-zzz-n
a-n
q 3
′
[0184]
反义链：3
′np
′-na′-x
′
x
′
x
′‑
nb′-y
′y′y′‑
nb′-z
′z′z′‑
na′-nq′ 5
[0185]
其中每个nb和nb′
独立地表示包含1-5个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，并且每个na和na′
独立地表示包含2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0186]
在一些实施方案中，核苷酸上的修饰选自由lna、crn、cet、una、hna、cena、2
’‑
甲氧基乙基、2
’‑
o-甲基、2
’‑
o-烷基、2
’‑
o-烯丙基、2
’‑
c-烯丙基、2
’‑
氟、2
’‑
脱氧、2
’‑
羟基及它们的组合组成的组。
[0187]
在一些实施方案中，核苷酸上的修饰是2
’‑
o-甲基或2
’‑
氟修饰。在一些实施方案中，配体是通过二价或三价分支接头附接的一种或多种galnac衍生物。在一些实施方案中，配体如式xa、式xb或式xc所描绘，或是如下所示的另一galnac结构。
[0188]
在一些实施方案中，配体附接至有义链的3
′
末端。在一些实施方案中，附接如下面所示的式xd所描绘。
[0189]
在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)还包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间联接。
[0190]
在一些实施方案中，p
′
＞0；或者p
′
＝2。
[0191]
在一些实施方案中，q
′
＝0，p＝0，q＝0，并且p’突出端核苷酸与c3mrna互补。在一些实施方案中，q
′
＝0，p＝0，q＝0，并且p’突出端核苷酸与c3 mrna不互补。
[0192]
在一些实施方案中，至少一个n
p’经由硫代磷酸酯联接与相邻核苷酸联接。
[0193]
在一些实施方案中，配体将核酸分子靶向肝细胞。例如，在一些实施方案中，配体与肝细胞特异性去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)结合，例如，配体包含半乳糖衍生物，例如galnac。
[0194]
在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)与一个或多个部分缀合或以其他方式物理缔合，所述部分调节(例如，增强)抑制性rna(例如，sirna)的活性、稳定性、细胞分布和/或细胞摄取和/或改变抑制性rna(例如，sirna)的一种或多种物理性质，诸如电荷或溶解性。在一些实施方案中，部分可以包括抗体或配体。配体可以是碳水化合物、凝集素、蛋白质、糖蛋白、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、核酸激素、生长因子或受体。在一些实施方案中，可以使用天然存在的激素、生长因子或其他配体的无生物活性变体。在一些实施方案中，该部分包含将抑制性rna(例如，sirna)靶向指定细胞类型(例如，肝细胞)的靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分与肝细胞特异性去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)结合。
[0195]
在一些实施方案中，部分经由可逆联接附接至抑制性rna(例如，sirna)。“可逆联接”是包含可逆键的联接。“可逆键”(也称为不稳定键或可裂解键)是与氢原子的共价键不同的共价键，该共价键在选定的条件下能够比分子中的其他键更快地被选择性破坏或裂解，该键能够在基本上不会破坏或裂解同一分子中的其他共价键的条件下被选择性破坏或裂解。键的裂解或不稳定性可以按照键裂解的半衰期(t
1/2
)(一半键裂解所需的时间)来描述。除非另有说明，否则本文中的目标可逆键是“生理性可逆键”，意指该键在哺乳动物体内通常遇到的或类似于在哺乳动物体内遇到的那些的条件下是可裂解的。生理性可逆键联接是包含至少一个生理性可逆键的联接。在一些实施方案中，生理性可逆键在哺乳动物细胞内条件下是可逆的，所述条件包括化学条件，诸如ph、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中发现的或类似于在哺乳动物细胞中发现的那些的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括哺乳动物细胞中通常存在的酶活性，诸如来自蛋白水解酶或水解酶的酶活性。酶不稳定键被体内的酶，例如细胞内酶裂解。ph不稳定键在ph小于或等于7.0时裂解。可逆键和可逆联接的实例以及它们将部分缀合到抑制性rna(例如，sirna)上的用途在例如美国专利申请公布第20130281685和20150273081号中有描述。
[0196]
在一些实施方案中，部分包含蛋白质转导结构域(ptd)。蛋白质转导结构域是利于附接至该结构域的异源分子(此类异源分子可以称为“货物”)的摄取的多肽或其部分。作为肽的蛋白质转导结构域可以称为细胞穿透肽(cpp)。许多蛋白质转导结构域/肽是本领域已
知的。ptd包括多种天然存在的或合成的富含精氨酸的肽。富含精氨酸的肽是含有至少30％精氨酸残基(例如至少40％、50％、60％或更多精氨酸残基)的肽。ptd的实例包括tat(至少氨基酸49-56)、触角足同源框结构域(antennopedia homeodomain)、hsv vp22和多聚精氨酸。此类肽可以是阳离子、疏水性或两亲性肽，并且可以包括非标准氨基酸和/或各种修饰或变型，诸如使用环状排列、反向、逆向、逆反或肽模拟物型式。ptd和货物的附接可以是共价的或非共价的。
[0197]
可以使用的示例性ptd在美国专利申请公布第20090093026号、第20090093425号、第20120142763号、第20150238516号和第20160215022号中有描述。ptd可以包含两个或更多个可以相同或不同的ptd(例如，2至10个ptd)。ptd可以彼此直接联接或者可以被联接部分隔开，该联接部分可以包含一个或多个氨基酸和/或一个或多个非氨基酸部分，诸如烷基链或低聚乙二醇部分。
[0198]
在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)包含阴离子电荷中和部分或与阴离子电荷中和部分物理缔合。阴离子电荷中和部分是指可以减少与之物理缔合的核酸的总净阴离子电荷的分子或化学基团。一个或多个阴离子电荷中和分子或基团可以与核酸缔合，其中每个分子或基团独立地有助于阴离子电荷的减少和/或阳离子电荷的增加。电荷中和意指核酸的阴离子电荷被减少、中和或比不存在阴离子电荷中和分子或基团的情况下相同核酸具有更多阳离子。磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保护基团是阴离子电荷中和基团的实例。在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)在一个或多个位置包含保护基团，该保护基团减少含有带负电荷的基团的骨架(例如，磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架)的净阴离子电荷。在一些实施方案中，带负电荷的磷酸二酯骨架通过用生物可逆性磷酸三酯保护基团合成而中和，所述保护基团在细胞内部通过细胞质硫酯酶的作用被转化为带电荷的磷酸二酯键，从而产生具有抑制表达的生物活性的试剂，例如可以介导rnai的抑制性rna(例如，sirna)。此类试剂，有时称为短干扰核糖核酸中性物(sirnn)，因此可以作为sirna前药。应当理解，骨架不需要完全中和(即，不带电)。在一些实施方案中，5％至100％的磷酸基团受到保护，例如25％-50％或50％至75％或75％至100％。在某些实施方案中，一条链或两条链上的至少5、6、7、8、9或10个磷酸基团受到保护。有用的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保护基团的实例、制备所述保护基团的方法以及所述保护基团在核酸中(例如，生成rnai试剂前药)的用途在美国专利申请公布第20110294869号、第20090093425号、第20120142763号和第20150238516号中有描述。在各种实施方案中，sirna可以包含本文所述的修饰中的任一种。例如，在一些实施方案中，它可以含有2
′
糖修饰(例如，2
′‑
f、2
′‑
o-me)。此外，sirnn可以具有本文所述的构型或修饰模式中的任一种。
[0199]
在一些实施方案中，附接到抑制性rna(例如，sirna)的部分包含碳水化合物。代表性的碳水化合物包括含有约4、5、6、7、8或9个单糖单元的单糖、二糖、三糖和寡糖。在某些实施方案中，碳水化合物包含半乳糖或半乳糖衍生物，诸如半乳糖胺、n-甲酰基-半乳糖胺、n-乙酰半乳糖胺、n-丙酰基-半乳糖胺、n-正丁酰基-半乳糖胺和n-异丁酰基半乳糖胺。在某些特别感兴趣的实施方案中，半乳糖衍生物包括n-乙酰半乳糖胺(galnac)。在某些实施方案中，该部分包含半乳糖或半乳糖衍生物的多个示例，例如多个n-乙酰半乳糖胺部分，例如3个galnac部分。如本文所用，术语“半乳糖衍生物”包括半乳糖和对去唾液酸糖蛋白受体的亲和力等于或大于半乳糖的半乳糖衍生物。术语“半乳糖簇”是指包含至少2个半乳糖衍生
物的结构，所述半乳糖衍生物通常通过共价附接到另一部分而彼此物理缔合。在一些实施方案中，半乳糖簇具有2-10个(例如，6个)或2-4个(例如，3个)末端半乳糖衍生物。末端半乳糖衍生物可以通过半乳糖衍生物的c-1碳附接到另一部分。在一些实施方案中，两个或更多个(例如三个)半乳糖衍生物附接到作为分支点并且可以附接到抑制性rna(例如，sirna)的部分。在一些实施方案中，半乳糖衍生物经由接头或间隔区联接到作为分支点的部分。在一些实施方案中，作为分支点的部分可以经由接头或间隔区附接到抑制性rna(例如，sirna)。例如，在一些实施方案中，半乳糖衍生物经由包含酰胺、羰基、烷基、低聚乙二醇部分或它们的组合的接头或间隔区附接到分支点。在一些实施方案中，附接到每个半乳糖衍生物的接头或间隔区是相同的。在一些实施方案中，半乳糖簇具有三个各自对去唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(例如，galnac)。其中3个末端galnac部分附接(例如，通过糖的c-1碳)到作为分支点的部分的结构可以称为三触角n-乙酰半乳糖胺(galnac3)。在一些实施方案中，包含半乳糖衍生物的一个或多个单体单元可以位点特异性地掺入抑制性rna(例如，sirna)中。此类含半乳糖衍生物的单体单元可以包含附接到核苷部分或非核苷部分的半乳糖衍生物，例如galnac。在一些实施方案中，至少3个核苷-galnac单体或至少3个非核苷-galnac单体位点特异性地掺入抑制性rna(例如，sirna)中。在一些实施方案中，此类掺入可以在使用亚磷酰胺化学法的固相合成过程中发生，或者经由合成后缀合发生。在一些实施方案中，含半乳糖衍生物的单体单元经由磷酸二酯键彼此连结和/或连结到没有附接半乳糖衍生物的抑制性rna(例如，sirna)的核苷上。在一些实施方案中，2个、3个或更多个含半乳糖衍生物的单体单元连续排列，即没有任何缺乏半乳糖衍生物的中间单元。在一些实施方案中，碳水化合物，例如半乳糖簇，例如三触角n-乙酰半乳糖胺或两个或多个含galnac的单体单元，存在于链的末端，例如有义链的3’末端或反义链的5’末端。示例性的碳水化合物(例如，半乳糖簇)、含半乳糖衍生物的单体单元、碳水化合物修饰的抑制性rna及其制造和使用方法在以下中有描述：美国专利申请公布第20090203135号、第20090239814号、第20110207799号、第20120157509号、第20150247143号，美国公布
‘
124；nair，jk等人，j.am.chem.soc.136，16958-16961(2014)；matsuda，s.等人，acs chem.biol.10，1181-1187(2015)；rajeev，k.等人，chembiochem 16，903-908(2015)；migawa，mt.等人，bioorg med chem lett.26(9)：2194-7(2016)；prakash，tp等人，j med chem.59(6)：2718-33(2016)。下面描绘了示例性的半乳糖簇。
[0200]
[0201][0202]
下面描绘了另外的galnac结构(并且可以如sharma等人，bioconjug.chem.29：2478-2488(2018)中所述那样合成)：
[0203][0204]
在一些实施方案中，m＝0且n＝2。在一些实施方案中，m＝1且n＝1。在一些实施方
案中，m＝1且n＝2。在一些实施方案中，m＝1且n＝3。
[0205][0206][0207]
本领域的普通技术人员认识到，将每个galnac连接到分支点的联接部分的结构可以不同。在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna)如下面所描绘的那样缀合至galnac：
[0208][0209]
式xd(其中所述galnac可以缀合在任一条链(例如，有义链)的3’末端或5’末端)
[0210][0211]
在一些实施方案中，抑制性rna(例如，sirna，诸如表10和表15中列出的sirna：1-57中的任一者，例如sirna 22、32和53)缀合至galnac配体(例如，式xd或式xe的galnac)。
[0212]
在一些实施方案中，galnac配体(例如，如式xd或式xe所示)缀合至sirna(例如，sirna：1-57中的任一者，例如sirna 22、32和53)的有义链或反义链的3’端核苷酸。在一些实施方案中，galnac配体(例如，如式xd或式xe所示)缀合至sirna的有义链或反义链的3’端核苷酸上的糖的3’位置。
[0213]
在一些实施方案中，galnac配体(例如，如式xd或式xe所示)缀合至sirna(例如，sirna：1-57中的任一者，例如sirna 22、32和53)的有义链或反义链的5’端核苷酸。在一些实施方案中galnac配体(例如，如式xd或式xe所示)缀合至sirna的有义链或反义链的5’端核苷酸的5’位置。
[0214]
在一些实施方案中，当抑制性rna(例如，seq id no：1-57的sirna，例如sirna 22、32和53)缀合至配体(例如，galnac配体)，抑制性rna可不包括对缀合至配体的核苷酸的修饰(例如，硫代磷酸酯键“ps”)。
[0215]
在一些实施方案中，sirna(诸如sirna：1-57中的任一者，例如sirna 22、32和53)缀合至有义链或反义链的一端的galnac配体(例如，如式xd或式xe所示)。在一些实施方案中，未缀合至galnac配体的其他三个端部含有修饰，诸如硫代磷酸酯键(“ps”)。在一些实施方案中，修饰包括介于两个、三个或四个5’或3’最末端核苷酸之间的ps键。在一些实施方案中，缀合至galnac配体的端部不含介于两个、三个或四个5’或3’最末端核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
[0216]
在一些实施方案中，本文所述的sirna可以缀合至如下所示的半乳糖结构：
[0217][0218]
在一些实施方案中，接头包含酰胺、羰基、烷基、低聚乙二醇部分或它们的组合。
[0219]
在一些实施方案中，本文所述的sirna可以缀合至如下所示的半乳糖结构：
[0220][0221]
在一些实施方案中，接头包含酰胺、羰基、烷基、低聚乙二醇部分或它们的组合。
[0222]
合成galnac配体的方法、将galnac配体缀合至抑制性rna的方法和另外的galnac配体是本领域已知的，并且包括例如wo 2017/021385、wo 2017/178656、wo 2018/215391、wo 2019/145543、wo 2017/084987、wo 2017/055423和wo 2012/083046中描述的那些，其通过引用整体并入本文。
[0223]
在一些实施方案中抑制性rna(例如，sirna)如下面所描绘的那样缀合至配体。
sirna是含有两个或更多个化学性质不同的区域的sirna，每个区域由至少一个单体单元构成，其中所述区域赋予化合物不同的性质。在一些实施方案中，至少一个区域经修饰以便赋予sirna增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取和/或增加的对靶核酸的结合亲和力，并且sirna的至少一个附加区域可以作为能够裂解rna：dna或rna：rna杂交体的酶(例如，rna酶h)的底物。在一些实施方案中，sirna的至少一个区域可以作为能够裂解rna：dna或rna：rna杂交体的酶(例如，rna酶h)的底物，并且至少一个区域可以通过空间阻断来抑制翻译。
[0230]
在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(例如，sirna)可以作为退火双链体sirna的形式引入靶细胞中。在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(例如，sirna)作为单链有义和反义核酸序列的形式引入靶细胞中，一旦处于靶细胞内，就退火形成抑制性rna(例如，sirna)双链体。可替代地，抑制性rna(例如，sirna)的有义链和反义链可以由引入靶细胞的表达载体(诸如本文所述的表达载体)编码。在靶细胞内表达后，转录的有义链和反义链可以退火以重构抑制性rna(例如，sirna)。
[0231]
本文所述的抑制性rna(例如，sirna或mirna，或包含编码sirna或mirna的核苷酸序列的载体)可以通过本领域已知的标准方法，例如，通过使用自动合成仪合成。通过此类方法产生的rna往往是高纯度的并且有效退火形成抑制性rna(例如，sirna)双链体。化学合成后，单链rna分子可以去保护，退火形成sirna，并纯化(例如，通过凝胶电泳或hplc)。可替代地，可以使用标准程序从dna模板体外转录rna，例如，该模板携带一个或多个rna聚合酶启动子序列(例如，t7或sp6 rna聚合酶启动子序列)。使用t7 rna聚合酶制备sirna的方案是本领域已知的(参见，例如，donze和picard，nucleic acids res.2002；30：e46；和yu等人，proc.natl.acad.sci.usa 2002；99：6047-6052)。有义和反义转录物可以在两个独立的反应中合成并且稍后退火，或者它们可以在单个反应中同时合成。
[0232]
抑制性rna(例如，sirna或mirna)也可以在细胞内通过从引入细胞中的表达构建体转录rna来形成(参见，例如，yu等人，proc.natl.acad.sci.usa 2002；99：6047-6052)。用于体内产生抑制性rna(例如，sirna)分子的表达构建体可包括一个或多个sirna编码序列，其可操作地连接到sirna编码序列正确转录所必需的元件，包括例如启动子元件和转录终止信号序列。用于此类表达构建体中的优选启动子包括聚合酶-iii hi-rna启动子(参见，例如，brummelkamp等人，science 2002；296：550-553)和u6聚合酶-iii启动子(参见，例如，sui等人，proc.natl.acad.sci.usa 2002；paul等人，nature biotechnol.2002；20：505-508；和yu等人，proc.natl.acad.sci.usa 2002；99：6047-6052)。sirna表达构建体还可包含一个或多个促进表达构建体克隆的载体序列。可以使用的标准载体包括，例如，psilencer 2.0-u6载体(ambion inc.，austin，tex.)。
[0233]
vi.表达载体
[0234]
在一些实施方案中，使用表达载体将本文所述的抑制性rna递送至受试者(例如，递送至受试者的细胞，例如，受试者的肝细胞)。许多形式的载体可用于递送本文所述的抑制性rna。表达载体的非限制性实例包括病毒载体(例如，适于基因疗法的载体)、质粒载体、噬菌体载体、粘粒、噬菌粒、人工染色体等。
[0235]
在一些实施方案中，编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列整合到病毒载体中。病毒载体的非限制性实例包括：逆转录病毒(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)、哈维鼠肉
瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒、劳斯肉瘤病毒)、腺病毒、腺相关病毒、sv40型病毒、多瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barr virus)、乳头瘤病毒、疱疹病毒、痘苗病毒和脊髓灰质炎病毒。
[0236]
在体内，许多补体蛋白，包括c3，主要在肝脏中合成。因此，在一些实施方案中，靶向肝细胞递送本文所述的抑制性rna。已经证实几类病毒载体有能力进行基因疗法构建体的肝靶向递送，包括逆转录病毒载体(参见，例如，axelrod等人，pnas 87：5173-5177(1990)；kay等人，hum.gene ther.3：641-647(1992)；van den driessche等人，pnas 96：10379-10384(1999)；xu等人，asaio j.49：407-416(2003)；和xu等人，pnas 102：6080-6085(2005))、慢病毒载体(参见，例如，mckay等人，curr.pharm.des.17：2528-2541(2011)；brown等人，blood 109：2797-2805(2007)；和matrai等人，hepatology 53：1696-1707(2011))、腺相关病毒(aav)载体(参见，例如，herzog等人，blood 91：4600-4607(1998))和腺病毒载体(参见，例如，brown等人，blood 103：804-810(2004)和ehrhardt等人，blood 99：3923-3930(2002))。
[0237]
逆转录病毒是属于逆转录病毒科的包膜病毒。一旦处于宿主细胞中，病毒就通过使用病毒逆转录酶将其rna转录为dna进行复制。逆转录病毒dna作为宿主基因组的一部分复制并且称为原病毒。可以使用本领域已知的技术将所选核酸插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。产生复制缺陷型逆转录病毒的方案是本领域已知的(参见，例如，kriegler，m.，gene transfer and expression，a laboratory manual，w.h.freeman co.，new york(1990)和murry，e.j.，methods in molecular biology，第7卷，humana press，inc.，cliffton，n.j.(1991))。然后可以分离重组病毒并在体内或体外递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的，例如参见美国专利第5,994,136号、第6,165,782号和第6,428,953号。逆转录病毒包括α逆转录病毒属(例如，禽白血病病毒)、β逆转录病毒属(例如，小鼠乳腺肿瘤病毒)、δ逆转录病毒属(例如，牛白血病病毒和人嗜t淋巴细胞病毒)、ε逆转录病毒属(例如，大眼鲈皮肤肉瘤病毒)和慢病毒属。
[0238]
在一些实施方案中，逆转录病毒是逆转录病毒科的慢病毒。慢病毒载体可以转导非增殖细胞并显示出低免疫原性。在一些实例中，慢病毒是但不限于人免疫缺陷病毒(hiv-1和hiv-2)、猿猴免疫缺陷病毒(s1v)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、马传染性贫血(eia)和维斯纳病毒(visna virus)。源自慢病毒的载体可以在体内实现显著水平的核酸转移。
[0239]
在一些实施方案中，载体是腺病毒载体。腺病毒是含有双链dna的病毒大家族。它们在宿主细胞的核内，使用宿主的细胞机器复制以合成病毒rna、dna和蛋白质。本领域已知腺病毒会影响复制型和非复制型细胞，容纳大的转基因，并且编码蛋白质而不整合到宿主细胞基因组中。
[0240]
在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(aav)载体。aav系统通常是本领域众所周知的(参见，例如，kelleher和vos，biotechniques，17(6)：1110-17(1994)；cotten等人，p.n.a.s.u.s.a.，89(13)：6094-98(1992)；curiel，nat immun，13(2-3)：141-64(1994)；muzyczka，curr top microbiol immunol，158：97-129(1992)；和asokan a等人，mol.ther.，20(4)：699-708(2012))。生成和使用重组aav(raav)载体的方法在例如美国专利第5,139,941号和第4,797,368号中有描述。
[0241]
已经表征了几种aav血清型，包括aav1、aav2、aav3(例如，aav3b)、aav4、aav5、
aav6、aav7、aav8、aav9、aav10和aav11以及它们的变体。通常，任何aav血清型都可用于递送本文所述的抑制性rna。然而，血清型具有不同的嗜性，例如，它们优先感染不同的组织。在一个实施方案中，因为补体蛋白是在肝脏中产生的，所以基于肝嗜性选择aav血清型，至少在血清型aav2、aav3(例如，aav3b)、aav5、aav7、aav8和aav9中发现(参见，例如，shaoyong等人，mol.ther.23：1867-1876(2015))。
[0242]
raav载体的aav序列通常包含顺式作用5’和3’反向末端重复序列(参见，例如，b.j.carter，在
″
handbook of parvoviruses
″
中，p.tijsser编辑，crc press，第155-168页(1990))。itr序列长度为约145bp。在一些实施方案中，基本上编码itr的整个序列都用于raav载体中，但是容许对这些序列进行一定程度的微小修饰。修饰这些itr序列的能力在本领域的技术范围内。(参见，例如，诸如sambrook等人
″
molecular cloning.a laboratory manual
″
，第2版，cold spring harbor laboratory，new york(1989)；和k.fisher等人，j virol.，70：520532(1996)的文本)。本公开的raav载体的一个实例是含有转基因(例如，编码本文所述的抑制性rna的核酸)的“顺式作用”质粒，其中选定的转基因序列和相关的调控元件的侧翼是5’和3’aav itr序列。aav itr序列可以从任何已知的aav获得，包括目前鉴定的哺乳动物aav型。
[0243]
除了以上针对raav载体鉴定的主要元件外，该载体还可以包括可操作地联接到转基因的常规控制元件，其联接方式容许转基因在用该载体转染或用本公开产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达。表达控制序列包括适当的转录起始序列、终止序列、启动子和增强子序列；有效的rna加工信号序列，诸如剪接和聚腺苷酸化(polya)信号序列；稳定细胞质mrna的序列；增强翻译效率的序列(即，kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强编码的产物分泌的序列。许多表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子，是本领域已知的，并且可以包括在本文所述的载体中。在一些实施方案中，可操作地连接的编码序列产生功能性rna(例如，mirna或sirna)。
[0244]
组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(rsv)ltr启动子(任选地具有rsv增强子)、巨细胞病毒(cmv)启动子(任选地具有cmv增强子)、sv40启动子和二氢叶酸还原酶启动子。诱导型启动子允许调控基因表达并且可以受外源供给的化合物、环境因素(诸如温度)或特定生理状态的存在调控，特定生理状态例如急性期、细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中。诱导型启动子和诱导型系统可从各种商业来源获得，包括但不限于invitrogen、clontech和ariad。已经描述了许多其它系统，并且本领域技术人员可以容易地选择。由外源供给的启动子调控的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(mt)启动子、地塞米松(dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、t7聚合酶启动子系统、蜕皮激素昆虫启动子、四环素阻遏系统、四环素诱导系统、ru486诱导系统和雷帕霉素诱导系统。在该上下文中可用的其他类型的诱导型启动子是受特定生理状态调控的启动子，特定生理状态例如温度、急性期、细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中。在另一个实施方案中，将使用转基因的天然启动子或其片段。在另一个实施方案中，其他天然表达控制元件，诸如增强子元件、聚腺苷酸化位点或kozak共有序列也可用于模拟天然表达。
[0245]
在一些实施方案中，调控序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调控序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。此类组织特异性调控序列(例如，启动子、增强子等)是本领域众所周知的。在一些实施方案中，启动子是鸡
β-肌动蛋白启动子、pol ii启动子或pol iii启动子。
[0246]
在一些实施方案中，将raav设计用于在肝细胞中表达本文所述的抑制性rna，并且raav包括一种或多种肝脏特异性调控元件，所述调控元件将抑制性rna的表达基本上限于肝细胞中。一般来说，肝脏特异性调控元件可以源自任何已知只在肝脏中表达的基因。wo 2009/130208鉴定了几种以肝脏特异性方式表达的基因，包括丝氨酸蛋白酶抑制剂，进化枝a成员1，也称为α-抗胰蛋白酶(serpina1；基因id 5265)、载脂蛋白c-i(apoc1；基因id 341)、载脂蛋白c-iv(apoc4；基因id 346)、载脂蛋白h(apoh；基因id 350)、甲状腺素运载蛋白(ttr；基因id 7276)、白蛋白(alb；基因id 213)、醛缩酶b(aldob；基因id 229)、细胞色素p450，家族2亚家族e多肽1(cyp2e1；基因id 1571)、纤维蛋白原α链(fga；基因id 2243)、转铁蛋白(tf；基因id 7018)和触珠蛋白相关蛋白(hpr；基因id 3250)。在一些实施方案中，本文所述的病毒载体包括源自这些蛋白中的一种或多种的基因组基因座的肝脏特异性调控元件。在一些实施方案中，启动子可以是肝脏特异性启动子甲状腺素结合球蛋白(tbg)。可替代地，可以使用其他肝特异性启动子(参见，例如，the liver specific gene promoter database，cold spring harbor，http：//rulai.cshl.edu/lspd/，诸如α1抗胰蛋白酶(a1at)；人白蛋白(miyatake等人，j.virol.71：512432(1997))；huma1b；乙型肝炎病毒核心启动子(sandig等人，gene ther.3：10029(1996))；或者lsp1。其他载体和调控元件在例如baruteau等人，j.inherit.metab.dis.40：497-517(2017)中有描述)。
[0247]
在一些实施方案中，病毒载体(例如，raav载体)包含编码本文所述的抑制性rna的dna序列。
[0248]
在一些实施方案中，载体(例如，病毒载体)包含一种或多种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码一种以上(例如，2、3、4、5种或更多种)包含与c3转录物，例如c3 mrna(seq id no：75)的靶部分互补的核酸链的mirna或sirna。在一些实施方案中，载体包含多个核苷酸序列，其中每个核苷酸序列编码本文所述的不同抑制性rna。在一些实施方案中，载体包含编码至少2种不同抑制性rna的多个核苷酸序列，其中所述核苷酸序列中的至少两种核苷酸序列是本文所述相同抑制性rna的拷贝。
[0249]
在一些实施方案中，除了编码本文所述的一种或多种抑制性rna的一种或多种序列之外，载体(例如，病毒载体)包含编码一种或多种c3抑制剂(例如，本文所述的c3抑制剂)的一种或多种另外的核苷酸序列。例如，c3抑制剂可以是多肽抑制剂和/或核酸适体(参见，例如，美国公布第20030191084号)。示例性的多肽抑制剂包括坎普他汀类似物(例如，包括可遗传编码的氨基酸的本文所述的坎普他汀类似物)、抗c3或抗c3b抗体(例如，scfv或单结构域抗体，例如，纳米抗体)、降解c3或c3b的酶(参见，例如，美国专利第6,676,943号)，或哺乳动物补体调控蛋白(例如，cr1、daf、mcp、cfh、cfi、c1抑制剂(c1-inh)、补体受体1的可溶形式(scr1)、tp10或tp20(avant therapeutics)或其部分。另外的多肽抑制剂包括微小因子h(参见，例如，美国公布第20150110766号)、来自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的efb蛋白或补体抑制剂(scin)蛋白，或它们的变体或衍生物或模拟物(参见，例如，美国公布20140371133)。
[0250]
在一些实施方案中，多肽抑制剂联接到分泌信号序列，用于从宿主细胞分泌表达的多肽抑制剂。
[0251]
vii.表达载体的产生
[0252]
用于获得表达载体例如raav的方法是本领域已知的。通常，所述方法牵涉培养含有以下的宿主细胞：编码aav衣壳蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；由aav反向末端重复序列(itr)和转基因组成的重组aav载体；和/或足够的辅助功能以容许将重组aav载体包装到aav衣壳蛋白中。
[0253]
将在宿主细胞中培养以将raav载体包装在aav衣壳中的组分可以反式提供给宿主细胞。可替代地，所需组分中的任何一种或多种(例如，重组aav载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可以由稳定宿主细胞提供，该宿主细胞已经使用本领域技术人员已知的方法工程改造成含有所需组分中的一种或多种。在一些实施方案中，此类稳定宿主细胞含有受诱导型启动子控制的所需组分。在其他实施方案中，所需组分可以受组成型启动子控制。在其他实施方案中，选定的稳定宿主细胞可以含有受组成型启动子控制的选定组分和受一种或多种诱导型启动子控制的其他选定组分。例如，可以生成源自293细胞的稳定宿主细胞(其含有受组成型启动子控制的e1辅助功能)，但是含有受诱导型启动子控制的rep和/或cap蛋白。本领域的技术人员可以使用常规方法生成其他稳定宿主细胞。
[0254]
产生本公开的raav所需的重组aav载体、rep序列、cap序列和辅助功能可以使用任何适当的遗传元件(例如，载体)递送至包装宿主细胞。选定的遗传元件可通过本领域已知的任何合适的方法递送，所述方法例如核酸操纵领域的技术人员已知的那些并且包括遗传工程、重组工程和合成技术(参见，例如，sambrook等人，molecular cloning：a laboratory manual，cold spring harbor press，cold spring harbor，n.y.)。类似地，生成raav病毒粒子的方法是众所周知的并且任何合适的方法都可以与本公开一起使用(参见，例如，fisher等人，j.virol.，70：520-532(1993)和美国专利第5,478,745号)。
[0255]
在一些实施方案中，重组aav可以使用三重转染方法产生(例如，如美国专利第6,001,650号中所述)。在一些实施方案中，通过用待包装到aav颗粒中的重组aav载体(包含转基因)、aav辅助功能载体和附属功能载体转染宿主细胞来产生重组aav。aav辅助功能载体编码“aav辅助功能”序列(即，rep和cap)，所述序列反式作用于产生性aav复制和衣壳化。在一些实施方案中，aav辅助功能载体支持有效的aav载体产生，而不生成任何可检测的野生型aav病毒粒子(即，含有功能性rep和cap基因的aav病毒粒子)。适用于本发明的载体的非限制性实例包括phlp19(参见，例如，美国专利第6,001,650号)和prep6cap6载体(参见，例如美国专利第6,156,303号)。附属功能载体编码非aav来源的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，aav依赖于这些功能进行复制(即“附属功能”)。附属功能包括aav复制所需的那些功能，包括但不限于牵涉激活aav基因转录、阶段特异性aav mrna剪接、aav dna复制、cap表达产物的合成和aav衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可源自任何已知的辅助病毒，诸如腺病毒、疱疹病毒(除1型单纯疱疹病毒外)和痘苗病毒。
[0256]
在一些实施方案中，本公开提供了转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞对外源dna的摄取，当外源dna已经引入细胞膜内部时，细胞已经被“转染”。许多转染技术是本领域公知的(参见，例如，graham等人(1973)virology，52：456；sambrook等人(1989)molecular cloning，a laboratory manual，cold spring harbor laboratories，new york，davis等人(1986)basic methods in molecular biology，elsevier；和chu等人(1981)gene 13：197)。此类技术可用于将一种或多种外源核酸，诸如核苷酸整合载体和其他核酸分子，引入合适的宿主细胞中。
[0257]
在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可用作aav辅助构建体、aav小基因质粒、附属功能载体和/或与重组aav的产生相关的其他转移dna的受者。该术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用的“宿主细胞”可以指已经用外源dna序列转染的细胞。应当理解，由于自然的、偶然的或有意的突变，单个亲本细胞的后代在形态学方面或在基因组或总dna补体方面不一定与原始亲本完全相同。
[0258]
用于生成和分离适于递送给受试者的aav病毒载体的其他方法在例如美国专利第7,790,449号、美国专利第7,282,199号、wo 2003/042397、wo 2005/033321、wo 2006/110689和美国专利第7,588,772号中有描述。在一个系统中，用编码侧翼为itr的转基因的构建体和编码rep和cap的构建体瞬时转染生产细胞系。在另一个系统中，用编码侧翼为itr的转基因的构建体瞬时转染稳定供给rep和cap的包装细胞系。在这些系统中的每一个系统中，aav病毒粒子是响应于辅助腺病毒或疱疹病毒的感染而产生的，并且raav与污染病毒分离。其他系统不需要用辅助病毒感染来恢复aav
‑‑
辅助功能(即腺病毒e1、e2a、va和e4或疱疹病毒ul5、ul8、ul52和ul29，以及疱疹病毒聚合酶)也由该系统反式供给。在此类系统中，可以通过用编码辅助功能的构建体瞬时转染细胞来供给辅助功能，或者可以将细胞工程改造成稳定含有编码辅助功能的基因，所述基因的表达可以在转录水平或转录后水平进行控制。
[0259]
在再另一个系统中，通过用基于杆状病毒的载体感染，将侧翼为itr的转基因和rep/cap基因引入昆虫宿主细胞中。此类生产系统是本领域已知的(通常参见，例如，zhang等人，2009，human gene therapy 20：922-929)。制备和使用这些和其他aav生产系统的方法也在美国专利第5,139,941号、第5,741,683号、第6,057,152号、第6,204,059号、第6,268,213号、第6,491,907号、第6,660,514号、第6,951,753号、第7,094,604号、第7,172,893号、第7,201,898号、第7,229,823号和第7,439,065号中有描述。
[0260]
前述用于产生重组载体的方法并不意在是限制性的，其他合适的方法对于技术人员而言将是显而易见的。
[0261]
viii.组合物和施用
[0262]
抑制性rna(例如，本文所述的和sirna或mirna)，或包含编码本文所述的sirna或mirna的核苷酸序列的载体可用于治疗补体介导的疾病或病症，例如，患有本文所述的补体介导的疾病或病症或对本文所述的补体介导的疾病或病症敏感的受试者。本文所述的抑制性rna的施用途径和/或模式可以根据所需结果而变化。本领域技术人员，即从业者，知道可以调整剂量方案以提供所需应答，例如治疗应答。施用方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、鞘内(例如，脑池内或经由腰椎穿刺)、阴道内、透皮、直肠、通过吸入或局部，特别是向耳、鼻、眼或皮肤施用。在一些实施方案中，将抑制性rna的组合物递送至中枢神经系统(cns)，例如经由侧脑室施用进行递送。施用模式由从业者自行决定。
[0263]
本领域技术人员将理解，抑制性rna(例如，本文所述的sirna或mirna)，或包含编码本文所述的sirna或mirna的核苷酸序列的载体可以递送至cns(例如，经由鞘内施用)以治疗影响cns的疾病或病症，诸如多发性硬化、帕金森氏病(parkinson’s disease)、亨廷顿病(huntington’s disease)、阿尔茨海默氏病(alzheimer’s disease)、其他慢性脱髓鞘疾病(例如，视神经脊髓炎)、肌萎缩性侧索硬化、慢性疼痛、中风、过敏性神经炎、进行性核上
性麻痹、路易体痴呆(即，路易体痴呆或帕金森氏病痴呆)、额颞叶痴呆、创伤性脑损伤、创伤性脊髓损伤、多系统萎缩、慢性创伤性脑病、克雅二氏症(creutzfeldt-jakob disease)和柔脑膜转移。
[0264]
本文所述的抑制性rna(例如，sirna)向细胞的递送可以多种不同方式实现。体内递送可以通过向受试者施用包含抑制性rna的组合物来进行，例如通过肠胃外施用途径，例如皮下或静脉内或肌肉内施用。
[0265]
在一些实施方案中，抑制性rna与递送剂缔合。“递送剂”是指与抑制性rna非共价或共价缔合或与抑制性rna共同施用并且起到使生物活性剂的稳定性和/或功效增加，超过如果在该递送剂不存在的情况下递送生物活性剂(例如，施用给受试者)时所产生的稳定性和/或功效的一种或多种功能的物质或实体。例如，递送剂可以保护抑制性rna免于降解(例如，在血液中)，可以促进抑制性rna进入细胞或进入目标细胞区室(例如，细胞质)，和/或可以增强与含有待调节分子靶标的特定细胞的缔合。本领域的普通技术人员知道许多可用于递送抑制性rna(例如，sirna)的递送剂。参见kanasty，r.等人nat mater.12(11)：967-77(2013)以查看这些技术中的一些技术。在一些实施方案中，例如，为了全身性施用抑制性rna，抑制性rna可以与递送剂诸如纳米颗粒、树枝状聚合物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统缔合。不希望受任何理论的束缚，据信带正电荷的阳离子递送系统会促进带负电荷的抑制性rna的结合，并且还增强在带负电荷的细胞膜处的相互作用，以容许细胞有效摄取抑制性rna。脂质(例如，阳离子脂质或中性脂质)、树枝状聚合物或聚合物可与抑制性rna结合或者可形成包封抑制性rna的囊泡或胶束。制备和施用包含阳离子剂和抑制性rna的复合物的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，特别考虑了使用美国专利公布20160298124中描述的递送剂中的任一种。在一些实施方案中，抑制性rna与环糊精形成复合物用于全身施用。在一些实施方案中，抑制性rna与脂质或含脂质的颗粒联合施用。在一些实施方案中，抑制性rna与阳离子聚合物(其可以是多肽或非多肽聚合物)、脂质、肽、peg、环糊精或它们的组合联合施用，这些可以是纳米颗粒或微粒的形式。脂质或肽可以是阳离子的。“纳米颗粒”是指二维或三维长度大于1纳米(nm)且小于约150nm，例如20nm-50nm或50nm-100nm的颗粒。“微粒”是指二维或三维长度大于150nm且小于约1000nm的颗粒。纳米颗粒可以具有与之共价或非共价附接的靶向部分和/或细胞穿透部分或膜活性部分。纳米颗粒，诸如脂质纳米颗粒，在例如tatiparti等人，nanomaterials 7：77(2017)中有描述。示例性的递送剂、制造方法和在递送抑制性rna中的用途在美国专利第7,427,605号、第8,158,601号、第9,012,498号、第9,415,109号、第9,062,021号、第9,402,816号中有描述。在一些实施方案中，考虑使用本领域中称为“smarticle”的递送技术。在一些实施方案中，考虑使用本领域中称为“稳定的核酸脂质颗粒”(snalp)的递送技术，其中待递送的核酸被包封在脂质双层中，该脂质双层含有阳离子和融合脂质的混合物，还涂覆有可扩散的聚乙二醇-脂质(peg-脂质)缀合物，该缀合物提供中性的亲水性外部。
[0266]
在一些实施方案中，递送剂包含一种或多种氨基醇阳离子脂质，诸如在美国专利第9,044,512号中描述的那些。
[0267]
在一些实施方案中，递送剂包含一种或多种氨基酸脂质。氨基酸脂质是含有氨基酸残基(例如，精氨酸、高精氨酸、去甲精氨酸、去甲去甲精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、高赖氨酸、组氨酸、1-甲基组氨酸、吡啶基丙氨酸、天冬酰胺、n-乙基天冬酰胺、谷氨酰胺、4-氨基苯丙
氨酸、n-甲基化型式及它们的侧链修饰衍生物)和一个或多个亲脂性尾部的分子。示例性氨基酸脂质及其用于递送核酸的用途在美国专利申请公布第20110117125号和美国专利第8,877,729、9,139,554和9,339,461号中有描述。在一些实施方案中，可以使用膜溶解性聚(酰氨基胺)聚合物和多聚缀合物，诸如美国专利申请公布第20130289207号中描述的那些。在一些实施方案中，递送剂包含脂肽化合物，该脂肽化合物包含中心肽并且在每个端部附接有亲脂性基团。在一些实施方案中，亲脂性基团可以衍生自天然存在的脂质。在一些实施方案中，亲脂性基团可以包含c(1-22)烷基、c(6-12)环烷基、c(6-12)环烷基-烷基、c(3-18)烯基、c(3-18)炔基、c(1-5)烷氧基-c(1-5)烷基或二氢鞘氨醇，或(2r，3r)-2-氨基-1，3-十八烷二醇、二十碳鞘氨醇烷、鞘氨醇、植物鞘氨醇或顺式-4-鞘氨醇。中心肽可以包含阳离子或两亲性氨基酸序列。此类脂肽的实例及其递送核酸的用途在例如美国专利第9,220,785号中有描述。
[0268]“掩蔽部分”意指当与另一试剂(例如，聚合物)物理缔合时，屏蔽、抑制或灭活该试剂的一种或多种性质(生物物理特征或生物化学特征)或活性的分子或基团。在一些实施方案中，掩蔽部分可以共价或非共价附接到抑制性rna上。掩蔽部分可以是可逆的，意指它经由可逆性联接附接到它所掩蔽的抑制性rna上。如本领域普通技术人员所认识到的，足够数目的掩蔽部分联接到待掩蔽的抑制性rna以达到所需的灭活水平。
[0269]
在一些实施方案中，抑制性rna缀合到为聚合物的递送剂上。可用的递送聚合物包括例如聚(丙烯酸酯)聚合物(参见，例如美国专利公布第20150104408号)、聚(乙烯酯)聚合物(参见，例如美国专利公布第20150110732号)和某些多肽。在一些实施方案中，递送聚合物是可逆性掩蔽的膜活性聚合物。在一些实施方案中，抑制性rna或聚合物或两者都有靶向部分与之缀合。在一些实施方案中，抑制性rna或抑制性rna-靶向部分缀合物与递送聚合物共同施用，但不与聚合物缀合。在这个背景下“共同施用”意指将抑制性rna和递送聚合物施用给受试者，使得它们在重叠的时间段内存在于受试者体内。抑制性rna-靶向部分缀合物和递送聚合物可以同时施用或者它们可以依序递送。对于同时施用，它们可以在施用前混合。对于依序施用，可以先施用抑制性rna或递送聚合物。抑制性rna和递送聚合物可以在相同的组合物中施用，或者可以在时间上足够接近地分开施用，使得抑制性rna向细胞的细胞质递送相对于不施用该聚合物时发生的细胞质递送而言得到增强。在一些实施方案中，施用抑制性rna和递送聚合物间隔不超过15分钟、30分钟、60分钟或120分钟施用。在一些实施方案中，递送聚合物是靶向、可逆性掩蔽的膜活性聚合物。该聚合物有靶向部分与之附接，该靶向部分将该聚合物靶向至期望增强抑制性rna的细胞质递送的细胞。抑制性rna可以靶向至相同的细胞，任选地使用相同的靶向部分，即抑制性rna可以作为抑制性rna-靶向部分缀合物施用。如本文所用，膜活性聚合物是表面活性的两亲性聚合物，能够对生物膜诱导以下效应中的一种或多种：膜的改变或破坏(允许非膜渗透性分子进入细胞或穿过膜)、膜中的孔隙形成、膜的分裂或膜的破坏或溶解。如本文所用，膜或细胞膜包含脂质双层。膜的改变或破坏可以在以下至少一种测定法中通过聚合物的活性在功能上进行定义：红细胞溶解(溶血)、脂质体渗漏、脂质体融合、细胞融合、细胞溶解和内体释放。膜活性聚合物可以通过破坏或去稳定质膜或内部囊泡膜(诸如内体或溶酶体)，例如通过在膜中形成孔隙，或破坏内体或溶酶体囊泡，从而容许囊泡的内容物释放到细胞质中来增强多核苷酸向细胞的递送。在一些实施方案中，靶向的可逆性掩蔽的膜活性聚合物是内体溶解性聚合物。内体溶解
性聚合物是这样的聚合物，其响应于ph的变化，能够引起内体的破坏或溶解或者以其他方式提供正常细胞膜不可渗透的化合物(诸如多核苷酸或蛋白质)从细胞内膜封闭的囊泡(诸如内体或溶酶体)中的释放。在一些实施方案中，聚合物是可逆改性的两亲性膜活性聚胺，其中可逆改性抑制膜活性，中和聚胺以减少正电荷并形成接近中性电荷的聚合物。可逆改性还可以提供细胞类型特异性靶向和/或抑制聚合物的非特异性相互作用。聚胺可以通过对聚胺上胺的可逆改性而被可逆改性。可逆性掩蔽的膜活性聚合物当被掩蔽时基本上没有膜活性，但在去掩蔽时变得有膜活性。掩蔽部分通常通过生理可逆性联接共价结合到膜活性聚合物上。通过使用生理可逆性联接，掩蔽部分可以在体内从聚合物上裂解，从而使聚合物去掩蔽并恢复去掩蔽的聚合物的活性。通过选择适当的可逆性联接，在将缀合物递送或靶向至所需细胞类型或细胞位置后，膜活性聚合物的活性得以恢复。联接的可逆性提供了膜活性聚合物的选择性激活。生理性可逆键在哺乳动物细胞内条件下是可逆的，所述条件包括化学条件，诸如ph、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中发现的或类似于在哺乳动物细胞中发现的那些的盐浓度。在一些实施方案中，靶向部分，例如asgpr靶向部分可以作为掩蔽部分。在一些实施方案中，asgpr靶向部分有亲脂性部分与之缀合。示例性的靶向部分(例如，asgpr靶向部分)、生理不稳定键(例如，酶不稳定键、ph不稳定键)、掩蔽部分、膜活性聚合物(例如，内体溶解活性聚合物)、亲脂性部分、rnai剂-靶向部分缀合物、递送剂-靶向部分缀合物、包含rnai剂、靶向部分和递送剂的缀合物，以及将核酸递送至细胞(例如，肝细胞)的方法在美国专利申请公布第20130245091号、第20130317079号、第20120157509号、第20120165393号、第20120172412号、第20120230938号、第20140135380号、第20140135381号、第20150104408号和第20150110732号中有描述。在一些实施方案中，抑制性rna与蜂毒肽共同施用，例如，如美国专利申请公布第20120165393号中所述。抑制性rna、蜂毒肽或两者可以有靶向部分与之缀合，任选地经由可逆性联接缀合。在一些实施方案中，掩蔽部分包含二肽-酰氨基苄基-碳酸酯或二取代的马来酸酐掩蔽部分，例如，如在美国专利申请公布第20150110732号中所述。
[0270]
在一些实施方案中，抑制性rna可以以“裸露”形式施用，即在递送剂不存在的情况下施用。裸露的抑制性rna可以处于合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可以例如包含乙酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或它们的任何组合。在一些实施方案中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。可以调节缓冲溶液的ph和摩尔渗透压浓度，使其适合施用于受试者。在一些实施方案中，抑制性rna不与脂质或含脂质的颗粒物理缔合施用。在一些实施方案中，抑制性rna不与纳米颗粒或微粒物理缔合施用。在一些实施方案中，抑制性rna不与阳离子聚合物物理缔合施用。在一些实施方案中，抑制性rna不与环糊精物理缔合施用。在一些实施方案中，以“裸露”形式施用的抑制性rna包含靶向部分。
[0271]
抑制性rna(例如，本文所述的sirna或mirna)，或包含编码本文所述的sirna或mirna的核苷酸序列的载体可以掺入药物组合物中。此类药物组合物尤其可用于体内或离体施用和递送给受试者。在一些实施方案中，药物组合物还含有药学上可接受的载剂或赋形剂。此类赋形剂包括任何药剂，例如本身不会诱导对接受组合物的个体有害的免疫应答，并且可以施用而没有过度毒性的药剂。如本文所用，术语“药学上可接受的”和“生理上可接受的”意指适于一种或多种施用途径、体内递送或接触的生物学上可接受的配制剂、其气态、液态或固态，或其混合物。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，诸如水、盐水、甘
油、糖和乙醇。其中还可以包括药学上可接受的盐，例如，无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，诸如润湿剂或乳化剂的ph缓冲物质等的辅助物质可以存在于这些媒介物中。
[0272]
药物组合物可以以盐的形式提供并且可以与许多酸形成，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。与对应的游离碱形式相比，盐倾向于更易溶解于水性溶剂或其他质子溶剂中。在一些实施方案中，药物组合物可以是冻干粉。
[0273]
药物组合物可以包括与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳液(例如，水包油或油包水)、混悬液、糖浆、酏剂、分散和悬浮介质、包衣、等渗和吸收促进剂或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和混悬液可包括悬浮剂和增稠剂。此类药学上可接受的载体包括片剂(包衣或无包衣)、胶囊(硬或软)、微珠、粉剂、粒剂和晶体。补充活性化合物(例如防腐剂、抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)也可掺入组合物中。
[0274]
药物组合物可以配制成与特定的施用或递送途径相容，如本文所述或本领域技术人员已知的。因此，药物组合物包括适于通过各种途径施用的载体、稀释剂或赋形剂。
[0275]
适于肠胃外施用的组合物可以包括活性化合物的水性和非水性溶液、混悬液或乳液，这些制剂通常是无菌的，并且可以与预期受者的血液等渗。非限制性说明性实例包括水、缓冲盐水、汉克斯溶液(hanks
′
solution)、林格氏溶液(ringer
′
s solution)、葡萄糖、果糖、乙醇、动物油、植物油或合成油。水性注射混悬液可含有增加混悬液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。另外，活性化合物的混悬液可制备成适当的油性注射混悬液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油诸如芝麻油，或合成脂肪酸酯诸如油酸乙酯或三甘油酯，或脂质体。任选地，混悬剂还可以包含合适的稳定剂或增加溶解度以允许制备高浓度溶液的试剂。
[0276]
可以将助溶剂和佐剂添加到配制剂中。助溶剂的非限制性实例含有羟基或其它极性基团，例如醇，诸如异丙醇；二醇，诸如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚；丙三醇；聚氧乙烯醇和聚氧乙烯脂肪酸酯。佐剂包括例如表面活性剂，诸如大豆卵磷脂和油酸；脱水山梨糖醇酯，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯；和聚乙烯吡咯烷酮。
[0277]
在已经制备了药物组合物之后，可以将它们放入适当的容器中并进行标记用于治疗。此类标记可以包括施用的量、频率和方法。
[0278]
适于本公开的组合物、方法和用途的药物组合物和递送系统是本领域已知的(参见，例如，remington：the science and practice of pharmacy.第21版.philadelphia，pa.lippincott williams&wilkins，2005)。
[0279]
本公开还提供了用于将抑制性rna(例如，本文所述的sirna或mirna)，或包含编码本文所述的sirna或mirna的核苷酸序列的载体引入细胞或动物中的方法。在一些实施方案中，此类方法包括使受试者(例如，受试者的细胞或组织)接触或向受试者(例如，受试者诸如哺乳动物)施用本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，使得抑制性rna在受试者中(例如，在受试者的细胞或组织中)表达。在另一个实施方案中，方法包括为个体(患者或受试者，诸如哺乳动物)的细胞提供本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，使得抑制性rna在个体中表达。
[0280]
本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体(例如raav载体))的组合物可以以足够或有效的量施用给有需要的受试者。剂量可以变化
并取决于治疗所针对的疾病的类型、发作、进展、严重程度、频率、持续时间或可能性，所需临床终点、先前或同时治疗、总体健康状况、受试者的年龄、性别、种族或免疫能力以及技术人员将认识到的其他因素。如任何不良副作用、并发症或所述治疗或疗法的其他风险因素和受试者的状态所示，剂量的量、数目、频率或持续时间可以按比例增加或减少。技术人员将认识到可能影响提供足以提供治疗或预防益处的量所需的剂量和时间的因素。
[0281]
达到治疗效果的剂量，例如按每千克体重的载体基因组(vg/kg)(例如，在基于载体递送的情况下)或按mg/kg体重(mg/kg)计的剂量，将基于若干因素变化，包括但不限于：施用途径、达到治疗效果所需的抑制性rna表达水平、治疗的特定疾病、宿主对病毒载体的任何免疫应答、宿主对异源抑制性rna的免疫应答，以及表达的抑制性rna的稳定性。基于上述因素以及其他因素，本领域技术人员对于抑制性rna的基于载体的递送，可以确定治疗患有特定疾病或病症的患者的raav/载体基因组剂量范围。通常，剂量范围将为至少1x108个或更多个，例如1x109、1x10
10
、1x10
11
、1x10
12
、1x10
13
、1x10
14
个或更多个载体基因组/千克受试者重量(vg/kg)以达到治疗效果。
[0282]
在一些实施方案中，抑制性rna的组合物以0.01mg/kg至50mg/kg的量施用于受试者。在一些实施方案中，抑制性rna组合物以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约15mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，抑制性rna组合物以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，抑制性rna组合物以约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2.0mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，该量介于0.01mg/kg至0.1mg/kg、0.01mg/kg至0.1mg/kg、0.1mg/kg至1.0mg/kg、1.0mg/kg至2.5mg/kg、2.5mg/kg至5.0mg/kg、5.0mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至20mg/kg、20mg/kg至30mg/kg、30mg/kg至40mg/kg或40mg/kg至50mg/kg之间。在一些实施方案中，施用固定剂量。在一些实施方案中，该剂量介于5mg至1.0g之间，例如介于5mg至10mg、10mg至20mg、20mg至40mg、40mg至80mg、80mg至160mg、160mg至320mg、320mg至640mg、640mg至1g之间。在一些实施方案中，该剂量为约1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg。在一些实施方案中，该剂量是日剂量。在一些实施方案中，该剂量根据给药间隔为至少2天，例如至少7天，例如约2、3、4、6或8周的给药方案施用。例如，在一些实施方案中，抑制性rna组合物根据给药间隔为至少7天的给药方案使用。在一些实施方案中，抑制性rna组合物每日、每周、每月或每2、3、4、5或6个月或更长时间施用。在一些实施方案中，本文所述的剂量和/或给药方案中的任一者都是皮下施用的。在一些实施方案中，抑制性rna组合物施用一次，随后测量抑制水平，并且一旦抑制水平降至一定水平，就施用后续剂量的抑制性组合物。
[0283]
在一些实施方案中，受试者在施用后至少2天，例如至少7天，例如约2、3、4、6、8、10、12、16或20周的时间段内表现出对c3的持续抑制，例如通过c3 mrna表达(例如在肝组织，例如肝活检中)测量的。在一些实施方案中，受试者表现出降低的血清c3水平，并且降低的血清c3水平在施用后至少2天，例如至少7天，例如约2、3、4、6、8、10、12、16或20周的时间段内维持。
[0284]
有效量或足够量可以(但不需要)在单次施用时提供，可能需要多次施用，并且可
以(但不需要)单独施用或与另一种组合物(例如，本文所述的另一补体抑制剂)组合施用。例如，该量可以按比例增加，如受试者的需要、所治疗疾病的类型、状态和严重程度或治疗的副作用(如果有的话)所示。认为有效的量还包括导致另一种治疗、治疗方案或规划的使用，诸如本文所述的另一种补体抑制剂的施用减少的量。
[0285]
因此，本公开的药物组合物包括其中含有有效量的活性成分以实现预期治疗目的的组合物。使用本公开中提供的技术和指导，熟练的医学从业者完全有能力确定治疗有效剂量。除其他因素外，治疗剂量可取决于受试者的年龄和一般状况、补体介导的疾病或病症的严重程度以及调节本文所述的抑制性rna表达水平的控制序列的强度。因此，在人类中的治疗有效量将落在相对宽的范围内，该范围可由医学从业者基于个体患者对基于载体的治疗的应答来确定。可将药物组合物递送至受试者，以便允许通过基于基因和/或细胞的疗法或通过对患者或供体细胞的离体修饰在体内产生本文所述的抑制性rna。
[0286]
本公开的方法和用途包括全身性、区域性或局部性地，或通过任何途径(例如通过注射或输注)递送和施用。药物组合物在体内的递送通常可以经由使用常规注射器注射来完成，但是也可以使用其他递送方法，诸如对流增强递送(参见，例如美国专利第5,720,720号)。例如，组合物可以皮下、表皮、皮内、鞘内、眶内、粘膜内、腹膜内、静脉内、胸膜内、动脉内、口服、肝内、侧脑室(例如，经由侧脑室注射)、经由门静脉或肌内递送。其他施用模式包括口服和肺部施用、栓剂和透皮施加。专门治疗患有补体介导的病症的患者的临床医生可以确定施用抑制性rna(例如，本文所述的sirna或mirna)，或包含编码本文所述的sirna或mirna的核苷酸序列的载体的最佳途径。
[0287]
在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)可以向受试者每天、每周、每2周、每3周或每4周或甚至以更长的时间间隔施用一次。在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)可以根据给药方案施用，该给药方案包括(i)每天、每周、每2周、每3周或每4周或甚至以更长的时间间隔一次的初始施用；接着是(ii)一段时间不施用，例如1、2、3、4、5、6、8或10个月，或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一些实施方案中，可以施用包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体：(i)在长达2、4或6周或更短的初始时间段内施用一次或多次；接着是(ii)一段时间不施用，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一些实施方案中，在治疗之前和/或之后监测受试者的c3表达和/或活性水平，例如，使用旁路途径测定法、经典途径测定法或两者来测量的。合适的测定法是本领域已知的并且包括例如溶血测定法。在一些实施方案中，如果c3表达和/或活性的测量水平相对于对照受试者中c3表达和/或活性的测量水平超过10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％或更多，则治疗或再治疗受试者。
[0288]
ix.疾病、病症和病状
[0289]
在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)施用给患有补体介导的对器官、组织或细胞的损伤或有此损伤风险的受试者。在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸的载体)与一种或多种另外的补体抑制剂组合施用给患有补体介导的对器官、组织或细胞的损伤或有此风险的受试者。在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)与离体的器官、组织或细胞接触。可以
将器官、组织或细胞引入受试者体内，并保护其免受将另外由受者的补体系统引起的损伤。
[0290]
某些目标用途包括：(1)在患有诸如阵发性睡眠性血红蛋白尿症或非典型溶血性尿毒症综合征或其他以补体介导的红细胞(rbc)溶解为特征的病症的个体中，保护rbc免受补体介导的损伤；(2)保护移植的器官、组织和细胞免受补体介导的损伤；(3)减少缺血/再灌注(i/r)损伤(例如，在遭受创伤、血管阻塞、心肌梗塞或可能发生i/r损伤的其他情形的个体中)；和(4)保护可能暴露于补体组分的各种身体结构(例如，视网膜)或膜(例如，滑膜)免受多种不同的补体介导的病症中的任何一种的补体介导的损伤。抑制细胞或其他身体结构表面的补体激活的有益作用不限于直接由保护细胞或结构本身免受直接补体介导的损伤(例如，防止细胞溶解)引起的有益作用。例如，抑制补体激活可以减少过敏毒素的生成以及导致的嗜中性粒细胞的流入/激活和其他促炎事件，和/或减少细胞内内容物的潜在破坏性释放，从而潜在地对远端器官系统或整个身体具有有益作用。
[0291]
a.血细胞保护
[0292]
在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于保护血细胞免受补体介导的损伤。血细胞可以是血液的任何细胞组分，例如红细胞(rbc)、白细胞(wbc)和/或血小板。多种病症与补体介导的对血细胞的损伤相关。此类病症可以由例如个体的细胞或可溶性crp中的一种或多种的缺乏或缺陷引起，例如由于(a)编码此类蛋白质的基因中的突变；(b)一种或多种crp的产生或恰当功能所需的基因中的突变，和/或(c)一种或多种crp的自身抗体的存在。补体介导的rbc溶解可由针对rbc抗原的自身抗体的存在引起，这些抗原可由各种各样的原因产生(通常为特发性)。在编码crp的基因中具有此类突变和/或具有针对crp或针对其自身rbc的抗体的个体，患牵涉补体介导的rbc损伤的病症的风险增加。已经有病症特有的一次或多次发作的个体复发的风险增加。
[0293]
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)是一种相对罕见的并且，包括以补体介导的血管内溶血为特征的获得性溶血性贫血、血红蛋白尿症、骨髓衰竭和血栓形成倾向(形成血凝块的倾向)。估计全世界每百万人中影响16人，两种性别中均有发生，并且可以出现在任何年龄，经常攻击年轻人(bessler，m.和hiken，j.，hematology am soc hematol educ program，104-110(2008)；hillmen，p.hematology am soc hematol educ program，116-123(2008))。pnh是一种慢性衰竭性疾病，由急性溶血性发作打断，并导致显著的发病率和预期寿命的减少。除贫血外，许多患者还经历腹痛、吞咽困难、勃起功能障碍和肺动脉高压，并且肾衰竭和血栓栓塞事件的风险增加。
[0294]
pnh在19世纪首次被描述为一种独特实体，但直到20世纪50年代，随着补体激活旁路途径的发现，pnh溶血的原因才得以牢固确立(parker cj.paroxysmal nocturnal hemoglobinuria：an historical overview.hematology am soc hematol educ program.93-103(2008))。cd55和cd59通常经由糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚(将某些蛋白质锚定到质膜上的糖脂结构)附接到细胞膜上。pnh由于造血干细胞的非恶性克隆扩增而出现，这些造血干细胞在编码牵涉gpi锚合成的蛋白质的piga基因中已经获得了体细胞突变(takeda j等人deficiency of the gpi anchor caused by a somatic mutation of the pig-a gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.cell.73：703-711(1993))。此类干细胞的后代缺乏gpi锚定蛋白，包括cd55和cd59。这种缺陷致使这些细胞对补体介导的
rbc溶解敏感。使用gpi锚定蛋白的抗体的流式细胞术分析常常用于诊断。它检测细胞表面gpi锚定蛋白的缺乏并允许确定缺乏的程度和受影响细胞的比例(brodsky ra.advances in the diagnosis and therapy of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.blood rev.22(2)：65-74(2008))。pnh iii型rbc在gpi联接蛋白中完全缺乏并且对补体高度敏感，而pnh ii型rbc部分缺乏且敏感性较低。flaer是气单胞菌溶素前提(一种结合gpi锚的细菌毒素)的荧光标记非活性变体并且越来越多地与流式细胞术一起用于pnh的诊断。flaer与粒细胞缺乏结合足以诊断pnh。在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或编码本文所述的抑制性rna的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，保护pnh rbc免于c3b沉积。在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或编码本文所述的抑制性rna的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，抑制患有pnh的受试者的血管内和血管外溶血。
[0295]
在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用给患有非典型溶血综合征(ahus)的受试者。ahus是一种慢性病症，其特征在于微血管病性溶血性贫血、血小板减少和急性肾衰竭，并且是由不适当的补体激活引起，通常是由于编码补体调控蛋白的基因的突变引起(warwicker，p.等人kidney int 53，836-844(1998)；kavanagh，d.和goodship，t.pediatr nephrol 25，2431-2442(2010))。补体因子h(cfh)基因中的突变是ahus患者中最常见的遗传异常，并且这些患者中的60-70％在疾病发作后一年内死亡或达到终末期肾衰竭(kavanagh和goodship，同上)。还已经描述了因子i、因子b、c3、因子h相关蛋白1-5和血栓调节蛋白中的突变。ahus的其他原因包括针对补体调控蛋白诸如cfh的自身抗体。在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用给已被鉴定为在因子i、因子b、c3、因子h相关蛋白1-5或血栓调节蛋白中具有突变或已被鉴定为具有针对补体调控蛋白例如cfh的抗体的受试者。
[0296]
补体介导的溶血发生在多种其他病状中，包括牵涉与rbc结合的抗体并导致补体介导的溶血的自身免疫性溶血性贫血。例如，此类溶血可发生在原发性慢性冷凝集素病以及对药物和其他外来物质的某些反应中(berentsen，s.等人，hematology 12，361-370(2007)；rosse，w.f.，hillmen，p.和schreiber，a.d.hematology am soc hematol educ program，48-62(2004))。在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，施用给患有慢性冷凝集素病或处于慢性冷凝集素病风险中的受试者。在另一个实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合用于治疗患有hellp综合征或处于hellp综合征风险中的受试者，所述hellp综合征由存在溶血、肝酶升高和血小板计数低定义并且与至少一些受试者中补体调控蛋白中的突变相关(fakhouri，f.等人，112：4542-4545(2008))。
[0297]
在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，施用给患有温热性自身免疫性溶血性贫血或处于温热性自身免疫性溶血性贫血风险中的受试者。
[0298]
在其他实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于保护待输注到受试者中的rbc或血液的其他细胞组分。此类用途的某些实例将在下面进一步讨论。
[0299]
b.移植
[0300]
移植是一种越来越重要的治疗方法，提供了一种置换已经因创伤、疾病或其他情况而受损的器官和组织的手段。肾脏、肝脏、肺、胰腺和心脏都是可以成功移植的器官。经常移植的组织包括骨骼、软骨、肌腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜和血管。胰岛或胰岛细胞移植是治疗糖尿病(例如i型糖尿病)的有前景的方法。出于本发明的目的，待移植、正在移植或已经移植的器官、组织或细胞(或细胞群)可称为“移植物”。为此目的，将输血认为是“移植物”。
[0301]
移植使移植物经受各种损伤事件和刺激，这些事件和刺激可造成移植物功能障碍，并可能造成失败。例如，缺血-再灌注(i/r)损伤是在许多移植物(特别是实体器官)的情况下发病率和死亡率的常见和重要的原因，并且可以是移植物存活可能性的主要决定因素。移植排斥是与遗传上不同的个体之间的移植相关的主要风险之一，并且可以导致移植物衰竭和需要将移植物从受者移除。
[0302]
在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于保护移植物免受补体介导的损伤。例如，细胞反应性坎普他汀类似物与移植物的细胞反应，变得与之共价附接，并抑制补体激活。细胞靶向的坎普他汀类似物与移植物中的靶分子(例如，由移植物中的内皮细胞或其他细胞表达的靶分子)结合并抑制补体激活。靶分子可以是，例如，其表达受刺激诸如损伤或炎症诱导或刺激的分子，将被受者识别为“非自身”的分子，通常在人类中发现其抗体的碳水化合物异种抗原诸如血型抗原或异种抗原，例如，包含α-gal表位的分子。在一些实施方案中，补体激活的减少可以通过与本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独接触或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合接触的移植物的血管中平均c4d沉积，与尚未与本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独接触或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合接触的移植物中的平均c4d沉积水平相比减少来证明(例如，在就移植物和他们接受的其他疗法而言匹配的受试者中)。
[0303]
在本公开的各种实施方案中，移植物可以与本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独接触或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合接触，所述抑制性rna在移植之前、期间和/或之后抑制c3表达。例如，在移植之前，从供体取出的移植物可以与包含细胞反应性、长效的或靶向的坎普他汀类似物的液体接触。例如，移植物可以浸泡在溶液中和/或用溶液灌注。在另一个实施方案中，在取出移植物之前将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，施用给供体。在一些实施方案中，在引入移植物期间和/或之后，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，施用给受者。在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，局部递送至移植的移植物。在一些实施方案中，全身施用，例如静脉内或皮下施用细胞反应性、长效
的或靶向的坎普他汀类似物。在一些实施方案中，在引入移植物之前，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，施用给受者。在一些实施方案中，受试者在接受移植物之后接受一个或多个另外剂量的抑制性rna、编码抑制性rna的载体和/或一种或多种另外的补体抑制剂。
[0304]
本公开提供了一种组合物，该组合物包含：(a)分离的移植物；和(b)抑制c3表达的本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)。本公开还提供了一种组合物，该组合物包含：(a)分离的移植物；(b)细胞反应性、长效的或靶向的坎普他汀类似物，和(c)抑制c3表达的本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)。在一些实施方案中，该组合物还包含适于接触(例如，适于冲洗、洗涤、浸泡、灌注、维持或储存)移植物(例如，器官)的液体溶液，所述移植物诸如已经从供体取出并等待移植到受者的分离的移植物。在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，该组合物包含：(a)适于接触移植物(例如，器官)的液体溶液；和(b)抑制c3表达的本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)。在一些实施方案中，该组合物还包含细胞反应性、长效的或靶向的坎普他汀类似物。该液体溶液可以是移植物生理上可接受(例如，非细胞毒性的适当的渗透组合物)并且鉴于随后将移植物引入受者在医学上可接受的(例如，优选无菌的或至少合理地不含微生物或其他污染物)，并且与细胞反应性坎普他汀类似物相容(即，不会破坏坎普他汀类似物的反应性)或与长效或靶向的坎普他汀类似物相容的任何液体溶液。在一些实施方案中，溶液是本领域中已知的用于任何此类目的的任何溶液。在一些实施方案中，液体溶液是马歇尔或高渗柠檬酸盐(baxter healthcare)、威斯康星大学(uw)溶液(viaspan
tm
，bristol myers squibb)、组氨酸色氨酸酮戊二酸盐(htk)溶液(kohler medical limited)、eurocollins(fresenius)和(sangstat medical)、polysol、igl-1或rs-1。当然，在生理上可接受的组合物的范围内，可以使用其他溶液，例如含有相同或不同浓度的等效或相似成分的溶液。在一些实施方案中，溶液不含预计会与细胞反应性坎普他汀类似物发生显著反应的成分，并且任何溶液都可以被改性或设计成缺少此类成分。在一些实施方案中，细胞反应性坎普他汀类似物以例如0.01mg/ml至100mg/ml的浓度存在于移植物相容性溶液中，或者可以添加到溶液中以达到此类浓度。
[0305]
在一些实施方案中，移植物是或包括实体器官，诸如肾脏、肝脏、肺、胰腺或心脏。在一些实施方案中，移植物是或包括骨骼、软骨、筋膜、腱、韧带、角膜、巩膜、心包、皮肤、心脏瓣膜、血管、羊膜或硬脑膜。在一些实施方案中，移植物包括多个器官，诸如心-肺或胰-肾移植物。在一些实施方案中，移植物包括不太完整的器官或组织。例如，移植物可以含有器官或组织的一部分，例如肝叶、血管切片、皮瓣或心脏瓣膜。在一些实施方案中，移植物包含含有分离的细胞或组织片段的制剂，所述细胞或组织片段已从其来源组织中分离出来，但保留了至少一些组织结构，例如胰岛。在一些实施方案中，制剂包含未经由结缔组织彼此附接的分离的细胞，例如源自外周血和/或脐带血、全血或任何含细胞的血液制品的造血干细胞或祖细胞，诸如红细胞(rbc)或血小板。在一些实施方案中，移植物获自已故供体(例如，“脑死亡捐献”(dbd)供体或“心脏死亡捐献”供体)。在一些实施方案中，根据移植物的特定
类型，从活体供体获得移植物。例如，肾脏、肝脏切片、血细胞是通常可以从活体供体获得的移植物类型，对供体没有不当风险并且符合合理的医疗实践。
[0306]
在一些实施方案中，移植物是异种移植物(即供体和受体是不同的物种)。在一些实施方案中，移植物是自体移植物(即，在同一个体中从身体的一部分到身体的另一部分的移植物)。在一些实施方案中，移植物是同系移植物(即，供体和受者在遗传上是相同的)。在大多数实施方案中，移植物是同种异体移植物(即，供体和受者是同一物种的遗传上不相同的成员)。在同种异体移植物的情况下，供体和受者可以是或可以不是遗传相关的(例如，家庭成员)。通常，供体和受者具有相容的血型(至少abo相容性和任选地rh、kell和/或其他血细胞抗原相容性)。受者的血液可能已经被筛选出针对移植物和/或受者和供体的同种抗体，因为此类抗体的存在可导致超急性排斥(即，排斥几乎在移植物与受者的血液接触后立即开始，例如在几分钟内开始)。可以使用补体依赖性细胞毒性(cdc)测定法筛选受试者血清中的抗hla抗体。将血清与一组已知hla表型的淋巴细胞一起孵育。如果血清含有针对靶细胞上的hla分子的抗体，则发生由于补体介导的溶解而引起的细胞死亡。使用一组选定的靶细胞允许确定对检测到的抗体的特异性。可用于确定抗hla抗体存在与否以及任选地确定其hla特异性的其他技术包括elisa测定法、流式细胞术测定法、微珠阵列技术(例如，luminex技术)。用于进行这些测定法的方法是众所周知的，并且用于进行这些测定法的多种试剂盒是可商购获得的。
[0307]
在一些实施方案中将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，抑制补体介导的排斥。例如，在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，抑制超急性排斥。超急性排斥至少部分是由抗体介导的受者补体系统的激活引起的，这种激活是经由经典途径和引起的mac在移植物上的沉积。它通常是由于受者中存在与移植物反应的预先存在的抗体。虽然期望尝试在移植前通过适当的匹配来避免超急性排斥，但由于例如时间和/或资源限制，这样做并不总是可能的。此外，一些受者(例如，多次输注的个体、先前已经接受过移植的个体、多次妊娠的妇女)可能已经具有如此多预先形成的抗体，可能包括通常不检测的抗原的抗体，以至于很难或者也许几乎不可能有信心及时获得相容性移植物。此类个体超急性排斥的风险增加。
[0308]
在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，抑制急性排斥或移植物衰竭。如本文所用，“急性排斥”是指在移植后至少24小时，通常至少几天至一周，到移植后6个月之间发生的排斥。抗体介导的急性排斥(amr)通常牵涉移植后最初几周供体特异性同种抗体(dsa)的急性升高。不希望受任何理论的束缚，可能预先存在的浆细胞和/或记忆b细胞向新的浆细胞的转化在dsa产量增加方面起作用。此类抗体可导致对移植物的补体介导的损伤，该损伤可通过将移植物与细胞反应性坎普他汀类似物接触来抑制。不希望受任何理论的束缚，抑制移植物的补体激活可以减少白细胞(例如，嗜中性粒细胞)浸润，这是急性移植物衰竭的另一促成因素。
[0309]
在一些实施方案中将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，抑制对移植
物的补体介导的i/r损伤。如下文进一步讨论的，i/r损伤可在供血暂时中断的组织再灌注时发生，如在移植的器官中发生的那样。减少i/r损伤将会降低急性移植物功能障碍的可能性或降低其严重程度，并降低急性移植物衰竭的可能性。
[0310]
在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，抑制慢性排斥和/或慢性移植物衰竭。如本文所用，“慢性排斥或移植物衰竭”是指在移植后至少6个月，例如在移植后6个月至1、2、3、4、5年或更长时间，通常在移植物功能良好的数月至数年后发生的排斥或衰竭。它是由针对移植物的慢性炎症和免疫应答引起的。为此目的，慢性排斥可包括慢性同种异体移植物血管病变，该术语用于指移植组织内部血管的纤维化。随着免疫抑制方案降低了急性排斥的发生率，慢性排斥作为移植物功能障碍和衰竭的原因变得越来越突出。越来越多的证据表明，同种抗体的b细胞产生是慢性排斥和移植物衰竭发生的重要因素(kwun j.和knechtle sj，transplantation，88(8)：955-61(2009))。移植物的早期损伤可能是导致慢性过程(诸如纤维化)的促成因素，该慢性过程最终导致慢性排斥。因此，使用细胞反应性坎普他汀类似物抑制此类早期损伤可以延迟和/或降低慢性移植物排斥的可能性或严重程度。
[0311]
在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，施用于移植物受者以抑制移植物排斥和/或移植物衰竭。
[0312]
c.缺血/再灌注损伤
[0313]
缺血-再灌注(i/r)损伤是创伤后和在与血流暂时中断相关的其他情况下组织损伤的重要原因，所述其他情况诸如心肌梗塞、中风、严重感染、血管疾病、动脉瘤修复、心肺分流术和移植。
[0314]
在创伤的情况下，由于挫伤、骨筋膜室综合征和血管损伤导致的全身性血氧不足、低血压和局部供血中断会导致损害代谢活性组织的缺血。供血的恢复触发通常比缺血本身更有害的强烈全身炎症反应。一旦缺血区域再灌注，局部产生和释放的因子进入循环系统并到达远端位置，有时会对未受初始缺血性伤害影响的器官诸如肺和肠造成显著损伤，导致单个和多个器官功能障碍。补体激活发生在再灌注后不久并且是缺血后损伤的关键介体，直接地和通过其对嗜中性粒细胞的化学吸引和刺激作用。所有三种主要的补体途径都被激活，并且协同或独立地作用，牵涉于影响许多器官系统的i/r相关不良事件。在本公开的一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，施用给最近(例如，在前2、4、8、12、24或48小时内)经历创伤的受试者，所述创伤例如，例如由于全身性血氧不足、低血压和/或供血局部中断使受试者处于i/r损伤风险中的创伤。在一些实施方案中，细胞反应性坎普他汀类似物可以血管内施用，任选地施用到为受伤的身体部位供血的血管中或直接施用到该身体部位。在一些实施方案中，受试者患有脊髓损伤、创伤性脑损伤、烧伤和/或出血性休克。
[0315]
在一些实施方案中，在外科手术，例如预计会暂时中断流向身体的组织、器官或部分的血流的外科手术之前、期间或之后，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组
合，施用给受者。此类手术的实例包括心肺分流术、血管成形术、心脏瓣膜修复/置换、动脉瘤修复或其他血管手术。本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，可以在外科手术之前、之后和/或在重叠时间段期间施用。
[0316]
在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，施用给患有mi、血栓栓塞性中风、深静脉血栓形成或肺栓塞的受试者。本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，可与溶栓剂诸如组织纤溶酶原激活物(tpa)(例如，阿替普酶(activase)、瑞替普酶(retavase)、替奈普酶(tnkase))、阿尼普酶(eminase)、链激酶(kabikinase，streptase)或尿激酶(abbokinase)组合施用。本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，可以在溶栓剂之前、之后和/或在重叠时间段期间施用。
[0317]
在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，施用给受者以治疗i/r损伤。
[0318]
d.其他补体介导的病症
[0319]
在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合引入眼中治疗眼病，诸如黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性(amd)和stargardt黄斑营养不良)、糖尿病性视网膜病、青光眼或葡萄膜炎。例如，可以将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合引入玻璃体腔(例如，通过玻璃体内注射)或引入视网膜下腔(例如，通过视网膜下注射)，以治疗患有amd或有amd风险的受试者。在一些实施方案中，amd是新生血管(湿性)amd。在一些实施方案中，amd是干性amd。如本领域普通技术人员将认识到的，干性amd涵盖地理萎缩(ga)、中度amd和早期amd。在一些实施方案中，治疗患有ga的受试者以便减缓或停止疾病的进展。例如，在一些实施方案中，对患有ga的受试者的治疗降低了视网膜细胞的死亡率。视网膜细胞死亡率的降低可以通过用本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合治疗的患者与对照(例如，给予假施用的患者)相比ga病变生长率的降低来证明。在一些实施方案中，受试者患有中度amd。在一些实施方案中，受试者患有早期amd。在一些实施方案中，治疗患有中度或早期amd的受试者以便减缓或停止疾病的进展。例如，在一些实施方案中，对患有中度amd的受试者的治疗可以减缓或防止进展为晚期形式的amd(新生血管amd或ga)。在一些实施方案中，对患有早期amd的受试者的治疗可以减缓或防止进展为中度amd。在一些实施方案中，眼同时患有ga和新生血管amd。在一些实施方案中，眼患有ga但未患湿性amd。在一些实施方案中，将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用于脉络膜上腔，例如通过脉络膜上腔注射施用，以治疗眼病，诸如黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性(amd)和stargardt黄斑营养不良)、糖尿病性视网膜病、青光眼或葡萄膜炎。在一些实施
方案中将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用，例如通过玻璃体内注射或视网膜下注射施用，以治疗青光眼、葡萄膜炎(例如，后葡萄膜炎)或糖尿病性视网膜病。在一些实施方案中将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合引入前房，例如以治疗前葡萄膜炎。
[0320]
在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有自身免疫性疾病或有自身免疫性疾病风险的受试者，所述自身免疫性疾病例如至少部分由针对一种或多种自身抗原的抗体介导的自身免疫性疾病。
[0321]
本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，可以引入例如患有关节炎(例如，类风湿性关节炎)的受试者中的滑液腔中。
[0322]
在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有脑内出血或有脑内出血风险的受试者。
[0323]
在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有重症肌无力(例如全身型重症肌无力)或有重症肌无力风险的受试者。
[0324]
在一些实施方案中本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有化脓性汗腺炎或有化脓性汗腺炎风险的受试者。
[0325]
在一些实施方案中本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有免疫介导的坏死性肌病或有免疫介导的坏死性肌病风险的受试者。
[0326]
在一些实施方案中本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有视神经脊髓炎(nmo)或有视神经脊髓炎风险的受试者。
[0327]
在一些实施方案中本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有影响肾脏(例如肾脏的肾小球)的病症或有该病症风险的受试者。在一些实施方案中，该病症是膜增生性肾小球肾炎(mpgn)，例如mpgn i型、mpgn ii型或mpgn iii型。在一些实施方案中，该病症是iga肾病(igan)。在一些实施方案中，该病症是原发性膜性肾病。在一些实施方案中，该病症是c3肾小球病。在一些实施方案中，该病症的特征在于肾脏中含有一种或多种补体激活产物(例如c3b)的肾小球沉积物。在一些实施方案中，如本文所述的治疗降低了此类沉积物的水平。在一些实施方案中，患有补体介导的肾病的受试者遭受蛋白尿(尿中异常高水平的蛋白质)和/或异常低的肾小球滤过率(gfr)。在一些实施方案中，如本文所述的治疗导致蛋白尿减少和/或gfr增加或稳定。
[0328]
在一些实施方案中本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核
苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有神经退行性疾病或有神经退行性疾病风险的受试者。在一些实施方案中本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有神经性疼痛或有发展神经性疼痛风险的受试者。在一些实施方案中本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有鼻窦炎或鼻息肉或有鼻窦炎或鼻息肉风险的受试者。在一些实施方案中本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有癌症或有癌症风险的受试者。在一些实施方案中本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有脓毒症或有脓毒症风险的受试者。在一些实施方案中本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有成人呼吸窘迫综合征或有成人呼吸窘迫综合征风险的受试者。
[0329]
在一些实施方案中本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗患有过敏反应或输注反应或有过敏反应或输注反应风险的受试者。例如，在一些实施方案中，受试者可以在接受可引起过敏反应或输注反应的药物或媒介物之前、期间或之后进行治疗。在一些实施方案中，用本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，治疗有食物(例如，花生、贝类或其他食物过敏原)、昆虫叮咬(例如，蜜蜂、黄蜂)引起的过敏反应风险或患有该过敏反应的受试者。
[0330]
在本公开的各种实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，可以局部或全身施用。
[0331]
在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗呼吸疾病，例如哮喘或慢性阻塞性肺病(copd)或特发性肺纤维化。在各种实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，可以例如通过吸入(例如作为干粉或经由雾化)施用至呼吸道，或者可以通过注射(例如静脉内、肌内或皮下)施用。在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，用于治疗重度哮喘，例如支气管扩张剂和/或吸入的皮质类固醇不能充分控制的哮喘。
[0332]
在一些方面，提供了治疗补体介导的病症(例如，补体介导的慢性病症)的方法，所述方法包括将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用给需要治疗该病症的受试者。在一些方面，提供了治疗th17相关病症的方法，该方法包括将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另
外的补体抑制剂组合施用给需要治疗该病症的受试者。
[0333]
在一些方面，“慢性病症”是持续至少3个月和/或在本领域被接受为慢性病症的病症。在许多实施方案中，慢性病症持续至少6个月，例如至少1年，或更长时间，例如无限期。本领域的普通技术人员将认识到，各种慢性病症的至少一些表现可能是间歇性的和/或严重程度可能随着时间的推移而增减。慢性病症可以是进行性的，例如，具有随着时间的推移变得更严重或影响更大区域的趋势。本文讨论了许多补体介导的慢性病症。补体介导的慢性病症可以是其中牵涉补体激活(例如，过度或不适当的补体激活)，例如，作为促成因素和/或至少部分的病因因素的任何慢性病症。为了方便起见，病症有时参考在患有该病症的受试者中通常特别受影响的器官或系统来分组。应当认识到，许多病症可以影响多个器官或系统，并且此类分类决不是限制性的。此外，在患有许多不同病症中的任一种的受试者中可出现许多表现(例如，症状)。关于本文中目标病症的非限制性信息可以在例如内科医学的标准教科书，诸如《塞西尔医学教科书》(cecil textbook of medicine)(例如，第23版)、《哈里逊内科学》(harrison’s principles of internal medicine)(例如，第17版)和/或专注于特定医学领域、特定身体系统或器官和/或特定病症的标准教科书中找到。
[0334]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症是th2相关病症。如本文所用，th2相关病症是以身体或其部分，例如至少一种组织、器官或结构中th2亚型的cd4 辅助t细胞(“th2细胞”)的数目过量和/或活性过量或不适当为特征的病症。例如，相对于th1亚型的cd4 辅助t细胞(“th1细胞”)，例如在至少一种受病症影响的组织、器官或结构中，th2细胞可能占优势。如本领域已知，th2细胞通常分泌特征性细胞因子，如诸如白细胞介素-4(il-4)、白细胞介素-5(il-5)和白细胞介素-13(il-13)，而th1细胞通常分泌干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子(tnf)。在一些实施方案中，th2相关病症的特征在于例如相对于ifn-γ和/或tnf，例如在至少一些至少一种组织、器官或结构中il-4、il-5和/或il-13的产生和/或量过量。
[0335]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症是th17相关病症。在一些方面，如2012年6月22日提交的题为“用补体抑制剂治疗慢性病症的方法(methods of treating chronic disorders with complement inhibitors)”的pct/us2012/043845中进一步详细描述的，补体激活和th17细胞参与牵涉树突细胞和抗体的循环，并促成作为一系列病症的基础的病理性免疫微环境的维持。不希望受任何理论的束缚，病理性免疫微环境一旦建立，就是自我维持的并促成细胞和组织损伤。在一些方面，长效坎普他汀类似物可用于治疗th17相关病症。
[0336]
如本文所用，th17相关病症是以身体或其部分，例如至少一种组织、器官或结构中th17亚型的cd4 辅助t细胞(“th17细胞”)的数目过量和/或活性过量或不适当为特征的病症。例如，相对于th1细胞和/或th2细胞，例如在至少一种受病症影响的组织、器官或结构中，th17细胞可能占优势。在一些实施方案中，th17细胞的优势是相对优势，例如，th17细胞与th1细胞的比率和/或th17细胞与th2细胞的比率相对于正常值增加。在一些实施方案中，th17细胞与t调节性细胞(cd4
cd25
调节性t细胞，也称为“treg细胞”)的比率相对于正常值增加。各种细胞因子，例如白细胞介素6(il-6)、白细胞介素21(il-21)、白细胞介素23(il-23)和/或白细胞介素1β(il-1)促进th17细胞的形成和/或th17细胞的激活。th17细胞的形成涵盖前体t细胞(例如，原始cd4 t细胞)向th17表型的分化以及它们成熟为功能性th17细胞。在一些实施方案中，th17细胞的形成涵盖th17细胞的发育、增殖(扩增)、存活和/或成
熟的任何方面。在一些实施方案中，th17相关病症的特征在于il-6、il-21、il-23和/或il-1的产生和/或量过量。th17细胞通常分泌特征性细胞因子，诸如白细胞介素-17a(il-17a)、白细胞介素-17f(il-17f)、白细胞介素-21(il-21)和白细胞介素-22(il-22)。在一些实施方案中，th17相关病症的特征在于th17效应细胞因子，例如il-17a、il-17f、il-21和/或il-22的产生和/或量过量。在一些实施方案中，在血液中可检测到细胞因子的过量产生或量。在一些实施方案中，细胞因子的过量产生或量是局部可检测到的，例如在至少一种组织、器官或结构中。在一些实施方案中，th17相关病症与treg数目减少和/或treg相关细胞因子量减少相关。在一些实施方案中，th17病症是任何慢性炎性疾病，该术语包括一系列疾病，其特征在于对多种组织的自我持续免疫伤害并且似乎与引起该疾病的初始伤害无关(可能未知)。在一些实施方案中，th17相关病症是任何自身免疫性疾病。许多(如果不是大多数的话)“慢性炎性疾病”实际上可能是自身免疫性疾病。th17相关病症的实例包括炎性皮肤病，诸如银屑病和特应性皮炎；系统性硬皮病和硬化；炎症性肠病(ibd)(诸如克罗恩病(crohn
′
s disease)和溃疡性结肠炎)；白塞氏病(behcet’s disease)；皮肌炎；多发性肌炎；多发性硬化(ms)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；骨关节炎；狼疮性肾炎；类风湿性关节炎(ra)、干燥综合征(sjogren’s syndrome)、多发性硬化、脉管炎；中枢神经系统(cns)炎性病症、慢性肝炎；慢性胰腺炎、肾小球肾炎；结节病；甲状腺炎、对组织/器官移植的病理性免疫应答(例如，移植排斥)；copd、哮喘、细支气管炎、过敏性肺炎、特发性肺纤维化(ipf)、牙周炎和牙龈炎。在一些实施方案中，th17疾病是经典已知的自身免疫性疾病，诸如i型糖尿病或银屑病。在一些实施方案中，th17相关病症是年龄相关性黄斑变性。
[0337]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症是ige相关病症。如本文所用，“ige相关病症”是以ige的产生和/或量过量和/或不适当、过量或不适当的产生ige的细胞(例如，产生ige的b细胞或浆细胞)的活性过量和/或不适当、和/或ige应答细胞(诸如嗜酸性粒细胞或肥大细胞)的活性过量和/或不适当为特征的病症。在一些实施方案中，ige相关病症的特征在于受试者血浆中和/或局部的总ige水平升高和/或在一些实施方案中过敏原特异性ige水平升高。
[0338]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症的特征在于身体内存在自身抗体和/或免疫复合物，自身抗体和/或免疫复合物可经由例如经典途径激活补体。自身抗体例如可以与自身抗原，例如身体内的细胞或组织上的自身抗原结合。在一些实施方案中，自身抗体与血管、皮肤、神经、肌肉、结缔组织、心脏、肾脏、甲状腺等中的抗原结合。在一些实施方案中，受试者患有视神经脊髓炎并产生针对水通道蛋白4的自身抗体(例如，igg自身抗体)。在一些实施方案中，受试者患有类天疱疮并产生针对半桥粒的结构组分(例如，跨膜胶原xvii(bp180或bpag2)和/或plakin家族蛋白bp230(bpag1))的自身抗体(例如，igg或ige自身抗体)。在一些实施方案中，补体介导的慢性病症不以自身抗体和/或免疫复合物为特征。
[0339]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症是呼吸病症。在一些实施方案中，慢性呼吸病症是哮喘或慢性阻塞性肺病(copd)。在一些实施方案中，慢性呼吸病症是肺纤维化(例如，特发性肺纤维化)、辐射诱导的肺损伤、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性肺炎(也称为过敏性肺泡炎)、嗜酸细胞性肺炎、间质性肺炎、肉样瘤、韦格纳肉芽肿病(wegener’s granulomatosis)或闭塞性细支气管炎。在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗需要治疗慢性呼吸病症的受试者的方法，所述慢性呼吸病症例如哮喘、copd、肺纤维化、辐射诱导
的肺损伤、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性肺炎(也称为过敏性肺泡炎)、嗜酸细胞性肺炎、间质性肺炎、肉样瘤、韦格纳肉芽肿病或闭塞性细支气管炎，该方法包括将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用于需要治疗该病症的受试者。
[0340]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症是过敏性鼻炎、鼻窦炎或鼻息肉。在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗需要治疗过敏性鼻炎、鼻窦炎或鼻息肉的受试者的方法，该方法包括将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用于需要治疗该病症的受试者。
[0341]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症是影响肌肉骨骼系统的病症。此类病症的实例包括炎性关节病状(例如，关节炎诸如类风湿性关节炎或银屑病性关节炎、青少年慢性关节炎、脊椎关节病、莱特氏综合征(reiter’s syndrome)、痛风)。在一些实施方案中，肌肉骨骼系统病症导致诸如疼痛、僵硬和/或受影响的身体部分的运动受限的症状。炎性肌病包括皮肌炎、多肌炎并且各种其他疾病是病因不明的导致肌无力的慢性肌肉炎症的病症。在一些实施方案中，补体介导的慢性病症是重症肌无力。在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗影响肌肉骨骼系统的前述病症中的任一种的方法，该方法包括将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用给需要治疗该病症的受试者。
[0342]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症是影响外皮系统的病症。此类病症的实例包括，例如，特应性皮炎、银屑病、类天疱疮、天疱疮、全是性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮病、硬化性皮肌炎、干燥综合征(syndrome)和慢性荨麻疹。在一些方面，本公开提供了一种治疗影响外皮系统的前述病症中的任一种的方法，该方法包括将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用给需要治疗该病症的受试者。
[0343]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症影响神经系统，例如中枢神经系统(cns)和/或外周神经系统(pns)。此类病症的实例包括，例如，多发性硬化、其他慢性脱髓鞘疾病(例如，视神经脊髓炎或慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(cidp))、肌萎缩性侧索硬化、慢性疼痛、中风、过敏性神经炎、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、路易体痴呆(即，路易体痴呆或帕金森氏病痴呆)、额颞叶痴呆、创伤性脑损伤、创伤性脊髓损伤、多系统萎缩、慢性创伤性脑病、克雅二氏症和柔脑膜转移。在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗影响神经系统的前述病症中的任一种的方法，该方法包括将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用给需要治疗该病症的受试者。
[0344]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症影响循环系统。例如，在一些实施方案中，该病症是脉管炎或与脉管炎症，例如血管和/或淋巴管炎症相关的其他病症。在一些实施方案中，脉管炎是结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿病、巨细胞动脉炎、查格-施特劳斯综合征(churg-strauss syndrome)、显微镜下多血管炎、亨-舍二氏紫癜(henoch-schonlein purpura)、高安氏动脉炎(takayasu
′
s arteritis)、川崎病(kawasaki disease)或白塞氏病(behcet’s disease)。在一些实施方案中，受试者，例如需要治疗脉管炎的受试者，抗中
性粒细胞胞浆抗体(anca)呈阳性。
[0345]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症影响胃肠系统。例如，该病症可以是炎性肠病，例如克罗恩病或溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗影响胃肠系统的补体介导的慢性病症的方法，该方法包括将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用给需要治疗该病症的受试者。
[0346]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症是甲状腺炎(例如，桥本甲状腺炎(hashimoto’s thyroiditis)、格雷夫斯病(graves’disease)、产后甲状腺炎)、心肌炎、肝炎(例如，丙型肝炎)、胰腺炎、肾小球肾炎(例如，膜增生性肾小球肾炎或膜性肾小球肾炎)或脂膜炎。
[0347]
在一些实施方案中，本公开提供了治疗患有慢性疼痛的受试者的方法，所述方法包括将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用给有此需要的受试者。在一些实施方案中，受试者患有神经性疼痛。神经性疼痛已经定义为由神经系统的原发性病变或功能障碍引发或引起的疼痛，尤其是作为影响躯体感觉系统的病变或疾病的直接后果出现的疼痛。例如，神经性疼痛可由牵涉躯体感觉途径的病变引起，对外周神经中的小纤维和/或cns中的脊髓丘脑皮层系统有损伤。在一些实施方案中，神经性疼痛由自身免疫性疾病(例如，多发性硬化)、代谢疾病(例如，糖尿病)、感染(例如，病毒性疾病诸如带状疱疹或hiv)、血管疾病(例如，中风)、创伤(例如，损伤、手术)或癌症引起。例如，神经性疼痛可以是在损伤愈合后或在外周神经末梢刺激停止后持续的疼痛或由于神经损伤而引起的疼痛。神经性疼痛或与神经性疼痛相关的示例性病状包括疼痛性糖尿病性神经病、疱疹后神经痛(例如，在急性发作后3个月或更多个月在急性带状疱疹的部位持续或复发的疼痛)、三叉神经痛、癌症相关的神经性疼痛、化疗相关的神经性疼痛、hiv相关的神经性疼痛(例如，由hiv神经病变引起)、中枢/中风后神经性疼痛、与背痛(例如下背痛)相关的神经病变(例如，由神经根病诸如脊根压迫例如腰根压迫引起，这种压迫可能是由于椎间盘突出引起的)、椎管狭窄、周围神经损伤性疼痛、幻肢痛、多神经病、脊髓损伤相关疼痛、脊髓病和多发性硬化。在本公开的某些实施方案中，根据给药计划将本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用，以治疗患有前述病状中的一种或多种病状的受试者的神经性疼痛。
[0348]
在一些实施方案中，补体介导的慢性病症是慢性眼病。在一些实施方案中，慢性眼病的特征在于黄斑变性、脉络膜新生血管(cnv)、视网膜新生血管(rnv)、眼部炎症或前述的任何组合。黄斑变性、cnv、rnv和/或眼部炎症可能是该病症的定义和/或诊断特征。以这些特征中的一种或多种为特征的示例性病症包括但不限于黄斑变性相关病状、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变、葡萄膜炎、角膜炎、结膜炎和巩膜炎。黄斑变性相关病状包括例如年龄相关性黄斑变性(amd)和stargardt黄斑营养不良。在一些实施方案中，受试者需要治疗湿性amd。在一些实施方案中，受试者需要治疗干性amd。在一些实施方案中，受试者需要治疗地理萎缩(ga)。在一些实施方案中，受试者需要治疗眼部炎症。眼部炎症可影响大量的眼结构，诸如结膜(结膜炎)、角膜(角膜炎)、巩膜外层、巩膜(巩膜炎)、葡萄膜、视网膜、脉管系统和/或视神经。眼部炎症的证据可包括眼中存在炎症相
关细胞诸如白细胞(例如，嗜中性粒细胞、巨噬细胞)、存在内源性炎症介质、一种或多种症状诸如眼疼、发红、光敏感、视力模糊和飞蚊症等。葡萄膜炎是一个通用术语，指眼葡萄膜中的炎症，例如，葡萄膜的任何结构(包括虹膜、睫状体或脉络膜)中的炎症。葡萄膜炎的具体类型包括虹膜炎、虹膜睫状体炎、睫状体炎、睫状体扁平部炎和脉络膜炎。在一些实施方案中，慢性眼病是以视神经损伤(例如视神经变性)为特征的眼病，诸如青光眼。
[0349]
如上所述，在一些实施方案中，慢性呼吸疾病是哮喘。关于哮喘的危险因素、流行病学、发病机理、诊断、当前管理等的信息可以在例如“expert panel report 3：guidelines for the diagnosis and management of asthma”.national heart lung and blood institute.2007.http：//www.nhlbi.nih.gov/guidelines/asthma/asthgdln.pdf.(“nhlbi guidelines”；www.nhlbi.nih.gov/guidelines/asthma/asthgdln.htm)，global initiative for asthma，global strategy for asthma management and prevention 2010“gina report”)和/或内科医学的标准教科书，诸如《塞西尔医学教科书》(cecil textbook of medicine)(第20版)、《哈里逊内科学》(harrison’s principles of internal medicine)(第17版)和/或专注于肺医学的标准教科书中找到。哮喘是气道的慢性炎症性病症，其中许多细胞和细胞要素起作用，例如肥大细胞、嗜酸性粒细胞、t淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和上皮细胞。哮喘个体经历与诸如喘息、气促(也称为呼吸困难或气短)、胸闷和咳嗽等症状相关的反复发作。这些发作通常与广泛但可变的气流阻塞相关，气流阻塞通常是自发可逆的或是经过治疗可逆的。炎症还导致对各种刺激的现有支气管高反应性的连带增加。气道高反应性(对刺激的过度支气管收缩应答)是哮喘的典型特征。一般来说，气流受限是由支气管收缩和气道水肿引起的。在一些哮喘患者中，气流受限的可逆性可能是不完全的。例如，气道重塑会导致固定的气道狭窄。结构变化可包括基底膜下增厚、上皮下纤维化、气道平滑肌肥大和增生、血管增生和扩张以及粘液腺增生和分泌过多。
[0350]
患有哮喘的个体可能经历加剧，加剧被鉴定为以个体先前状态的改变为特征的事件。重度哮喘加剧可定义为需要个体和他/她的医生采取紧急行动以防止严重后果的事件，诸如住院或死于哮喘。例如，重度哮喘加剧可能需要在其哮喘通常在没有ocs的情况下得到良好控制的受试者中使用全身性皮质类固醇(例如，口服皮质类固醇)，或者可能需要增加稳定维持剂量。中度哮喘加剧可定义为对受试者而言很麻烦、提示需要改变治疗但不严重的事件。这些事件在临床上通过超出受试者日常哮喘变化的正常范围来鉴定。
[0351]
目前用于哮喘的药物通常分为两大类：长期控制药物(“控制药物”)，诸如吸入性皮质类固醇(ics)、口服皮质类固醇(ocs)、长效支气管扩张剂(laba)、白三烯调节剂(例如白三烯受体拮抗剂或白三烯合成抑制剂、抗ige抗体(奥马珠单抗(omalizumab))、色甘酸和奈多罗米(nedocromil)(其用于实现和维持对持续性哮喘的控制)；以及快速缓解药物，诸如短效支气管扩张剂(saba)，其用于治疗急性症状和加剧。出于本发明的目的，这些治疗可称为“常规疗法”。对加剧的治疗还可以包括增加控制药物疗法的剂量和/或强度。例如，一个疗程的ocs可以用于重获哮喘控制。目前的指南要求每天施用控制药物，或者在许多情况下，对于患有持续性哮喘的受试者，每天施用多个剂量的控制药物(xolair除外，其每2周或4周施用一次)。
[0352]
如果受试者平均每周出现两次以上的症状和/或通常每周使用两次以上的快速缓
解药物(例如，saba)来控制症状，则通常认为该受试者患有持续性哮喘。一旦相关的共病已得到治疗且吸入器技术和依从性已得到优化，就可基于控制受试者的哮喘所需的治疗强度对“哮喘严重程度”进行分类，(参见，例如，gina报告；taylor，dr，eur respir j 2008；32：545-554)。治疗强度的描述可以基于逐步治疗算法中推荐的药物和剂量，所述逐步治疗算法可以在指南诸如nhlbi指南2007、gina报告以及它们的前身和/或标准医学教科书中找到。例如，哮喘可分类为间歇性、轻度、中度或重度，如表7所示，其中“治疗”是指足以达到受试者最佳哮喘控制水平的治疗。应当理解，轻度、中度和重度哮喘的类别通常暗示持续性而非间歇性哮喘。本领域的普通技术人员将认识到，表7是示例性的，并且并非所有这些药物在所有保健系统中都将是可用的，这可能会影响在一些环境中对哮喘严重程度的评估。还应当认识到，其他新兴的或新的方法可影响轻度/中度哮喘的分类。然而，仍然可以应用相同的原则，即通过使用非常低强度的治疗实现良好控制的能力来定义轻度哮喘，通过对高强度治疗的需要来定义重度哮喘。哮喘严重程度也可以或可替换地基于没有治疗时该疾病的内在强度进行分类(参见，例如，nhbli指南2007)。可以基于当前肺活量测定法和患者对前2-4周症状的回忆进行评估。可以评估当前损伤和未来风险的参数，并将其包括在哮喘严重程度水平的确定中。在一些实施方案中，哮喘严重程度的定义，对于0-4岁、5-11岁或≥12岁的个体分别如nhbli指南的图3.4(a)、3.4(b)、3.4(c)所示。
[0353]
表7：基于治疗的哮喘分类
[0354][0355]“哮喘控制”是指通过治疗(无论是药理学治疗还是非药理学治疗)减轻或去除哮喘表现的程度。哮喘控制可以基于诸如症状频率、夜间症状、肺功能客观量度(诸如肺活量测定参数)(例如，预测的％fev1、fev1可变性、使用saba进行症状控制的需要)的因素来评估。可以评估当前损伤和未来风险的参数，并将其包括在哮喘控制水平的确定中。在一些实施方案中，哮喘控制的定义，对于0-4岁、5-11岁或≥12岁的个体分别如nhbli指南的图4.3(a)、4.3(b)或4.3(c)所示。
[0356]
一般来说，本领域的普通技术人员可以选择确定哮喘严重程度水平和/或控制程度的适当手段，并且可以使用本领域普通技术人员认为合理的任何分类方案。
[0357]
在本公开的一些实施方案中，使用给药方案，用本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合来治疗患有持续性哮喘的受试者。在一些实施方案中，受试者患有轻度或中度哮喘。在一些实施方案中，受试者患有重度哮喘。在一些实施方案中，受试者患有使用常规疗法不能良好控制的哮喘。在一些实施方案中，受试者患有当使用常规疗法治疗时，需要使用ics以便良好控制的哮喘。在一些实施方案中，受试者患有尽管使用了ics，但未能得到良好控制的哮喘。在一些实施方案中，受试者患有如果使用常规疗法治疗，将需要使用ocs以便良好控制的哮喘。在一些实施方案中，受试者患有尽管使用了包括ocs在内的高强度常
规疗法，仍未得到良好控制的哮喘。在一些实施方案中，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合，作为控制药物施用或使受试者避免使用或减少它们常规控制药物的剂量。
[0358]
在一些实施方案中，受试者患有过敏性哮喘，这是大多数哮喘个体的情况。在一些实施方案中，如果哮喘的非过敏性触发因素(例如，寒冷、运动)未知和/或在标准诊断评价中未鉴定，则认为哮喘受试者患有过敏性哮喘。在一些实施方案中，如果受试者出现以下情况，则认为哮喘受试者患有过敏性哮喘：(i)在暴露于受试者敏感的一种或多种过敏原后可再现地发展哮喘症状(或哮喘症状恶化)；(ii)表现出对受试者敏感的一种或多种过敏原具有特异性的ige；(iii)对受试者敏感的一种或多种过敏原表现出皮肤点刺试验呈阳性；和/或(iv)表现出符合特应性特征的其他症状，诸如过敏性鼻炎、湿疹或总血清ige升高。应当认识到，例如，如果受试者在特定环境中经历恶化的症状，则特定的过敏性触发因素可能无法鉴定，但可以怀疑或推断。
[0359]
吸入过敏原激发是一种广泛用于评价过敏性气道疾病的技术。吸入过敏原导致与例如肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的ige受体结合的过敏原特异性ige交联。分泌途径的激活随之发生，导致支气管收缩和血管通透性介质的释放。患有过敏性哮喘的个体可能在过敏原激发后发展出各种表现，例如早期哮喘应答(ear)、晚期哮喘应答(lar)、气道高反应性(ahr)和气道嗜酸细胞增多，其中每一种都可以如本领域已知的那样进行检测和定量。例如，气道嗜酸粒细胞增多可被检测为痰和/或bal液中嗜酸性粒细胞的增加。ear，有时称为即刻哮喘应答(iar)，是对吸入过敏原激发的应答，该应答在吸入后不久变得可检测，通常在吸入10分钟(min)内，例如，作为fev1的降低。ear通常在30分钟内达到最大值并且在激发后2-3小时(h)内消退。例如，如果受试者的fev1在该时间窗口内相对于基线fev1降低至少15％，例如至少20％，则可以认为他/她表现出“阳性”ear(其中“基线”在本文中指激发前的状况，例如，相当于当未经历哮喘加剧且未暴露于受试者敏感的过敏性刺激时受试者的通常状况)。晚期哮喘应答(lar)通常在激发后3小时至8小时之间开始并且特征在于气道的细胞炎症、支气管血管渗透性增加和粘液分泌。它通常被检测为fev1的降低，其幅度可能比与ear相关的幅度更大并且可能在临床上更重要。例如，如果与基线fev1相比，受试者的fev1在相关时间段内相对于基线fev1降低至少15％，例如至少20％，则可以认为他/她表现出“阳性”lar。延迟气道应答(dar)可在激发后约26至32小时之间开始出现，在激发后约32至48小时之间达到最大值并且在激发后约56小时内消退(pelikan，z.ann allergy asthma immunol.2010，104(5)：394-404)。
[0360]
在一些实施方案中，慢性呼吸病症是慢性阻塞性肺病(copd)。copd涵盖一系列以气流受限为特征的病状，气流受限即使进行治疗也不完全可逆并且通常是进行性的。copd的症状包括呼吸困难(气促)、运动耐量下降、咳嗽、痰液产生、喘息和胸闷。患有copd的人可经历症状的急性发作(例如，在不到一周的过程中发展，并且通常在24小时或更短的过程中发展)(称为copd加剧)，性发作在频率和持续时间上可能不同，并且与显著的发病率相关。它们可能由诸如呼吸感染、暴露于有害颗粒等事件引发，或者可能有未知的病因。吸烟是copd最常见的风险因素，并且其他吸入暴露也可促成疾病的发展和进展。遗传因素在copd中的作用是一个活跃的研究领域。一小部分copd患者具有α-1抗胰蛋白酶的遗传性缺陷，α-1抗胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶的主要循环抑制剂，并且这种缺陷可导致疾病的快速进行形
式。
[0361]
copd的特有病理生理学特征包括小气道的狭窄和结构变化以及肺实质(尤其是肺泡周围)的破坏，最常见的原因是慢性炎症。在copd中观察到的慢性气流受限通常牵涉这些因素的混合，并且它们在促成气流受限和症状方面的相对重要性因人而异。术语“气肿”是指终末细支气管远端的空隙(肺泡)扩大及其壁的破坏。应当注意的是，术语“气肿”在临床上经常用于指与此类病理变化相关的医学状况。一些患有copd的个体患有慢性支气管炎，慢性支气管炎在临床术语中定义为在一年的3个月中的大多数日子里咳嗽并产生痰液，持续2年。关于copd的风险因素、流行病学、发病机理、诊断和当前管理的进一步信息可以在以下找到：例如global initiative on chronic obstructive pulmonary disease，inc.(gold)网站(www.goldcopd.org)上可获得的“慢性阻塞性肺病的诊断、管理和预防的全球策略(global strategy for the diagnosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease)”(2009年更新)(本文也称为“gold报告”)，www.thoracic.org/clinical/copd-guidelines/resources/copddoc.pdf的ats网站上可获得的美国胸科协会/欧洲呼吸协会指南(2004)(american thoracic society/european respiratory society guidelines)(本文也称为“atc/ers copd指南”)和内科学标准教科书，诸如《塞西尔医学教科书》(第20版)、《哈里逊内科学》(第17版)和/或专注于肺医学的标准教科书。
[0362]
在一些实施方案中，本文公开的方法抑制(干扰、破坏)以上讨论的dc-th17-b-ab-c-dc循环。例如，本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合施用，可以打破补体刺激dc细胞以促进th17表型的循环。因此，th17细胞的数目和/或活性减少，转而减少th17介导的b细胞刺激和多克隆抗体产生的量。在一些实施方案中，这些作用导致免疫微环境“重置”到更正常、更少病理的状态。如pct/us2012/043845(wo/2012/178083)的实施例1和美国公布第20140371133号中所述，已在哮喘动物模型中获得支持补体抑制对th17相关细胞因子产生具有延长的抑制作用的能力的证据。
[0363]
在一些实施方案中，抑制dc-th17-b-ab-c-dc循环具有疾病修正作用。不希望受任何理论的束缚，不仅仅是治疗病症的症状，抑制dc-th17-b-ab-c-dc循环可干扰基本的病理机制，这即使在症状得到良好控制时也可促成正在进行的组织损伤和/或可促成疾病的加剧。在一些实施方案中，抑制dc-th17-b-ab-c-dc循环导致慢性病症进入缓解。在一些实施方案中，缓解是指患有慢性病症的受试者中不存在或基本上不存在疾病活动的状态，有疾病复发的可能性。在一些实施方案中，在不存在持续疗法或减少剂量或增加给药间隔的情况下，缓解可以持续较长的时间(例如，至少6个月，例如6-12个月、12-24个月或更长)。在一些方面，补体的抑制可改变富含th17细胞的组织的免疫微环境，并将其改为富含调节性t细胞(treg)的微环境。这样做可以使免疫系统自身“重置”并且进入缓解状态。在一些实施方案中，例如，缓解可以持续到触发事件发生。触发事件可以是，例如，感染(其可以导致与感染因子和自身蛋白都反应的多克隆抗体的产生)、暴露于特定的环境条件(例如，高水平的空气污染物诸如臭氧或微粒物质或烟雾组分诸如香烟烟雾、过敏原)等。遗传因素可能会发挥作用。例如，具有编码补体组分的基因的特定等位基因的个体可能具有较高的补体活性基线水平、更具反应性的补体系统和/或较低的内源性补体调控蛋白活性基线水平。在一些
实施方案中，个体具有与amd风险增加相关的基因型。例如，受试者可在编码补体蛋白或补体调控蛋白(例如cfh、c3、因子b)的基因中具有多态性，其中该多态性与amd风险增加相关。
[0364]
在一些实施方案中，免疫微环境可随着时间的推移而渐进地变得越来越向病理状态极化，例如，在尚未发展出慢性病症的症状的受试者中，或在已经发展出该病症并已如本文所述进行治疗的受试者中。此类转变可以随机发生(例如，至少部分由于抗体水平和/或亲和力的明显随机波动)和/或作为积聚的“亚阈值”触发事件的结果而发生，所述事件的强度不足以触发病症的症状爆发。
[0365]
在一些实施方案中，考虑到本文所述的抑制性rna(或包含编码本文所述的抑制性rna的核苷酸序列的载体)，单独或与本文所述的一种或多种另外的补体抑制剂组合的相对较短疗程，例如在1周至6周之间，例如约2-4周，可提供持久益处。在一些实施方案中，实现缓解持续较长时间段，例如1-3个月、3-6个月、6-12个月、12-24个月或更长时间。在一些实施方案中，可以在症状复发之前对受试者进行监测和/或预防性治疗。例如，受试者可以在暴露于触发事件之前或之时进行治疗。在一些实施方案中，可以监测受试者，例如，生物标志物的增加，例如，包含th17细胞或th17细胞活性或补体激活的指示物的生物标志物，并且可以在此类生物标志物的水平增加时进行治疗。参见，例如pct/us2012/043845中的进一步讨论。
[0366]
x.联合疗法
[0367]
在一些方面，本公开的方法牵涉单独或与一种或多种另外的补体抑制剂组合施用本文所述的抑制性rna。在一些实施方案中，将抑制性rna施用给已经接受另一种补体抑制剂治疗的受试者；在一些实施方案中，向接受抑制性rna的受试者施用另一种补体抑制剂。在一些实施方案中，将抑制性rna和另一种补体抑制剂两者施用给受试者。
[0368]
在一些实施方案中，施用抑制性rna可允许施用与作为单一疗法施用第二补体抑制剂相比第二补体抑制剂减少的给药方案(例如，牵涉单独剂量中的较小量、减少的给药频率、减少的剂量次数和/或减少的总暴露量)。不希望受任何理论的束缚，在一些实施方案中，第二补体抑制剂减少的给药方案可以避免一种或多种否则可能导致的不良副作用。
[0369]
在一些方面，抑制性rna与第二补体抑制剂组合施用可以充分减少受试者血液中c3的量，使得需要抑制性rna和/或第二补体抑制剂减少的给药方案来实现所需程度的补体抑制。
[0370]
在一些方面，抑制性rna与第二补体抑制剂组合施用可以充分减少受试者血液中c3的量，使得需要抑制性rna和/或第二补体抑制剂减少的给药方案来实现补体介导的病症的一种或多种体征、症状、生物标志物或结果量度的所需水平或所需量的改善。
[0371]
在一些实施方案中，与作为单一疗法施用抑制性rna或第二补体抑制剂相比，此类减少的剂量可以以更小的体积、或使用更低的浓度、或使用更长的给药间隔、或前述的任何组合来施用。
[0372]
任何补体抑制剂，例如本领域已知的补体抑制剂，可以与本文所述的抑制性rna组合施用。在一些实施方案中，补体抑制剂是坎普他汀或坎普他汀类似物。
[0373]
坎普他汀是一种与c3结合并抑制补体激活的环肽。美国专利第6,319,897号描述了具有序列ile-[cys-val-val-gln-asp-trp-gly-his-his-arg-cys]-thr(seq id no：1)的肽，两个半胱氨酸之间的二硫键用括号表示。应当理解，美国专利第6,319,897号没有使
用名称“坎普他汀”，但随后在科学和专利文献(参见，例如morikis等人，protein sci.，7(3)：619-27，1998)中用于指具有与美国专利第6,319,897号中公开的seq id no：2相同的序列但是在c端酰胺化的肽。术语“坎普他汀”在本文中与此类用法一致。已经开发了具有比坎普他汀更高的补体抑制活性的坎普他汀类似物。参见，例如wo2004/026328(pct/us2003/029653)，morikis，d.等人，biochem soc trans.32(pt 1)：28-32，2004，mallik，b.等人，j.med.chem.，274-286，2005；katragadda，m.等人j.med.chem.，49：4616-4622，2006；wo2007062249(pct/us2006/045539)；wo2007044668(pct/us2006/039397)；wo/2009/046198(pct/us2008/078593)；wo/2010/127336(pct/us2010/033345)。
[0374]
如本文所用，术语“坎普他汀类似物”包括坎普他汀及其任何补体抑制类似物。术语“坎普他汀类似物”涵盖坎普他汀和基于坎普他汀设计或鉴定的并且其补体抑制活性，例如使用本领域接受的任何补体激活测定法或基本上类似或等同的测定法测量的那样，是坎普他汀的至少50％的其他化合物。某些合适的测定法在美国专利第6,319,897号、wo2004/026328、morikis，同上，mallik，同上，katragadda 2006，同上，wo2007062249(pct/us2006/045539)；wo2007044668(pct/us2006/039397)；wo/2009/046198(pct/us2008/078593)；和/或wo/2010/127336(pct/us2010/033345)中有描述。该测定法可以例如测量旁路途径或经典途径介导的红细胞溶解，或者是elisa测定法。在一些实施方案中，使用wo/2010/135717(pct/us2010/035871)中描述的测定法。
[0375]
表8提供了在本公开中有用的坎普他汀类似物的非限制性列表。与亲本肽坎普他汀相比，在左侧一列中通过标示在指定位置(1-13)的具体修饰，以缩写形式提及类似物。与本领域中的用法一致，如本文所用的“坎普他汀”以及本文所述的坎普他汀类似物相对于坎普他汀的活性是指在c端酰胺化的坎普他汀肽。除非另有说明，否则表8中的肽在c端酰胺化。粗体文本用于标示某些修饰。与坎普他汀相关的活性基于公开的数据和其中描述的测定法(wo2004/026328、wo2007044668，mallik，2005；katragadda，2006)。在某些实施方案中，当用于本公开的治疗组合物和方法中时，表8中列出的肽是经由两个cys残基之间的二硫键环化的。使肽环化的替代手段也在本公开的范围内。
[0376]
表8
[0377]
[0378][0379][0380]
na＝不可用
[0381]
在本公开的组合物和方法的某些实施方案中，坎普他汀类似物具有选自序列9-36的序列。在一个实施方案中，坎普他汀类似物具有seq id no：28的序列。如本文所用，“l-氨基酸”是指通常存在于蛋白质中的天然存在的左旋α-氨基酸或那些α-氨基酸的烷基酯中的任一种。术语“d-氨基酸”是指右旋α-氨基酸。除非另有说明，否则本文提及的所有氨基酸都是l-氨基酸。
[0382]
在一些实施方案中，坎普他汀类似物(例如，本文公开的坎普他汀类似物中的任一种)的一个或多个氨基酸可以是n-烷基氨基酸(例如，n-甲基氨基酸)。例如，但不限于，肽的环状部分内的至少一个氨基酸、环状部分n端的至少一个氨基酸和/或环状部分c端的至少一个氨基酸可以是n-烷基氨基酸，例如n-甲基氨基酸。在一些实施方案中，例如，坎普他汀类似物包含n-甲基甘氨酸，例如在对应于坎普他汀的位置8的位置和/或在对应于坎普他汀的位置13的位置。在一些实施方案中，表8中的坎普他汀类似物中的一种或多种含有至少一个n-甲基甘氨酸，例如在对应于坎普他汀的位置8的位置和/或在对应于坎普他汀的位置13的位置。在一些实施方案中，表8中的坎普他汀类似物中的一种或多种含有至少一个n-甲基异亮氨酸，例如在对应于坎普他汀的位置13的位置。例如，表8中列出其序列的肽或任何其他坎普他汀类似物序列的c末端或其附近的thr可以被n-甲基ile置换。正如将认识到的那样，在一些实施方案中，n-甲基化氨基酸包含位置8处的n-甲基gly和位置13处的n-甲基ile。在一些实施方案中，代替本文所述的一个或多个取代或除本文所述的一个或多个取代以外，坎普他汀类似物(例如，表8中列出的坎普他汀类似物中的任一种)在对应于seq id no：8的位置3的位置包含异亮氨酸。例如，在一些实施方案中，坎普他汀类似物包含seq id no：8-36中任一者的序列或由该序列组成，其中位置3是异亮氨酸。在一些实施方案中，坎普他汀类似物包含seq id no：25、33或36中任一者的序列或由该序列组成，其中位置4是异亮氨酸。在例如wo2019/166411中描述了另外的坎普他汀类似物。
[0383]
坎普他汀类似物可以通过本领域已知的肽合成的各种合成方法，经由氨基酸残基的缩合，例如根据常规的肽合成方法来制备，可以通过使用本领域已知的方法在体外或在活细胞中从编码坎普他汀类似物的适当核酸序列表达来制备。例如，可以使用malik同上，katragadda同上、wo2004026328和/或wo2007062249中描述的标准固相方法合成肽。潜在反应性部分，诸如氨基和羧基、反应性官能团等，可以使用本领域已知的各种保护基团和方法进行保护并随后去保护。参见，例如，“protective groups in organic synthesis”，第3版greene，t.w.和wuts，p.g.编辑，john wiley&sons，new york：1999。肽可以使用标准方法诸如反相hplc纯化。如果需要，可以使用已知的方法诸如反相hplc进行非对映体肽的分离。如果需要，可以将制剂冻干，随后溶解在合适的溶剂(例如，水)中。可以使用碱诸如naoh将所得溶液的ph调节至例如生理ph。如果需要，肽制剂可以通过质谱法来表征，例如，以确认质量和/或二硫键的形成。参见，例如，mallik，2005和katragadda，2006。
[0384]
可以通过添加诸如聚乙二醇(peg)的分子来修饰坎普他汀类似物，以稳定该化合物，降低其免疫原性，增加其在体内的寿命，增加或降低其溶解度，和/或增加其降解抗性。聚乙二醇化的方法是本领域众所周知的(veronese，f.m.和harris，adv.drug deliv.rev.54，453-456，2002；davis，f.f.，adv.drug deliv.rev.54，457-458，2002)；hinds，k.d.和kim，s.w.adv.drug deliv.rev.54，505-530(2002；roberts，m.j.，bentley，m.d.和harris，j.m.adv.drug deliv.rev.54，459-476；2002)；wang，y.s.等人adv.drug deliv.rev.54，547-570，2002)。多种聚合物诸如peg和改性peg(包括多肽可以方便地附接到其上的衍生化peg)在nektar advanced pegylation 2005-2006 product catalog，nektar therapeutics，san carlos，ca中有描述，其还提供了适当缀合程序的详情。
[0385]
在一些实施方案中，seq id no：9-36中的任一个的坎普他汀类似物在n端、c端或两处延伸一个或多个氨基酸，其中所述氨基酸中的至少一个具有包含反应性官能团的侧
链，所述反应性官能团诸如伯胺或仲胺、巯基、羧基(其可以作为羧酸根基团存在)、胍基、酚基、吲哚环、硫醚或咪唑环，其利于与反应性官能团缀合以将peg附接到坎普他汀似物上。在一些实施方案中，坎普他汀类似物包含具有包含伯胺或仲胺的侧链的氨基酸，例如lys残基。例如，将lys残基或包含lys残基的序列添加在本文所述的坎普他汀类似物(例如，包含seq id no：9-36中的任一者的坎普他汀类类似物)的n端和/或c端。
[0386]
在一些实施方案中，lys残基被刚性或柔性间隔区与坎普他汀类似物的环状部分隔开。间隔区可以例如包含经取代的或未取代的、饱和或不饱和的烷基链、低聚(乙二醇)链和/或其他部分，例如，如本文关于接头所述。该链的长度可以是例如2至20个碳原子。在其他实施方案中，间隔区是肽。肽间隔区的长度可以是例如1至20个氨基酸，例如长度是4至20个氨基酸。例如，合适的间隔区可包含多个gly残基、ser残基或两者或由多个gly残基、ser残基或两者组成。任选地，具有包含伯胺或仲胺的侧链的氨基酸和/或间隔区中的至少一个氨基酸是d-氨基酸。可以使用多种聚合物骨架或支架中的任何一种。例如，聚合物骨架或支架可以是聚酰胺、多糖、聚酸酐、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、多肽、聚环氧乙烷或树枝状聚合物。合适的方法和聚合物骨架例如在wo98/46270(pct/us98/07171)或wo98/47002(pct/us98/06963)中有描述。在一个实施方案中，聚合物骨架或支架包含多个反应性官能团，诸如羧酸、酸酐或琥珀酰亚胺基团。聚合物骨架或支架与坎普他汀类似物反应。在一个实施方案中，坎普他汀类似物包含许多不同反应性官能团中的任何一种，诸如羧酸、酸酐或琥珀酰亚胺基团，所述反应性官能团与聚合物骨架上的适当基团反应。可替代地，可以相互连接形成聚合骨架或支架的单体单元首先与坎普他汀类似物反应，然后聚合所得单体。在另一个实施方案中，短链预聚合、官能化，然后不同组成的短链混合物组装成更长的聚合物。
[0387]
在一些实施方案中，坎普他汀类似物部分附接在线性peg的每个末端。可以使用在链的每个末端都具有反应性官能团的双官能peg，例如，如本文所述。在一些实施方案中，反应性官能团是相同的，而在一些实施方案中，在每个末端存在不同的反应性官能团。
[0388]
一般而言并且在本文描绘的化合物中，聚乙二醇部分与氧原子一起绘制在重复单元的右侧或重复单元的左侧。在只绘制一个取向的情况下，本公开涵盖给定化合物或种类的聚乙二醇部分的两个取向(即(ch2ch2o)n和(och2ch2)n)，或者在化合物或种类含有多个聚乙二醇部分的情况下，本公开涵盖所有取向的组合。
[0389]
在一些实施方案中，双官能线性peg包含在其每个末端都包含反应性官能团的部分。反应性官能团可以是相同的(同双官能)或不同的(异双官能)。在一些实施方案中，双官能peg的结构可以是对称的，其中相同的部分用于将反应性官能团连接到-(ch2ch2o)n链的每个末端的氧原子上。在一些实施方案中，使用不同的部分将两个反应性官能团连接到分子的peg部分。下面描绘了示例性双官能peg的结构。为了说明的目的，描绘了其中反应性官能团包含nhs酯的化学式，但是也可以使用其他反应性官能团。
[0390]
在一些实施方案中，双官能线性peg具有式a：
[0391][0392]
其中每个t和“反应性官能团”独立地如下定义，并在本文的类别和亚类中有描述，
并且n如上定义并在本文的类别和亚类中有描述。
[0393]
每个t独立地是共价键或c
1-12
直链或支链烃链，其中t的一个或多个碳单元任选地且独立地被-o-、-s-、-n(r
x
)-、-c(o)-、-c(o)o-、-oc(o)-、-n(r
x
)c(o)-、-c(o)n(r
x
)-、-s(o)-、-s(o)
2-、-n(r
x
)so
2-或-so2n(r
x
)-置换；并且
[0394]
每个r
x
独立地是氢或c
1-6
脂肪族。
[0395]
反应性官能团具有结构-coo-nhs。
[0396]
式a的示例性双官能peg包括：
[0397][0398]
在一些实施方案中，坎普他汀类似物上的官能团(例如，胺基、羟基或硫醇基)与具有如本文所述的“反应性官能团”的含peg的化合物反应，以生成此类缀合物。举例来说，式i可形成具有以下结构的坎普他汀类似物缀合物：
[0399][0400]
其中，表示胺基在坎普他汀类似物上的附接点。在某些实施方案中，胺基是赖氨酸侧链基团。
[0401]
在某些实施方案中，此类缀合物的peg组分的平均分子量为约5kd、约10kd、约15kd、约20kd、约30kd或约40kd。在某些实施方案中，此类缀合物的peg组分的平均分子量为约40kd。
[0402]
术语“双官能”或“双官能化”在本文中有时用于指包含两个与peg联接的坎普他汀类似物部分的化合物。此类化合物可以用字母“bf”来表示。在一些官能化化合物是对称的。在一些实施方案中，peg与双官能化化合物的每个坎普他汀类似物部分之间的联接是相同的。在一些实施方案中，peg与双官能化化合物的坎普他汀类似物之间的每个联接包含氨基甲酸酯。在一些实施方案中，peg与双官能化化合物的坎普他汀类似物之间的每个联接包含氨基甲酸酯，不包含酯。在一些实施方案中，双官能化化合物的每个坎普他汀类似物经由氨基甲酸酯直接联接到peg上。在一些实施方案中，双官能化化合物的每个坎普他汀类似物经由氨基甲酸酯直接联接到peg上，并且双官能化化合物具有结构：
[0403][0404]
在本文所述的化学式和实施方案的一些实施方案中，
[0405]
表示在具有以下结构的坎普他汀类似物中赖氨酸侧链基团的附接点：
[0406][0407]
其中符号表示一个化学部分与分子或化学式的其余部分的附接点。
[0408]
在一些实施方案中，包含一个或多个反应性官能团的peg可获自例如nof america corp.white plains，ny或boc sciences 45-16 ramsey road shirley，ny 11967，usa等，或者可使用本领域已知的方法制备。
[0409]
在一些实施方案中，使用接头连接本文所述的坎普他汀类似物和本文所述的peg。用于连接坎普他汀类似物和peg的合适接头在上文和本文的类别和亚类中有广泛描述。在一些实施方案中，接头具有多个官能团，其中一个官能团连接到坎普他汀类似物，另一个官能团连接到peg部分。在一些实施方案中，接头是双官能化合物。在一些实施方案中，接头具有nh2(ch2ch2o)nch2c(＝o)oh的结构，其中n为1至1000。在一些实施方案中，接头是8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(aeeac)。在一些实施方案中，接头被活化以与坎普他汀类似物的聚合物部分或官能团缀合。例如，在一些实施方案中，aeeac的羧基在与赖氨酸基团侧链的胺基缀合之前被活化。
[0410]
在一些实施方案中，坎普他汀类似物上的合适官能团(例如，胺基、羟基、硫醇或羧酸基团)用于直接或经由接头与peg部分缀合。在一些实施方案中，坎普他汀类似物通过胺基经由接头与peg部分缀合。在一些实施方案中，胺基是氨基酸残基的α-氨基。在一些实施方案中，胺基是赖氨酸侧链的胺基。在一些实施方案中，坎普他汀类似物通过赖氨酸侧链的氨基(ε-氨基)经由具有nh2(ch2ch2o)nch2c(＝o)oh结构的接头与peg部分缀合，其中n为1至1000。在一些实施方案中，坎普他汀类似物通过赖氨酸侧链的氨基经由aeeac接头缀合至peg部分。在一些实施方案中，在缀合后，nh2(ch2ch2o)nch2c(＝o)oh接头在坎普他汀赖氨酸侧链上引入-nh(ch2ch2o)nch2c(＝o)一部分。在一些实施方案中，在缀合后aeeac接头在坎普他汀赖氨酸侧链上引入-nh(ch2ch2o)2ch2c(＝o)-部分。
[0411]
在一些实施方案中，坎普他汀类似物经由接头缀合至peg部分，其中接头包含aeeac部分和氨基酸残基。在一些实施方案中，坎普他汀类似物经由接头缀合至peg部分，其中接头包含aeeac部分和赖氨酸残基。在一些实施方案中，坎普他汀类似物的c端连接至aeeac的氨基，并且aeeac的c端连接至赖氨酸残基。在一些实施方案中，坎普他汀类似物的c端连接至aeeac的氨基，并且aeeac的c端连接至赖氨酸残基的α-氨基。在一些实施方案中，坎普他汀类似物的c端连接至与aeeac的氨基，aeeac的c端连接至赖氨酸残基的α-氨基，并且peg部分通过所述赖氨酸残基的ε-氨基缀合。在一些实施方案中，赖氨酸残基的c端是经修饰的。在一些实施方案中，赖氨酸残基的c端通过酰胺化进行修饰。在一些实施方案中，坎
普他汀类似物的n端是经修饰的。在一些实施方案中，坎普他汀类似物的n端是经乙酰化的。
[0412]
在某些实施方案中，坎普他汀类似物可表示为m-aeeac-lys-b
2，
，其中b2是封闭部分，例如nh2，m表示seq id no：9-36中的任一者，条件是seq id no：9-36中的任一者的c端氨基酸经由与aeeac-lys-b2结合的肽键联接。单官能或多官能(例如，双官能)peg的nhs部分与赖氨酸侧链的游离胺反应，生成单官能化(一个坎普他汀类似物部分)或多官能化(多个坎普他汀类似物部分)的聚乙二醇化坎普他汀类似物。在各种实施方案中，可以使用包含含有反应性官能团的侧链的任何氨基酸来代替lys(或者除了lys之外)。包含合适的反应性官能团的单官能或多官能peg可以以类似于nhs-酯活化的peg与lys反应的方式与此类侧链反应。
[0413]
关于上述化学式和结构中的任一者，应该理解的是，明确地公开了其中坎普他汀类似物组分包含本文所述的任何坎普他汀类似物，例如seq id no：9-36的任何坎普他汀类似物的实施方案。例如，但不限于，坎普他汀类似物可包含seq id no：28的氨基酸序列。图2中描绘了一种示例性的聚乙二醇化坎普他汀类似物，其中坎普他汀类似物组分包含seq id no：28的氨基酸序列。应当理解，如本文所述，在各种实施方案中，peg部分可以具有各种不同的分子量或平均分子量。在某些实施方案中，坎普他汀类似物是聚乙二醇西他可普兰(pegcetacoplan)(“apl-2”)，具有图2化合物的结构，n为约800至约1100且peg的平均分子量为约40kd。聚乙二醇西他可普兰也称为聚(氧-1，2-乙二基)α-氢-ω-羟基-15，15
’‑
二酯，具有n-乙酰基-l-异亮氨酰-l-半胱氨酰-l-缬氨酰-1-甲基-l-色氨酰-l-谷氨酰胺酰-l-α-天冬氨酰-l-色氨酰甘氨酰-l-丙氨酰-l-组氨酰-l-精氨酰-l-半胱氨酰-l-苏氨酰-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-n
6-羧基-l-环状赖氨酰胺(2
‑‑
＞12)-(二硫化物)；或o，o
′‑
双[(s2，s
12-环{n-乙酰基-l-异亮氨酰-l-半胱氨酰-l-缬氨酰-1-甲基-l-色氨酰-l-谷氨酰-l-α-天冬氨酰-l-色氨酰甘氨酰-l-丙氨酰-l-组氨酰-l-精氨酰-l-半胱氨酰-l-苏氨酰-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-l-赖氨酰胺})-n
6.15-羰基]聚乙二醇(n＝800-1100)。在例如wo 2012/155107和wo 2014/078731中描述了另外的坎普他汀类似物。
[0414]
在一些实施方案中，本文所述的坎普他汀类似物以约800mg至约1200mg，例如约1060mg至约1100mg，例如约1070mg至约1090mg，例如约1075mg至约1085mg，例如约1080mg的剂量，每周或每3天施用两次，持续约4周、约8周、约12周、约16周、约20周、约24周、约28周、约32周、约36周、约40周、约44周、约48周、约52周、约1.2年、1.4年、1.6年、1.8年、2年、3年、4年、5年或更长时间。
[0415]
在一些实施方案中，将包含一种或多种抑制性rna(例如，本文所述的和sirna或mirna)，或包含含有编码本文所述的sirna或mirna的核苷酸序列的载体的组合物与坎普他汀类似物组合施用给受试者，使得坎普他汀类似物和/或抑制性rna组合物以较低的频率和/或较低的剂量施用。在一些实施方案中，将包含一种或多种抑制性rna(例如，本文所述的和sirna或mirna)或包含含有编码本文所述的sirna或mirna的核苷酸序列的载体的组合物与坎普他汀类似物组合施用给受试者，使得施用坎普他汀类似物每周一次、每2周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次或更长时间一次，剂量为约800mg至约1200mg，例如约1060mg至约1100mg，例如约1070mg至约1090mg，例如约1075mg至约1085mg，例如约1080mg。
[0416]
在一些实施方案中，补体抑制剂是抗体，例如，抗c3和/或抗c5抗体，或其片段。在
一些实施方案中，抗体片段可用于抑制c3或c5激活。片段化的抗c3或抗c5抗体可以是fab’、fab’(2)、fv或单链fv。在一些实施方案中，抗c3或抗c5抗体是单克隆的。在一些实施方案中，抗c3或抗c5抗体是多克隆的。在一些实施方案中，抗c3或抗c5抗体是去免疫的。在一些实施方案中，抗c3或抗c5抗体是全人单克隆抗体。在一些实施方案中，抗c5抗体是依库珠单抗(eculizumab)。在一些实施方案中，补体抑制剂是抗体，例如，抗c3和/或抗c5抗体，或其片段。
[0417]
在一些实施方案中，补体抑制剂是多肽抑制剂和/或核酸适体(参见，例如，美国公布第20030191084号)。示例性的多肽抑制剂包括降解c3或c3b的酶(参见，例如，美国专利第6,676,943号)。另外的多肽抑制剂包括微小因子h(参见，例如，美国公布第20150110766号)、来自金黄色葡萄球菌的efb蛋白或补体抑制剂(scin)蛋白，或它们的变体或衍生物或模拟物(参见，例如，美国公布20140371133)。
[0418]
多种其他补体抑制剂也可用于本公开的各种实施方案中。在一些实施方案中，补体抑制剂是天然存在的哺乳动物补体调控蛋白或其片段或衍生物。例如，补体调控蛋白可以是cr1、daf、mcp、cfh或cfi。在一些实施方案中，补体调节多肽是在其天然存在状态下通常与膜结合的多肽。在一些实施方案中，使用此类多肽的缺少一些或全部跨膜和/或胞内结构域的片段。例如，也可以使用补体受体1(scr1)的可溶形式。例如，可以使用称为tp10或tp20(avant therapeutics)的化合物。也可以使用c1抑制剂(c1-inh)。在一些实施方案中，使用可溶性补体控制蛋白，例如cfh。
[0419]
也可以使用c1抑制剂。例如，美国专利第6,515,002号描述了抑制c1的化合物(呋喃基脒和噻吩基脒、杂环脒和胍)。美国专利第6,515,002号和第7,138,530号描述了抑制c1的杂环脒。美国专利第7,049,282号描述了抑制经典途径激活的肽。某些肽包含以下或由以下组成：wesngqpenn(seq id no：73)或ktiskakgqprepqvyt(seq id no：74)或与之具有显著序列同一性和/或三维结构相似性的肽。在一些实施方案中，这些肽与igg或igm分子的一部分相同或基本上相同。美国专利第7,041,796号公开了c3b/c4b补体受体样分子及其抑制补体激活的用途。美国专利第6,998,468号公开了补体激活的抗c2/c2a抑制剂。美国专利第6,676,943号公开了来自肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)的人补体c3降解蛋白。
[0420]
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献，包括基因库登录号，都通过引用整体并入。另外，材料、方法和实例仅为说明性，并非旨在为限制性的。除非另外定义，本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或试验中，但本文描述了合适的方法和材料。
[0421]
本公开通过以下实施例进一步说明。提供这些实施例仅用于说明目的。不得将它们解释为以任何方式限制本公开的范围或内容。
[0422]
xi.范例
[0423]
实施例1：使用sirna敲低hela细胞中的c3表达
[0424]
细胞培养
[0425]
从atcc(与lgc standards，wesel，germany合作的atcc，，产品目录号atcc-crm-ccl-2)获得hela细胞并在加湿培养箱中在37℃下在含5％co2的气氛中，在补充至含有10％胎牛血清(#1248d，biochrom gmbh，berlin，germany)和100u/ml青霉素/100μg/ml链霉素(#
a2213，biochrom gmbh，berlin，germany)的ham f12(#fg0815，biochrom，berlin，germany)中培养。为了用sirna转染hela细胞，将细胞以15,000个细胞/孔的密度接种到96孔组织培养板(#655180，gbo，germany)中。
[0426]
sirna
[0427]
设计并合成177种sirna来靶向mrna转录物的不同区域。在该实验中，每种sirna的有义链含有18个与c3转录物上的靶区序列(seq id no：75)相同的核苷酸并且在3’末端含有一个附加腺嘌呤核苷酸。另外，在该实验中，反义链含有18个与c3转录物上的靶区序列(seq id no：75)互补的核苷酸，并且在5’末端含有一个附加尿嘧啶核苷酸且在3’末端含有2个附加尿嘧啶核苷酸。
[0428]
在该实验中，sirna含有对有义链的修饰，包括以下修饰模式：
[0429]
xsxsxfxxxxfxfxfxxxfxxxxxfxa
[0430]
反义链包括以下修饰模式：
[0431]
usxfsxxxxxxxxxxxxfxxxxxsusu
[0432]
其中“x”表示任何核苷酸；小写字母表示用2
′‑
o-甲基修饰的核苷酸；“xf”表示用2
′‑
氟基团修饰的核苷酸(“x”可以是任何核苷酸)。例如，“af”表示用2
′‑
氟基团修饰的腺嘌呤核苷酸。“s”表示硫代磷酸酯键。
[0433]
sirna的转染和c3活性测定-双剂量实验
[0434]
sirna的转染用lipofectamine rnaimax(invitrogen/life technologies，karlsruhe，germany)根据制造商的反向转染说明进行。在该实验中，分别用10nm和0.5nm的sirna进行双剂量筛选，一式四份。靶向aha1的sirna同时用作c3靶mrna表达的非特异性对照和分析关于aha1 mrna水平的转染效率的阳性对照。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶用作模拟转染。
[0435]
与sirna一起孵育24小时后，去除培养基并将细胞在150μl培养基-溶解混合物(1体积溶解混合物，2体积细胞培养基)中溶解，然后在53℃下孵育30分钟。根据制造商的说明，用针对人c3的探针组(登录号-#nm_000064，介于序列的碱基106与碱基907之间)进行bdna测定(thermofisher quantigene rna测定)，该探针组由thermofisher scientific设计并由metabion international ag，planegg，germany合成。在室温下于黑暗中孵育30分钟后，使用1420发光计数器(wallac victor light，perkin elmer，rodgau-j
ü
gesheim，germany)读取发光值。
[0436]
通过与aha1探针组杂交，另外两个靶非特异性对照(对于萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶而言)用作aha1 mrna水平的对照。对于双剂量筛选中的每张96孔板和两种剂量的转染效率通过将具有aha1-sirna的孔中的aha1水平
[0437]
(归一化为gapdh)与用对照获得的aha1水平相关联来计算。siaha1在10nm剂量下的转染效率为约90％，并且在0.5nm剂量下的转染效率为约85％。
[0438]
sirna的活性通过各自靶标的最低荧光或最低百分比mrna浓度来度量。对于每个孔，将靶mrna水平归一化为各自的gapdh mrna水平。将给定sirna的活性表示为相对于对照孔的平均靶mrna浓度(归一化为gapdh mrna)，经过处理的细胞中各自靶标的百分比mrna浓度(归一化为gapdh mrna)。
[0439]
基于活性对前24种sirna的双剂量筛选结果示于下表9。这些sirna的序列示于下
表10。
[0440]
表9：
[0441][0442][0443]
表10：
[0444]
[0445][0446]
剂量应答实验
[0447]
选择在两种剂量下都具有最佳活性的前12种sirna在剂量应答实验(drc)中进行测试。用一式四份转染的10个浓度的sirna进行剂量应答实验，在6倍稀释步骤中从100nm开始至～10fm。模拟转染的细胞在drc实验中用作对照。
[0448]
对于每个孔，将靶mrna水平归一化为各自的gapdh mrna水平。将给定sirna的活性表示为相对于模拟转染孔(drc)的平均靶mrna浓度(归一化为gapdh mrna)，经过处理的细胞中各自靶标的百分比mrna浓度(归一化为gapdh mrna)。
[0449]
来自drc实验的ic50和ic80值以及来自双剂量实验(10nm剂量)的最大kd结果示于下表11：
[0450]
表11：
[0451]
sirna idic50ic80最大kd(hela)90.751#不适用75％100.172#不适用77％230.77545.87379％
30.6464.03584％220.246442952.01073％200.395#不适用71％180.564#不适用78％40.20811.81281％10.08612.74481％120.349#不适用77％50.44514.09281％160.0876.18683％
[0452]
实施例2：使用sirna敲低hepg2细胞中的c3表达
[0453]
基于前50种sirna在hepg2细胞中展示出的活性(实施例1)，重复实施例1中的双剂量实验。
[0454]
从atcc(与lgc standards，wesel，germany合作的atcc，，产品目录号atcc-hb-8065)获得hepg2细胞并在加湿培养箱中在37℃下在含5％co2的气氛中，在补充至含有10％胎牛血清(#1248d，biochrom gmbh，berlin，germany)、1x非必需氨基酸(#k0293；biochrom，berlin，germany)、4mm l-谷氨酰胺(#k0283，biochrom，berlin，germany)和100u/ml青霉素/100μg/ml链霉素(#a2213，biochrom gmbh，berlin，germany)的mem eagle(#m2279，sigma-aldrich，germany)中培养。
[0455]
sirna的转染和c3活性测定-双剂量实验
[0456]
为了用sirna转染hepg2细胞，将细胞以15,000个细胞/孔的密度接种到胶原蛋白包被的96孔组织培养板(#655150，gbo，germany)中。sirna的转染直接在接种后用lipofectamine rnaimax(invitrogen/life technologies，karlsruhe，germany)根据制造商的反向转染说明进行。在该实验中，分别用10nm和0.1nm的sirna进行双剂量筛选，一式四份。靶向aha1的sirna同时用作c3靶mrna表达的非特异性对照和分析关于aha1 mrna水平的转染效率的阳性对照。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶用作模拟转染。
[0457]
与sirna一起孵育24小时后，去除培养基并将细胞在150μl培养基-溶解混合物(1体积溶解混合物，2体积细胞培养基)中溶解，然后在53℃下孵育30分钟。根据制造商的说明，用针对人c3的探针组(登录号-#nm_000064，介于序列的碱基106与碱基907之间)进行bdna测定(thermofisher quantigene rna测定)，该探针组由thermofisher scientific设计并由metabion international ag，planegg，germany合成。在室温下于黑暗中孵育30分钟后，使用1420发光计数器(wallac victor light，perkin elmer，rodgau-j
ü
gesheim，germany)读取发光值。
[0458]
aha1-sirna用作c3 mrna表达的非特异性对照并且用作阳性对照以通过与aha1探针组杂交测量aha1 mrna水平来分析转染效率。所用的aha-1sirna以前是从一大组候选sirna中选出的，并且已知在体外和体内都极具活性。通过分析与非特异性对照相比，用aha1-sirna时的aha1敲低(归一化为gapdh)来计算每张96孔板的转染效率。将aha1-sirna(归一化为gapdh)与用对照获得的aha1水平相关联。siaha1在10nm剂量下的转染效率为约90％，并且在0.5nm剂量下的转染效率为约85％。
[0459]
sirna的活性通过各自靶标的荧光或百分比mrna浓度来度量。对于每个孔，将靶
mrna水平归一化为各自的gapdh mrna水平。将给定sirna的活性表示为相对于对照孔的平均靶mrna浓度(归一化为gapdh mrna)，经过处理的细胞中各自靶标的百分比mrna浓度(归一化为gapdh mrna)。
[0460]
基于活性对前12种sirna的双剂量筛选结果对于10nm和0.1nm剂量分别示于下表12和表13。
[0461]
表12：
[0462][0463][0464]
表13：
[0465]
sirna id10nm下的kd0.1nm下的kd1088％84％192％68％2293％67％1692％67％494％66％991％63％589％55％1287％53％392％52％684％49％2088％44％1890％37％
[0466]
实施例3：使用具有各种修饰模式的sirna在hepg2细胞中的c3敲低表达
[0467]
测试了来自实施例1和实施例2的前6种sirna的修饰。
[0468]
细胞培养
[0469]
从atcc(与lgc standards，wesel，germany合作的atcc，，产品目录号atcc-hb-8065)获得hepg2细胞并在加湿培养箱中在37℃下在含5％co2的气氛中，在补充至含有10％胎牛血清(#1248d，biochrom gmbh，berlin，germany)、1x非必需氨基酸(#k0293；biochrom，berlin，germany)、4mm l-谷氨酰胺(#k0283，biochrom，berlin，germany)和100u/ml青霉素/100μg/ml链霉素(#a2213，biochrom gmbh，berlin，germany)的mem eagle(#m2279，sigma-aldrich，germany)中培养。
[0470]
sirna
[0471]
基于来自实施例1和实施例2的就活性而言前几种sirna的核苷酸序列(sirna id：1、4、9、10、16和22)设计并合成具有不同修饰模式的sirna。针对前几种sirna核苷酸序列中的每一种设计并合成5个“变体”，并根据所做的修饰将每个双链体标识为“变体1”、“变体2”、“变体3”、“变体4”、“变体5”。将来自实施例1和实施例2的sirna(sirna id：1、4、9、10、16和22)标识为“变体0”。
[0472]
使用每种sirna id 1、4、9、10、16和22的有义链的以下修饰模式(5’至3’)：
[0473]
xsxsxfxxxxfxfxfxxxfxxxxxfxa(在“变体0”以及“变体1”和“变体5”中使用的模式)
[0474]
xfsxsxfxxfxxfxxfxxfxxfxxfxxfxaf(在“变体2”、“变体3”和“变体4”中使用的模式)
[0475]
使用反义链的以下修饰模式(5’至3’)：
[0476]
usxfsxxxxxxxxxxxxfxxxxxsusu(在“变体0”中使用的模式)
[0477]
usxfsxxxxxxxxxxxxfxxxxxsxsx(在“变体1”和“变体3”中使用的模式；是与“变体0”中使用的相同模式，除了最后两个核苷酸与c3 mrna转录物互补，即seq id no：75)
[0478]
usxfsxxfxxfxxfxxfxxfxxfxxfxxfxsxsx(在“变体2”中使用的模式)
[0479]
usxfsxxxxfxxxxxxxxfxxfxxxsxsx(在“变体4”和“变体5”中使用的模式)
[0480]
其中“x”表示任何核苷酸；小写字母表示用2
′‑
o-甲基修饰的核苷酸；“xf”表示用2
′‑
氟基团修饰的核苷酸(“x”可以是任何核苷酸)。例如，“af”表示用2
′‑
氟基团修饰的腺嘌呤核苷酸。“s”表示硫代磷酸酯键。
[0481]
剂量应答实验
[0482]
sirna的转染用lipofectamine rnaimax(invitrogen/life technologies，karlsruhe，germany)根据制造商的反向转染说明进行。
[0483]
在hepg2细胞中使用剂量应答实验(drc)测试每种sirna。已知会敲低c3表达的另外两种sirna(sirna id 26和27)用作阳性对照。
[0484]
用一式四份转染的10个浓度的sirna进行剂量应答实验，在6倍稀释步骤中从100nm开始至～10fm。模拟转染的细胞用作阴性对照。
[0485]
对于每个孔，将靶mrna水平归一化为各自的gapdh mrna水平。将给定sirna的活性表示为相对于模拟转染孔(drc)的平均靶mrna浓度(归一化为gapdh mrna)，经过处理的细胞中各自靶标的百分比mrna浓度(归一化为gapdh mrna)。
[0486]
来自drc实验的ic50、ic80值和最大kd示于下表14。这些sirna的序列示于下表15。
[0487]
表14：
[0488][0489][0490]
表15：
[0491][0492]
[0493][0494]
表14中的ic50和ic80值标示修饰模式在表现上有所不同。例如，sirna id：32(使用“变体5”中鉴定的修饰模式)具有比sirna id：1(“变体0”)、28(“变体1”)、29(“变体2”)、30(“变体3”)和31(“变体4”)更好的活性(ic50和ic80值分别为0.018nm和0.108nm)，即使这些sirna中的每一个都基于相同的核苷酸序列，并且靶向c3转录物的相同区域。
[0495]
另外，修饰模式的表现(即，不同的变体)似乎因sirna核苷酸序列(即，c3转录物的靶区域)而异。例如，经证实在基于sirna 1的核苷酸序列的sirna中“变体5”在c3敲低方面最有效(参见sirna id：32(变体5)与例如sirna id：1(变体0)相比)，而在基于sirna 22的核苷酸序列的sirna中，“变体0”似乎在c3敲低方面最有效(参见sirna id：22(变体0)与例如sirna：55(变体3)相比)。
[0496]
实施例4：非人灵长类动物中sirna 58的体内评价
[0497]
sirna构建体
[0498]
选择来自实施例3的sirna 53并如下所述进一步修饰以生成sirna 58。
[0499]
表16：
[0500][0501]
另外，sirna经由位于sirna 58有义链5’末端的nhc6接头缀合至下面所示的galnac结构。
[0502][0503][0504]
然后在非人灵长类动物中对经修饰的sirna(下文称为“sirna 58”)进行评价。
[0505]
研究设计
[0506]
第1天，对初始雄性食蟹猴(每组中n＝3)皮下(sc)施用单剂量的3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg sirna 58或媒介物(磷酸盐缓冲盐水)。
[0507]
计划在第-5、-1、3、8、15、22、29、40、57、67、82、97、112、127、142、157、172和184天收集血清样品(其中负值对应于注射sirna 58或赋形剂之前的天数)。使用elisa测定法测量血清中的c3蛋白水平。另外，还分析了血清样品的补体旁路活性(ah50)。将第-1天的值用作基线。
[0508]
在第15、46和79天进行肝脏穿刺活检。使用定量pcr测定法测量样品中的c3 mrna水平。在这些实验中，将c3 mrna水平归一化为actb mrna水平。
[0509]
结果
[0510]
图3呈现了每个组给药后长达67天的血清c3蛋白水平的时间过程。结果指示，到第29天与基线值相比，单sc剂量的sirna 58使血清c3蛋白水平在3mg/kg剂量下降低77％，在10mg/kg剂量下降低85％，并且在30mg/kg剂量下降低90％，到第15天接近这些水平的降低很明显。另外，图3中的数据显示减少持续到第67天。
[0511]
图4显示，与媒介物对照相比，到第15天，单剂量的sirna 58引起肝脏c3 mrna在3mg/kg剂量下降低89％，在10mg/kg剂量下降低97％，并且在30mg/kg剂量下降低99％。在第46天持续降低(图5)。
[0512]
图6呈现了截至第67天收集的血清中补体旁路途径(ah50)活性水平的时间过程。结果指示，到第29天与基线值相比，单sc剂量的sirna 58使补体旁路途径活性在3mg/kg剂量下降低65％，在10mg/kg剂量下降低82％，并且在30mg/kg剂量下降低92％，到第15天降低达到这些水平。另外，降低的活性在第67天持续，其中与基线值相比，活性在3mg/kg剂量下降低68％，在10mg/kg剂量下降低91％，并且在30mg/kg剂量下降低98％。
[0513]
实施例5：非人灵长类动物中sirna 60的体内评价
[0514]
sirna构建体
[0515]
选择来自实施例3的sirna 32并如下所述进一步修饰以生成sirna 60。
[0516]
表17：
[0517][0518]
另外，sirna经由位于sirna 60有义链5’末端的nhc6接头缀合至下面所示的galnac结构。
[0519][0520]
在非人灵长类动物中对经修饰的sirna(下文称为“sirna 60”)进行评价。
[0521]
研究设计
[0522]
第1天，对初始雄性食蟹猴(每组中n＝3)皮下(sc)施用单剂量的3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg sirna 60或媒介物(磷酸盐缓冲盐水)。
[0523]
在第-5、-1、3、8、15、22、29、40、57、67、82、97、112、127、142、157、172和184天收集血清样品(其中负值对应于注射sirna 60或赋形剂之前的天数)。使用elisa测定法测量血清中的c3蛋白水平。另外，还分析了血清样品的补体旁路活性(ah50)。将第-1天的值用作基线。
[0524]
在第15、46和79天进行肝脏穿刺活检。使用定量pcr测定法测量样品中的c3 mrna水平。在这些实验中，将c3 mrna水平归一化为actb mrna水平。
[0525]
实施例6：sirna 58的脱靶分析和安全性
[0526]
分析sirna 58的有义链和反义链的核苷酸序列的潜在脱靶活性(lindow等人，2012)。分析成熟人rna和初级人rna中有义链和反义链的潜在脱靶活性。
[0527]
方法
[0528]
分析的序列如下：
[0529]
反义(引导)链：5
’‑
uguagguucauguaguuggcu-3’(seq id no：321)
[0530]
有义(乘客)链：5
’‑
ccaacuacaugaaccuaca-3’(seq id no：147)
[0531]
反义链(成熟人rna)：为了鉴定潜在脱靶基因，使用fasta包(v36；pearson 2000)中的smith-waterman空位局部比对(ssearch)，用以下参数进行相似性搜索：
[0532]-e e值小于5000。e对应于在搜索这种大小的数据库时，人们可以期望偶然看到的搜索命中的数目；使用相对高的数目以确保检测到所有潜在的杂交脱靶序列。
[0533]-w(比对侧翼的位置数目)设为5
[0534]-n针对核酸搜索
[0535]-f和-g针对空位产生和延伸罚分设为1000以避免空位比对
[0536]
ssearch36-n-w 5-e 5000-f 1000-g 1000 query refmrna.fa
[0537]
反义链(初级人rna)：为了鉴定在细胞核内具有潜在脱靶效应的基因，探索了寡核苷酸序列与初级rna(未剪切并含有内含子)的匹配。具体地，这些相似性搜索是使用fasta包(v36；pearson 2000)中与人类基因组(版本hg38)的smith-waterman空位局部比对(ssearch)，用以下参数进行的：
[0538]-e e值小于5000。e对应于在搜索这种大小的数据库时，人们可以期望偶然看到的搜索命中的数目；使用相对高的数目以确保检测到所有潜在的杂交脱靶序列。
[0539]-w(比对侧翼的位置数目)设为5
[0540]-n针对核酸搜索
[0541]-f和-g针对空位产生和延伸罚分设为1000以避免空位比对
[0542]
ssearch36-n-w 5-e 5000-f 1000-g 1000 query refgene.fa
[0543]
基因组比对可以鉴定在参考基因组中发现每个序列的位置；然而，参考基因组本身不含基因和基因体的定位。因此，为了获得关于哪些基因具有杂交潜力的信息，在比对后，将命中的ssearch基因组坐标转换为bed文件格式，并使用bedtools(v2.28.0)intersect对其基因的基因内命中进行注释。对于gencodev32和hg38从ucsc基因组浏览器的表查看器的“基因和基因预测表”中获得基因位置。以下命令用于bedtools的注释：
[0544]
bedtools intersect-a hitbedfile.bed-b genebedfile.bed-wo
[0545]-a和-b标注输入
[0546]-wo写出获得基因名称所需的命中和完整注释的原始位置
[0547]
有义链(成熟人rna)：为了鉴定潜在脱靶基因，使用fasta包(v36；pearson 2000)中的smith-waterman空位局部比对(ssearch)，用以下参数进行相似性搜索：
[0548]-e e值小于5000。e对应于在搜索这种大小的数据库时，人们可以期望偶然看到的搜索命中的数目；使用相对高的数目以确保检测到所有潜在的杂交脱靶序列。
[0549]-w(比对侧翼的位置数目)设为5
[0550]-n针对核酸搜索
[0551]-f和-g针对空位产生和延伸罚分设为1000以避免空位比对
[0552]
进行搜索以寻找具有以下特征的成熟rna序列：(1)超过11的最长不间断互补性(由于有义序列较短而从13减少)和超过16的匹配数目(2个或一个错配)，和/或(2)14或更多bp的不间断互补性和16个匹配(3个错配)。
[0553]
有义链(初级人rna)：为了鉴定在细胞核内具有潜在脱靶效应的基因，探索了寡核苷酸序列与初级rna(未剪切并含有内含子)的匹配。具体地，这些相似性搜索是使用fasta包(v36；pearson 2000)中与人类基因组(版本hg38)的smith-waterman空位局部比对(ssearch)，用以下参数进行的：
[0554]-e e值小于5000。e对应于在搜索这种大小的数据库时，人们可以期望偶然看到的搜索命中的数目；使用相对高的数目以确保检测到所有潜在的杂交脱靶序列。
[0555]-w(比对侧翼的位置数目)设为5
[0556]-n针对核酸搜索
[0557]-f和-g针对空位产生和延伸罚分设为1000以避免空位比对
[0558]
ssearch36-n-w 5-e 5000-f 1000-g 1000 query refgene.fa
[0559]
为了获得关于哪些基因具有其初级mrna受argonaut脱靶裂解的潜力的信息，在比
对后，将命中的ssearch基因组坐标转换为bed文件格式，并使用bedtools(v2.28.0)intersect对其基因的基因内命中进行注释。对于gencodev32和hg38从ucsc基因组浏览器的表查看器的“基因和基因预测表”中获得基因位置。以下命令用于bedtools的注释：
[0560]
bedtools intersect-a hitbedfile.bed-b genebedfile.bed-wo
[0561]-a和-b标注输入
[0562]-wo写出获得基因名称所需的命中和完整注释的原始位置
[0563]
基因分析：为了了解任何潜在的安全风险，进一步分析基于上述搜索鉴定的基因。评价了寡核苷酸药物积聚的主要器官-肝脏和肾脏-中的基因表达。使用gtex人类组织表达图谱(gtex consortium 2013)计算gtex中每个受试者每个基因的每百万log2转化转录物(tpm)表达值，并获得每个基因的中值。值：低于3指示非常低的表达，3-4指示低表达，4-6指示中等表达，且超过6指示高表达。
[0564]
接下来，进行对每个靶标完全敲低或部分敲低相关的疾病证据的搜索。为了在存在靶标完全敲低的情况下检查疾病的证据，使用在线人类孟德尔遗传数据库(omim；hamosh等人2002)以发现与罕见种系突变和人类遗传病症的关联。值得注意的是，前几种基因脱靶命中的大多数含有应该会严重降低rnai效率的多个错配。虽然大多数人类常染色体基因不是剂量特异性的(rice和mclysaght 2017)，并且一个等位基因的失活不会产生任何表型，但使用clingen(https：//search.clinicalgenome.org/)进行了剂量特异性效应证据的额外搜索，收集了关于单倍体不足和三倍体敏感性剂量特异性基因的信息。
[0565]
结果：
[0566]
反义链：sirna 58反义链的唯一完全互补命中是靶c3。初级和成熟rna中的次最佳匹配都具有3个或更多个错配，预计这些错配会显著降低杂交依赖性脱靶效应。前几种脱靶候选物中的大多数在肝脏和肾脏中表现出低表达和/或与人类遗传病症无关联。唯一的例外是rabl3，其中在单一家族中，特异性功能获得性截断突变与遗传性胰腺癌综合征相关。sirna 58对rabl3的潜在敲低预计不会模拟这种新型功能获得性突变。
[0567]
有义链：在与sirna 58的有义链互补的序列中，初级和成熟人rna之间没有完全互补的匹配。大多数与有义链具有互补性的基因既不在人的肝脏也不在肾脏中明显地表达，与已知的遗传病症也没有联系，包括与有义寡核苷酸只有一个错配的gpr173。
[0568]
实施例7：大鼠中sirna 59的体内评价
[0569]
sirna构建体
[0570]
如下所述对来自实施例3的sirna 33进一步修饰以生成sirna 59。
[0571]
表18：
[0572][0573]
另外，sirna经由位于sirna 59有义链5’末端的nhc6接头缀合至下面所示的galnac结构。
[0574][0575]
然后在sprague-dawley大鼠中对经修饰的sirna(下文称为“sirna 59”)进行评价。
[0576]
目的：本研究的目的是确定以单次皮下注射的形式施用给sprague-dawley大鼠时，三个剂量水平的sirna 59的血浆药代动力学(pk)和有限组织分布。本研究的第二个目的是比较三个剂量水平的sirna 59以单次皮下注射形式施用对比三天内施用等效剂量(每天施用一次)的药效作用。
[0577]
方法
[0578]
研究设计：
[0579]
表19：实验研究设计
[0580][0581][0582]a基线收集＝在第-5天和第-1天之间发生的一次收集
[0583]b第4、5、6和7组中的动物将接受3次每日剂量的ta(或安慰剂)以达到分别为3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg和30mg/kg的标示的总目标剂量。
[0584]c阴性对照(在大鼠中没有交叉反应并且不会使c3沉默的sirna)。sc＝皮下；pk＝药代动力学；pd＝药效学；ta＝试验品
[0585]
给药：给第1-3组和第8组的动物单次皮下注射pbs媒介物或3mg/kg、10mg/kg或30mg/kgsirna 59，分别以0.6mg/ml、2mg/ml和6mg/ml的浓度配制在pbs中，给药体积为5ml。给第4-7组的动物每天皮下注射3次10mg/ml sirna(-)对照，或1mg/ml、3.3mg/ml或10mg/ml sirna 59，分别以0.2mg/ml、0.6mg/ml和2mg/ml的浓度配制在pbs中，给药体积为5ml。
[0586]
取样：对于pd分析，在基线和给药后第3、8、15、22和29天收集血浆和血清样品。在给药后15分钟和1小时、4小时、8小时、24小时、48小时和72小时收集血浆样品。在给药后第3天和第30天进行尸体解剖时收集肝脏样品。
[0587]
生物分析方法：在confluence discovery technologies(mo，usa)使用双抗体夹心elisa试剂盒，根据制造商的说明(eagle biosciences；血浆稀释度为1∶10,000)分析血浆pd样品的c3蛋白浓度。
[0588]
在confluence discovery technologies(mo，usa)使用ap wieslab测定法(eagle biosciences，产品目录号compl ap330)分析血清pd样品的旁路途径(ap)补体激活。
[0589]
在epigendx(ma，usa)使用半验证rt-qpcr方法分析pd组织样品的c3 mrna水平。
[0590]
结果
[0591]
循环c3：在5个时间点采集血浆并评估c3浓度的变化。在各剂量组中看到对sirna的明显的剂量依赖性应答(图7)。到研究第8天，所有剂量组都达到c3蛋白减少的最大水平。在单剂量治疗组与qdx3等效剂量组之间血浆c3浓度数据是相当的。仅在3mg/kg剂量组中观察到血浆c3蛋白完全恢复到基线水平。10mg/kg和30mg/kg剂量组在第29天最后一次采血时似乎没有完全恢复到它们各自的基线c3蛋白水平。
[0592]
旁路途径补体活性：用单剂量sirna 59和赋形剂处理的每只动物以及经多剂量sirna(-)对照处理的动物的血清，用于ap wieslab测定法中，这是一种基于elisa的测定法，测量旁路途径激活后c5b-9的形成，以评估补体激活(图8)。图8示出了在用媒介物(a)、sirna(-)对照(b)、3mg/kg的sirna 59(c)、10mg/kg的sirna 59(d)和30mg/kg的sirna 59(e)皮下处理的动物血清中通过使用elisa(光密度测量；od)检测和量化可溶性c5b-9复合物对旁路途径活性的测量。数据表示平均值
±
sem(n＝3)。血清ap补体活性在对照组之间高度可变。来自高剂量sirna 59组的血清具有大约90％的旁路途径活性的平均降低，从给药后第8天持续到第15天。
[0593]
肝组织中的c3转录物：在研究的两个终末时间点，观察到肝脏中c3 mrna的降低以剂量依赖性方式出现(图9)。在处理后3天，与媒介物对照中的c3表达相比，单剂量pk动物组中的肝脏c3 mrna水平显著降低。在用30mg/kg sirna 59处理的动物中，肝脏中的平均c3表达为媒介物处理的臂中基因表达的3％，到第30天升高到25％。到第30天研究终止时，没有处理动物完全恢复c3表达。
[0594]
讨论：皮下施用sirna 59后，观察到血浆中c3蛋白和肝组织中c3 mrna明显的剂量依赖性减少。另外，当sirna 59以单次皮下推注的形式和在3天内以每日注射的形式施用时，观察到的剂量应答是相似的。分别到第29天和第30天，仅在低剂量组中c3血浆蛋白浓度和肝脏中的mrna表达恢复。
[0595]
在单剂量组与多剂量等效组之间，c3血浆蛋白水平和肝脏基因表达在所有时间点
都是相当的。除了高剂量组动物的血清外，任何剂量组均未观察到ap wieslab活性的变化，尽管在10mg/kg剂量后，c3血浆蛋白浓度降低了约90％。在来自任何治疗组的动物中均未观察到痛苦或行为变化的迹象，并且在ta施用后未观察到体重减轻，这表明本研究中使用的剂量良好耐受。
[0596]
这些结果指示，在用靶向c3的galnac标记的sirna处理后，全身循环c3蛋白可以以剂量依赖的方式沉默。
[0597]
等效方案
[0598]
本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同形式。本发明的范围并非旨在限于以上描述，而是如以下权利要求书中所述。
再多了解一些
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