稳定化的基于纤连蛋白的支架分子的制作方法

稳定化的基于纤连蛋白的支架分子
1.本技术是申请号为2015800263137的中国专利申请(申请日：2015年3月19日，发明名称：稳定化的基于纤连蛋白的支架分子)的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求2014年3月20日提交的美国临时申请no.61/955,975和2014年11月25日提交的美国临时申请no.62/084,270的权益，其内容通过提述明确并入本文。
4.背景
5.adnectin是一类来源于人纤连蛋白iii型第十结构域(
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fn3)的具有高亲和力和特异性靶结合特性的治疗蛋白。然而，尽管野生型
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fn3是极其稳定和易溶的，在野生型序列的基础上含有大约4-31个突变的
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fn3的靶结合变体在稳定性和溶解度方面变化很大。换言之，任何基于野生型
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fn3序列的突变，即使是靶结合所必需的，也存在着降低蛋白质稳定性的风险。因此，希望鉴定出可以对野生型
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fn3序列实施的使其稳定的修饰，最好与介导adnectin与其治疗靶标结合的残基的身份无关。
6.概述
7.本文中提供了稳定化的基于纤连蛋白的支架(fbs)蛋白，例如fn3，如
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fn3分子(例如，人
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fn3分子)，所述分子的c端连接于由氨基酸序列pmxn组成的部分，其中p是脯氨酸，x是任何氨基酸，m是至少为1的整数，并且n是0或至少为1的整数，并且其中pmxn部分增强fbs蛋白的至少一种特征，例如，热稳定性。
8.附图简述
9.图1：人
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fn3结构域(pdb id:1fna)的晶体结构、以及在该结构中可见的多肽的蛋白质序列的表示。在该结构中限定的最后两个残基，在该感兴趣序列中的“ei”，显示为紧接在c端β链g的下游的黑色球体。
10.发明详述
11.定义
[0012]“氨基酸残基”是在肽键形成中已经失去一个水分子(来自含氮侧的h 和来自羧基侧的oh-)之后的剩余氨基酸部分。
[0013]
如本文中使用的，“10
fn3结构域”或“10
fn3部分”或“10
fn3分子”是指野生型
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fn3及其生物活性变体，例如与靶标(如靶蛋白)特异性地结合的生物活性变体。野生型人
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fn3结构域可包含seq id no:1-8所示的氨基酸序列之一。野生型人
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fn3结构域的生物活性变体包括这样的
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fn3结构域，相对于包含seq id no:1-8中的任一者的
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fn3结构域，其包含至少、包含至多、或包含大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40或45个氨基酸改变(即，取代、添加或缺失)。相对于包含seq id no:1-8中任一者的
10
fn3结构域，野生型
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fn3结构域的生物活性变体还可包含、或包含至多1-3、1-5、1-10、1-15、1-10、1-25、1-30、1-35、1-40或1-45个氨基酸改变。在某些实施方案中，相对于包含seq id no:1-8中任一者的
10
fn3结构域，野生型人
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fn3结构域的生物活性变体不包含多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40或45个氨基酸改变(即，取代、添加或缺失)。氨基酸改变可以在环区、链、或n端、或
c端区中。允许环区中氨基酸改变的简并
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fn3氨基酸序列的例子在本文中提供为seq id no:9-16。
[0014]“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何序列，而不论长度、翻译后修饰、或功能。多肽可包括如在美国专利号6,559,126中描述的那些天然氨基酸和非天然氨基酸，通过提述将该专利并入本文。也可以多种标准化学方法中的任何方法修饰多肽(例如，可用保护基修饰氨基酸；可将羧基端氨基酸变成末端酰胺基团；可用基团修饰氨基端残基，例如，以增强亲油性；或者，可以化学方式将多肽糖基化或以别的方式修饰，以增加稳定性或体内半衰期)。多肽修饰可包括另一种结构如环状化合物或其他分子与多肽的附接，并且还可包括含有处于改变构型的一个或多个氨基酸(即，r或s；或者，l或d)的多肽。
[0015]
如本文中使用的
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fn3结构域(或部分或分子)的“区域”是指环(ab、bc、cd、de、ef和fg)、β链(a、b、c、d、e、f和g)、n端(相应于seq id no:1的氨基酸残基1-7)、或c端(相应于seq id no:1的氨基酸残基93-94)。
[0016]
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fn3结构域(或部分)的“北极环”是指
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fn3结构域的bc、de和fg环中任一者。
[0017]
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fn3结构域(或部分)的“南极环”是指
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fn3结构域的ab、cd和ef环中任一者。
[0018]“支架区”是指人
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fn3结构域的任何非环区。支架区包括a、b、c、d、e、f和gβ链以及n端区(相应于seq id no:1的残基1-7的氨基酸)和c端区(相应于seq id no:1的残基93-94的氨基酸)。
[0019]
本文中的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在序列比对和引入空位(如果需要的话，达到最大序列同一性百分比，并且不将任何保守取代看作序列同一性的一部分)之后，候选序列中与选定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比之目的的比对可以通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现，例如，利用可公开获得的计算机软件，如blast
sm
、blast
sm-2、align、align-2或megalign软件。本领域技术人员可确定测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
[0020]
为本文的目的，如下计算给定氨基酸序列a相对于(与、或针对)给定氨基酸序列b的氨基酸序列同一性％(或者可表述为给定氨基酸序列a相对于(与、或针对)给定氨基酸序列b具有或包含一定的氨基酸序列同一性％)：100乘以分数x/y，其中x为在a与b的序列比对程序(如blast
sm
、blast
sm-2、align、align-2或megalign)比对中通过该程序评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中y为b中的氨基酸残基的总数。应当理解的是，在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况下，a相对于b的氨基酸序列同一性％不会等于b相对于a的氨基酸序列同一性％。
[0021]
如本文中使用的，多肽中的氨基酸残基被视为“贡献于结合”靶标，如果(1)残基的侧链或主链的任何非氢原子被发现与结合靶标的任何原子相距五埃之内(基于实验确定的该复合物的三维结构)；和/或(2)该残基突变为野生型
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fn3(例如seq id no:1)中等价残基、突变为丙氨酸、或突变为具有与讨论中的残基大小相似或更小的侧链的残基，导致测量的针对靶标的平衡解离常数增加(例如，k
on
增加)。
[0022]
多肽的血清或血浆“半衰期”可通常定义为该多肽的血清浓度在体内降低50％(例如，由于通过天然机制对该多肽的降解和/或该多肽的清除或鳌合)所花费的时间。可以任何本身已知的方式，例如通过药代动力学分析，来测定半衰期。适合的技术对于本领域人员
来说是清楚的，例如，可通常涉及下列步骤：向灵长动物给予适宜剂量的多肽；以规律间隔从所述灵长动物采集血液样品或其他样品；确定所述血液样品中的多肽浓度水平；并且根据由此获得的数据(的绘图)计算直到该多肽的水平或浓度相比于给药时的初始水平降低50％的时间。确定半衰期的方法例如可见于kenneth等人，chemical stability of pharmaceuticals:a handbook for pharmacists(1986)；peters等人，pharmacokinete analysis:a practical approach(1996)；和gibaldi,m.等人，pharmacokinetics,second rev.edition,marcel dekker(1982)。
[0023]
可以使用诸如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(auc)之类的参数来表示血清半衰期。“半衰期的增加”是指这些参数中任一者、这些参数的任何两者、或所有这三个参数的增加。在某些实施方案中，半衰期的增加是指t1/2-β的增加，同时有或者没有t1/2-α和/或auc或这两者的增加。
[0024]
药物产品(例如，包含fbs部分和hsa部分的蛋白质)的“货架期”是该产品在发生分解之前的储存时长。例如，货架期可以定义为该产品分解0.1％、0.5％、1％、5％、或10％的时间。
[0025]
概览
[0026]
本文中提供了与靶标特异性地结合的包含基于纤连蛋白的支架(fbs)结构域(例如fn3)的蛋白质，如
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fn3分子，其中fbs结构域在其c端与由pmxn组成的区域连接，其中p是脯氨酸，x是任何氨基酸，并且其中n是0或至少为1的整数，m是至少为1的整数。本技术至少部分地基于这样的发现：相对于未经修饰的
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fn3分子，在
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fn3分子的c端添加脯氨酸和任选地一个或多个氨基酸可增强
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fn3分子的至少一种特征，例如其热稳定性或溶解度。
[0027]
本文中描述的
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fn3分子可被设计为与任何感兴趣的靶标结合。在示例性实施方案中，靶标是抗原、多肽或感兴趣的治疗蛋白靶标。示例性的治疗上期望的靶标包括，例如，肿瘤坏死因子α(tnf-α)、vegfr2、pcsk9、il-23、egfr和igf1r。
[0028]
基于纤连蛋白的支架
[0029]
如本文中使用的，“基于纤连蛋白的支架”或“fbs”蛋白或部分是指基于纤连蛋白iii型(“fn3”)重复的蛋白质或部分。fn3是一种小型(约10kda)结构域，具有免疫球蛋白(ig)折叠(即，ig样β夹心结构，由七个β链和六个环构成)结构。纤连蛋白具有18个fn3重复，虽然各重复之间的序列同源性较低，但它们在三级结构上有高度的相似性。fn3结构域还出现在除了纤连蛋白之外的多种蛋白质，例如粘附分子、细胞表面分子(例如，细胞因子受体)、和碳水化合物结合结构域中。综述可参见bork等人，proc.natl.acad.sci.usa,89(19):8990-8994(1992)；bork等人，j.mol.biol.,242(4):309-320(1994)；campbell等人，structure,2(5):333-337(1994)；harpez等人，j.mol.biol.,238(4):528-539(1994))。“fbs”蛋白或部分这一术语意图包括来自这些其他蛋白质(即，非纤连蛋白分子)的基于fn3结构域的支架。
[0030]
fn3结构域是小型的、单体的、可溶的、且稳定的。它缺乏二硫键，因此在还原条件下是稳定的。按照从n端到c端的顺序，fn3结构域包含：β或β样链a；环ab；β或β样链b；环bc；β或β样链c；环cd；β或β样链d；环de；β或β样链e；环ef；β或β样链f；环fg；和β或β样链g。上述七个反平行β链排列成两个β片层，这两个β片层形成稳定的核心，同时产生两个由连接β或β样链的环构成的“面”。环ab、cd、和ef位于一个面上(“南极”)，且环bc、de、和fg位于相对的面
上(“北极”)。
[0031]
fn3分子中的环在结构上类似于抗体的互补决定区(cdrs)，并且当其被改变时，可能参与fn3分子和靶标(例如靶蛋白)的结合。fn3分子的其他区域，如β或β样链以及n端或c端区，当被改变时，也可能参与和靶标的结合。任何或所有环ab、bc、cd、de、ef和fg均可参与靶标结合。任何β或β样链都可能参与和靶标的结合。fn3结构域还可通过一个或多个环以及一个或多个β或β样链而结合至靶标。结合可能还需要n端或c端区。在蛋白质中使用的fbs结构域可包含所有环、所有β或β样链、或仅仅它们的一部分，其中某些环和/或β或β样链和/或n端区或c端区被修饰(或改变)，条件是fbs结构域优选地与靶标特异性结合。例如，fbs结构域可包含1、2、3、4、5或6个环，1、2、3、4、5、6、7、或8个β链，以及任选地包含n端区和/或c端区，其中一个或多个环、一个或多个β链、n端区和/或c端区相对于野生型fbs结构域被修饰。
[0032]
在示例性实施方案中，本文中描述的配体(或靶标)结合fbs部分基于纤连蛋白iii型第十结构域，即，fn3的第十模块(
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fn3)。野生型人
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fn3部分的氨基酸序列如下：
[0033][0033]
(ab、cd和ef环加下划线；bc、fg、和de环用粗体着重标记；β链位于各个环区之间或其邻近；n端区以斜体表示)。seq id no:1的最后两个氨基酸残基为c端区的一部分。
[0034]
野生型人
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fn3分子还包括那些缺乏n端区或其部分的分子。例如，野生型
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fn3分子可包含seq id no:1，其中缺失了氨基酸残基1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6或1-7(分别为seq id no:2-8)。表1显示了这些野生型人
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fn3部分的氨基酸序列：
[0035]
表1：具有不同n端区的野生型人
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fn3分子的氨基酸序列
[0036]
[0037][0038]
在一些实施方案中，ab环对应于seq id no:1的残基14-17，bc环对应于残基23-31，cd环对应于残基37-47，de环对应于残基51-56，ef环对应于残基63-67，并且fg环对应于残基75-87。bc、de和fg环沿着该分子的一个面，即“北极”对齐，而ab、cd和ef环沿着该分子的相对面，即“南极”对齐。在seq id no:1中，β链a对应于残基8-13，β链b对应于残基残基18-22，β链c对应于32-36，β链d对应于残基48-50，β链e对应于残基57-62，β链f环对应于残基68-74，并且β链g环对应于残基88-92。β链通过相应的环彼此连接，例如，在β链a、环ab、β链b等等的形成中，链a和b经由环ab连接。
[0039]
基于人
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fn3结构域的fbs蛋白的实例为adnectin(adnexus，bristol-myers squibb的全资附属公司)。adnectin是这样的
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fn3分子，其中
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fn3结构域的cdr样环区、β链、n端区和/或c端区已经被修饰，从而演化出能够与感兴趣的化合物结合的蛋白质。例如，美国专利号7,115,396描述了
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fn3结构域蛋白，其中针对bc、de、和fg环的改变导致高亲和力tnfα结合物。美国专利号7,858,739描述了fn3结构域蛋白，其中针对bc、de、和fg环的改变导致高亲和力vegfr2结合物。
[0040]
在某些实施方案中，fbs部分包含
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fn3结构域，所述
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fn3结构域由以下简并序列概括性地限定：
[0041][0042]
或由选自seq id no:10-16的序列限定，所述序列除了分别缺乏1、2、3、4、5、6或7个n端氨基酸之外，与seq id no:9相同。表2显示了这些简并的人
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fn3分子的氨基酸序列。
[0043]
表2：具有不同n端区的简并野生型人
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fn3分子的氨基酸序列
[0044][0045][0046]
在seq id no:25-32和50中，ab环以(x)u表示，bc环以(x)v表示，cd环以(x)w表示，de环以(x)
x
表示，ef环以(x)y表示，fg环以xz表示。x表示任何氨基酸，在x下面的下标表示氨基酸的数目的整数。具体地说，u、v、w、x、y和z各自可独立地为2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或6-7个氨基酸。β链序列(在seq id no:9
中加下划线)在所有7个支架区上可以具有相对于seq id no:9-16中所示的相应氨基酸的0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、或0到1个取代、缺失或添加。在一些实施方案中，β链序列在所有7个支架区上可以具有相对于seq id no:9-16中所示的相应氨基酸的0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、或0到1个取代(例如保守性取代)。
[0047]
在某些实施方案中，疏水性核心氨基酸残基(在以上seq id no:9中的粗体字的残基)是固定的，且任何取代、保守性取代、缺失或添加均发生在除了所述疏水性核心氨基酸残基之外的残基处。因此，在一些实施方案中，本文中提供的多肽的疏水性核心残基相对于野生型人
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fn3结构域(例如，seq id no:1)未经修饰。
[0048]
在一些实施方案中，fbs部分包含
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fn3结构域，其中该
10
fn3结构域包含环ab、环bc、环cd、环de、环ef、和环fg，并且选自环ab、bc、cd、de、ef和fg中的至少一个环具有相对于野生型人
10
fn3结构域的相应环序列改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，单个环被改变。在一些实施方案中，至多2个环被改变。在一些实施方案中，至多3个环被改变。在一些实施方案中，bc、de和/或fg环被改变。在某些实施方案中，ab、cd、和ef环被改变。在某些实施方案中，fg环是唯一被改变的环。在某些实施方案中，cd环是唯一被改变的环。在其他实施方案中，cd和fg环均被改变，并且任选地，其他环都不被改变。在某些实施方案中，cd和ef环均被改变，并且任选地，其他环都不被改变。在一些实施方案中，一个或多个特定的支架改变与一个或多个环改变相组合。“改变”意指相对于模板序列(即，相应的野生型人纤连蛋白结构域)的一个或多个氨基酸序列改变，并且包括氨基酸添加、缺失、和取代。本文中进一步公开了包含改变的环和/或支架区(例如，β链、n端区和c端区)的特定组合的示例性
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fn3分子。
[0049]
应当理解，为了实现对于期望靶标具有强亲和力的
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fn3结合结构域，并不是环区中的每个残基都需要修饰。另外，还可在环区中形成插入和缺失，同时仍然产生高亲和力
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fn3结合结构域。
[0050]
在一些实施方案中，选自ab、bc、cd、de、ef和fg的一个或多个环相对于野生型人
10
fn3中的相应环可以在长度上延长或缩短。在任何给定的多肽中，一个或多个环可以在长度上延长，一个或多个环可以在长度上缩短，或者这两者的组合。在一些实施方案中，给定环的长度可以延长2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-25、5-20、5-15、5-10、10-25、10-20、或10-15个氨基酸。在一些实施方案中，给定环的长度可以缩短1-15、1-11、1-10、1-5、1-3、1-2、2-10、或2-5个氨基酸。具体地说，
10
fn3的fg环的长度为13个残基，而在抗体重链中的相应环的长度在4-28个残基的范围。因此，对于靶结合依赖于fg的多肽，为了优化其抗原结合，可以改变
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fn3的fg环的长度以及序列，以在靶结合中获得尽可能大的灵活性和亲和力。
[0051]
在一些实施方案中，fbs部分包含
10
fn3结构域，其中非环区包含与seq id no:1的非环区具有至少80％、85％、90％、95％、98％、或100％同一性的氨基酸序列，其中选自ab、bc、cd、de、ef和fg的至少一个环被改变。例如，在某些实施方案中，ab环可具有至多4个氨基酸取代，至多10个氨基酸插入，至多3个氨基酸缺失，或上述组合；bc可具有至多10个氨基酸取代，至多4个氨基酸缺失，至多10个氨基酸插入，或上述组合；cd环可具有至多6个氨基酸取代，至多10个氨基酸插入，至多4个氨基酸缺失，或上述组合；de环可具有至多6个氨基酸取代，至多4个氨基酸缺失，至多13个氨基酸插入，或上述组合；ef环可具有至多5个氨基酸取代，至多10个氨基酸插入，至多3个氨基酸缺失，或上述组合；和/或fg环可具有至多12个氨基酸取代，至多11个氨基酸缺失，至多25个氨基酸插入，或上述组合。
[0052]
在一些实施方案中，fbs部分包含与人
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fn3结构域具有至少40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％同一性的
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fn3结构域，所述人
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fn3结构域具有选自包括seq id no:1-16的序列组的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文中提供的fbs部分与选自包括seq id no:1-16的氨基酸序列组的氨基酸序列具有至少50％的同一性。在其他实施方案中，该fbs部分与选自包括seq id no:1-16的氨基酸序列组的氨基酸序列具有至少65％的同一性。在某些实施方案中，一个或多个环相对于野生型序列的相应环的序列将不被修饰、并且/或者一个或多个β链相对于野生型序列的相应β链的序列将不被修饰、并且/或者n端区或c端区将不被修饰。在某些实施方案中，fbs部分中的
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fn3结构域的各个β或β样链可包含、其基本组成为、或其组成为与具有seq id no:1的相应β或β样链的序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸序列。优选地，β链区中的变化将不会破坏多肽在生理条件下的稳定性。
[0053]
在一些实施方案中，通过一个或多个保守取代可以修饰0fn3结构域的非环区。通过保守取代可以改变
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fn3结构域中多达5％、10％、20％或甚至30％或更多的氨基酸，而基本上不改变
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fn3的配体亲和力。在某些实施方案中，非环区，例如β链，可包含0-15、0-10、0-8、0-6、0-5、0-4、0-3、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、2-15、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、5-15、或5-10个保守氨基酸取代。在示例性实施方案中，支架修饰可将
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fn3结合物对配体的结合亲和力降低100倍、50倍、25倍、10倍、5倍、或2倍。这样的变化可能改变
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fn3的体内免疫原性，并且在免疫原性降低的情况下，这样的变化可能是合意的。如本文中使用的，“保守取代”是在物理上或功能上与相应参考残基类似的残基。即，保守取代与其参考残基具有相似的大小、性状、电荷、化学特性，包括形成共价键或氢键等等的能力。示例性的保守取代包括满足在dayhoff等人，atlas of protein sequence and structure,5:345-352(1978and supp.)中针对可接受点突变所定义的标准的那些取代。保守取代的实例包括在下组范围内的取代：(a)缬氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f)丝氨酸、苏氨酸；(g)赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。
[0054]
本文中还提供了具有环和支架修饰组合的
10
fn3结构域。偶联物可包含
10
fn3结构域，所述结构域包含(i)在环ab、bc、cd、de、ef、或fg中的至少一者的氨基酸序列中的修饰，和(ii)在至少一个支架区的氨基酸序列中的修饰(即，在β链、n端区、和/或c端区的至少一者中的修饰)，其中修饰的环和修饰的支架区两者贡献于对同一个靶标的结合。在示例性实施方案中，支架区修饰位于环区中的修饰的附近，例如，如果ab环被修饰，则支架突变可能倾向于位于在
10
fn3结构域的线性序列上邻近于ab环的β链a和/或β链b中。在其他实施方案中，在
10
fn3结构域的线性序列上彼此邻近的环区和支架区中可能同时出现一簇修饰。例如，对于既具有环修饰有具有支架修饰的fn3结合物而言，氨基酸修饰簇可能出现于下列在
10
fn3结构域的线性序列上彼此邻近的下列环区和支架区组合：β链/环/β链、环/β链/环、环/β链/环/β链、端区/β链/环、或环/β链/端区，等等。例如，就具有新颖的环修饰和支架修饰组合的fn3结构域而言，其可具有这样的修饰簇：在一段20个连续氨基酸的序列上，相对于野生型至少有15个氨基酸被修饰。在其他实施方案中，相对于野生型fn3结构域序列的相应氨基酸序列段，在一段连续的20个残基中的至少17个、20个残基中的至少18个、25个残基中的至少17个、25个残基中的至少20个、或30个残基中的至少25个被修饰。在某些实施方案中，
给定的fn3结构域可具有被未修饰的(即，野生型)序列段分隔开的两个或三个修饰簇。对于任何给定的经修饰区域(即，环、β链或端区)而言，可以是该区域的全部、或者是该区域仅仅一个部分相对于野生型序列修饰。当β链区被修饰时，疏水性核心残基优选地保持未被修饰(即，野生型)，而β链中的一个或多个非核心残基被修饰。
[0055]
在一些实施方案中，
10
fn3结构域包含沿着分子的“西侧”的结合面(“西侧结合物”或“ws结合物”)。与在seq id no:1中示出的相应cd和fg环序列相比，ws结合物可包含修饰的cd环和修饰的fg环。cd环和fg环两者贡献于与同一个靶标结合。在某些实施方案中，ws结合物可在fn3结构域内的一个或多个区域包含另外的修饰。例如，ws结合物可包含在邻近cd和/或fg环的一个或多个β链区中的支架修饰。具体地说，ws结合物在β链c、β链d、β链f、和/或β链g的一者或多者中可以包含序列修饰。示例性的支架修饰包括在对应于seq id no:1的氨基酸位置33、35、49、69、71、73、89和/或91的一个或多个支架区位置处的修饰。ws结合物还可以在bc环中，尤其是在bc环的c端部分中包含修饰。在一个实施方案中，bc环中的最后两个残基(即，对应于野生型
10
fn3结构域中的氨基酸30和31)相对于野生型序列被修饰。上述另外的环修饰和支架修饰的全部或部分可以与修饰的cd和fg环一道贡献于与靶标的结合。优选地，疏水性核心残基相对于野生型序列未被修饰。
[0056]
示例性ws结合物包括在位置30、31、33、35、37、38、46、47、49、50、67、69、71、73、75、76、84、85、86、87、89或91处具有野生型或突变氨基酸的那些结合物。
[0057]
在一些实施方案中，
10
fn3结构域包含在cd环、de环以及在一些情况下在ef环中的修饰，其中这些环修饰均贡献于靶接合。这些多肽被称为“前结合物”(“front binder”)。前结合物可另外包含在一个或多个支架区、尤其是在修饰环区之侧翼或邻近的支架区中的修饰。例如，前结合物可在β链c、β链d、和/或β链e中一者或多者中包含相对于野生型fn3结构域、例如人
10
fn3结构域(seq id no:1)的相应β链的序列的支架修饰。优选地，疏水性核心残基相对于野生型序列未被修饰。可存在于前结合物中的示例性支架修饰包括在对应于seq id no:1的氨基酸位置36、49、58和/或50中的一个或多个位置处的修饰。这样的支架修饰可以与修饰的环一道贡献于对靶标的结合。在某些实施方案中，前结合物可包含跨fn3(例如
10
fn3结构域)的若干环区和链区的修饰簇。具体地说，前结合物在对应于野生型fn3(例如人
10
fn3)结构域(seq id no:1)的残基36到66的氨基酸之间的31个残基中可包含至少15、20、24、25、或27个残基的修饰。环和/或链修饰可包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其组合。在示例性实施方案中，cd环相对于fn3例如野生型人
10
fn3结构域(seq id no:1)的cd环在长度上延长或在长度上缩短。
[0058]
在一些实施方案中，
10
fn3结构域包含在ef和fg环中的修饰，其中这些环修饰贡献于与同一个靶标的结合。这些多肽在本文中称为“后结合物”(“back binder”)。后结合物可在其他环和/或支架区中包含另外的修饰。例如，后结合物在ab环的至少一个部分，优选地在ab环的n端部分中可含有修饰。在示例性实施方案中，相对于野生型序列，ab环中的前两个氨基酸(即，对应于野生型
10
fn3结构域中的氨基酸残基14和15)被修饰。在某些实施方案中，后结合物还可含有一个或多个支架修饰，尤其是在邻近修饰的环区的一个或多个支架区中的修饰。例如，后结合物可在β链a、β链g、n端区、和/或c端区的一者或多者中含有一个或多个修饰。优选地，疏水性核心残基相对于野生型序列未被修饰。示例性支架修饰包括在对应于seq id no:1的氨基酸位置1-7、9-13、89、91、93和/或94的一个或多个位置处的修
饰。一个或多个所述的另外的环修饰和/或支架修饰可以连同所述修饰的ef和fg环一起贡献于对靶标的结合。适合的环和/或支架区修饰包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其组合。在某些实施方案中，fg环的氨基酸序列相对于野生型人
10
fn3结构域(seq id no:1)的fg环在长度上延长或在长度上缩短。
[0059]
在某些实施方案中，后结合物可包含跨越
10
fn3结构域中连续几个区域的修饰氨基酸残基簇。例如，fn3(例如
10
fn3)结构域的前15个氨基酸残基中的至少14个残基可相对于野生型fn3(例如人
10
fn3结构域)(seq id no:1)中的相应残基被修饰，和/或对应于野生型fn3(例如人
10
fn3)结构域(seq id no:1或23)的残基80到97(或94)之间的氨基酸的18个残基中的至少15个残基可相对于野生型序列中的相应残基被修饰。当提及在
10
fn3分子中比94位更靠c端的氨基酸时，其语境是这样的
10
fn3分子：该分子在fn3结构域的第10个重复和第11个重复之间包含一个柔性接头(即，eidkpsq)，由此形成101个氨基酸长的蛋白质(因此，seq id no:23表示seq id no:1的c端连接eidkpsq)。
[0060][0061]
在某些实施方案中，相对于野生型序列的相应区域的序列，
10
fn3结构域在β链a、环ab、β链b、环cd、β链e、环ef、和β链f的氨基酸序列中包含修饰。这些多肽在本文中被称为“南极结合物”(“south pole binder”)或“sp结合物”。这些修饰的环和链贡献于对同一个靶标的结合。cd环的氨基酸序列相对于野生型fn3(例如人
10
fn3)结构域(seq id no:1或23)的cd环可以在长度上延长或在长度上缩短。相对于野生型序列对应区的序列，这些南极结合物在β链g和/或c端区中可包含另外的修饰。在示例性实施方案中，南极结合物可在对应于野生型序列的位置11、12、19、60、61、69、91、93和95-97的氨基酸处包含一个或多个修饰。
[0062]
在一些实施方案中，与seq id no:1或23中示出的相应bc、de和fg环相比，
10
fn3结构域包含修饰的bc、de和fg环，以及在β链c、β链d、β链f和β链g链残基的一者或多者中的另外的修饰。这些β链和环区修饰一起贡献于对靶标的结合。这些蛋白质在本文中被称为“西北结合物”(“northwest binder”)或“nw结合物”。在示例性实施方案中，nw结合物包含一个或多个对应于seq id no:1或23的支架区位置r33、t49、y73和s89的氨基酸位置中任一者或其组合的支架修饰。环和/或支架区中的适合修饰包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其组合。在某些实施方案中，bc、de和fg环的一者或多者相对于野生型序列在长度上延长或在长度上缩短，或其组合。在一个实施方案中，bc、de和fg环各自相对于野生型序列(例如，seq id no:1或23)在长度上延长或在长度上缩短，或其组合。在一些实施方案中，bc环仅有一个部分，尤其是c端部分，相对于野生型序列被修饰。例如，bc环可以仅在对应于野生型bc环的氨基酸27-31的氨基酸残基处被修饰，而bc环的剩余部分(即，对应于野生型环的残基23-26)不被修饰。
[0063]
在一些实施方案中，
10
fn3结构域包含修饰的bc、de和fg环，并且在n端区、β链a、β链b和/或β链e中任一者或其组合中包含一个或多个另外的修饰。这些蛋白质在本文中被称为“东北结合物”(“northeast binder”)或“ne结合物”。在示例性实施方案中，ne结合物在对应于野生型序列(seq id no:1或23)的支架区位置1-7、e9、l19、s21和/或t58的氨基酸中任一者或其组合处被修饰。修饰的环和支架区的组合贡献于对靶标的结合。
[0064]
在一些实施方案中，
10
fn3结构域在ab、cd、de和ef环的一者或多者中包含修饰，并且在β链b、β链d和/或β链e的一者或多者中包含另外的修饰。这些蛋白质在本文中被称为“南前结合物”(“south front binder”)。修饰的环和链残基的组合贡献于与靶标的结合。在示例性实施方案中，南前结合物可在对应于seq id no:1或23的支架区位置l19、t49、t58、s60、和/或g61的一个或多个氨基酸位置处和/或在对应于seq id no:1或23的环区位置t14-s17、p51、t56、g40-e47、和/或k63-g65的一个或多个氨基酸位置处被修饰。在示例性实施方案中，南前结合物在ab环中、在对应于野生型序列的残基18和20的氨基酸之间、和/或在cd环中，可以在长度上延长或在长度上缩短。
[0065]
在一些实施方案中，与seq id no:1或23的相应链比较，
10
fn3结构域包含修饰的β链a和β链g。这些蛋白质在本文中被称为“ag结合物”或“ag链”。在某些实施方案中，ag链结合物在fn3(例如
10
fn3结构域)的n端和c端部分包含修饰簇，而fn3的中间部分保持未修饰。例如，在ag链结合物的
10
fn3结构域的前19个氨基酸(即，对应于seq id no:1或23的氨基酸位置1-19)中可包含16/19个氨基酸的修饰，且在
10
fn3结构域的最后18个氨基酸(即，对应于seq id no:9的氨基酸位置84-101)中可包含13-17/18个氨基酸的修饰、或在
10
fn3结构域的最后22个氨基酸(即，对应于seq id no:9的氨基酸位置80-101)中可包含14-18/22个氨基酸的修饰。在示例性实施方案中，ag结合物在对应于seq id no:9的位置1-7、9、11-17、19、84-89和91-97的一个或多个位置处可包含修饰。优选地，ag结合物中的这些修饰区贡献于与同一个靶标结合。
[0066]
在一些实施方案中，
10
fn3结构域包含修饰的cd和ef环、并且在对应于seq id no:1或23的位置69或91-97的残基中任一者或其组合中包含另外的修饰。这些蛋白质在本文中被称为“西南结合物”(“southwest binder”)或“sw结合物”。修饰的环和支架区贡献于与靶标的结合。
[0067]
在某些实施方案中，蛋白质包含具有降低的免疫原性的
10
fn3结构域，其中bc环的一部分保留为野生型。优选地，这样的多肽相对于在bc环的更大部分中具有修饰的等同多肽具有较低的免疫原性。在示例性实施方案中，bc环的n端部分保留为野生型。例如，bc环的前1、2、3、4、5、或5个残基可保留为野生型，而bc环的剩余c端残基可被修饰。在bc环的n端区的至少一部分为野生型的fn3设计中，建议相对于野生型序列保持β链b和/或β链c的全部或部分不被修饰，尤其是邻近bc环的β链b和/或β链c部分(即，β链b的c端部分和/或β链c的n端部分)。在示例性实施方案中，fn3结构域在bc环的n端部分中具有野生型序列，且具有降低的免疫原性，该fn3结构域在n端区、β链a、ab环、和β链b中可以没有任何修饰。在bc环的一部分为野生型的fn3设计中，bc环的修饰部分连同
10
fn3结构域的其他区中的修饰可贡献于靶结合。
[0068]
在某些实施方案中，蛋白质包含具有降低的免疫原性的
10
fn3结构域，其中在β链b/bc环/β链c区中的强hla锚(“bc锚”)已经被去除或破坏(例如，相对于野生型序列被修饰从而降低与一个多个hla受体的结合亲和力)。例如，通过在对应于seq id no:1的位置l19、s21、r33和/或t35的一个或多个位置修饰fn3(例如
10
fn3)结构域，可去除或破坏bc锚。当bc锚已经去除或破坏时，有可能修饰bc环的序列，而不显著增加bc区的免疫原性。因此，许多这样的fn3设计除了在β链b和/或β链c中的修饰之外，还具有bc环中的修饰。bc环可贡献于靶结合，任选地与fn3结构域的其他区中的修饰联合贡献于靶结合。在β链b和/或β链c中的
修饰可以贡献于也可以不贡献于靶接合。
[0069]
在示例性实施方案中，fbs，例如
10
fn3结构域，以小于500nm、100nm、50nm、10nm、5nm、1nm、500pm、100pm或更小的kd与期望靶标结合。在一些实施方案中，fbs，例如
10
fn3结构域，以1pm和1μm之间、100pm和500nm之间、1nm和500nm之间、或1nm和100nm之间的kd与期望靶标结合。在示例性实施方案中，
10
fn3部分特异性地结合不被野生型
10
fn3结构域，尤其是野生型人
10
fn3结构域，例如具有seq id no:1-8的野生型人
10
fn3结构域结合的靶标。
[0070]
在某些实施方案中，fbs部分包含与选自seq id no:1-16的序列组的氨基酸序列具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，并且fbs特异性地与靶标结合，例如以小于500nm、100nm、50nm、10nm、5nm、1nm、500pm、100pm或更小的kd特异性地与靶标结合。fbs部分可以在一个或多个环、以及一个或多个支架区中包含氨基酸改变(或变化)。
[0071]
在一些实施方案中，可以将整联蛋白结合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(rgd)(seq id no:1的氨基酸78-80)中的一个或多个残基加以取代，从而破坏整联蛋白结合。在一些实施方案中，本文中提供的所述多肽的fg环不含rgd整联蛋白结合位点。在一个实施方案中，该rgd序列被替换为极性氨基酸-中性氨基酸-酸性氨基酸序列(以n端到c端的方向)。在某些实施方案中，该rgd序列被替换为sge或rge。
[0072]
在一些实施方案中，相对于
10
fn3结构域(例如包含seq id no:1的
10
fn3结构域)的相应区域的氨基酸序列，fbs部分的n端和/或c端区的氨基酸序列可以通过缺失、取代或插入而被修饰。
[0073]
在某些实施方案中，相对于具有seq id no:1的野生型人
10
fn3结构域中的相应氨基酸的序列，本文提供的多肽中seq id no:1的前1、2、3、4、5、6、7、8或9个残基的氨基酸序列可以被修饰或缺失。在示例性实施方案中，与seq id no:1-16中任一者的氨基酸1-7、8或9对应的氨基酸被替换为长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3,1-2、或1个氨基酸的替代n端区。示例性替代n端区包括(用单字母氨基酸代码表示)：m、mg、g、mgvsdvprdl(seq id no:24)和gvsdvprdl(seq id no:25)、或seq id no:24或25中任一者的n端截短。其他适合的替代n端区包括，例如，xnsdvprdl(seq id no:26)、xndvprdl(seq id no:27)、xnvprdl(seq id no:28)、xnprdl(seq id no:29)、xnrdl(seq id no:30)、xndl(seq id no:31)、或xnl，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中当n＝1时，x是met或gly，并且当n＝2时，x是met-gly。当met-gly序列被添加至
10
fn3结构域的n端时，m常被切割掉，在n端留下g。在其他实施方案中，替代的n端区包含氨基酸序列mastsg(seq id no:32)。
[0074]
如本文中进一步描述，在一些实施方案中，seq id no:1的前七个或八个残基(即，残基1-7或1-8)缺失，从而产生具有例如seq id no:8的氨基酸序列的
10
fn3结构域。具有seq id no:1-16中任一者的氨基酸序列的
10
fn3结构域的n端或c端还可添加另外的序列。例如,在一些实施方案中，n端延伸由选自下组的氨基酸序列组成：m、mg、和g。例如，seq id no:1-16中任一者之前可以是m、mg、或g。
[0075]
在某些实施方案中，fbs部分基于纤连蛋白例如人纤连蛋白的iii型结构域的第10重复之外的fn3重复。例如，fbs部分可类似于任何其他纤连蛋白iii型重复，例如，第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、和第18fn3重复。在其他实施方案中，fbs部分可以来自纤连蛋白之外的分子。示例性fbs部分可以来源于肌
腱蛋白，肌腱蛋白是一种由15个fn3结构域组成的蛋白质，这些结构域彼此具有如纤连蛋白中所见的相似的序列相似性。这些重复描述于例如jacobs等人，protein engineering,design&selection,25:107(2012)。基于纤连蛋白分子中的重复以及肌腱蛋白分子中的重复的同源性，已经产生基于这些同源性的人工分子。包含基于纤连蛋白分子中的结构域的同源性的共有氨基酸序列的蛋白质被称为fibcon和fibconb(wo2010/093627和jacobs等人，(2012)，上文)，基于肌腱蛋白分子中的结构域的同源性的蛋白质被称为tencon。示例性fibcon氨基酸序列包含下列氨基酸序列：
[0076]
mpaptdlrftnetpsslliswtpprvqitgyiirygpvgsdgrvkeftvppsvssatitglkpgteytisvialkdnqeseplrgrvttgg(fibconb；seq id no:33)，
[0077]
其中环ab由氨基酸13-16组成(tpss；seq id no:34)，环bc由氨基酸22-28组成(tpprvqi；seq id no:35)，环cd由氨基酸38-43组成(vgsdgr；seq id no:36)，环de由氨基酸51-54组成(psvs；seq id no:37)，环ef由氨基酸60-64组成(glkpg；seq id no:38)，环fg由氨基酸75-81组成(kdnqesep；seq id no:39)。另一种fibcon氨基酸序列包含下列氨基酸序列：
[0078]
ldaptdlqvtnvtdtsitvswtppsatitgyritytpsngpgepkeltvppsstsvtitgitpgveyvvsvyalkdnqespplvgtctt(seq id no:40；jacobs等人，上文)。
[0079]
源于肌腱蛋白的fn3蛋白包括tencons(wo 2010/051274、wo 2010/051310和wo 2011/137319，将它们通过提述明确并入本文)。示例性tencon蛋白具有下列氨基酸序列：
[0080]
lpapknlvvsevtedslrlswtapdaafdsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvkgghrsnplsaeftt(seq id no:41；jacobs等人，上文，和wo 2011/137319)，
[0081]
其中环ab由氨基酸13-16组成(teds；seq id no:42)，环bc由氨基酸22-28组成(tapdaaf；seq id no:43)，环cd由氨基酸38-43组成(sekvge；seq id no:44)，环de由氨基酸51-54组成(gser；seq id no:45)，环ef由氨基酸60-64组成(glkpg；seq id no:46)，环fg由氨基酸75-81组成(kgghrsn；seq id no:47)。
[0082]
fibcon、fibconb或tencon部分，或其靶结合变体，无论是单独的还是缀合有异源部分的，可以如本文中描述进行融合。来自其他蛋白质，例如细胞表面激素和细胞因子受体、伴侣蛋白、和碳水化合物结合结构域，的fn3结构域可以如本文中描述进行偶联。
[0083]
fbs蛋白或部分在例如wo 2010/093627、wo 2011/130324、wo 2009/083804、wo 2009/133208、wo 02/04523、wo 2012/016245、wo 2009/023184、wo 2010/051310、wo 2011/020033、wo 2011/051333、wo 2011/051466、wo 2011/092233、wo 2011/100700、wo 2011/130324、wo 2011/130328、wo 2011/137319、wo 2010/051274、wo 2009/086116、wo 09/058379、wo 2013/067029 wo 2012/016245、wo 2014/120891和wo 2014/043344中有描述(所有这些专利均通过提述明确并入本文)：任何在这些出版物中描述的fbs蛋白或部分均可如本文描述加以使用。
[0084]
在某些实施方案中，蛋白质包含至少2个fbs部分，例如，所述蛋白质包含多价fbs部分。例如，多价fbs可包含共价缔合的2、3或更多个fbs部分，例如
10
fn3结构域。在示例性实施方案中，fbs部分是包含两个
10
fn3结构域的双特异性或二聚体蛋白。
[0085]
在多价蛋白中的各个fbs部分，例如，各个
10
fn3结构域，可以通过多肽接头加以连接。示例性的多肽接头包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、或1-2个氨基酸的多
肽。适合的用于连接
10
fn3结构域的接头是这样的接头，其允许各别的结构域彼此独立地折叠，形成容许与靶分子高亲和力结合的三维结构。适合的接头的具体实例包括基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、基于脯氨酸-丙氨酸的接头、以及本文中描述的任何其他接头。在一些实施方案中，所述接头为基于甘氨酸-脯氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和脯氨酸残基，并且长度可以在3和30、10和30、以及3和20个氨基酸之间。这样的接头的实例包括gpg、gpgpgpg(seq id no:48)和gpgpgpgpgpg(seq id no:49)。在一些实施方案中，所述接头为基于脯氨酸-丙氨酸的接头。这些接头包含脯氨酸和丙氨酸残基，并且长度可以在3和30、10和30、3和20以及6和18个氨基酸之间。这样的接头的实例包括papapa(seq id no:50)、papapapapapa(seq id no:51)和papapapapapapapapa(seq id no:52)。在一些实施方案中，所述接头是基于甘氨酸-丝氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和丝氨酸残基并且长度可以在8和50、10和30、以及10和20个氨基酸之间。这样的接头的实例包括gsgsgsgsgs((gs)5；seq id no:53)、gsgsgsgsgsgs((gs)6；seq id no:54)、gsgsgsgsgsgsgsgsgsgs((gs)
10
；seq id no:55)、ggggsggggsggggs((g4s)4；seq id no:56)、ggggsggggsggggsggggsggggs((g4s)5；seq id no:57)、和ggggsggggsgggsg(seq id no:58)。在示例性实施方案中，接头不含任何asp-lys(dk)对。
[0086]
pmxn部分，例如，稳定化部分
[0087]
在某些实施方案中，fbs，例如
10
fn3部分，在其c端与由pmxn组成的部分连接，其中p是脯氨酸，x是任何氨基酸，m是至少为1的整数，并且n是0或至少为1的整数，并且p在x的n端。pmxn部分可以直接连接于
10
fn3部分的c端氨基酸，例如它的第94个氨基酸(基于seq id no:1的氨基酸编号)。pmxn部分可经由肽键与
10
fn3部分的第94个氨基酸连接。pmxn部分可与这样的
10
fn3部分连接，所述
10
fn3部分具有与seq id no:1同源的氨基酸序列，或者包含表1或2中所示的氨基酸序列、基本上由表1或2中所示的氨基酸序列组成、或由为表1或2中所示的氨基酸序列组成。在seq id no:1末端的单个脯氨酸残基称为“95pro”或“pro95”或“p95”或“95p”。
[0088]
与pmxn部分连接的示例性
10
fn3部分包括下列序列：
[0089]
levvaatptslliswdapavtvryyritygetggnspvqeftvpgskstatisglkpgvdytitvyavtgrgdspasskpisinyrtpmxn(seq id no:59)
[0090]
vsdvprdlevvaatptslliswdapavtvryyritygetggnspvqeftvpgskstatisglkpgvdytitvyavtgrgdspasskpisinyrtpmxn(seq id no:60)
[0091]
在pmxn中，m可以是1、2、3或更多。例如，m可以是1-3或者m可以是1-2。“n”可以是0、1、2、3或更多，例如，n可以是1-3或1-2。
[0092]
如本文中进一步描述的，通过修饰一个或多个环和/或一个或多个β链的氨基酸序列，可以修饰这些
10
fn3部分使之与靶标结合(并且形成fbs部分)。与pmxn连接的fbs部分在本文中被称为“修饰的fbs部分”。因此，本文中提供了包含与seq id no:59或60至少约50％、60％、70％、80％、90％、或95％相同的氨基酸序列的fbs部分的蛋白质，其中所述蛋白质包含pmxn，并且，其中fbs与靶标特异性地结合(除了通过rgd结构域之外)。
[0093]
在pmxn中，n可以是0，在这种情况下，该蛋白质的c端氨基酸是pm，例如p。在某些实施方案中，n不是0，并且可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。例如，n可以是0-10、0-5、0-3、1-10、1-5、1-3或1-2。然而，该脯氨酸可以与10个以上的氨基酸连接。例如，在串联
fbs部分或与另一种多肽融合的fbs部分中，fbs部分的c端氨基酸可与一个或多个脯氨酸连接，并且最后的脯氨酸与第二个fbs部分或与异源部分连接。因此，在某些实施方案中，n可以是范围为0-100、0-200、0-300、0-400、0-500或更大的整数。
[0094]
在某些实施方案中，pmxn包含半胱氨酸。例如，脯氨酸之后的第一个氨基酸可以是半胱氨酸，并且该半胱氨酸可以是该分子中最后的氨基酸或者该半胱氨酸可以在一个或多个氨基酸之后。半胱氨酸的存在容许异源部分(如化学部分，例如peg)与fbs部分偶联。包含半胱氨酸的示例性pmxn部分包括：pmcxn，其中c是半胱氨酸。另一个实例是pmxn1cxn2，其中n1和n2独立地是0或至少为1的整数。例如，n1可以是1并且n2可以是1、2、3、4或5。
[0095]
示例性pmxn部分包括在表3中列出的那些。
[0096]
表3：示例性pmxn部分
[0097]
具有1个脯氨酸的部分具有2个脯氨酸的部分ppppippipcppcpidppidpieppiepidk(seq id no:61)ppidk(seq id no:62)piek(seq id no:63)ppiek(seq id no:64)pidkp(seq id no:65)ppidkp(seq id no:66)piekp(seq id no:67)ppiekp(seq id no:68)pidkps(seq id no:69)ppidkps(seq id no:70)piekps(seq id no:71)ppiekps(seq id no:72)pidkpc(seq id no:73)ppidkpc(seq id no:74)piekpc(seq id no:75)ppiekpc(seq id no:76)pidkpsq(seq id no:77)ppidkpsq(seq id no:78)piekpsq(seq id no:79)ppiekpsq(seq id no:80)pidkpcq(seq id no:81)ppidkpcq(seq id no:82)piekpcq(seq id no:83)ppiekpcq(seq id no:84)phhhhhh(seq id no:85)pphhhhhh(seq id no:86)pchhhhhh(seq id no:87)ppchhhhhh(seq id no:88)
[0098]
任何pmxn部分，例如，在表3中所示的那些，可以被组氨酸尾所跟随，例如，6xhis标签，或其他标签。这并不排除组氨酸尾可能被包括在pmxn中。
[0099]
pmxn部分添加到fbs部分上可增强fbs部分的一种或多种特征。例如，如实施例中所示，相对于未与pmxn部分连接的部分，它增强
10
fn3部分的热稳定性。热稳定性的提高预期可改善其他期望的特性，如溶解度、正确折叠和表达水平。例如，如实施例中所示，相对于未与pmxn部分连接的fbs，fbs c端pmxn部分的存在提高了fbs的溶解度。
[0100]
因此，在某些实施方案中，相对于未与pmxn部分连接的fbs部分，fbs例如
10
fn3部分的tm至少被提高1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15℃。例如，相对于未与pmxn部分连接的fbs部分，tm可增加1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、或1-5℃。例如，可如下所述通过热
engineering:nucleic acids and molecular biology,vol.22,pp.65-96,gross,h.j.,ed.(2009))。为了将接头与fbs上的半胱氨酸附接，该接头例如可以包含马来酰亚胺基部分，该部分然后与半胱氨酸反应而形成共价键。在某些实施方案中，优化半胱氨酸周围的氨基酸以促进化学反应。例如，相对于以一段带正电荷的氨基酸围绕半胱氨酸，通过使带负电荷的氨基酸围绕半胱氨酸可以使反应更快(ep 1074563)。
[0109]
关于癌症治疗，该药物优选地是引起靶向的癌细胞死亡的细胞毒性药物。可以在fbs-dc中使用的细胞毒性药物包括下列类型的化合物及其类似物和衍生物：
[0110]
(a)烯二炔类，如卡奇霉素(参见，例如，lee等人，j.am.chem.soc.,109:3464,3466(1987))和uncialamycin(参见，例如，davies等人，wo 2007/038868 a2(2007)和chowdari等人，美国专利号8,709,431b2(2012))；
[0111]
(b)微管溶素类(参见，例如，domling等人，美国专利号7,778,814b2(2010)；cheng等人，美国专利号8,394,922b2(2013)；和cong等人，美国专利申请公开号2014/0227295 a1；
[0112]
(c)cc-1065和倍癌霉素(参见，例如，boger,美国专利号6,5458,530b1(2003)；sufi等人，美国专利号8,461,117b2(2013)；和zhang等人，美国专利申请公开号2012/0301490 a1(2012))；
[0113]
(d)埃坡霉素类(参见，例如，vite等人，美国专利申请公开号2007/0275904 a1(2007)和美国专利号re42,930e(2011))；
[0114]
(e)奥利斯达汀(auristatins)类(参见，例如，senter等人，美国专利号6,844,869b2(2005)和doronina等人，美国专利号7,498,298 b2(2009))；
[0115]
(f)吡咯并苯并二氮杂卓(pbd)二聚体类(参见，例如，howard等人，美国公开文本nos.2013/0059800 a1(2013)和2013/0028919 a1(2013)；和wo 2013/041606 a1(2013))；以及
[0116]
(g)美登木素生物碱类，如dm1和dm4(参见，例如，chari等人，美国专利号5,208,020(1993)和amphlett等人，美国专利号7,374,762 b2(2008))。
[0117]
在某些实施方案中，fbs-pmxn，其中至少一个x是半胱氨酸，与标记物或可检测部分连接，用于例如体外或体内检测或成像。
[0118]
可检测标记物可以是当前在体外诊断学领域中使用的任何不同类型，包括颗粒标记物，包括金属溶胶，如胶体金；同位素，如i
125
或tc
99
，例如与n2s2、n3s或n4类型的肽螯合剂一起提供；发色团，包括荧光标志物、生物素、发光标志物、磷光标志物等，还有将给定底物转化为可检测标志物的酶标记物，以及通过后续扩增例如聚合酶链反应显示的多核苷酸标签。然后可通过亲和素或链霉亲和素结合检测生物素化抗体。适合的酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等等。例如，标记物可以是酶(碱性磷酸酶)，其可通过测定在转化1,2二氧杂环丁烷底物，如金刚烷基甲氧基磷氧酰苯基二氧杂环丁烷(amppd)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2
′‑
(5
′‑
氯)三环{3.3.1.1 3,7}癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠(cspd)，还有cdp和或本领域技术人员熟知的其他发光底物，例如适合的镧系元素铽(iii)和铕(iii)的螯合物之后化学发光的存在或形成而加以检测。
[0119]
可以使用的可检测部分包括放射性物质，如：放射性重金属，如铁螯合物，钆或锰的放射性螯合物，氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射体，
18
f、
60
cu、
61
cu、
62
cu、
64
cu、
124
i、
86
y、
89
zr
nm进行uv检测，并进行荧光检测(激发＝280nm，发射＝350nm)。可采用具有适当流速的100mm硫酸钠、100mm磷酸钠、150mm氯化钠的缓冲液(例如，ph 6.8)的sec柱。使用凝胶过滤标准品(bio-rad laboratories,hercules,ca)进行分子量校准。
[0128]
在某些实施方案中，包含fbs部分和pmxn部分的蛋白质具有与未修饰的fbs部分至少一样强的生物活性。上述生物活性可以是与靶标的结合亲和力，或者在某种测定中的生物活性，例如破坏肿瘤细胞的能力。在某些实施方案中，所述蛋白质的生物活性在未修饰的fbs部分的活性的5％、10％、25％、50％、100％、2倍或更多倍之内。
[0129]
包含fbs和pmxn部分的蛋白质还可包括以上特征的组合。例如，蛋白质可以在高达50mg/ml的浓度是可溶的，可以至少90％单体形式存在，并且/或者具有与未修饰的fbs至少一样强力的生物活性。
[0130]
当提及增强的特性时，该增强是统计学显著的增强。
[0131]
核酸-蛋白质技术
[0132]
一种迅速制造和测试具有特异性结合性质的fbs结构域的方式是adnexus(bristol-myers squibb的一家公司)的核酸-蛋白质技术。这种体外表达和标签化技术(称作profusion)利用核酸-蛋白质融合(rna-和dna-蛋白质融合)，可用于鉴定对于与蛋白质结合而言重要的新多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白质技术是将蛋白质与其编码遗传信息共价偶联的技术。关于rna-蛋白质技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的详细描述参见szostak等人，美国专利nos.6,258,558；6,261,804；6,214,553；6,281,344；6,207,446；6,518,018；pct公开文本nos.wo 00/34784；wo 01/64942；wo 02/032925；和roberts等人，proc natl.acad.sci.,94:12297-12302(1997)，通过提述将其并入本文。
[0133]
载体及多核苷酸实施方案
[0134]
本文中公开的包含fbs部分和pmxn部分的各种蛋白质的编码核酸可以通过化学、酶促或重组方式合成。可以选择密码子用法以提高细胞中的表达。这样的密码子用法将取决于所选择的细胞类型。已经开发了专门针对大肠杆菌和其他细菌、以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的密码子用法模式。参见，例如，mayfield等人，proc.natl.acad.sci.usa,100(2):438-442(jan.21,2003)；sinclair等人，protein expr.purif.,26(1):96-105(oct.2002)；connell,n.d.,curr.opin.biotechnol.,12(5):446-449(oct.2001)；makrides等人，microbiol.rev.,60(3):512-538(sep.1996)；和sharp等人，yeast,7(7):657-678(oct.1991)。
[0135]
核酸操作的通用技术描述于例如sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual，第二版，vols.1-3,cold spring harbor laboratory press(1989)，或ausubel,f.等人，current protocols in molecular biology,green publishing and wiley-interscience,new york(1987)及定期的更新中，将这些文献通过提述并入本文。编码多肽的dna与适合的来源于哺乳动物、病毒、或昆虫基因的转录或翻译调节元件可操作连接。这样的调节元件包括转录启动子、任选的控制转录的操作序列、编码适合的mrna核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译的终止的序列。另外，组入在宿主中复制的能力(通常由复制起点赋予)、以及易化转化体识别的选择基因。
[0136]
本文中描述的蛋白质不仅可以直接地重组产生，还可以以带有异源多肽的多肽的形式产生，所述异源多肽优选是信号序列或其他在成熟蛋白或多肽的n端具有特异性切割
位点的多肽。选用的异源信号序列优选是可被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列替换为例如选自下组的原核信号序列：碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定肠毒素ii前导序列。为了酵母分泌，可将天然信号序列取代为例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母属和克鲁维酵母属α-因子前导序列)、或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌葡糖淀粉酶前导序列、或pct公开文本wo 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列，例如单纯疱疹gd信号。这样的前体区域的dna可以阅读框的方式连接于编码蛋白质的dna。
[0137]
表达载体和克隆载体都包含使所述载体能够在一个或多个选定的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这个序列是使所述载体能够独立于宿主染色体dna而复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。对于多种细菌、酵母、和病毒而言这样的序列是熟知的。来自质粒pbr322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(sv40、多瘤病毒、腺病毒、vsv或bpv)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，复制起点组分对于哺乳动物表达载体是不需要的(通常使用sv40起点仅仅是因为它含有早期启动子)。
[0138]
表达载体和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志物。典型的选择基因编码这样的蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素的抗性，(b)补足营养缺陷型缺陷，或(c)提供从复合培养基中不可得的关键养分，例如，编码用于杆菌的d-丙氨酸消旋酶的基因。
[0139]
适合于在酵母中使用的选择基因是trp1基因，其存在于酵母质粒yrp7中(stinchcomb等人，nature,282:39(1979))。trp1基因针对缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株提供选择标志物，例如，no.44076或pep4-1.jones,genetics,85:12(1977)。此外，酵母宿主细胞基因组中trp1缺损的存在提供了一个有效的通过在缺乏色氨酸的情况下的生长来检测转化的环境。类似地，leu2缺陷型酵母株(20,622或38,626)通过已知的携带leu2基因的质粒而得到补全。
[0140]
表达载体和克隆载体常常含有可被宿主生物识别、并且与编码蛋白质的核酸可操作连接的启动子。适合于与原核宿主一起使用的启动子包括phoa启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子例如tac启动子。然而，其他已知的细菌启动子也是适合的。用于细菌系统中的启动子还将包含shine-dalgarno(s.d.)序列，其与编码蛋白质的dna可操作连接。
[0141]
真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有的真核基因都具有富at区，它位于转录起始的位点上游大约25到30个碱基处。另一个序列在许多基因的转录起点上游70到80个碱基处出现的是cncaat(seq id no:109)区，其中n可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3
′
端有aataaa(seq id no:110)序列，它可能是向编码序列的3
′
端添加多聚a尾的信号。所有这些序列都适宜地插入真核表达载体中。
[0142]
适合于与酵母宿主一起使用的启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶的启动子。
[0143]
其他酵母启动子，它们是拥有可通过生长条件控制转录这一额外优势的诱导型启动子，是下列酶的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素c、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶，以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。适合在酵母表达中使用的载体和启动子在欧洲专利公开文本73,657以及pct公开文本wo 2011/124718和wo 2012/059486中有进一步描述。将酵母增强子与酵母启动子一起使用也是有利的。
[0144]
在哺乳动物宿主细胞中，来自载体的转录可以受到例如获自病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，以及最优选地，猴病毒40(sv40))的基因组中的启动子、获自异源哺乳动物的启动子(例如启动子或免疫球蛋白启动子)、获热休克启动子的控制，只要这样的启动子与宿主细胞系统相容即可。
[0145]
sv40病毒的早期启动子和晚期启动子可方便地作为sv40限制性片段获得，该片段还包含sv40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子可方便作为hindiii e限制性片段获得。美国专利号4,419,446中公开了利用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达dna的系统。在美国专利号4,601,978中描述了对这个系统的修改。关于人β干扰素cdna在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中的表达，还参见reyes等人，nature,297:598-601(1982)。或者，可使用劳斯肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
[0146]
经常通过向载体中插入增强子序列来增加高等真核生物对编码蛋白质的dna的转录。目前已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α甲胎蛋白、和胰岛素)的增强子序列。然而，通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起点晚期侧(late side)(bp 100-270)的sv40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧(late side)的多瘤病毒增强子、以及腺病毒增强子。关于真核生物启动子活化的增强元件，还参见yaniv,nature,297:17-18(1982)。增强子可拼接到载体中多肽编码序列5
′
或3
′
位置，但优选位于启动子的5
′
的某个位点。
[0147]
在真核宿主细胞(例如，酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类、或来自其他多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体还将含有对于终止转录和稳定化mrna必需的序列。这样的序列通常可从真核生物或病毒dna的5
′
(有时还有3
′
)非翻译区或cdna得到。这些区域含有转录为编码多肽的mrna的非翻译部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区。参见wo 94/11026及其中所公开的表达载体。
[0148]
重组dna也可包括任何类型的可用于纯化蛋白质的蛋白质标签序列。蛋白质标签的实例包括，但不限于，组氨酸标签、标签、myc标签、ha标签、或gst标签。用于细菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞宿主的适当克隆与表达载体可见于：cloning vectors:a laboratory manual,elsevier,new york(1985)，该文献的相关公开内容通过提述并入本文。
[0149]
可使用适合于宿主细胞的方法将表达构建体导入宿主细胞中，这对于本领域技术人员是容易想到的。将核酸导入宿主细胞中的各种方法是本领域中已知的，包括，但不限于，电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其他物质转染；微粒轰击；脂质体转染；及感染(其中载体为感染介质)。
[0150]
适合的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞、或细菌细胞。适合的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，大肠杆菌或芽孢杆菌属物种。酵母，优选地来自酵
母属物种的酵母如酿酒酵母，也可用于产生多肽。还可使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白质。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统由luckow等人(bio/technology,6:47(1988))综述。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括内皮细胞、cos-7猴肾细胞、cv-1、l细胞、c127、3t3、中华仓鼠卵巢(cho)、人胚肾细胞、hela、293、293t、和bhk细胞系。通过培养适合的宿主/载体系统来表达重组蛋白而制备纯化的蛋白质。然后从培养基或细胞提取物中纯化fbs蛋白。
[0151]
蛋白质产生
[0152]
用本文中描述的用于产生蛋白质的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在常规营养培养基中培养宿主细胞，所述营养培养基经过改良以适应诱导启动子、选择转化体、或扩增编码期望序列的基因。
[0153]
可在各种培养基中培养用于产生蛋白质的宿主细胞。可商购的培养基，如ham's f10(sigma)、最小必需培养基((mem)、(sigma))、rpmi-1640(sigma)、和dulbecco's modified eagle's medium((dmem)、(sigma))适合于培养宿主细胞。另外，在ham等人，meth.enzymol.,58:44(1979),barnes等人，anal.biochem.,102:255(1980),美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；pct公开文本wo 90/03430；wo 87/00195；或美国专利号re30,985中描述的培养基中任一者可用作宿主细胞的培养基。在需要时，可对任何这些培养基补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐)、缓冲液(如hepes)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素药物)、微量元素(定义为无机化合物，通常以在微摩尔范围内的终浓度存在)、以及葡萄糖或等效能源。还可包括适当浓度的本领域技术人员已知的任何其他必要的补充剂。培养条件，诸如温度、ph值等，是先前用于经选择用于表达的宿主细胞的那些条件，且对于普通技术人员而言是容易想到的。
[0154]
还可使用无细胞翻译系统产生本文中公开的蛋白质。为了这样的目的，必须修饰编码蛋白质的核酸，以允许体外转录而产生mrna并允许mrna在所用的特定无细胞系统(真核无细胞翻译系统例如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统，原核无细胞翻译系统例如细菌无细胞翻译系统)中进行无细胞翻译。
[0155]
也可通过化学合成产生蛋白质(例如，通过在solid phase peptide synthesis，第二版，the pierce chemical co.,rockford,il(1984))中描述的方法)。蛋白质的修饰也可通过化学合成产生。
[0156]
本文中公开的蛋白质可通过蛋白质化学领域中通常已知的用于蛋白质的分离/纯化方法来纯化。非限制性实例包括萃取、重结晶、盐析(例如，使用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、正相色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法、电泳、逆流分布法或这些方法的任何组合。纯化后，可通过本领域已知的多种方法中的任何方法，包括但不限于，过滤和透析，将蛋白质交换到不同的缓冲液中和/或浓缩。
[0157]
经纯化的蛋白质优选为至少85％纯，更优选为至少95％纯，且最优选为至少98％或99％纯。不论纯度的精确数值，蛋白质的纯度足以用作医药产品。
[0158]
示例性用途
[0159]
修饰的fbs蛋白可以应用于未通过添加pmxn部分被修饰的fbs蛋白能够应用的任
何目的。
[0160]
在一个方面，本技术提供了包含可用于治疗病症的修饰fbs部分的蛋白质。可以治疗的疾病或病症将由fbs部分的结合特异性来定义。如本文中描述的，修饰的fbs部分可被设计为与任何感兴趣的靶标结合。示例性的靶标包括，例如，tnf-α、vegfr2、pcsk9、il-23、egfr和igf1r。只是作为例子，与tnf-α结合的修饰的fbs部分可用于治疗自身免疫病症，如类风湿关节炎、炎性肠病、银屑病、和哮喘。本文中描述的修饰的fbs蛋白还可用于治疗癌症。
[0161]
在某些实施方案中，用于治疗患有诸如癌症之类的疾病的受试者的方法包括向受试者给予修饰的fbs-药物偶联物。
[0162]
本文中提供了用于向受试者给予蛋白质的方法。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，所述蛋白质对于哺乳动物尤其是人类是药学上可接受的。“药学上可接受的”组合物是指给予动物而无显著不良医疗后果的组合物。药学上可接受的组合物的实例包括包含缺乏整联蛋白结合结构域(rgd)的fbs部分的组合物、以及基本上不含内毒素或热原或具有极低内毒素或热原水平的组合物。
[0163]
本文中描述的修饰的fbs蛋白的其他用途包括它们在体外或体内检测测定法中的用途。例如，它们可用于检测样品中的靶分子。方法可包括使该样品与本文中描述的修饰的fbs接触，其中所述接触在允许fbs-靶标复合物形成的条件下进行；和检测所述复合物，由此检测所述样品中的所述靶标。可使用任何本领域公认的技术进行检测，例如放射线照相术、免疫测定法、荧光检测、质谱法、或表面等离子体共振。样品可来自人或其他哺乳动物。对诊断目的而言，适当的作用剂是包括用于全身成像的放射性同位素的可检测标记物，以及用于样品测试的放射性同位素、酶、荧光标记物和其他适合的抗体标签。
[0164]
在某些实施方案中，本文中描述的修饰的fbs可用于多种诊断和成像应用中。在某些实施方案中，用体内可检测的部分标记修饰的fbs，并且如此标记的fbs可用作体内成像剂，例如用于全身成像的体内成像剂。例如，在一个实施方案中，用于检测受试者体内含有给定抗原的肿瘤的方法包括：向受试者给予与可检测标记物连接的修饰的fbs，并且在适当的时间后检测受试者体内的标记物。
[0165]
fbs成像剂可以用来诊断与给定抗原水平增加相关的病症或疾病，例如癌症，其中肿瘤选择性地过表达所述抗原。以类似的方式，与给定抗原特异性地结合的修饰的fbs可以用来监测正在由于与该抗原相关的状况而接受治疗的受试者体内该抗原的水平。修饰的fbs可以修饰后也可以不修饰而使用，并且可以通过共价或非共价附接可检测部分加以标记。
[0166]
制剂和施用
[0167]
本技术进一步提供了包含本文中描述的蛋白质的药学上可接受的组合物，其中所述组合物基本上不含内毒素和/或热原。
[0168]
通过将所描述的具有期望纯度的蛋白质与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合而制备用于储存的包含蛋白质的治疗制剂(osol,a.编辑，remington's pharmaceutical sciences，第16版(1980))，其呈水溶液、冻干或其他干燥制剂的形式。采用剂量和浓度的可接受的载体、赋形剂、或稳定剂对于接受者是无毒的，并且包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂
(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类、二糖类、和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖、或葡聚糖；螯合剂，如edta；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如，zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如吐温、或聚乙二醇(peg)。
[0169]
在被治疗的特殊适应症需要时，本文中的制剂还可含有一种以上的活性化合物，优选地，所述活性化合物具有彼此无不良影响的互补活性。这样的分子以对预期目的有效的量适当地组合存在。
[0170]
还可例如通过凝聚技术或通过界面聚合而将蛋白质包埋在制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。这样的技术公开于osol,a.编辑，remington'spharmaceutical sciences，第16版(1980)中。
[0171]
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这通过无菌过滤膜容易实现。
[0172]
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适合实例包括含有本文中描述的蛋白质的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品的形式，例如薄膜、或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、l-谷氨酸和y乙基-l-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如lupron(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的注射微球)、和聚-d-(-)-3-羟丁酸。虽然诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够使分子释放持续100天，但某些水凝胶释放蛋白质持续较短的时期。当封装的蛋白质在体内长时间保留时，它们可能由于暴露于37℃的湿气而变性或凝集，导致生物活性的丧失和可能的免疫原性变化。可以根据所涉及的机制针对稳定化设计合理的策略。例如，如果发现凝集机制为通过巯基二硫键转换的分子间s
‑‑
s键形成，可通过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制含湿量、使用适当的添加剂、和开发特定的聚合物基质组成而实现稳定化。
[0173]
虽然技术人员将理解，每种蛋白质的剂量将取决于蛋白质的个性(identity)，优选的剂量范围可以为从约10mg/平方米到约2000mg/平方米，更优选从约50mg/平方米到约1000mg/平方米。
[0174]
为了治疗应用，以药学上可接受的剂型向受试者给予蛋白质。所述蛋白质可以推注的方式或通过在一定时段中以连续方式静脉内给予，通过肌内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、或吸入途径给予。还可以通过瘤内、肿瘤周围、病灶内、或病灶周围途径给予蛋白质，以发挥局部以及全身性疗效。适合的药学上可接受的载体、稀释剂、和赋形剂是熟知的，并且在临床情况允许的情况下可由本领域的技术人员确定。适合的载体、稀释剂和/或赋形剂包括：(1)杜尔贝科(dulbecco)磷酸盐缓冲盐水，ph约7.4，含有1mg/ml到25mg/ml的人血清白蛋白，(2)0.9％盐水(0.9％w/v nacl)、和(3)5％(w/v)右旋糖。本发明的方法可以在体外、体内、或离体实施。
[0175]
蛋白质、和一种或多种另外的治疗剂的给药，无论是联合给药还是依次给药，可如
上文针对治疗应用的描述来进行。技术人员将了解，用于联合给药的适合的药学上可接受的载体、稀释剂、和赋形剂取决于联合给药的具体治疗剂的个性(identity)。
[0176]
当以除了冻干剂型之外的含水剂型存在时，一般将蛋白质配制为约0.1mg/ml到100mg/ml的浓度，不过也允许这些范围之外的广泛变化。对于疾病的治疗，适当的蛋白质剂量将取决于有待治疗的疾病的类型、该疾病的严重性和病程、所述蛋白质是为预防目的还是治疗目的、先前治疗的过程、患者的临床病史和对融合物的反应、以及主治医师的裁量。适当地以一次或经过一系列治疗向患者施用蛋白质。
[0177]
示例性实施方案
[0178]
1.一种分离的特异性地与靶标结合的基于纤连蛋白的支架(fbs)蛋白，其中所述fbs是非天然存在的fbs，并且其中该fbs在其c端与由氨基酸序列pmxn组成的部分连接，其中p是脯氨酸，x是任何氨基酸，m是至少为1的整数，n是0或至少为1的整数，并且其中pmxn部分对fbs蛋白提供了相对于未与pmxn部分连接的fbs蛋白增强的特性。
[0179]
2.实施方案1的分离的fbs蛋白，其中该部分由p组成(m是1并且n是0)。
[0180]
3.实施方案1的分离的fbs蛋白，其中该部分由pp组成(m是2并且n是0)。
[0181]
4.实施方案1的分离的fbs蛋白，其中该部分由pmxn组成，其中n是1-150。
[0182]
5.实施方案1的分离的fbs蛋白，其中该部分由pmxn组成，其中n是1-10。
[0183]
6.实施方案1的分离的fbs蛋白，其中该部分由pmxn组成，其中n是1-5。
[0184]
7.实施方案1的分离的fbs蛋白，其中该部分由pi、pc、pid、pie、pidk(seq id no:61)、piek(seq id no:63)、pidkp(seq id no:65)、piekp(seq id no:67)、pidkps(seq id no:69)、piekps(seq id no:71)、pidkpc(seq id no:73)、piekpc(seq id no:75)、pidkpsq(seq id no:77)、piekpsq(seq id no:79)、pidkpcq(seq id no:81)、piekpcq(seq id no:83)、phhhhhh(seq id no:87)或pchhhhhh(seq id no:86)组成。
[0185]
8.实施方案1-7的任一项的分离的fbs蛋白，其中该fbs蛋白是fn3蛋白。
[0186]
9.实施方案8的分离的fbs蛋白，其中该fn3蛋白是
10
fn3蛋白。
[0187]
10.实施方案9的分离的fbs蛋白，其中该
10
fn3蛋白是人
10
fn3蛋白。
[0188]
11.实施方案1-10的任一项的分离的fbs蛋白，其包含与seq id no:1具有至少50％同一性的氨基酸序列。
[0189]
12.实施方案1-11的任一项的分离的fbs蛋白，其在至少一个环区或一个支架区中包含至少一个氨基酸突变。
[0190]
13.实施方案1-12的任一项的分离的fbs蛋白，其包含氨基酸序列vsdvprdlevvaa(x)ullisw(x)vyrity(x)wftv(x)
x
atisgl(x)yytitvya(x)zisinyrt(seq id no:9)，其中(x)u、(x)v、(x)w、(x)
x
、(x)y和(x)z由野生型氨基酸序列(seq id no:1)组成或相对于相应野生型序列包含至少一个氨基酸差异，并且该序列任选地包含1-10个支架、n端和/或c端突变。
[0191]
14.实施方案1-13的任一项的分离的fbs蛋白，其包含与seq id no:1至少50％相同的氨基酸序列，其中fbs蛋白的c端氨基酸残基与由pmxn组成的部分融合，其中fbs蛋白以小于500nm的kd与靶标特异性地结合，所述靶标不被包含seq id no:1的野生型
10
fn3分子所结合。
[0192]
15.实施方案14的分离的fbs蛋白，其包含与seq id no:1至少70％相同的氨基酸
序列。
[0193]
16.实施方案1-15的任一项的分离的fbs蛋白，其中由pmxn组成的部分通过肽键与fbs蛋白的c端氨基酸残基连接。
[0194]
17.实施方案1-16的任一项的分离的fbs蛋白，其中pmxn是p或pc。
[0195]
18.实施方案1-17的任一项的分离的fbs蛋白，其包含与seq id no:1至少60％相同的氨基酸序列，其中fbs蛋白的c端氨基酸残基通过肽键与脯氨酸连接，其中fbs蛋白以小于500nm的kd与靶标特异性地结合，所述靶标不被包含seq id no:1的野生型
10
fn3分子所结合。
[0196]
19.实施方案1-18的任一项的分离的fbs蛋白，其中pmxn的至少一个x是半胱氨酸并且其中该半胱氨酸
[0197]
20.实施方案19的分离的fbs蛋白，其中该半胱氨酸与异源部分偶联。
[0198]
21.实施方案20的分离的fbs蛋白，其中该异源分子是可检测部分。
[0199]
22.实施方案20或21的分离的fbs蛋白，其中该异源分子是药物部分，并且该药物部分和fbs形成fbs-药物偶联物。
[0200]
23.实施方案1-22的任一项分离的fbs蛋白，其中由pmxn部分赋予的增强特性是增强的稳定性。
[0201]
24.实施方案23的分离的fbs蛋白，其中增强的稳定性是tm增加至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或更多。
[0202]
下列代表性实施例包含适用于本发明在其不同的实施方案及其等同方案中的实践的重要附加信息、范例和指导。这些实施例旨在帮助说明本发明，而不意图构成也不应解释为对本发明范围的限制。
实施例
[0203]
实施例1：通过在
10
fn3分子的c端添加脯氨酸而增强热稳定性
[0204]
在自然界中，
10
fn3是一长串纤连蛋白iii型结构域中的一部分；紧接在
10
fn3下游的结构域被命名为
11
fn3。以下序列显示了
10
fn3的野生型序列(斜体)和
11
fn3(粗体)结构域，以及它们之间的接合部(加下划线)。
[0205][0206]
基于
10
fn3的晶体和nmr结构以及在
10
fn3与
11
fn3之间的序列比对(dickinson等人，"crystal structure of the tenth type iii cell adhesion module of human fibronectin",j.mol.biol.,36:1079-1092(1994))，这个序列的头两个残基，rt，是
10
fn3的最后β链(“链g”)的一部分，并且该序列的剩余部分eidkpsq是一个柔性接头，位于结构化的纤连蛋白iii型第十和第十一结构域之间。
[0207]
基于
10
fn3的工程化的蛋白质结构域的c端常常自野生型序列加以修饰，以帮助其克隆、表达和纯化。在针对不同的adnectin的工程化c端的调查中发现，从rte到rtp的突变导致了几种不同的adnectin的热稳定性增加。表4列出了在本研究中使用的不同c端。
[0208]
表4：在
10
fn3和
11
fn3之间的野生型接头以及在本研究中进行比较的工程化adnectin c端序列。“具有p和his标签的短的工程化c端”和“具有pc的短的工程化c端”含有rte到rtp的突变。
[0209][0210][0211]
通过比较几对在c端有差异的adnectin，测试了从rte到rtp突变对adnectin热稳定性的影响。表5描述了在本研究中使用的几对adnectin，包括其名称、靶标、和热力学特性。adnectin 1为与靶标x结合的adnectin。所有列出的adnectin均是使用profusion(mrna-展示)技术从高复杂度文库中选择的，并通过定向诱变将其c端再工程化。全蛋白质序列列出如下。
[0212]
表5：克隆名称、c端、靶标、和解链温度(如通过差示扫描量热法在0.5mg/ml在pbs(ph 7.4)中测定的)。adnectin prd-1414和prd-1417与40kda的2分支的peg(nof,cat.#gl2-400ma01)偶联
[0213][0214]
在本实施例中使用的蛋白质的氨基酸序列：
[0215]
adx_2382_d09:
[0216]
mgvsdvprdlevvaatptslliswdapaegygyyritygetggnspvqeftvpvskgtatisglkpgvdytitvyavefdfpgagyyhrpisinyrteidkpsqhhhhhh*(seq id no:96)
[0217]
adx_5484_a03:
[0218]
mgvsdvprdlevvaatptslliswdapaegygyyritygetggnspvqeftvpvskgtatisglkpgvdytitvyavefdfpgagyyhrpisinyrtphhhhhh*(seq id no:97)
[0219]
adx_2987_h07:
[0220]
mgvsdvprdlevvaatptslliswtlphagrahyyritygetggnspvqeftvpgrgvtatisglkpgvdytitvyavtvtttkvihykpisinyrteidkpsqhhhhhh*(seq id no:97)
[0221]
adx_5484_a04:
[0222]
mgvsdvprdlevvaatptslliswtlphagrahyyritygetggnspvqeftvpgrgvtatisglkpgvdytitvyavtvtttkvihykpisinyrtphhhhhh*(seq id no:98)
[0223]
prd-1414:
[0224]
mgvsdvprdlevvaatptslliswdapaegygyyritygetggnspvqeftvpvskgtatisglkpgvdytitvyavefdfpgagyyhrpisinyrtec*(seq id no:99)
[0225]
prd-1417:
[0226]
mgvsdvprdlevvaatptslliswdapaegygyyritygetggnspvqeftvpvskgtatisglkpgvdytitvyavefdfpgagyyhrpisinyrtpc*(seq id no:100)
[0227]
在以上每个序列中的“*”表示终止密码子，以及每个adnectin的c端。
[0228]
在每种蛋白质的细菌表达过程中，n端m被去除。在表征每种蛋白质之前，纯化的prd-1414和prd-1417蛋白中的c残基与peg偶联。
[0229]
如表5中所示，具有在c端含有脯氨酸取代野生型谷氨酸(rte到rtp突变)的c端的adnectin显示出更高的热稳定性。对于几个实施例，当以人
10
fn3和
11
fn3之间的天然接头为模型的较长c端被取代为仅含有脯氨酸和六聚组氨酸纯化标签的较短的工程化c端时，观察到这种稳定性的增加。在具有短的工程化c端和聚乙二醇(peg)的
10
fn3蛋白中，在添加c端脯氨酸之后，也观察到热稳定性的提高。这种稳定性的增加可能因为该特定位置上的脯氨酸的存在。
[0230]
实施例2：具有c端脯氨酸的第二pcsk9 adnectin的稳定化
[0231]
这个实施例显示，通过添加c端脯氨酸也增强了另一种pcsk9 adnectin分子的热稳定性。
[0232]
在这个实施例中，聚乙二醇化的(40kda分支的peg)pcsk9 adnectin adx_2013_e01的c端来自nyrteiekpcq(seq id no:101)到nyrtpc(seq id no:102)的修饰，并通过tsf测量稳定性。这种adnectin的氨基酸序列提供在wo 2011/130354中。这些结果指示，具有nyrteiekpcq(seq id no:101)c端的聚乙二醇化的adnectin具有70℃的tm，而具有nyrtpc(seq id no:102)c端的聚乙二醇化的adnectin具有76℃的tm。
[0233]
因此，这种pcsk9 adnectin的热稳定性由于c端脯氨酸的存在而提高了6℃。
[0234]
实施例3：不同的c端关于热稳定性的比较
[0235]
本实施例显示了在其c端有或没有脯氨酸的adnectin以及在其c端具有2个脯氨酸的adnectin的热稳定性的比较。
[0236]
对于两种实施例1中描述的adnectin(与pcsk9结合的adx_2392_d09和与肌肉生长抑制素结合的adx_2987_h07)以及另一种与不同的靶标结合的adnectin(adnectin 1，与靶标x结合)，修饰它们的c端，如表6中所示，并确定了它们的热稳定性和单体％。针对不同靶标(x)的adnectin(“adnectin 1”)也用相同的c端序列加以修饰。通过tsf确定热稳定性并通过sec确定单体％。
[0237]
表6：具有不同c端的adnectin的单体百分比和热稳定性
[0238][0239]
如表6所示的结果表明，c端的身份对单体％没有显著影响，然而，它对解链温度(tm)有影响。如实施例1中描述的，对两种adnectin而言，nyrtph6(seq id no:105)相对于nyrth6(seq id no:104)都增加了热稳定性：对pcsk9 adnectin增加了4℃，对肌肉生长抑制素adnectin增加了6℃。另外，第二个脯氨酸的存在提供了与单一脯氨酸所提供的相似的稳定作用。
[0240]
因此，相对于没有c端脯氨酸的相同分子，一个或两个c端脯氨酸的存在增强了adnectin的热稳定性。
[0241]
实施例4：c端脯氨酸的添加提高了溶解度
[0242]
本实施例证明，相对于没有c端脯氨酸的相同串联adnectin，c端脯氨酸的存在提高了串联adnectin的溶解度。
[0243]
串联adnectin，即，由接头连接的两个adnectin，其各自与不同靶标结合并含有nyrte(seq id no:107)c端或nyrtp(seq id no:108)c端，在大肠杆菌blr细胞中表达并且在30℃发酵。没有脯氨酸的串联物的效价为1.2g/l可溶蛋白和2.8g/l总蛋白，表明所表达的蛋白质的43％可溶。具有脯氨酸的串联物的效价为2.56g/l可溶蛋白和2.61g/l总蛋白。即使在使没有脯氨酸的串联物的不溶部分复性、并且获得98％纯和2.5mg/ml的单体的溶液之后，此蛋白质组成亦未显示出与其靶标的显著结合，表明它可能没有正确地重折叠。
[0244]
因此，鉴于在两种蛋白质之间的唯一差异是在c端分别存在e和p，这些结果表明脯氨酸的存在为串联物提供了提高的溶解度。
[0245]
综上所述，本技术包括但不限于以下各项：
[0246]
1.一种分离的特异性地与靶标结合的基于纤连蛋白的支架(fbs)蛋白，其中所述fbs是非天然存在的fbs，并且其中所述fbs在其c端与由氨基酸序列pmxn组成的部分连接，其中p是脯氨酸，x是任何氨基酸，m是至少为1的整数，n是0或至少为1的整数，并且其中该pmxn部分对该fbs蛋白提供相对于未与pmxn部分连接的fbs蛋白的增强的特性。
[0247]
2.项1的分离的fbs蛋白，其中该部分由p组成(m是1并且n是0)。
[0248]
3.项1的分离的fbs蛋白，其中该部分由pp组成(m是2并且n是0)。
[0249]
4.项1的分离的fbs蛋白，其中该部分由pmxn组成，其中n是1-150。
[0250]
5.项1的分离的fbs蛋白，其中该部分由pmxn组成，其中n是1-10。
[0251]
6.项1的分离的fbs蛋白，其中该部分由pmxn组成，其中n是1-5。
[0252]
7.项1的分离的fbs蛋白，其中该部分由pi、pc、pid、pie、pidk(seq id no:61)、piek(seq id no:63)、pidkp(seq id no:65)、piekp(seq id no:67)、pidkps(seq id no:69)、piekps(seq id no:71)、pidkpc(seq id no:73)、piekpc(seq id no:75)、pidkpsq(seq id no:77)、piekpsq(seq id no:79)、pidkpcq(seq id no:81)、piekpcq(seq id no:83)、phhhhhh(seq id no:87)或pchhhhhh(seq id no:86)组成。
[0253]
8.项1-7的任一项的分离的fbs蛋白，其中该fbs蛋白是fn3蛋白。
[0254]
9.项8的分离的fbs蛋白，其中该fn3蛋白是
10
fn3蛋白。
[0255]
10.项9的分离的fbs蛋白，其中该
10
fn3蛋白是人
10
fn3蛋白。
[0256]
11.项1-10的任一项的分离的fbs蛋白，其包含与seq id no:1至少50％相同的氨基酸序列。
[0257]
12.项1-11的任一项的分离的fbs蛋白，其在至少一个环区或一个支架区中包含至少一个氨基酸突变。
[0258]
13.项1-12的任一项的分离的fbs蛋白，其包含氨基酸序列vsdvprdlevvaa(x)ullisw(x)vyrity(x)wftv(x)xatisgl(x)yytitvya(x)zisinyrt(seq id no:9)，其中(x)u、(x)v、(x)w、(x)x、(x)y和(x)z由野生型氨基酸序列(seq id no:1)组成或包含相对于相应野生型序列的至少一个氨基酸差异，并且该序列任选地包含1-10个支架、n端和/或c端突变。
[0259]
14.项1-13的任一项的分离的fbs蛋白，其包含与seq id no:1至少50％相同的氨基酸序列，且其中该fbs蛋白的c端氨基酸残基与由pmxn组成的部分融合，其中该fbs蛋白以小于500nm的kd与靶标特异性地结合，所述靶标不被包含seq id no:1的野生型10fn3分子结合。
[0260]
15.项14的分离的fbs蛋白，其包含与seq id no:1至少70％相同的氨基酸序列。
[0261]
16.项1-15的任一项的分离的fbs蛋白，其中所述由pmxn组成的部分通过肽键与所述fbs蛋白的c端氨基酸残基连接。
[0262]
17.项1-16的任一项的分离的fbs蛋白，其中所述pmxn是p或pc。
[0263]
18.项1-17的任一项的分离的fbs蛋白，其包含与seq id no:1至少60％相同的氨基酸序列，且其中该fbs蛋白的c端氨基酸残基通过肽键与脯氨酸连接，且其中该fbs蛋白以小于500nm的kd与靶标特异性地结合，所述靶标不被包含seq id no:1的野生型10fn3分子结合。
[0264]
19.项1-18的任一项的分离的fbs蛋白，其中所述pmxn的至少一个x是半胱氨酸。
[0265]
20.项19的分离的fbs蛋白，其中该半胱氨酸与异源部分偶联。
[0266]
21.项20的分离的fbs蛋白，其中该异源分子是可检测部分。
[0267]
22.项20或21的分离的fbs蛋白，其中该异源分子是药物部分，并且该药物部分和所述fbs形成fbs-药物偶联物。
[0268]
23.项1-22的任一项分离的fbs蛋白，其中由所述pmxn部分赋予的增强特性是增强的稳定性。
[0269]
24.项23的分离的fbs蛋白，其中增强的稳定性是tm增加至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或更多。
[0270]
在背景、详述、附图简述、和实施例中引证的每篇文献(包括专利、专利申请、期刊论文、摘要、实验手册、书籍、登录号、登录号、或其他公开内容)的全部公开内容特此通过提述完整并入本文。
[0271]
本发明在范围上不受本文中公开的具体实施方案的限制，这些实施方案旨在作为本发明的单独方面的简单说明，并且在功能上等效者均在本发明的范围内。根据前述说明和教导，除了在本文中描述的那些之外，对本发明的模型和方法的多种修改对于本领域技术人员是显而易见的，并且类似地预期落入本发明的范围内。可以实施这样的修改或其他实施方案而不脱离本发明的真正范围和精神。