细胞的制作方法

细胞
发明领域
1.本发明涉及一种工程化细胞，其表达嵌合抗原受体(car)和转基因t细胞受体(tcr)；和fas配体(fasl)结合受体。
2.发明背景
3.肿瘤微环境(tme)为肿瘤细胞提供存活、生长和免疫抗性的基本信号。tme是抑制免疫性的并且在免疫治疗中(如car t细胞治疗)能够抑制免疫细胞的持续和存活。tme使用的免疫抑制机制包括例如上调免疫检验点信号如pdl-1和/或ctla-4以及分泌细胞因子如il-6和/或tgf-β。
4.最近的证据表明免疫抑制性的tme也上调死亡配体如fas配体(fasl)。fasl诱导表达fas的死亡受体的免疫细胞如肿瘤浸润淋巴细胞(til)的凋亡。
5.除了tme上调死亡配体外，还显示car-t细胞自身在激活和car构建体转导时上调死亡受体和它们的配体，引起激活诱导的死亡(aicd)并且进一步恶化car-t细胞在tme中持续存在的问题。此外，fasl不仅由激活的t细胞表达，而且也在暴露于激活的t细胞产生的ifnγ时被上调。
6.特别地，具有两个共刺激胞内域的第三代car似乎由于增加的fasl表达而对aicd非常敏感(xu等人,2017,hum vaccin immunother.13(7):1548-1555,benmebarek等人,2019,inj mol sci.20(6):1283)。
7.科学家们已经尝试用抗体技术阻断fas/fasl相互作用，但体内数据显示每2到3天需要显著数量的抗体，这导致在实践中显著的副作用(ma等人.,2016,plos pathog.12(5):e1005642)。
8.此外，由于fasl是t细胞施加杀伤的重要武器，用抗体阻断fasl会妨碍car t细胞的杀伤作用(gargett等人,2016,mol ther.24:1135-49)。
9.因此，需要可替代的方法以消除对car t细胞的死亡受体刺激，以缓解这个免疫检验点并提高工程化细胞在tme中的持续存在和存活的效力。
10.发明概述
11.本发明人已经确定表达竞争性结合fasl并中和fas-fasl途径的受体的细胞能够减少或阻止fas诱导的凋亡。这一受体和car或转基因tcr的共表达改善了表达car/tcr的细胞向肿瘤脉管系统的浸润和其在tme的持续存在。
12.发明人提出两个可选择的方法来实现fas-fasl途径的中和，二者都竞争性地结合fasl，阻断fasl引发三聚化和经由它们各自的死亡域的同型相互作用而招募一种被称为fas相关死亡域(fadd)的蛋白的能力。
13.第一种方法涉及将fas受体的细胞外域与肿瘤坏死因子受体(tnfr)的细胞内信号传导域融合。第二种方法涉及表达与fasl结合的膜结合型诱饵受体3(dcr3)。
14.相应地，在第一方面，本发明提供了一种细胞，其包含(a)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(b)fasl结合受体(flbr)，所述flbr包含：(i)fas胞外域和tnfr胞内域，其中所述tnfr胞内域包含诱饵受体2(dcr2)、gitr、cd30、xedar、cd40、cd27、bcma或
fn14胞内域的信号传导部分，或(ii)膜结合型诱饵受体3(dcr3)。
15.不同的是，本发明fas受体的胞内域tnfr胞内域不能经由同型相互作用结合至fas相关死亡域(fadd)上的死亡域，并且因此死亡诱导信号传导复合体(disc)的组装受到了抑制，这最终抑制fas-fasl至凋亡的途径。相似地，膜结合型dcr3与fasl的结合超过了fas受体，这中和了fas-fasl途径。
16.在上述第一种方法中，本发明的flbr可以具有通用结构：
17.fas exo-tm-tnfr endo
18.其中：
19.fas exo为fas胞外域；
20.tm为跨膜域；和
21.tnfr endo为tnfr胞外域。
22.具体地，flbr可以包含fas胞外域和cd40胞内域。cd40胞内域可以包含如seq id no.4所示的序列。
23.本技术的flbr可以包含fas跨膜域。可替代地，flbr的跨膜域可以包含cd28跨膜域、cd8a跨膜域、dcr2跨膜域、tyrp-1跨膜域或egfr跨膜域。
24.在上述第二个方法中，flbr可以具有通用结构：
25.dcr3-间隔物-tm-endo
26.其中：
27.dcr3包含dcr3的fasl结合域
28.间隔物为连接dcr3和跨膜域的间隔物序列
29.tm为跨膜域
30.endo为可选的细胞内序列
31.膜结合型dcr3可以经由cd8跨膜茎系链至膜。可替代地，膜结合型dcr3可以经由能够将其他可溶的诱饵受体系链于细胞质膜上的任何序列而系链至膜。
32.膜结合型dcr3可以在c端肝素结合域(hbd)包含突变。这是因为hbd结合硫酸肝素蛋白多糖(hspg)，该hspg经由交联能够诱导树突状细胞凋亡。更具体地，膜结合型dcr3的hbd的c端部分可以包含在参照下文seq id no.9所示的序列的位置k256、r258和r259中的一个或多个处具有突变。将这些否则为碱性的氨基酸突变为丙氨酸残基，会消除与hspg的结合。
33.flbr可以包含选自以下组的序列：fas-dcr2(seq id no:35)、fas-gitr(seq id no:36)、fas-cd30(seq id no:37)、fas-xedar(seq id no:38)、fas-cd27(seq id no:39)、fas-bcma(seq id no:40)、fas-cd40(seq id no:41)、fas-fn14(seq id no:42)、dcr3-cd8stk(seq id no:43)和dcr3mut-cd8stk(seq id no:44)或与seq id no:35-44中的任一个具有至少80％序列同一性的变体。flbr还可以包含多于一个tnfr胞内域。例如，flbr的序列可以为fas-gitr-gitr、fas-gitr-cd30、fas-gitr-xedar或fas-gitr-dcr2。可替代地，flbr可以为例如dcr3-41bb、dcr3-ox40、dcr3-xedar、dcr3-gitr、dcr3-cd40、dcr3-cd27、dcr3-bcma或dcr3-fn14。
34.在第二方面，本发明提供了包含fas胞外域和tnfr胞内域的fasl结合受体(flbr)，其中tnfr胞内域包含诱饵受体2(dcr2)、gitr、cd30、xedar、cd40、cd27、bcma或fn14胞内域
的信号传导部分。特别地，tnfr胞内域可以为cd40胞内域。
35.在第三方面，本发明提供了编码本发明的flbr的核酸序列。
36.在第四方面，本发明提供了核酸构建体，其包含：(a)第一核酸序列，其编码嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(b)第二核酸序列，其编码如上文限定的fasl结合受体(flbr)。
37.第一和第二核酸序列可以被共表达位点(例如编码自切割肽的序列)分隔。
38.在第五方面，本发明提供了核酸序列试剂盒，其包含：(a)第一核酸序列，其编码嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(b)第二核酸序列，其编码如上文限定的fasl结合受体(flbr)。
39.在第六方面，本发明提供了载体，其包含根据本发明第三方面的核酸序列或根据本发明第四方面的核酸构建体。
40.在第七方面，本发明提供了载体试剂盒，其包含：
41.(a)第一载体，其包含编码嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)的核酸序列；和
42.(b)第二载体，其包含编码如上文限定的fasl结合受体(flbr)的核酸序列。
43.在第八方面，本发明提供了药物组合物，其包含多个根据本发明第一方面的细胞。
44.在第九方面，本发明提供了根据本发明第八方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
45.在第十方面，本发明提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包含向有此需要的受试者施用根据本发明第八方面的药物组合物的步骤。
46.该方法可以包含下列步骤：(i)分离含有细胞的样品；(ii)用根据本发明第三方面的核酸序列、根据本发明第四方面的核酸构建体、根据本发明第五方面的核酸序列试剂盒、根据本发明第六方面的载体、或根据本发明第七方面的载体试剂盒转导或转染所述细胞；和(iii)向受试者施用来自(ii)的细胞。
47.细胞可以为自体的或同种异体的。
48.在第十一方面，本发明提供了根据本发明第八方面的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
49.疾病可以是癌症。
50.在第十二方面，本发明提供了制造根据本发明第一方面的细胞的方法，其包含在体外将根据本发明第三方面的核酸序列、根据本发明第四方面的核酸构建体、根据本发明第五方面的核酸序列试剂盒、根据本发明第六方面的载体或根据本发明第七方面的载体试剂盒引入细胞的步骤。
51.细胞可以来自分离自受试者的样品。
52.出人意料的是，发明人发现与表达仅具有截短的fas细胞内死亡域的fas受体的细胞相比，细胞表达本发明的fasl结合受体(flbr)对该细胞传递更强的对fasl介导的凋亡的抗性。发明人提出利用这项发现来产生对tme内fasl诱导具有更有效抗性的car-和tcr-表达细胞，从而提供优越的免疫疗法。
53.附图简述
54.图1-(a)说明经典car的示意图。(b)至(d)：car胞内域的不同代和排列：(b)初始设
计通过fcεr1-γ或cd3ζ胞内域单独传输itam信号，而后期设计在相同的混合的胞内域中传输额外的(c)一个或(d)两个共刺激信号。
55.图2-说明wt fas-fasl诱导凋亡(a)和fas-l结合受体(flbr)：fas-dcr2(b)、fas-tnfr(c)、膜结合型dcr3(d)和dcr3结构(e)的示意图。
56.图3-tnf超家族的汇总。fas和trail受体分子均使用fadd作为衔接分子并且tnfr1和d3使用tradd作为衔接分子。
57.图4-在肿瘤微环境(tme)中的fas-fasl相互作用的示意图。fasl由t细胞/car-t细胞表达并且过度激活的t细胞导致激活诱导的细胞死亡(aicd)(a)，mdsc(b)，t regs(c)，肿瘤内皮细胞(d)，癌细胞(e)和癌症分泌外泌体(f)。
58.图5-t细胞共培养测定法的示意图。
59.图6-相对于来自fmc63(抗cd19 car)转导的pbmc的细胞计数，比较car与fasl结合构建体共表达的总细胞存活计数的流式细胞术数据。fasl结合受体(flbr)构建体fas-dcr2、fas-gitr和fas-cd30和dcr3-cd8stk显示出优于其他构建体的细胞死亡挽救。
60.图7-比较car与fasl结合构建体dcr3和dcr3-cd8stk共表达的总细胞存活计数的流式细胞术数据。膜结合型dcr3-cd8stk显示出优于可溶性dcr3的细胞存活。
61.图8-比较转导的rqr8阳性细胞的存活的流式细胞术数据。fasl结合受体(flbr)构建体fas-dcr2、fas-gitr和fas-cd30显示出优于其他构建体的细胞死亡挽救。虚线指示经转导以共表达fmc63、fasδdd和fasl的pbmc的平均存活。
62.图9-使用固定化重组可溶性fas配体诱导细胞死亡，相对于fmc63比较car与fasl结合构建体共表达的总细胞存活计数的流式细胞术数据。fasl结合受体(flbr)构建体fas-dcr2和fas-gitr显示出优于其他构建体的细胞死亡挽救。
63.图10-使用固定化重组可溶性fas配体诱导细胞死亡，相对于fmc63比较car与fasl结合构建体共表达的转导的rqb8阳性细胞存活的流式细胞术数据。
64.图11-使用固定化可溶性重组fas配体诱导细胞死亡，比较绝对rqr8阳性细胞计数的流式细胞术数据。
65.图12-使用固定化可溶性fas配体诱导细胞死亡，比较第5天和第0天绝对rqr8阳性细胞计数的增殖倍数差异。fasl结合受体构建体fas-xedar显示出比截短的fas细胞内死亡域构建体高得多的增殖倍数差异。
66.图13-使用固定化可溶性fas配体诱导细胞死亡，比较转导的rqr8阳性细胞百分比的流式细胞术数据。fasl结合受体(flbr)构建体fas-xedar在第0天和第5天显示出高于截短的fas细胞内死亡域的rqr8阳性细胞富集。
67.图14-使用固定化可溶性fas配体诱导细胞死亡，比较转导的rqr8阳性细胞的存活的流式细胞术数据。fasl结合受体(flbr)构建体fas-xedar显示出从fasl介导的细胞死亡的保护，在“fasl 抗fmc53”条件下明显。
68.图15-使用固定化可溶性fas配体诱导细胞死亡，显示出fasl结合配体(flbr)构建体fas-xedar相比截短的fas细胞内死亡域分泌显著更高的基底干扰素γ的流式细胞术数据。
69.图16-显示fasl结合受体(flbr)构建体fas-xedar相比截短的fas细胞内死亡域分泌显著更高的诱导性il-2的流式细胞术数据。
70.图17-使用固定化可溶性fas配体诱导细胞死亡，比较转导的rqr8阳性细胞的存活和绝对细胞计数的流式细胞术数据。出人意料地是，用flbr构建体fas-cd27、fas-cd40、fas-bcma和fas-fn14转导的pbmc与fasδdd和fas-41bb相比具有更高的绝对rqr8阳性细胞计数。
71.图18-使用固定化可溶性fas配体诱导细胞死亡，相对于在pbs处理孔温育的转导的pbmc，比较转导的rqr8阳性细胞的绝对细胞计数的流式细胞术数据。当用固定化fasl温育时，相比于fasδdd，用flbr构建体fas-cd27、fas-cd40、fas-bcma和fas-fn14转导的pbmc具有优越的增殖。
72.图19-使用固定化可溶性fas配体诱导细胞死亡，比较转导的rqr8阳性细胞的增殖倍数差异(第5天的绝对细胞计数与第0天的绝对细胞计数相比)。当用固定化fasl温育时，相比于fasδdd和fas-41bb，用flbr构建体fas-cd27、fas-cd40、fas-bcma和fas-fn14转导的pbmc具有优越的增殖。
73.图20-使用固定化可溶性fas配体诱导细胞死亡，显示出当与fas配体温育时flbr构建体fas-cd27、fas-cd40、fas-bcma和fas-fn14相比fasδdd分泌显著更高的干扰素γ的流式细胞术数据。flbr构建体fas-cd40、fas-bcma和fas-fn14也诱导基底干扰素γ的分泌(相比于pbd条件)。
74.图21-在反复遭遇抗原后，与gd2靶向car共表达的fas-xedar、fas-cd40、fas-bcma和fas-fn14提高细胞毒性潜力。
75.gd2靶向car t细胞与supt1 gd2靶物以1:1的效应物与靶物的比率共培养。每3-4天，用0.5x105supt1 gd2细胞/孔重新刺激car t细胞。每次重新刺激前用facs定量靶细胞杀伤。剩余存活的靶细胞通过其sytox blue的排除和cd2和cd3表达的缺乏来定义，而t细胞通过cd2和cd3的表达来定义。线代表3个单独的pbmc供体的中位值。
76.发明详述
77.fas-fasl途径
78.fas受体(cd95，肿瘤坏死因子受体超家族成员6，uniprot id:p25445)是相对分子质量约45,000的1型跨膜糖蛋白受体，其定位于包括淋巴细胞和肝细胞在内的多种细胞的表面。fas受体引发导致细胞凋亡的信号转导途径，并且fas的表达可以被淋巴细胞的激活以及细胞因子如ifnγ和tnf提高。fas与其配体fasl(fasl/cd95l，uniprot id：p48023)的相互作用调节了许多通过程序性细胞死亡介导的生理和病理过程。
79.fas和fasl都是tnf-r超家族的成员，其包含1-5个细胞外富含半胱氨酸域(crd)以及在它们的细胞质尾部中的由80-100个残基长的基序组成的死亡域(dd)。
80.fas与fasl的结合经由它们的死亡域(dd)的同型相互作用引发受体三聚化并招募被称为fas相关死亡域(fadd)的蛋白质。接下来，fadd随后将procaspase-8招募至激活的受体，并且产生的死亡诱导信号传导复合体(disc)执行半胱天冬酶-8蛋白水解激活，这起始随后的半胱天冬酶(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)介导的凋亡的级联(图2a和3)。
81.fasl是一个重要的免疫检查点，因为其在tme内的许多细胞中过表达(图4)。据报道，许多癌症本身都表达fasl，例如黑色素瘤、肺癌、肝细胞癌、食道癌和结肠癌。
82.另外，已显示肿瘤内皮细胞(其排列血管并控制血液和营养物质流动以及白细胞的运输)表达fasl，而正常脉管系统不表达。
83.此外，fasl由衍生自骨髓的抑制细胞(mdsc)表达。mdsc是异质细胞群，它们在癌症、慢性炎症、自身免疫和传染病期间扩增，并抑制免疫反应从而促进肿瘤生长。最后，据报道癌症相关成纤维细胞(caf)和cd4 cd25 调节性t细胞也表达fasl。
84.t细胞也表达fasl，并且已显示fasl在car-t中进一步上调，这意味着car t细胞对自相残杀敏感。最后，不仅激活的t细胞表达fasl，暴露于由激活的t细胞产生的ifnγ也上调fasl。
85.作为t细胞稳态的机制，持续激活的t细胞通过称为激活诱导细胞死亡(aicd)的机制而死亡，并且fas-fasl途径被表征为其原因。尽管细胞溶解活性和细胞因子产生得到改善，由于fasl表达的提高第三代car-t细胞对aicd更敏感。
86.因此，避免经由fas-fasl途径引发的凋亡为过继转移细胞在浸润(经由肿瘤脉管系统)和在tme内的持续方面提供了显著的益处。
87.fasl结合受体(flbr)
88.本发明涉及fasl结合受体(flbr)，其包含fas胞外域和肿瘤坏死因子受体(tnfr)胞内域。
89.flbr可以具有通用结构：
90.fas exo-tm-tnfr endo
91.其中：
92.fas exo为fas胞外域；
93.tm为跨膜域；和
94.tnfr endo为tnf受体的胞内域。
95.fas胞外域
96.人fas序列从uniprot(登录号p25445)获得并且如下文序列id no.49所示。在这个序列中，残基26-173形成细胞外域(seq id no.50)；残基174-190形成跨膜域(seq id no.20)；并且残基191-335形成细胞质域(seq id no.51)。在seq id no.51中，下划线表示实施例所述的截短的fas(fasδdd)中删除的序列的部分。
97.seq id no.49(人fas)
98.mlgiwtllplvltsvarlssksvnaqvtdinskglelrktvttvetqnleglhhdgqfchkpcppgerkardctvngdepdcvpcqegkeytdkahfsskcrrcrlcdeghgleveinctrtqntkcrckpnffcnstvcehcdpctkcehgiikectltsntkckeegsrsnlgwlcllllpiplivwvkrkevqktcrkhrkenqgshesptlnpetvainlsdvdlskyittiagvmtlsqvkgfvrkngvneakideikndnvqdtaeqkvqllrnwhqlhgkkeaydtlikdlkkanlctlaekiqtiilkditsdsensnfrneiqslv
99.seq id no.50(fas细胞外域)
100.qvtdinskglelrktvttvetqnleglhhdgqfchkpcppgerkardctvngdepdcvpcqegkeytdkahfsskcrrcrlcdeghgleveinctrtqntkcrckpnffcnstvcehcdpctkcehgiikectltsntkckeegsrsn
101.seq id no.51(fas细胞质域)
102.krkevqktcrkhrkenqgshesptlnpetvainlsdvdlskyittiagvmtlsqvkgfvrkngvneakideikndnvqdtaeqkvqllrnwhqlhgkkeaydtlikdlkkanlctlaekiqtiilkditdsensnfrneiqslv
103.本发明的flbr可以包含如seq id no.50所示的fas细胞外域或其变体，该变体与
seq id no.50至少80、90、95或99％相同，条件是所得的flbr分子与内源性fas竞争与fasl的结合并且不具有结合fadd的能力或具有降低的结合fadd的能力。
104.用程序如blast(在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov免费使用)可以容易地确定两个多肽序列之间的同一性百分比。适宜地，在参考和/或查询序列的整体中确定同一性百分比。
105.flbr跨膜域
106.flbr包含跨越膜的跨膜域。跨膜域可以是在膜中热力学稳定，例如不二聚化的任何蛋白质结构。其通常是包含几个疏水残基的α螺旋。可以使用任何跨膜蛋白的跨膜域来提供跨膜部分。本领域技术人员可以使用tmhmm算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/)确定跨膜域的存在和跨距。此外，鉴于蛋白质的跨膜域为相对简单的结构，即经预测形成足够长度以跨越膜的疏水α螺旋的多肽序列，也可以使用人工设计的tm域(us7052906 b1描述了跨膜组分)。
107.跨膜域可以包含疏水α螺旋。跨膜域可以衍生自fas。跨膜域可以包含如seq id no:20所示的序列或其具有至少80％序列同一性的变体。
108.seq id no:20(fas跨膜域)
109.lgwlcllllpiplivwv
110.变体可以与seq id no:20具有至少90、95、98或99％的序列同一性，条件是变体序列保持穿过膜的能力。
111.跨膜域可以基于来自tnfr的跨膜域，例如本文所述的tnfr。适宜地，跨膜域可以基于与存在于flbr中的胞内域相同的tnfr。
112.适宜地，跨膜域可以包含seq id no:20-34中任一项或其具有至少80％序列同一性的变体。变体可以与seq id no:21-34具有至少90、95、98或99％的序列同一性，条件是变体序列保持穿过膜的能力。
113.seq id no:21(dcr2跨膜域)
114.yliiivvlviilavvvvgfsc
115.seq id no:22(gitr跨膜域)
116.lgwltvvllavaacvllltsa
117.seq id no:23(cd30跨膜域)
118.pvlfwvilvlvvvvgssafll
119.seq id no:24(cd8跨膜域)
120.aptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd
121.seq id no:25(cd28跨膜域)
122.flfvllgvgsmgvaaivwgaw
123.seq id no:26(4-1bb跨膜域)
124.iisfflaltstallfllffltlrfsvv
125.seq id no:27(dr3跨膜域)
126.mfwvqvllaglvvplllgatl
127.seq id no:28(ox40跨膜域)
128.vaailglglvlgllgplaill
129.seq id no:29(cd70跨膜域)
130.vlraalvplvaglviclvvci
131.seq id no:30(cd40跨膜域)
132.alvvipiifgilfaillvlvfi
133.seq id no:31(xedar跨膜域)
134.lvalvssllvvf tlaflglff
135.seq id no:32(fn14跨膜域)
136.ilggalsltfvlgllsgflvw
137.seq id no:33(bcma跨膜域)
138.ilwtclglsliislavfvlmfll
139.seq id no:34(cd27跨膜域)
140.ilvifsgmflvftlagalflh
141.tnfr胞内域
142.tnf超家族的细胞质域中的结构基序根据其信号传导特性将它们分为两组：包含死亡域(dd)的那些和接合tnfr相关因子(traf)的其他结构基序。第三组缺乏膜锚定域并且从表面被蛋白水解切割或经由糖脂连接锚定，并且被称为“诱饵受体”。
143.表1给出tnfr的列表。
144.表1
145.[0146][0147]
本技术的flbr可以包含tnfr的胞内域或其信号传导部分。tnfr可以选自以下组成的组：gitr、dcr2、cd30、xedar、cd40、cd27、bcma或fn14。
[0148]
糖皮质激素诱导的tnf受体
[0149]
flbr可以包含gitr(uniprot id:q9y5u5)的胞内域。gitr为在t细胞上组成型表达的细胞表面受体，当cd3/28刺激时其表面表达提高。它是一种共刺激受体，其激活经由traf2/5募集导致nfkb和map-激酶信号传导，导致cd25的上调以及il-2和ifnγ的分泌。
[0150]
gitr胞内域如seq id no:1所示。flbr可以包含seq id no:1或其变体，该变体与seq id no:1具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性并且保持诱导gitr介导的信号传导的能力。
[0151]
seq id no:1(gitr胞内域)
[0152]
qlglhiwqlrsqcmwpretqlllevppstedarscqfpeeergersaeekgrlgdlwv
[0153]
cd30胞内域
[0154]
flbr可以包含cd30(uniprot id:p28908)的胞内域。cd30，又称为tnfrsf8，是tnfr家族的细胞膜蛋白和肿瘤标志物。激活的t和b细胞表达受体，并且traf2和traf5可以与这个受体相互作用并介导导致nf-κ-b的激活的信号转导。它是凋亡的正调节剂，并且已经显示其限制自身反应性cd8效应t细胞的增殖潜力并保护身体免受自身免疫。已经报道了编码不同同等型的该基因的两个可变剪接转录变体。
[0155]
cd30胞内域如seq id no:2所示。flbr可以包含seq id no:2或其变体，该变体与seq id no:2具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性并保持诱导cd30介导的信号传导的能力。
[0156]
seq id no:2(cd30胞内域)
[0157]
hrracrkrirqklhlcypvqtsqpklelvdsrprrsstqlrsgasvtepvaeerglmsqplmetchsvgaayleslplqdaspaggpssprdlpeprvstehtnnkiekiyimkadtvivgtvkaelpegrglagpaepeleeeleadhtphypeqetepplgscsdvmlsveeegkedplptaasgk
[0158]
xedar胞内域
[0159]
flbr可以包含xedar(uniprot id:qphav5)的胞内域。xedar，又称为tnfrsf27或eda2r(外异蛋白a2受体)，是tnfr(肿瘤坏死因子受体)超家族的iii型跨膜蛋白并且含有3个富含半胱氨酸的重复和单个跨膜域但缺乏n端信号肽。该蛋白介导nf-κb和jnk途径的激活。通过与traf3和traf6的结合介导激活。
[0160]
xedar胞内域如seq id no:3所示。flbr可以包含seq id no:3或其变体，该变体与seq id no:3具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性并保持诱导xedar介导的信号传导的能力。
[0161]
seq id no:3(xedar胞内域)
[0162]
tsntkckeegsrsnlgwlcllllpiplivwvlyckqffnrhcqrggllqfeadktakeeslfpvppsketsaesqvsenifqtqplnpileddcsstsgfptqesftmasctseshshwvhspiecteldlqkfsssasytgaetlggntvestgdrlelnvpfevpsp
[0163]
cd40胞内域
[0164]
flbr可以包含cd40(uniprot id:p25942)的胞内域。cd40(分化簇40)或tnfrsf5(肿瘤坏死因子超家族成员5)是在抗原呈递细胞上发现的共刺激蛋白并且是其细胞激活所必需的。已经发现该受体在介导广泛的免疫和炎症应答(包括t细胞依赖性免疫球蛋白类别转换、记忆b细胞发育以及生发中心形成)中是必不可少的。cd40在巨噬细胞和b细胞中转导traf6和map3k8介导的信号以激活erk，导致免疫球蛋白分泌的诱导。
[0165]
cd40胞内域如seq id no:4所示。flbr可以包含seq id no:4或其变体，该变体与seq id no:4具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性并保持诱导cd40介导的信号传导的能力。
[0166]
seq id no:4(cd40胞内域)
[0167]
kkvakkptnkaphpkqepqeinfpddlpgsntaapvqetlhgcqpvtqedgkesrisvqerq
[0168]
cd27胞内域
[0169]
flbr可以包含cd27(uniprot id:qphav5)的胞内域。cd27，又称为tnfrsf7(肿瘤坏死因子受体超家族7)或t细胞激活抗原cd27，是t细胞免疫的生成并长期维持所需要的跨膜蛋白。其与配体cd70结合，并且在调控b细胞激活和免疫球蛋白合成中起到关键作用。该受体转导导致nf-κb和mapk8/jnk的激活的信号。已经显示衔接物蛋白traf2和traf5介导该受体的信号传导过程。cd27结合蛋白(siva)是促凋亡蛋白，其可以与该受体结合并且被认为在该受体诱导的凋亡中起到重要作用。
[0170]
cd27胞内域如seq id no:5所示。flbr可以包含seq id no:5或其变体，该变体与seq id no:5具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性并保持诱导gitr介导的信号传导的能力。
[0171]
seq id no:5(cd27胞内域)
[0172]
qrrkyrsnkgespvepaepchyscpreeegstipiqedyrkpepacsp
[0173]
bcma胞内域
[0174]
flbr可以包含bcma(uniprot id:qo2223)的胞内域。bcma(b细胞成熟抗原)，又称为tnfrsf17(肿瘤坏死因子受体超家族成员17)，是在人中由tnfrsf17基因编码的蛋白。tnfrsf17是tnf受体超家族的细胞表面受体，其识别b细胞激活因子(baff/tnfsf13b)和增殖诱导配体(april/tnfsf13)。该受体促进b细胞存活并且在体液免疫的调控中起作用。其还激活nf-κb和jnk。
[0175]
bcma胞内域如seq id no:6所示。flbr可以包含seq id no:6或其变体，该变体与seq id no:6具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性并保持诱导gitr介导的信号传导的能力。
[0176]
seq id no:6(bcma胞内域)
[0177]
rkinseplkdefkntgsgllgmanidleksrtgdeiilprgleytveectcedcikskpkvdsdhcfplpameegatilvttktndyckslpaalsateieksisar
[0178]
fn14胞内域
[0179]
flbr可以包含fn14(uniprot id:q9np84)的胞内域。fn14，又称为tnfrsf12a，是tnfsf12/tweak的受体并且在一些细胞类型中是凋亡的弱诱导物。其也促进血管生成和内皮细胞的增殖并且可以调节对基质蛋白的细胞粘附。
[0180]
fn14胞内域如seq id no:7所示。flbr可以包含seq id no:7或其变体，该变体与seq id no:7具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性并保持诱导fn14介导的信号传导的能力。
[0181]
seq id no:7(fn14胞内域)
[0182]
rrcrrrekfttpieetggegcpavaliq
[0183]
dcr2(诱饵受体2)
[0184]
flbr可以包含dcr2(uniprot id:q9ubn6)的胞内域的部分。dcr2，又称为trail4或tnfrsf10d(肿瘤坏死因子受体超家族10d)，是细胞毒性配体trail的细胞表面受体。
[0185]
本发明的flbr可以包含缺乏功能性死亡域的dcr2细胞内域。例如，dcr2胞内域可
以包含不能结合fadd的截短的死亡域。将fas的细胞外结合域与具有非功能性死亡域的dcr2细胞内域融合，产生与fas竞争与fasl的结合但是不能与fadd结合的flbr，抑制fasl诱导的凋亡途径。
[0186]
dcr2细胞内域诱导nf-κb信号传导，提供促存活和抗凋亡的功能，这是癌症所利用的特征。因此，本发明的flbr中将fas胞外域和dcr2胞内域组合的益处在于其使fasl诱导的促凋亡信号无效并且经由nfκb将促凋亡信号转换为促存活结果。
[0187]
具有截短的死亡域的dcr2胞内域如seq id no:8所示。flbr可以包含seq id no:8或其变体，该变体与seq id no:8具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性并保持诱导dcr2介导的信号传导的能力。
[0188]
seq id no:8(dcr2胞内域)
[0189]
rkkfisylkgicsgggggpervhrvlfrrrscpsrvpgaednarnetlsnrylqptqvseqeiqgqelaeltgvtvespeepqrlleqaeaegcqrrrllvpvndadsadistlldasatleeghaketiqdqlvgseklfyeedeagsatscl
[0190]
本发明的flbr可以包含超过一个tnfr胞内域。例如，可以将flbr的fas胞外域和tnfr胞内域融合至选自表1所列出的tnfr胞内域中的任一个的另外的tnfr胞内域的信号传导部分。flbr构建体可以包含，例如，fas受体胞外域和两个tnfr胞内域(例如fas-cd30-41bb或fas-cd30-ox40)。
[0191]
下文是包括信号肽(正常文本)、fas胞外域(粗体)、跨膜域(斜体)和tnfr胞内域(下划线)的完整flbr序列的列表。flbr可以包含这些全长序列之一或其部分：例如，其可以包含fas胞外域和tnfr组合但具有不同的信号肽和/或跨膜域。
[0192]
seq id no:35(人fas-dcr2)
[0193][0194]
seq id no:36(人fas-gitr)
[0195][0196]
seq id no:37(人fas-cd30)
[0197][0198]
seq id no:38(人fas-xedar)
[0199][0200]
seq id no:39(人fas-cd27)
[0201][0202]
seq id no:40(人fas-bcma)
[0203][0204][0205]
seq id no:41(人fas-cd40)
[0206][0207]
seq id no:42(人fas-fn14)
[0208][0209]
本发明的flbr可以包含seq id no:35-42中的任一项或其具有至少80％序列同一性的变体。变体可以与seq id no:35-42具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性，条件是该变体序列在由细胞表达时保持抑制fasl诱导的凋亡的能力。
[0210]
膜结合型dcr3
[0211]
dcr3(诱饵受体3,tnfrsf6b,uniprot id:o95407)是已经历可变剪接的i型跨膜糖蛋白，形成tnfr超家族的可溶性成员。该可溶性受体结合并中和fasl的生物学功能，从而抑制fasl诱导的凋亡。dcr3也结合配体tl1a和light，它们分别与经由受体dr3和hvem诱导凋亡相关。
[0212]
为了克服在tme中fasl诱导的car-t细胞凋亡，本发明的flbr可以包含dcr3的fasl结合部分，其将与fas竞争与fasl的结合。然而，由于dcr3是可溶性蛋白，car-t的dcr3分泌可能对宿主t细胞具有混杂影响(中和表达fasl的宿主t细胞应答)。
[0213]
为了减少dcr3与呈递在宿主t细胞上的fasl的细胞-细胞接触，本发明的dcr3是膜结合型dcr3。膜结合型dcr3可以具有通用结构：
[0214]
dcr3-间隔物-tm-endo
[0215]
其中：
[0216]
dcr3包含dcr3的fasl结合域
[0217]
间隔物为连接dcr3和跨膜域的间隔物序列
[0218]
tm为跨膜域
[0219]
endo为任选的细胞内序列。
[0220]
flbr可以包含具有seq id no:9的dcr4域或其保持结合fasl能力的与seq id no:9具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的变体。
[0221]
seq id no:9(dcr3)
[0222]
vaetptypwrdaetgerlvcaqcppgtfvqrpcrrdspttcgpcpprhytqfwnylercrycnvlcgereeearachathnracrcrtgffahagfclehascppgagviapgtpsqntqcqpcppgtfsassssseqcqphrnctalglalnvpgssshdtlctsctgfplstrvpgaeeceravidfvafqdisikrlqrllqaleapegwgptpragraa
lqlklrrrltellgaqdgallvrllqalrvarmpglersvrerflpvh
[0223]
dcr3的结构包含结合fasl的四个n端富含半胱氨酸域(crd)，和结合硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)的c端肝素结合域(hbd)(图2e)。已经显示在树突状细胞中dcr3的hbd而不是结合fasl的crd经由hspg的交联诱导凋亡。(you et al.,2008,blood 111,1480
–
1488).
[0224]
dcr3的hbd经由包含三个碱性氨基酸(k
256
、r
258
和r
259
)的结合基序结合hspg。本发明的flbr可以包含含有k
256
、r
258
和r
259
中一个或多个突变的dcr3突变形式。该突变可以降低或破坏对hspg的结合。该突变或每一个突变可以是取代突变。该突变或每一个突变可以涉及用丙氨酸取代氨基酸。flbr可以包含seq id no.10所示的序列，其包含在位置k
256
、r
258
和r
259
中的每一个处的丙氨酸取代，以加粗显示。
[0225]
seq id no:10(突变的dcr3)
[0226][0227]
间隔物
[0228]
间隔物序列可以是将dcr3域与细胞膜物理间隔和/或提供一定程度的柔性的任何序列。通常用于car的间隔物序列可以用于本发明的膜结合型dcr3 flbr。表2提供了仅用于说明目的的合适序列的列表。
[0229]
表2:用于膜结合型dcr3的合适的间隔物序列
[0230][0231][0232]
膜结合型dcr3可以包含如seq id no:11-17中任一项的间隔物或其与seq id no:11-17具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的变体。
[0233]
flbr可以包含将dcr3连接至间隔物的一小段氨基酸。接头可以，例如，包含2至10或3至5个氨基酸。接头可以是“标准的”sdp接头序列。
[0234]
本文所述的flbr可以包含如图2d和图5b所描绘的经由cd8跨膜茎(cd8stk)结合于细胞质膜的修饰的dcr3。
[0235]
膜结合型dcr3 tm域
[0236]
膜结合型dcr3还包含跨膜域。如上文所解释的，跨膜域可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构并且通常是包含几个疏水残基的α螺旋。跨膜域可以衍生自任何跨膜蛋白。当间隔物衍生自跨膜蛋白，如cd8或cd28，tm域可以方便地衍生自相同的蛋白。
[0237]
cd28和cd8α的序列分别如下文seq id no:52和53所示。
[0238]
seq id no.52(cd28 tm域)
[0239]
fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv
[0240]
seq id no.53(cd8 tm域)
[0241]
iyiwaplagtcgvlllslvit
[0242]
跨膜域可以包含如seq id no:52或53所示的序列或其保持跨膜能力的具有至少90、95或99％序列同一性的变体。
[0243]
膜结合型dcr3胞内域
[0244]
包含膜结合型dcr3变体的flbr可以包括细胞内的极性锚定，其提供紧靠细胞质膜的极性区域。极性锚定的序列如下文seq id no.18所示。
[0245]
可替代地或另外地，flbr可以包括细胞内刚性接头。该序列没有通常使用的甘氨酸-丝氨酸接头灵活并且在重组蛋白序列的c端末端具有优势。刚性接头序列如下文seq id no.19所示。
[0246]
seq id no:18(极性锚定)
[0247]
rkkr
[0248]
seq id no:19(具有截断的刚性接头)
[0249]
leaeaaakeaaakeaaakeaaakaleaeaaakeaaakeaaakeaaakale
[0250]
除了或代替极性锚定/刚性接头，本发明的flbr的膜结合型dcr3特征还可以包含tnfr胞内域。tnfr胞内域可以选自表1中列出的tnfr中的任一个。tnfr胞内域可以包含如seq id no.1-8所示的序列之一。
[0251]
下文是基于膜结合型dcr3的两个完整的flbr序列。该序列包括信号肽(正常文本)、dcr3(粗体)、标准接头(粗体和下划线)、间隔物(斜体)、跨膜域(下划线)、极性锚定(双下划线)和刚性接头(粗体和斜体)。flbr可以包含这些全长序列之一或其部分：例如，其可以包含dcr3和极性锚定/刚性接头但具有不同的信号肽、间隔物和/或跨膜域。
[0252]
seq id no:43(人dcr3-cd8茎/tm/刚性接头)
[0253][0254][0255]
seq id no:44(人突变的dcr3-cd8茎/tm/刚性接头)
[0256][0257]
本发明的flbr可以包含seq id no:33或44或与其具有至少80％序列同一性的变体。该变体可以与seq id no:33或44具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性，条件是当由细胞表达时该变体序列保持抑制fasl诱导的凋亡的能力。
[0258]
核酸序列
[0259]
本发明提供了编码fasl结合受体(flbr)的核酸序列，其包含：
[0260]
(i)fas胞外域和tnfr胞内域，其中tnfr胞内域包含诱饵受体2(dcr2)、gitr、cd30、xedar、cd40、cd27、bcma或fn14胞内域的信号传导部分，或
[0261]
(ii)膜结合型诱饵受体3(dcr3)。
[0262]
在表达tnfr的多核苷酸不是细胞内源性基因组的一部分的意义上，核酸序列是“外源性多核苷酸”。例如，外源性多核苷酸可以是工程化核酸构建体或载体的部分。
[0263]
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在相互为同义词。
[0264]
技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。另外，应当理解，技术人员可以使用常规的技术进行不影响本文所述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映要在其中表达多肽的任何特定宿主生物体的密码子使用。
[0265]
根据本发明的核酸可以包含dna或rna。它们可以是单链的或双链的。它们也可以是其中包括合成的或修饰的核苷酸的多核苷酸。本领域已知许多不同类型的对寡核苷酸的修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3’和/或5’末端添加吖啶或聚赖氨酸链。为了本文所述的用途，应当理解多核苷酸可以通过本领域可用的任何方法修饰。可以进行此类修饰以增强目的多核苷酸的体内活性或寿命。
[0266]
与核苷酸序列有关的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括从或对序列的一个(或多个)核酸的任何取代、变异、修饰、置换、删除或添加。
[0267]
核酸构建体
[0268]
在一个方面，本发明提供了核酸构建体，其包含：(i)第一核酸序列，其编码i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)如上文所定义的第二核酸序列。
[0269]
核酸构建体可以具有通用结构：
[0270]
car/tcr-coexpr-flbr；或
[0271]
flbr-coexpr-car/tcr
[0272]
其中：
[0273]
car/tcr为编码car或tcr的核酸序列；
[0274]
coexpr为使car/tcr和flbr能够作为单独的多肽共表达的核酸序列；和
[0275]
flbr为编码如本文所述的fasl结合受体的核酸序列。
[0276]
在上文的结构中，“coexpr”为使两个多肽作为分隔的实体共表达的核酸序列。其可以是编码切割位点的序列，使得核酸构建体产生由切割位点连接的两种多肽。切割位点可以是自切割的，因此当多肽产生时，其立即被切割成单独的肽而不需要任何外部的切割活性。
[0277]
切割位点可以是使两个多肽能够变为分开的任何序列。
[0278]
为了方便，本文使用术语“切割”，但切割位点可以通过不同于经典的切割的机制导致肽分开成单独的实体。例如，对于口蹄疫病毒(fmdv)2a自切割肽(见下文)，已经提出了各种模型来解释“切割”活性：宿主细胞蛋白酶的蛋白水解、自身蛋白水解或翻译作用(donnelly等人(2001)j.gen.virol.82:1027-1041)。这种“切割”的确切机制对于本发明的目的来说并不重要，只要切割位点位于编码蛋白的核酸序列之间时，导致蛋白作为分开的实体表达。
[0279]
切割位点可以，例如是弗林蛋白酶切割位点、烟草蚀刻病毒(tev)切割位点或编码自切割肽。
[0280]“自切割肽”指具有这样功能的肽，当包含蛋白和自切割肽的多肽产生时，其立即“切割”或分开成不同的和分散的第一和第二多肽，而不需要任何外部的切割活性。
[0281]
自切割肽可以是来自口疮病毒或心脏病毒2a自切割肽。口疮病毒或心脏病毒主要的2a/2b切割由在其自身c端的2a“切割”介导。在口疮病毒，诸如口蹄疫病毒(fmdv)和马鼻炎a病毒中，2a区是约18个氨基酸的短节段，连同蛋白2b的n端残基(保守的脯氨酸残基)代表能够在其自身的c端介导“切割”的自主元件(如上文donelly等人(2001))。
[0282]
切割位点可以包含如seq id no.54(raegrgslltcgdveenpgp)所示的2a样序列。
[0283]
本发明进一步提供了试剂盒，其包含：(i)第一核酸序列，其编码i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；(ii)第二核酸序列，其是能够表达如本文定义的fasl结合受体(flbr)的外源性多核苷酸。
[0284]
嵌合抗原受体(car)
[0285]
图1中示意性所示的经典的car是嵌合的i型跨膜蛋白，其将细胞外抗原识别域(粘合剂)连接于细胞内信号传导域(胞内域)。粘合剂通常是衍生自单克隆抗体(mab)的单链可变片段(scfv)，但其可以基于包含抗体样抗原结合位点或靶抗原的配体的其他格式。间隔物域可能是从膜中分离粘合剂以及允许其具有合适的方向所必须的。通用的间隔物域为igg1的fc。取决于抗原，更紧凑的间隔物可能足够，例如cd8α的茎，甚至只是单独的igg1铰链。跨膜域将蛋白质锚定在细胞膜上并且将间隔物连接至胞内域。
[0286]
早期的car设计具有衍生自fcεr1或cd3ζ的γ链的细胞内部分的胞内域。因此，这些第一代受体传递免疫信号1，其足以触发同源靶细胞的t细胞杀伤，但是不能完全激活t细胞增殖和存活。为了克服这一限制，已经构建了复合胞内域：将t细胞共刺激分子的细胞内部分与cd3ζ的细胞内部分融合产生第二代受体，其可以在抗原识别后同时传递激活和共刺激信号。最常用的共刺激域是cd28的共刺激域。这提供了最有力的共刺激信号—即触发t细胞增殖的免疫信号2。还描述了一些包括tnf受体家族胞内域的受体，如传递生存信号的密
切相关的ox40和4-1bb。现在已经描述了更有力的第三代car，其具有能够传递激活、增殖和存活信号的胞内域。
[0287]
可以使用例如逆转录病毒载体将编码car的核酸转移至t细胞。通过这种方式，可以产生大量抗原特异性t细胞用于过继细胞转移。当car结合靶抗原时，这导致激活信号传输到表达car的t细胞。因此，car将t细胞的特异性和细胞毒性引导至表达靶抗原的细胞。
[0288]
抗原结合域
[0289]
抗原结合域是识别抗原的经典car的部分。
[0290]
本领域已知许多抗原结合域，包括基于抗体的抗原结合位点、抗体类似物和t细胞受体。例如，抗原结合域可以包含：衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scfv)、靶抗原的天然配体、对靶物具有足够亲和力的肽、单个域粘合剂如骆驼、人工粘合剂如darpin或衍生自t细胞受体的单链。
[0291]
已知各种肿瘤相关抗原(taa)，其中一些在下文表3中显示。本发明所用的抗原结合域可以是其中指示的能够结合taa的域。
[0292]
表3
[0293][0294][0295]
跨膜域
[0296]
跨膜域是跨越膜的经典car的序列。它可以包含疏水α螺旋。如上文所解释，跨膜域可以衍生自任何跨膜蛋白或可以是合成的。car的tm域可能衍生自cd28，其提供良好的受体稳定性。可替代地，跨膜域可以衍生自黑素体蛋白tryp-1。
[0297]
信号肽
[0298]
car可以包含信号肽，使得当其在细胞(诸如t细胞)中表达时，将新生蛋白引导至内质网并且随后引导至细胞表面，其在此处表达。
[0299]
信号肽的核心可以包含一长段倾向于形成单个α-螺旋的疏水氨基酸。信号肽可以
以一短段带正电荷的氨基酸开始，这有助于在转移过程中加强多肽合适的拓扑结构。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的一段氨基酸。信号肽酶可以在转移过程中或完成后切割以产生游离的信号肽和成熟蛋白。然后特定的蛋白酶消化游离的信号肽。
[0300]
间隔物域
[0301]
car可以包含将抗原结合域连接至跨膜域的间隔物序列。柔性间隔物允许抗原结合域朝向不同方向以促进结合。
[0302]
间隔物序列可以，例如，包含igg1 fc区、igg1铰链或人cd8茎或小鼠cd8茎。间隔物可以替代地包含与igg1 fc区、igg1铰链或cd8茎具有相似的长度和/或域间隔特性的替代接头序列。可以改变人igg1间隔物以去除fc结合基序。car可以包含表2中列出的间隔物之一。
[0303]
细胞内信号传导域
[0304]
细胞内信号传导域是经典car的信号传递部分。细胞内信号传导域可以是或包含t细胞信号传导域。
[0305]
细胞内信号传导域可以包含一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)。itam是四个氨基酸的保守序列，在免疫系统的某些细胞表面蛋白的细胞质尾部重复两次。该基序包含由任何其他两个氨基酸与亮氨酸或异亮氨酸分隔的酪氨酸，产生签名yxxl/i。在分子的尾部中这些签名的两个通常由6到8个氨基酸分隔(yxxl/ix
(6-8)
yxxl/i)。
[0306]
itam对于免疫细胞中的信号转导很重要。因此，发现它们存在于重要的细胞信号传导分子，如t细胞受体复合物的cd3和ζ链、b细胞受体复合物的cd79α和β链和某些fc受体的尾部。这些基序中的酪氨酸残基在受体分子与其配体相互作用后被磷酸化，并为参与细胞信号传导途径的其他蛋白质形成对接位点。
[0307]
最常用的信号传导域组分是包含3个人itam的cd3-ζ胞内域。在抗原结合后将激活信号传递给t细胞。cd3-ζ可能无法提供完全有能力的激活信号并且可能需要额外的共刺激信号。共刺激信号有两个主要类型：属于ig家族(cd28、icos)和tnf家族(ox40、41bb、cd27、gitr等—见表1)的共刺激信号。例如，嵌合cd28和ox40可以与cd3-ζ一起使用以传递增殖/存活信号，或者所有三者可以一起使用(如图1b所说明)。
[0308]
胞内域可以包含如seq id no:45-48所示的序列或其具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的变体，条件是该变体序列保持向细胞传递激活信号的能力。
[0309]
seq id no:45(cd3-ζ胞内域)
[0310]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0311]
seq id no:46(4-1bb和cd3-ζ胞内域)
[0312]
mgnscynivatlllvlnfertrslqdpcsncpagtfcdnnrnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecsstsnaecdctpgfhclgagcsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsldgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassvtppaparepghspqiisfflaltstallfllffltlrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0313]
seq id no:47(cd28和cd3-ζ胞内域)
[0314]
skrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrr
eeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0315]
seq id no:48(cd28、ox40和cd3-ζ胞内域)
[0316]
skrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlakirvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0317]
转基因t细胞受体(tcr)
[0318]
t细胞受体(tcr)是在t细胞表面发现的分子，其负责将抗原片段识别为与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的肽。
[0319]
tcr是由两条不同的蛋白质链组成的异二聚体。在人中，在95％的t细胞中tcr由alpha(α)链和beta(β)链(分别由tra和trb编码)组成，而在5％的t细胞中tcr由gamma和delta(γ/δ)链(分别由trg和trd编码)组成。
[0320]
当tcr与抗原肽和mhc(肽/mhc)结合时，t淋巴细胞通过信号转导被激活。
[0321]
与常规的抗体导向靶抗原相比，tcr识别的抗原可以包括整个潜在的细细胞内蛋白质阵列，这些蛋白质被加工并作为肽/mhc复合物递送到细胞表面。
[0322]
通过使用载体人工引入tra和trb基因或trg和trd基因，可能工程化改造细胞以表达异源(即非天然)tcr分子。例如，可以将工程化tcr的基因重新引入自体t细胞并转移回患者用于t细胞过继疗法。此类“异源”tcr在本文中也可以称为“转基因tcr”。
[0323]
本发明涉及共表达本文所定义的转基因tcr和flbr的细胞。
[0324]
载体
[0325]
本发明还提供载体或载体试剂盒，其包含一个或多个编码根据本发明的flbr的核酸序列。此类载体可以用于将核酸序列引入宿主细胞使其表达本文所定义的car/tcr和flbr。
[0326]
载体可以是，例如，质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mrna。
[0327]
载体可以能够转染或转导细胞，如t细胞或nk细胞。
[0328]
细胞
[0329]
本发明提供了共表达本文所定义的car/tcr和flbr的细胞。
[0330]
细胞可以包含本发明的核酸或载体。
[0331]
细胞可以是溶细胞性免疫细胞如t细胞或nk细胞。
[0332]
t细胞或t淋巴细胞是一类在细胞介导的免疫中起核心作用的淋巴细胞。它们可以通过在细胞表面t细胞受体(tcr)的存在而与其他淋巴细胞，如b细胞和自然杀伤细胞(nk细胞)区分开。有多种类型的t细胞，总结如下。
[0333]
辅助性t辅助细胞(th细胞)在免疫过程中协助其他白血细胞，包括b细胞成熟为浆细胞和记忆b细胞，以及激活细胞毒性t细胞和巨噬细胞。th细胞在其表面表达cd4。th细胞在被抗原呈递细胞(apc)表面上的mhc ii类分子呈递肽抗原时变为活化。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括th1、th2、th3、th17、th9或tfh，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
[0334]
溶细胞性t细胞(tc细胞或ctl)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还与移植排
斥有关。ctl在其表面表达cd8。这些细胞通过与存在于所有有核细胞表面的mhc i类相关抗原结合来识别它们的靶物。通过调节性t细胞分泌的il-10、腺苷和其他分子，可以使cd8 细胞失活至无能状态，其预防自身免疫性疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。
[0335]
记忆t细胞是抗原特异性t细胞的子集，在感染消退后长期存在。当再次暴露于其同源抗原后它们迅速扩增成大量效应t细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆t细胞包括三种亚型：中央记忆t细胞(tcm细胞)和两种效应记忆t细胞(tem细胞和temra细胞)。记忆细胞可以是cd4 或cd8 。记忆t细胞通常表达细胞表面蛋白cd45ro。
[0336]
调节性t细胞(treg细胞)，以前称为抑制性t细胞，对于维持免疫耐受至关重要。它们的主要作用是在免疫应答末期关闭t细胞介导的免疫，以及在胸腺中抑制逃脱负选择过程的自身反应性t细胞。
[0337]
已经描述了两个主要类型的cd4 treg细胞—天然存在的treg细胞和适应性treg细胞。
[0338]
天然存在的treg细胞(也称为cd4 cd25 foxp3 treg细胞)出现在胸腺中，并且与发育中的t细胞与已被tslp激活的髓样(cd11c )和浆细胞样(cd123 )树突状细胞之间的相互作用有关。通过称为foxp3的细胞内分子的存在，可以将天然存在的treg细胞与其他t细胞区分开。foxp3基因的突变可以阻止调节性t细胞发育，导致致命的自身免疫性疾病ipex。
[0339]
适应性treg细胞(也称为tr1细胞或th3细胞)可能起源于正常的免疫应答期间。
[0340]
细胞可以是自然杀伤细胞(或nk细胞)。nk细胞形成先天免疫系统的一部分。nk细胞以不依赖于mhc的方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速应答。
[0341]
nk细胞(属于先天淋巴细胞组)被定义为大颗粒淋巴细胞(lgl)，构成从产生b和t淋巴细胞的共同淋巴样祖细胞分化而来的第三种细胞。已知nk细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化和成熟，然后它们进入循环。
[0342]
本发明的细胞可以是上文提及的任何细胞类型。
[0343]
根据本发明的细胞可以从患者自己的外周血(第一方)离体产生，或者在造血干细胞移植的环境中从供体外周血(第二方)产生，或者从来自无关联供体的外周血(第三方)中产生。
[0344]
可替代地，细胞可以衍生自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为例如t或nk细胞。可替代地，可以使用保留其溶解功能并可作为治疗剂的永生化t细胞系。
[0345]
在所有这些实施方案中，表达嵌合多肽的细胞是通过引入编码嵌合多肽的dna或rna产生的，通过包括用病毒载体转导、用dna或rna转染的多种方法中的一种。
[0346]
本发明的细胞可以是来自受试者的离体细胞。细胞可以来自外周血单核细胞(pbmc)样品。在转导编码根据本发明第一方面提供的嵌合多肽分子的核酸之前，可以激活和/或扩增细胞，例如通过用抗cd3单克隆抗体处理。
[0347]
本发明的细胞可以通过以下方式制造：
[0348]
(i)从受试者或上文列出的其他来源中分离含有细胞的样品；和
[0349]
(ii)用一种或多种编码如本文所定义的car/tcr和flbr的核酸序列转导或转染细胞。
[0350]
然后可以纯化细胞，例如，基于car/tcr的抗原结合域的表达或fas胞外域的表达来选择细胞。
[0351]
药物组合物
[0352]
本发明还涉及含有本发明的一个或多个细胞的药物组合物。具体地，本发明涉及包含根据本发明的细胞的药物组合物。
[0353]
药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种进一步具有药学活性的多肽和/或化合物。此类制剂可以是，例如适合静脉输注的形式。
[0354]
治疗方法
[0355]
本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的方法，其包含向受试者施用本发明的细胞(例如在如上文所述的药物组合物中)的步骤。
[0356]
合适地，用于治疗和/或预防疾病的本方法可以包含向受试者施用本发明的细胞(例如在如上文所述的药物组合物中)。
[0357]
治疗疾病的方法涉及本发明细胞的治疗用途。在这方面，可以将细胞施用于患有现有疾病或病况的受试者，以减轻、减少或改善与至少一种与疾病相关症状和/或减缓、减少或阻断疾病的进展。
[0358]
预防疾病的方法涉及本发明细胞的防治用途。在这方面，可以将细胞施用于尚未感染疾病和/或未表现出疾病的任何症状的受试者，以预防或削弱疾病的病因或减少或预防至少一种与疾病相关的症状的发展。受试者可能具有该疾病的易感性或被认为有发展该疾病的风险。
[0359]
方法可以涉及以下步骤：
[0360]
(i)分离含有细胞的样品；
[0361]
(ii)用本发明提供的核酸序列或载体转导或转染细胞；
[0362]
(iii)向受试者施用来自(ii)的细胞。
[0363]
本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的本发明的细胞。
[0364]
本发明还涉及细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
[0365]
通过本发明的方法治疗和/或预防的疾病可以是癌症。
[0366]
癌症可以是如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。
[0367]
疾病可以是多发性骨髓瘤(mm)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、神经母细胞瘤、t细胞急性淋巴细胞白血病(t-all)或弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。
[0368]
本发明的细胞，特别是car细胞，可以能够杀伤靶细胞，如癌细胞。靶细胞可以通过taa的表达，例如上文表3中提供的taa的表达来识别。癌症可以是表3中列出的癌症。
[0369]
制备细胞的方法
[0370]
本发明的表达car或转基因tcr的细胞可以通过包括用病毒载体转导、用dna或rna转染的多种方法之一来引入编码car或tcr和fasl结合受体(flbr)的dna或rna产生。
[0371]
本发明的细胞可以由以下步骤制备：
[0372]
(i)从受试者或上文列出的其他来源之一中分离含有细胞的样品；和
[0373]
(ii)用一种或多种如上文所定义的核酸序列或核酸构建体在体外或离体转导或转染细胞。
[0374]
然后可以纯化细胞，例如，基于抗原结合多肽的抗原结合域的表达来选择。
[0375]
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，任何与本文描述的方法和材料相似或等效的方法和材料都可以用于本公开实施方案的实践或测试。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均以5’至3’方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。
[0376]
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确说明，否则在范围的上限和下限之间每个中间值至下限单位的十分之一也被具体公开。任何规定值或规定范围内的中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围都包含在本公开内容内。在规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每一个较小的范围都包含在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含或排除在范围内，并且每个范围的上下限(任何一个、任何一个都不或二者都)都包含在较小的范围内，也包含在本公开中，受规定范围内任何具体排除的限制。在所述范围包括限制之一或两者的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本公开中。
[0377]
必须注意，如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。
[0378]
如本文所用，术语“包含”(“comprising”、“comprises”和
““
comprised of”)、与“包括”(“including”、“includes”)或“含有”(“containing”、“contains”)同义，并且是包容性或开放式的，并且不排除另外的、非列举的成员、元件或方法步骤。术语“包含”还包括术语“由
……
组成”。
[0379]
本文所讨论的出版物仅为了其在本技术的提交日之前的公开而提供。本文中的任何内容均不应被解释为承认此类出版物构成所附权利要求的现有技术。
[0380]
现在将通过实施例进一步描述本发明，其旨在用来帮助本领域的普通技术人员实施本发明并且无意以任何方式限制本发明的范围。
实施例
[0381]
实施例1—与fasl结合的构建体的体外测试
[0382]
创建表达表4列出的构建体的一组细胞。所有的细胞表达第二代抗cd19 car(fmc63)。创建两个型式的细胞组：其中一个的构建体中包含编码fas配体的基因，因此该细胞共表达fasl(图6-8中的 fasl)；并且其中一个的构建体中不包含编码fas配体的基因(图6-8中的-fasl)。培养细胞并测试其抵抗fasl诱导的细胞死亡的能力。
[0383]
表4
[0384][0385]
更详细地，用抗cd3和抗cd28抗体(0.5μg/ml)激活新鲜分离的原代人外周血单核细胞(pbmc)24小时。然后将il-2(100iu/ml)添加到pbmc中再持续24小时。用含有目的基因的粗逆转录病毒上清液在24孔板中转导活化的pbmc中的300,000个。
[0386]
将pbmc在1000g下旋转40分钟，此时将细胞转移到恒温箱中培养3天。然后通过移液重悬浮细胞并将100μl转移到96孔板中。通过计数存活pbmc的数量在流式细胞仪上分析细胞存活。
[0387]
将绝对细胞数量归一化至经工程化改造以单独表达fmc63的pbmc。
[0388]
图6显示了1到8号构建体的结果。显然，表达car和fas-dcr2、fas-gitr、fas-cd30或膜结合型dcr3的细胞在抵抗细胞死亡方面远远优于共表达car和fas-41bb、fasox40或fasδdd的细胞。
[0389]
相似地，图7显示了表达本发明膜结合型dcr3的细胞而不是表达可溶性dcr3的等同细胞的提高的细胞存活(比较构建体8和9)。
[0390]
对构建体1至7重复上述方法，但这次构建体还表达了分选自杀基因(sort-suicide gene)rqr8，其描述于wo2013/153391。rqr8用作转导细胞(rqr8阳性细胞)的标志物。发现表达flbr之一的细胞：fas-dcr2、fas-cd30或fas-gitr具有比表达fas-δdd、fas-ox40或fas-41bb的细胞更高的转导细胞数量。
[0391]
实施例2—fasl结合受体(flbr)与固定化fas配体的体外测试。
[0392]
使用固定化可溶性fas配体测试实施例1中描述的未转导以表达fasl的细胞组抵抗fasl诱导的细胞死亡的能力。
[0393]
用表达上文表4中表达构建体2、3、5和6，即car fasδdd、fas-dcr2、fas-gitr和fas-ox40的逆转录病毒载体转导pbmc。
[0394]
将可溶性fas配体(2.5μg)在96孔板上在4℃下固定化过夜。fas配体固定化的板用pbs清洗4次。将50,000个转导的pbmc添加到具有固定化fas配体的孔中并在恒温箱中培养5天。
[0395]
通过离心旋转细胞，对cd3和cd34进行染色，并通过流式细胞术分析细胞。使用countbright
tm
绝对计数珠(thermo fisher)确定存活pbmc的绝对数量。在没有fas配体的情况下，将绝对细胞数量归一化至转导单独的fmc63的pbmc。
[0396]
结果如图9和10所示。与表达fas-ox40或dnfas的细胞相比，见到用固定化fasl培养的表达fas-dcr2和fas-gitr的细胞增加的细胞计数。
[0397]
实施例3—fasl结合受体(flbr)与固定化fas配体的体外测试。
[0398]
表达表5列出的构建体创建细胞组。所有的细胞表达抗cd19 car(fmc63)。使用固定化可溶性fas配体测试细胞抵抗fasl诱导的细胞死亡的能力。在存在或不存在抗fmc63抗独特型抗体的情况下测试细胞。
[0399]
表5
[0400][0401]
用表达实施例1所描述的构建体的逆转录病毒载体转导pbmc。
[0402]
可溶性fas配体(2.5μg)单独或与1μg抗fmc63 ab组合在96孔板上在4℃下固定化过夜。将pbs添加到单独的孔中作为对照。fas配体/抗fmc63ab固定化的板用pbs清洗4次。将转导的pbmc(50,000)添加到孔中，并在恒温箱中培养5天。
[0403]
在将细胞接种到96孔板时(第0天)，通过离心旋转细胞，对cd3和cd34染色(以检测rqr8并因此检测转导的细胞)并通过流式细胞术分析以确定表达rqr8的细胞的百分比。使用countbright
tm
绝对计数珠确定pbmc的绝对数量。
[0404]
在温育的第5天，通过离心旋转细胞，取出100μl上清液用于细胞因子分析，对细胞进行cd3和cd34染色，然后通过流式细胞术分析以确定表达rqr8的细胞的百分比。使用countbright
tm
绝对计数珠确定存活pbmc的绝对数量。将温育第5天的绝对细胞数量相对于第0天进行分析以测量增殖倍数差异。将绝对细胞数量归一化至培养在pbs处理孔的pbmc。
[0405]
结果显示于图11-16。
[0406]
在没有car刺激的情况下，fas-xedar的表达诱导pbmc组成型增殖并且能够阻止fasl诱导的细胞死亡(图11和12)。
[0407]
fmc63-cd3z转导的细胞对fasl介导的细胞死亡易感。当转导细胞与抗fmc63独特型ab和fasl共同温育时尤其明显(图13，蓝色圆圈)。如图13和14所示，表达fas-xedar的细胞相比表达显性失活的fas(即具有截短的死亡域(fasδdd)的细胞显示出更强的对fasl诱导的死亡的抗性。随着时间的推移，对于转导的细胞，用表达fas-xedar的载体转导的细胞群变得富集(图13)。
[0408]
在具有单独的固定化fas配体或fas配体/抗fmc63的板上温育转导的pbmc 5天后，旋转细胞并取出100μl上清液用于细胞因子分析。根据制造商的说明，使用elisa max
tm deluxe set human ifn-γ(biolegend)和elisa max
tm deluxe set human il-2
(biolegend)测量上清液的细胞因子浓度。
[0409]
表达fas-xedar的细胞相比表达截短的fas(fasδdd)的细胞显示出显著更高的il2和干扰素γ的释放(图15和16)。即使在没有固定化fas配体温育的情况下也观察到ifnγ释放的增加(图15)。
[0410]
实施例4—tnfr fasl结合受体(flbr)和固定化fas配体的进一步体外筛选。
[0411]
创建表达表6中列出的构建体的细胞组。所有的细胞表达抗cd19 car(fmc63-cd3z)。使用固定化可溶性fas配体测试细胞抵抗fasl诱导的细胞死亡的能力。
[0412]
表6
[0413]
构建体编号构建体表达10fmc63-cd3z单独的car12fmc63-cd3z fasδddcar和具有截短的死亡域的fas受体13fmc63-cd3z fas-hvemcar和包含fas胞外域和hvem胞内域的flbr14fmc63-cd3z fas-cd27car和包含fas胞外域和cd27胞内域的flbr15fmc63-cd3z fas-41bbcar和包含fas胞外域和41bb胞内域的flbr16fmc63-cd3z fas-cd40car和包含fas胞外域和cd40胞内域的flbr17fmc63-cd3z fas-baff-rcar和包含fas胞外域和baff-r胞内域的flbr18fmc63-cd3z fas-bcmacar和包含fas胞外域和bcma胞内域的flbr19fmc63-cd3z fas-fn14car和包含fas胞外域和fn14胞内域的flbr
[0414]
使用固定化可溶性fas配体重复实施例2所描述的方法以诱导细胞死亡。结果显示于图17-20中。
[0415]
显示fas-tnfr嵌合体的表达阻止fasl诱导的细胞死亡，并且在fasl接合后诱导pbmc的增殖。特别地，表达fas-cd27、fas-cd40、fas-bcma和fas-fn14的细胞显示出最高的平均细胞计数(图17)。图18显示了在固定化fasl存在下培养的转导的pbmc相对于在不存在fasl下培养的转导的pbmc的绝对细胞计数，证实筛选的fas-tnfr中的每种的表达诱导增殖。与第0天分析相比，增殖倍数差异(图19)显示fas-cd27、fas-cd40、fas-bcma和fas-fn14的表达相比fas-41bb和fasδdd的表达诱导更大的转导的pbmc的增殖。
[0416]
在温育转导的pbmc与fas配体5天后，旋转细胞并取出100μl上清液用于细胞因子分析。根据制造商的说明，使用elisa max
tm deluxe set human ifn-γ(biolegend)测量上清液的细胞因子浓度。如图20所示，表达fas-cd40的细胞相比表达fasδdd的细胞显示出显著更高的干扰素γ释放。即使在没有暴露于固定化fasl的情况下，也观察到表达fas-cd40 flbr的细胞的ifnγ释放增加。与fasδdd构建体相比，当与固定化fas配体温育时，表达flbr fas-cd27、fas-cd40、fas-bcma和fas-fn14的细胞也显示出更高的干扰素γ释放(pg/ml)。
[0417]
实施例5—在再刺激测定中研究共表达抗gd2 car和tnfr fasl结合受体(flbr)的细胞的细胞毒性能力。
[0418]
为了评估fas-tnfr嵌合体在car背景中的细胞毒性优势，使转导的pbmc经受连续几轮的再刺激(图21)。转导pbmc以表达靶向gd2的car自身或经由2a自切割肽与截短的fas(fasδdd)、fas-41bb、fas-xedar、fas-cd40、fas-cd27、fas-bcma或fas-fn14共表达。非转导的(nt)和转导的pbmc与表达gd2的supt1靶细胞以1:1的效应物与靶物的比率共培养并培
养四天，此时定量剩余的存活的靶细胞的百分比。每3或4天用0.5x105supt1 gd2细胞/孔再刺激car-t细胞。在体外连续共培养杀伤测定期间，在反复遭遇gd2阳性supt1肿瘤细胞后测量gd2 car-t细胞维持细胞毒性和扩增的能力时，共表达fas-xedar、fas-cd40、fas-bcma和fas-fn14的gd2 car-t细胞(图21e、f、h和i)显著优于对照gd2 car-t细胞和共表达fasδdd、fas-41bb和fas-cd27(图21b、c、d和g)的gd2 car-t细胞。对照gd2 car-t细胞和共表达fasδdd、fas-41bb或fas-cd27的gd2 car-t细胞两者在第5次再刺激时开始不能清除靶物，失去其扩增和消除gd2阳性肿瘤细胞的能力。相比之下，共表达fas-xedar、fas-cd40、fas-bcma和fas-fn14的gd2 car-t细胞对抗原刺激的应答持续更长，因此在清除靶细胞方面更优越。
[0419]
细胞培养和试剂
[0420]
实验中使用的所有细胞系和原代t细胞均在补充由10％胎牛血清(fbs,biosera)和1％l-谷氨酰胺(glutamax,gibco)的rpmi 1640培养基(lonza)中培养。supt1细胞购买于atcc。t细胞由获得自国家健康服务血液与移植(national health service blood and transplant，nhsbt；colindale,uk)的pbmc产生。转导的t细胞在与前述相同的培养基中培养，添加100u/ml白细胞介素2(il-2)。countbright
tm
绝对计数珠(thermo fisher)用于确定存活pbmc的绝对数量。根据制造商的说明，使用elisa max
tm deluxe set human ifn-γ(biolegend；430104)和elisa max
tm deluxe set human il-2(biolegend；431804)测量细胞因子浓度。
[0421]
转导
[0422]
逆转录病毒是通过使用genejuice(millipore)与编码gag-pol(peq-pam3-e36)的质粒、编码rd114包膜(rdf37)的质粒和期望的逆转录病毒转移载体质粒瞬时转染293t细胞产生的。如前所述，使用retronectin(takara)进行转导。不同构建体的转导效率通过流式细胞术基于rqr8的表达染色来评估，使用qbend/10mab进行。使用macsquant analyzer 10(miltenyi)进行流式细胞术分析。使用bd facs进行流式分选。
[0423]
上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，应当理解，所要求保护的本发明不应被过度地限制于此类具体的实施方案。实际上，对分子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的用于实施本发明所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。