一种昆虫共生菌分离培养基及应用

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种昆虫共生菌分离培养基及应用。


背景技术：

2.昆虫是自然界中最大的生物类群，已经鉴定的种类超过100多万种，占地球上动物类群的75％以上。除了有少数有害种类以外，大部分种类都在为地球生态系统和人类做着重要的贡献。在食用、环境治理、工业资源、观赏、土壤改良等方面发挥着极其重要的作用。研究表明，昆虫在实现医生功能时，具有体内微生物的参与。
3.昆虫体内栖息着各种各样的微生物，这些微生物一般存在于昆虫肠道、外骨骼、特殊器官和细胞内。昆虫共生菌主要包括酵母、真菌和细菌三大类。昆虫共生菌的作用众多，可为昆虫提供饮食中缺乏的必需营养，特别是取食木质部或韧皮部的昆虫，共生菌可以消化纤维素，从而辅助昆虫在营养不均衡的条件下存活；昆虫共生菌也可以保护宿主细胞免受病原菌侵害以及抵御天敌；共生菌可影响宿主交配行为并调控其生殖，昆虫共生菌也可赋予昆虫杀虫剂抗性，昆虫也可利用其共生菌杀灭害虫。由于昆虫共生菌可以释放各类生物活性物质，辅助昆虫或植物进行良性生长，因此，对昆虫共生菌进行资源化利用意义重大。
4.首先，研究者需要将昆虫共生菌进行有效地分离和培养，共生菌存活于昆虫体内，其体内环境复杂多变，传统培养基无法同时满足多种昆虫共生菌的生存需求，更无法进一步促进昆虫共生菌的生长繁殖。因此，本发明提供一种昆虫共生菌分离培养基及应用。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种昆虫共生菌分离培养基及应用，有效解决了传统培养基无法对昆虫共生菌进行有效分离，并进一步促进昆虫共生菌生长繁殖的技术问题，改善了昆虫共生菌的分离效果。
6.本发明提供了一种昆虫共生菌分离培养基及应用，其特征在于，由以下质量百分比的原料组成：胰酪蛋白胨3％～8％，蝉花干粉5％～15％，酵母提取物1％～5％，活性多糖1％～3％，玉米浸粉2％～6％，维生素c0.4％～0.8％，维生素e0.4％～0.8％，中微量元素溶液0.1％～0.3％，余量为纯水。
7.优选的，所述活性多糖为枸杞多糖、香菇多糖、灵芝多糖和松花粉多糖中的一种或多种。
8.优选的，所述中微量元素溶液由0.5～1.5gfeso4、0.2～0.4gk2hpo4、1.5～3gnacl、0.1～0.3gcacl2·
2h2o、2～3.5gmgso4，纯水定容至500ml。
9.本发明还提供了一种昆虫共生菌分离培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.s1，采用生理盐水清洗去除杂质的蝉花，去除表面多余生理盐水后，于35℃～40℃干燥处理3～5h，真空冷冻干燥，并于无菌条件下粉碎后，得到蝉花干粉；
11.s2，称取胰酪蛋白胨3％～8％，蝉花干粉5％～15％，酵母提取物1％～5％，活性多糖1％～3％，玉米浸粉2％～6％，维生素c0.4％～0.8％，维生素e0.4％～0.8％，中微量元素溶液0.1％～0.3％，向所述蝉花干粉中加入纯水搅拌至完全溶解，依次加入酵母提取物、活性多糖和玉米浸粉形成混合溶液；向胰酪蛋白胨加入纯水煮沸至完全溶解后倒入所述混合溶液中，高压蒸汽灭菌30～40min，依次加入维生素c、维生素e和中微量元素溶液，得到昆虫共生菌分离培养基。
12.优选的，s1中，所述真空冷冻干燥工艺为：在-10℃～-20℃下冷冻处理蝉花4h～6h，在5～10pa的气压下缓慢升温至10℃～20℃，保持3～5h后，在同样的气压条件下缓慢升温至25℃～35℃。
13.优选的，s1中，所述蝉花干粉的目数为100～200目。
14.优选的，s2中，所述蝉花和纯水的料液比为1g:200～300ml。
15.优选的，s2中，所述胰酪蛋白胨与纯水的料液比为1g:25～40ml。
16.一种昆虫共生菌分离培养基在分离昆虫体内真菌和细菌中的应用。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
18.(1)本发明是以胰酪蛋白胨，蝉花干粉，酵母提取物，活性多糖，玉米浸粉，维生素c，维生素e和中微量元素溶液形成的昆虫共生菌分离培养基，蝉花干粉含有多种昆虫共生菌所需的营养成分，其中，虫草酸可帮助抵御病原菌的侵害，蝉花干粉中的18种氨基酸、生物碱、麦角甾醇与胰酪蛋白胨、酵母提取物、活性多糖互相协同，提供了昆虫共生菌所必需的营养成分，补加玉米浸粉、维生素c、维生素e和中微量元素溶液进一步促进了昆虫共生菌的生长繁殖。
19.(2)通过使用本发明提供的昆虫共生菌分离培养基，昆虫内生菌的分离效率较高，进一步提高了昆虫内生菌生长需求的广谱适应性。
具体实施方式
20.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。下述试验方法和检测方法，如没有特殊说明，均为常规方法；所述试剂和原料，如没有特殊说明，均为市售。
21.实施例1
22.一种昆虫共生菌分离培养基，由以下质量百分比的原料组成：胰酪蛋白胨3％，蝉花干粉5％，酵母提取物1％，活性多糖1％，玉米浸粉2％，维生素c0.4％，维生素e0.4％，中微量元素溶液0.1％，余量为纯水。
23.所述活性多糖为枸杞多糖、香菇多糖、灵芝多糖、松花粉多糖。
24.所述中微量元素溶液由0.5gfeso4、0.2gk2hpo4、1.5gnacl、0.1gcacl2·
2h2o、2gmgso4，纯水定容至500ml。
25.本发明还提供了一种昆虫共生菌分离培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
26.s1，采用生理盐水清洗去除杂质的蝉花，去除表面多余生理盐水后，于35℃干燥处理3h，在-10℃下冷冻处理蝉花4h，在5pa的气压下缓慢升温至10℃，保持3h后，在同样的气压条件下缓慢升温至25℃，并于无菌条件下粉碎后，得到100目的蝉花干粉；
27.s2，称取各原料物质，向s1所述的蝉花干粉中按照1g:200ml的料液比加入纯水搅拌至完全溶解，依次加入酵母提取物、活性多糖和玉米浸粉形成混合溶液；向胰酪蛋白胨按照1g:25ml的料液比加入纯水煮沸至完全溶解后倒入所述混合溶液中，高压蒸汽灭菌30min，依次加入维生素c、维生素e和中微量元素溶液，得到昆虫共生菌分离培养基。
28.实施例2
29.一种昆虫共生菌分离培养基，由以下质量百分比的原料组成：胰酪蛋白胨8％，蝉花干粉15％，酵母提取物5％，活性多糖3％，玉米浸粉6％，维生素c0.8％，维生素e0.8％，中微量元素溶液0.3％，余量为纯水。
30.所述活性多糖为枸杞多糖、香菇多糖、灵芝多糖、松花粉多糖。
31.所述中微量元素溶液由1.5gfeso4、0.4gk2hpo4、3gnacl、0.3gcacl2·
2h2o、3.5gmgso4，纯水定容至500ml。
32.本发明还提供了一种昆虫共生菌分离培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
33.s1，采用生理盐水清洗去除杂质的蝉花，去除表面多余生理盐水后，于40℃干燥处理5h，在-20℃下冷冻处理蝉花6h，在10pa的气压下缓慢升温至20℃，保持5h后，在同样的气压条件下缓慢升温至35℃，并于无菌条件下粉碎后，得到200目的蝉花干粉；
34.s2，称取各原料物质，向s1所述的蝉花干粉中按照1g:300ml的料液比加入纯水搅拌至完全溶解，依次加入酵母提取物、活性多糖和玉米浸粉形成混合溶液；向胰酪蛋白胨按照1g:40ml的料液比加入纯水煮沸至完全溶解后倒入所述混合溶液中，高压蒸汽灭菌40min，依次加入维生素c、维生素e和中微量元素溶液，得到昆虫共生菌分离培养基。
35.实施例3
36.一种昆虫共生菌分离培养基，由以下质量百分比的原料组成：胰酪蛋白胨5％，蝉花干粉10％，酵母提取物3％，活性多糖2％，玉米浸粉4％，维生素c0.6％，维生素e0.6％，中微量元素溶液0.2％，余量为纯水。
37.所述活性多糖为枸杞多糖、香菇多糖、灵芝多糖、松花粉多糖。
38.所述中微量元素溶液由1gfeso4、0.3gk2hpo4、2gnacl、0.2gcacl2·
2h2o、2.5gmgso4，纯水定容至500ml。
39.本发明还提供了一种昆虫共生菌分离培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
40.s1，采用生理盐水清洗去除杂质的蝉花，去除表面多余生理盐水后，于38℃干燥处理4h，在-15℃下冷冻处理蝉花5h，在8pa的气压下缓慢升温至15℃，保持4h后，在同样的气压条件下缓慢升温至30℃，并于无菌条件下粉碎后，得到150目的蝉花干粉；
41.s2，称取各原料物质，向s1所述的蝉花干粉中按照1g:250ml的料液比加入纯水搅拌至完全溶解，依次加入酵母提取物、活性多糖和玉米浸粉形成混合溶液；向胰酪蛋白胨按照1g:30ml的料液比加入纯水煮沸至完全溶解后倒入所述混合溶液中，高压蒸汽灭菌35min，依次加入维生素c、维生素e和中微量元素溶液，得到昆虫共生菌分离培养基。
42.实施例4
43.一种昆虫共生菌分离培养基，由以下质量百分比的原料组成：胰酪蛋白胨6％，蝉花干粉8％，酵母提取物2％，活性多糖1.5％，玉米浸粉3％，维生素c0.5％，维生素e0.5％，
中微量元素溶液0.1％，余量为纯水。
44.所述活性多糖为枸杞多糖、香菇多糖、灵芝多糖、松花粉多糖。
45.所述中微量元素溶液由0.8gfeso4、0.4gk2hpo4、2.5gnacl、0.1gcacl2·
2h2o、3gmgso4，纯水定容至500ml。
46.本发明还提供了一种昆虫共生菌分离培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
47.s1，采用生理盐水清洗去除杂质的蝉花，去除表面多余生理盐水后，于36℃干燥处理3.5h，在-12℃下冷冻处理蝉花4.5h，在6pa的气压下缓慢升温至12℃，保持3.5h后，在同样的气压条件下缓慢升温至28℃，并于无菌条件下粉碎后，得到100目的蝉花干粉；
48.s2，称取各原料物质，向s1所述的蝉花干粉中按照1g:220ml的料液比加入纯水搅拌至完全溶解，依次加入酵母提取物、活性多糖和玉米浸粉形成混合溶液；向胰酪蛋白胨按照1g:35ml的料液比加入纯水煮沸至完全溶解后倒入所述混合溶液中，高压蒸汽灭菌32min，依次加入维生素c、维生素e和中微量元素溶液，得到昆虫共生菌分离培养基。
49.实施例5
50.一种昆虫共生菌分离培养基，由以下质量百分比的原料组成：胰酪蛋白胨4％，蝉花干粉12％，酵母提取物4％，活性多糖2.5％，玉米浸粉5％，维生素c0.7％，维生素e0.7％，中微量元素溶液0.3％，余量为纯水。
51.所述活性多糖为枸杞多糖、香菇多糖、灵芝多糖、松花粉多糖。
52.所述中微量元素溶液由1.2gfeso4、0.4gk2hpo4、1.8gnacl、0.2gcacl2·
2h2o、2.2gmgso4，纯水定容至500ml。
53.本发明还提供了一种昆虫共生菌分离培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
54.s1，采用生理盐水清洗去除杂质的蝉花，去除表面多余生理盐水后，于37℃干燥处理4.5h，在-18℃下冷冻处理蝉花5.5h，在7pa的气压下缓慢升温至18℃，保持4.5h后，在同样的气压条件下缓慢升温至32℃，并于无菌条件下粉碎后，得到200目的蝉花干粉；
55.s2，称取各原料物质，向s1所述的蝉花干粉中按照1g:280ml的料液比加入纯水搅拌至完全溶解，依次加入酵母提取物、活性多糖和玉米浸粉形成混合溶液；向胰酪蛋白胨按照1g:28ml的料液比加入纯水煮沸至完全溶解后倒入所述混合溶液中，高压蒸汽灭菌38min，依次加入维生素c、维生素e和中微量元素溶液，得到昆虫共生菌分离培养基。
56.为了进一步说明本发明的效果，本发明还设置了对比例，如下：
57.对比例1
58.一种昆虫共生菌分离培养基，由以下质量百分比的原料组成：胰酪蛋白胨5％，蝉花干粉10％，酵母提取物3％，活性多糖2％，玉米浸粉4％，维生素c0.6％，维生素e0.6％，中微量元素溶液0.2％，余量为纯水。
59.所述活性多糖为枸杞多糖、香菇多糖、灵芝多糖、松花粉多糖。
60.所述中微量元素溶液由1gfeso4、0.3gk2hpo4、2gnacl、0.2gcacl2·
2h2o、2.5gmgso4，纯水定容至500ml。
61.本发明还提供了一种昆虫共生菌分离培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
62.s1，采用生理盐水清洗去除杂质的蝉花，去除表面多余生理盐水后，于38℃干燥处理4h，在-15℃下冷冻处理蝉花5h，在8pa的气压下缓慢升温至15℃，保持4h后，在同样的气压条件下缓慢升温至30℃，并于无菌条件下粉碎后，得到150目的蝉花干粉；
63.s2，称取各原料物质，向s1所述的蝉花干粉中按照1g:250ml的料液比加入纯水搅拌至完全溶解，依次加入酵母提取物、活性多糖和玉米浸粉形成混合溶液；向胰酪蛋白胨按照1g:30ml的料液比加入纯水煮沸至完全溶解后倒入所述混合溶液中，高压蒸汽灭菌35min，依次加入维生素c、维生素e和中微量元素溶液，得到昆虫共生菌分离培养基。
64.对比例2
65.一种昆虫共生菌分离培养基，由以下质量百分比的原料组成：胰酪蛋白胨5％，蝉花干粉10％，酵母提取物3％，活性多糖2％，玉米浸粉4％，维生素c0.6％，维生素e0.6％，中微量元素溶液0.2％，余量为纯水。
66.所述活性多糖为枸杞多糖、香菇多糖、灵芝多糖、松花粉多糖。
67.所述中微量元素溶液由1gfeso4、0.3gk2hpo4、2gnacl、0.2gcacl2·
2h2o、2.5gmgso4，纯水定容至500ml。
68.本发明还提供了一种昆虫共生菌分离培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
69.s1，采用生理盐水清洗去除杂质的蝉花，去除表面多余生理盐水后，于38℃干燥处理4h，在-15℃下冷冻处理蝉花5h，在8pa的气压下缓慢升温至15℃，保持4h后，在同样的气压条件下缓慢升温至30℃，并于无菌条件下粉碎后，得到150目的蝉花干粉；
70.s2，称取各原料物质，向s1所述的蝉花干粉中按照1g:250ml的料液比加入纯水搅拌至完全溶解，依次加入酵母提取物、活性多糖和玉米浸粉形成混合溶液；向胰酪蛋白胨按照1g:30ml的料液比加入纯水煮沸至完全溶解后倒入所述混合溶液中，高压蒸汽灭菌35min，依次加入维生素c、维生素e和中微量元素溶液，得到昆虫共生菌分离培养基。
71.对比例3
72.一种昆虫共生菌分离培养基，由以下质量百分比的原料组成：胰酪蛋白胨5％，蝉花干粉10％，酵母提取物3％，活性多糖2％，玉米浸粉4％，维生素c0.6％，维生素e0.6％，中微量元素溶液0.2％，余量为纯水。
73.所述活性多糖为枸杞多糖、香菇多糖、灵芝多糖、松花粉多糖。
74.所述中微量元素溶液由1gfeso4、0.3gk2hpo4、2gnacl、0.2gcacl2·
2h2o、2.5gmgso4，纯水定容至500ml。
75.本发明还提供了一种昆虫共生菌分离培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
76.s1，采用生理盐水清洗去除杂质的蝉花，去除表面多余生理盐水后，于38℃干燥处理4h，在-15℃下冷冻处理蝉花5h，在8pa的气压下缓慢升温至15℃，保持4h后，在同样的气压条件下缓慢升温至30℃，并于无菌条件下粉碎后，得到150目的蝉花干粉；
77.s2，称取各原料物质，向s1所述的蝉花干粉中按照1g:250ml的料液比加入纯水搅拌至完全溶解，依次加入酵母提取物、活性多糖和玉米浸粉形成混合溶液；向胰酪蛋白胨按照1g:30ml的料液比加入纯水煮沸至完全溶解后倒入所述混合溶液中，高压蒸汽灭菌35min，依次加入维生素c、维生素e和中微量元素溶液，得到昆虫共生菌分离培养基。
78.对比例4
79.一种昆虫共生菌分离培养基，由以下质量百分比的原料组成：胰酪蛋白胨5％，蝉花干粉10％，酵母提取物3％，活性多糖2％，玉米浸粉4％，维生素c0.6％，维生素e0.6％，中微量元素溶液0.2％，余量为纯水。
80.所述活性多糖为枸杞多糖、香菇多糖、灵芝多糖、松花粉多糖。
81.所述中微量元素溶液由1gfeso4、0.3gk2hpo4、2gnacl、0.2gcacl2·
2h2o、2.5gmgso4，纯水定容至500ml。
82.本发明还提供了一种昆虫共生菌分离培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
83.s1，采用生理盐水清洗去除杂质的蝉花，去除表面多余生理盐水后，于38℃干燥处理4h，在-15℃下冷冻处理蝉花5h，在8pa的气压下缓慢升温至15℃，保持4h后，在同样的气压条件下缓慢升温至30℃，并于无菌条件下粉碎后，得到150目的蝉花干粉；
84.s2，称取各原料物质，向s1所述的蝉花干粉中按照1g:250ml的料液比加入纯水搅拌至完全溶解，依次加入酵母提取物、活性多糖和玉米浸粉形成混合溶液；向胰酪蛋白胨按照1g:30ml的料液比加入纯水煮沸至完全溶解后倒入所述混合溶液中，高压蒸汽灭菌35min，依次加入维生素c、维生素e和中微量元素溶液，得到昆虫共生菌分离培养基。
85.分别采用上述实施例1～5和对比例1～4制备得到的昆虫共生菌分离培养基对家蚕的肠道匀浆稀释液进行培养，每份实施例和对比例的样品均重复培养、分离和纯化5次，并对分离得到的菌种进行鉴定，其结果如表1～5所示。
86.表1本发明实施例1～5的培养基分离纯化得到的家蚕肠道内生细菌
87.假单胞菌属(pseudomonas)气单胞菌属(aeromonas)短波单胞杆菌属(brevundimonas)葡萄球菌属(staphylococcus)短杆菌属(brevibracterium)埃希氏菌属(escherichia)寡养单胞菌属(stenotrophomonas)克雷伯氏菌属(klebsiella)肠杆菌属(enterobacter)柠檬酸杆菌属(citrobacter)
88.表2对比例1的培养基分离纯化得到的家蚕肠道内生细菌
89.假单胞菌属(pseudomonas)气单胞菌属(aeromonas)短波单胞杆菌属(brevundimonas)葡萄球菌属(staphylococcus)短杆菌属(brevibracterium)克雷伯氏菌属(klebsiella)肠杆菌属(enterobacter) 90.表3对比例2的培养基分离纯化得到的家蚕肠道内生细菌
91.假单胞菌属(pseudomonas)葡萄球菌属(staphylococcus)短波单胞杆菌属(brevundimonas)短杆菌属(brevibracterium)寡养单胞菌属(stenotrophomonas)克雷伯氏菌属(klebsiella)肠杆菌属(enterobacter) 92.表4对比例3的培养基分离纯化得到的家蚕肠道内生细菌
93.假单胞菌属(pseudomonas)气单胞菌属(aeromonas)短杆菌属(brevibracterium)埃希氏菌属(escherichia)
寡养单胞菌属(stenotrophomonas)克雷伯氏菌属(klebsiella)肠杆菌属(enterobacter)柠檬酸杆菌属(citrobacter)
94.表5对比例4的培养基分离纯化得到的家蚕肠道内生细菌
95.假单胞菌属(pseudomonas)气单胞菌属(aeromonas)短杆菌属(brevibracterium)葡萄球菌属(staphylococcus)寡养单胞菌属(stenotrophomonas)埃希氏菌属(escherichia)肠杆菌属(enterobacter)柠檬酸杆菌属(citrobacter)
96.由表1～5可知：本发明实施例1～5提供的昆虫共生菌分离培养基使得家蚕肠道内生菌被分离出的种类丰富，可达10种；而对比例1～4提供的培养基分离得到的家蚕肠道内生菌的种类相对较少；结合表1、表2和表3可知，当昆虫共生菌分离培养基中分别缺少蝉花干粉和活性多糖两个组分时，埃希氏菌属及柠檬酸杆菌属均无法从家蚕肠道中进行有效分离，且对比例1中缺少蝉花干粉组分会直接影响寡养单胞菌属的分离，对比例2中缺少活性多糖则会对气单胞菌属的分离产生较大影响；结合表1、表4和表5可知，当昆虫共生菌分离培养基中分别缺少酵母提取物和胰酪蛋白胨两个组分时，短波单胞杆菌属无法从家蚕肠道中进行有效分离，且对比例3中缺少酵母提取物会直接影响葡萄球菌属的分离，对比例4中缺少胰酪蛋白胨则会对克雷伯氏菌属的分离产生较大影响；综上所述，本发明提供的昆虫共生菌分离培养基可有效分离筛选出较多种类的菌群，分离得到的内生菌多样性优势显著。
97.综上所述，本发明提供的昆虫共生菌分离培养基具有对家蚕肠道内生菌良好的分离效果，提供了一种效果优异的筛选培养基，通过使用本发明提供的昆虫共生菌分离培养基，昆虫体内细菌和真菌的分离效率较高，进一步提高了昆虫内生菌生长需求的广谱适应性。
98.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。