一种含三萜类化合物的角果木叶提取物及其制备方法和应用

1.本发明涉及天然药物化学技术领域，具体涉及一种含三萜类化合物的角果木叶提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.角果木(学名：ceriops tagal(perr.)c.b.rob.)是红树科角果木属植物。角果木叶为红树科植物角果木的叶，其全年均可采，鲜用或晒干，主要用于解毒截疟。
3.现有技术对于角果木叶中的有效成分研究不够深入，研究报道较少。本发明发明人虽然前期从角果木叶中分离得到了两个具有一定抗肿瘤活性的达玛烷型三萜cereotagalol c和cereotagalol d(详见xin wu,hongbo liao,xiaohui zhu,hongyu lu,xiaobin zeng,liao cui,xiaohua lv,yanqun li and chaohua zhang.two new dammarane triterpenes from the leaves of ceriops tagal,rec.nat.prod.10:5(2016)628-632.)；但是角果木叶中是否还存在其它抗肿瘤成分，本领域技术人员是不得而知的，还需要进一步深入研究。
4.因此，以角果木叶为原料，进一步从中开发出具有效果更好的抗肿瘤作用的有效部位或进一步开发出具有肿瘤作用的有效成分具有重要的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术对于角果木叶中的抗肿瘤成分研究不足，本发明首先提供了一种含三萜类化合物的红树林角果木叶提取物；研究表明，由本发明所述方法制备得到的含三萜类化合物的红树林角果木叶提取物，其富集了大量的抗肿瘤有效成分。
6.本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
7.一种含三萜类化合物的角果木叶提取物的制备方法，其包含如下步骤：
8.(1)取干燥的角果木叶用有机溶剂进行提取，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶有机溶剂提取物；
9.(2)将角果木叶有机溶剂提取物上大孔树脂柱，用乙醇水溶液组成的洗脱溶剂进行洗脱得洗脱液，将洗脱液浓缩干燥后得角果木叶大孔树脂洗脱部位；即所述的含三萜类化合物的角果木叶提取物。
10.本发明先将角果木叶用丙酮提取再经本发明所述的大孔树脂柱浓缩富集有效成分制备得到的提取物，其中不仅富集有具有已知的具有抗癌作用的三萜类化合物，同时还富集了大量的其它活性成分。通过本发明所述方法制备得到的提取物，其是一个由多种活性成分组成的有效成分集合；其具有优异的抗癌作用，如同时具有优异的抗肝癌、肺癌以及结肠癌作用。
11.优选地，步骤(1)中的所述的有机溶剂为丙酮。
12.优选地，步骤(1)中的所述的提取是指加热回流提取，提取时间为1～2h。
13.优选地，步骤(2)中大孔树脂柱的具体洗脱条件为：将角果木叶醇提取物上大孔树脂柱，先用体积分数为40～50％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用体积分数为70～80％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为70～80％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，将洗脱液浓缩干燥后得角果木叶大孔树脂洗脱部位。
14.最优选地，步骤(2)中大孔树脂柱的具体洗脱条件为：将角果木叶有机溶剂提取物上大孔树脂柱，先用体积分数为45％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，将洗脱液浓缩干燥后得角果木叶大孔树脂洗脱部位。
15.优选地，所述的大孔树脂柱为ab-8型大孔树脂柱。
16.进一步将角果木叶大孔树脂洗脱部位用硅胶柱富集有效成分；所述的硅胶柱的具体洗脱条件为：先用体积比为98～99:1～2的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用体积比为93～95:7～5的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为93～95:7～5的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液浓缩干燥后即得所述的含三萜类化合物的角果木叶提取物。
17.最优选地，所述的硅胶柱的具体洗脱条件为：先用体积比为98:2的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用体积比为94:6的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为94:6的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液浓缩干燥后即得所述的含三萜类化合物的角果木叶提取物。
18.发明人需要进一步说明的是：硅胶柱洗脱条件非常关键，发明人在大量的实验中惊奇的发现，在本发明上述硅胶柱洗脱条件下制备得到的含三萜化合物的角果木叶提取物其抗结肠癌作用得到了进一步大幅提高，具有十分优异的抗结肠癌作用。
19.优选地，上述方法制备得到的含三萜类化合物的角果木叶提取物中含有式ⅰ、ⅱ和ⅲ所示结构的三萜类化合物；
[0020][0021]
发明人将通过上述硅胶柱制备得到的所述的含三萜类化合物的角果木叶提取物，再次上硅胶柱，然后用体积比为98:2氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱，得到式ⅰ、ⅱ和ⅲ所示结构的三萜化合物。式ⅰ、ⅱ和ⅲ所示结构的三萜类化合物的核磁图谱见说明书附图。
[0022]
本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的含三萜类化合物的角果木叶提取物。
[0023]
本发明还提供了一种上述含三萜类化合物的角果木叶提取物在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用。
[0024]
优选地，所述的肿瘤为肝癌、肺癌或结肠癌中的一种或多种。
[0025]
有益效果：本发明提供了一种全新的含三萜类化合物的角果木叶提取物的制备方法；研究表明，由本发明所述方法制备得到的角果木叶提取物富集了大量的抗肿瘤成分，其中包括三萜类化合物；由该方法制备得到的含三萜类化合物的角果木叶提取物能够同时对肝癌、肺癌以及结肠癌具有抑制作用，体现出了优异的抗肿瘤作用。
附图说明
[0026]
图1为式ⅰ所示结构的三萜类化合物的1h-nmr图谱。
[0027]
图2为式ⅰ所示结构的三萜类化合物的13c-nmr图谱。
[0028]
图3为式ⅱ所示结构的三萜类化合物的1h-nmr图谱。
[0029]
图4为式ⅱ所示结构的三萜类化合物的13c-nmr图谱。
[0030]
图5为式ⅲ所示结构的三萜类化合物的1h-nmr图谱。
[0031]
图6为式ⅲ所示结构的三萜类化合物的13c-nmr图谱。
具体实施方式
[0032]
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
[0033]
实施例1含三萜类化合物的角果木叶提取物的制备方法
[0034]
(1)取干燥的角果木叶加入有机溶剂，然后加热到沸腾状态进行回流提取1.5h，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶有机溶剂提取物；其中，所述的有机溶剂为丙酮，有机溶剂的重量用量为干燥的角果木叶的重量的15倍；
[0035]
(2)将角果木叶有机溶剂提取物上大孔树脂柱(采用ab-8型大孔树脂，大孔树脂填料的重量为角果木叶有机溶剂提取物重量的50倍)，先用3倍柱体积的体积分数为45％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，将洗脱液浓缩干燥后得角果木叶大孔树脂洗脱部位，即含三萜类化合物的角果木叶提取物。
[0036]
实施例2含三萜类化合物的角果木叶提取物的制备方法
[0037]
(1)取干燥的角果木叶加入有机溶剂，然后加热到沸腾状态进行回流提取1.5h，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶有机溶剂提取物；其中，所述的有机溶剂为丙酮，有机溶剂的重量用量为干燥的角果木叶的重量的15倍；
[0038]
(2)将角果木叶有机溶剂提取物上大孔树脂柱(采用ab-8型大孔树脂，大孔树脂填料的重量为角果木叶有机溶剂提取物重量的50倍)，先用3倍柱体积的体积分数为45％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，将洗脱液浓缩干燥后得角果木叶大孔树脂洗脱部位；
[0039]
(3)将角果木叶大孔树脂洗脱部位上硅胶柱(所述的硅胶为200-300目硅胶，硅胶的重量为角果木叶大孔树脂洗脱部位重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积比为98:2的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积比为94:6的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为94:6的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液浓缩干燥后即得所述的含三萜类化合物的角果木叶提取物。
[0040]
对比例1含三萜类化合物的角果木叶提取物的制备方法
[0041]
(1)取干燥的角果木叶加入有机溶剂，然后加热到沸腾状态进行回流提取1.5h，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶有机溶剂提取物；其中，所述的有机溶剂为丙酮，有机溶剂的重量用量为干燥的角果木叶的重量的15倍；
[0042]
(2)将角果木叶有机溶剂提取物上大孔树脂柱(采用ab-8型大孔树脂，大孔树脂填料的重量为角果木叶有机溶剂提取物重量的50倍)，先用3倍柱体积的体积分数为45％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，将洗脱液浓缩干燥后得角果木叶大孔树脂洗脱部位；
[0043]
(3)将角果木叶大孔树脂洗脱部位上硅胶柱(所述的硅胶为200-300目硅胶，硅胶的重量为角果木叶大孔树脂洗脱部位重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积比为95:5的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积比为90:10的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为90:10的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液浓缩干燥后即得所述的含三萜类化合物的角果木叶提取物。
[0044]
对比例1与实施例2的区别在于，硅胶柱的洗脱条件不同，对比例1的硅胶柱洗脱条件为：先用体积比为95:5的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用体积比为90:10的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱；而实施例2则是先用体积比为98:2的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；再用体积比为94:6的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱。
[0045]
对比例2含三萜类化合物的角果木叶提取物的制备方法
[0046]
(1)取干燥的角果木叶加入有机溶剂，然后加热到沸腾状态进行回流提取1.5h，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶有机溶剂提取物；其中，所述的有机溶剂为丙酮，有机溶剂的重量用量为干燥的角果木叶的重量的15倍；
[0047]
(2)将角果木叶有机溶剂提取物上大孔树脂柱(采用ab-8型大孔树脂，大孔树脂填料的重量为角果木叶有机溶剂提取物重量的50倍)，先用3倍柱体积的体积分数为45％的乙醇水溶液洗脱除杂；然后再用5倍柱体积的体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱下来的洗脱液，将洗脱液浓缩干燥后得角果木叶大孔树脂洗脱部位；
[0048]
(3)将角果木叶大孔树脂洗脱部位上硅胶柱(所述的硅胶为200-300目硅胶，硅胶的重量为角果木叶大孔树脂洗脱部位重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积比为90:10的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积比为85:15的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为85:15的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液浓缩干燥后即得所述的含三萜类化合物的角果木叶提取物。
[0049]
对比例2与实施例2的区别在于，硅胶柱的洗脱条件不同，对比例2的硅胶柱洗脱条件为：先用体积比为90:10的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用体积比为85:15的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱；而实施例2则是先用体积比为98:2的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂；再用体积比为94:6的石油醚和丙酮组成的混合有机溶剂进行洗脱。
[0050]
实验例含三萜类化合物的角果木叶提取物抗癌活性测试
[0051]
试验方法：取人癌细胞于rpmi 1640培养基中培养，癌细胞以1.5
×
104每孔加入96孔板中，放入培养箱中，在37℃含5％co2的条件下培养24小时，接着吸去培养基。然后实验组加入含有0.01～100μg/ml待测提取物的rpmi 1640培养基，空白组加入不含提取物的等量的rpmi 1640培养基；加入培养基后继续培养48h；接着加入mtt(浓度为5mg/ml)，培养4h后，吸去上清液，加入100μl dmso，在暗处放置15min后用酶标仪于570nm下测定吸光值。根据吸光值计算细胞存活情况，每个处理设6个重复孔。
[0052]
细胞存活率(％)＝δod
药物处理组
/δod
空白组
×
100；再根据剂量效应曲线计算细胞半抑制浓度(ic
50
)，实验结果见表1。
[0053]
测试的癌细胞为：肝癌细胞bel-7404、肺癌细胞a549以及结肠癌细胞sw620。
[0054]
测试提取物为：实施例1、2以及对比例1、2制备得到的含三萜类化合物的角果木叶提取物。
[0055]
表1.含三萜类化合物的角果木叶提取物抗癌活性测试结果
[0056][0057]
由表1实验数据可以看出，实施例1制备得到的含三萜类化合物的角果木叶提取物，其对肝癌细胞、肺癌细胞以及结肠癌细胞的ic50值均在20μg/ml左右，该实验数据表明，本发明先将角果木叶用丙酮提取再经本发明所述的大孔树脂柱浓缩富集有效成分制备得到的提取物，其能同时对肝癌细胞、肺癌细胞以及结肠癌细胞均具有良好的抑制效果。
[0058]
由表1实验数据可以看出，实施例2制备得到的含三萜类化合物的角果木叶提取物其对结肠癌细胞的ic50值为2.2，远远小于实施例1制备得到的含三萜类化合物的角果木叶提取物。这说明，本发明在角果木叶大孔树脂洗脱部位的基础上，进一步通过本发明所述的硅胶柱洗脱条件制备得到的含三萜类化合物的角果木叶提取物，其抗结肠癌作用得到了进一步地大幅提高；具有十分优异的抗结肠癌作用。
[0059]
由表1实验数据还可以看出，实施例2制备得到的含三萜类化合物的角果木叶提取物，其对肝癌细胞以及肺癌细胞的抑制作用并未得到改善或大幅改善；这说明，本发明在角果木叶大孔树脂洗脱部位的基础上，进一步通过本发明所述的硅胶柱洗脱条件制备得到的含三萜类化合物的角果木叶提取物，其只能进一步大幅提高抗结肠癌作用，并不能大幅提高抗肝癌以及抗肺癌作用。
[0060]
从由表1实验数据还可以看出，对比例1和2制备得到的含三萜类化合物的角果木叶提取物其抗结肠癌作用与实施例1相比，并未得到大幅提高甚至还减弱了；这说明，硅胶柱洗脱条件十分关键，在角果木叶大孔树脂洗脱部位的基础上，只有采用本发明所述的硅胶柱洗脱条件才能富集得到大量的具有抗结肠癌作用的有效成分，制备得到的提取物才能进一步大幅提高抗结肠癌作用；而在其它硅胶柱洗脱条件下并不能进一步富集得到具有抗结肠癌作用的有效成分，制备得到的提取物并不能大幅提高抗结肠癌作用。