IL-38短发夹RNA片段及其治疗牙周炎的用途

il-38短发夹rna片段及其治疗牙周炎的用途
技术领域
1.本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学技术领域，具体涉及 一种il-38短发夹rna片段及其治疗牙周炎的用途。


背景技术：

2.牙周炎是由口腔微生物引起的慢性感染性疾病，其影响范围可达世界 人口的10％-15％，是成人失牙的首要原因。当侵入牙周组织的致病菌 (如牙龈卟啉单胞菌)不能及时被宿主免疫系统清除时，会导致牙周局部 炎症。炎症免疫反应所产生的炎性因子可能随血液循环到达其他组织器 官，引起全身性免疫反应，进而导致慢性炎症性病理表现。因此，牙周炎 与多种系统性疾病相关，研究发现，牙周炎参与心血管疾病的发生发展， 如突发性动脉粥样硬化性心血管疾病；牙周炎被列为糖尿病的第六大并发 症，同时，糖尿病患者更易患牙周炎。另外，国外诸多研究团队发现牙周 炎与呼吸道疾病、癌症、阿尔兹海默症、不良妊娠和风湿性关节炎的发病 机制也密切相关。因此，牙周炎慢性炎症的发病机制研究对牙周炎本身及 其引发的系统性疾病的防治均有重大意义。
3.il-36亚家族细胞因子在炎症反应和维持粘膜稳态过程中发挥重要作 用，由il-36α、il-36β、il-36γ、il-36ra及il-38组成。il-36细胞因子 主要表达于上皮组织，包括皮肤组织、口腔上皮等。有研究表明，il-36 细胞因子参与牛皮癣、关节炎和结肠炎等慢性炎症疾病的病理过程。在口 腔炎症方面，reynold课题组发现，牙周炎主要致病菌，牙龈卟啉单胞菌 通过激活口腔上皮细胞系tlr2信号通路，使il-36γ基因表达水平明显升 高。同时，il-36γ具有刺激树突状细胞、巨噬细胞或口腔上皮并产生 cxcl-1和ccl-20的能力，进而促进中性粒细胞和th17细胞的免疫应答 水平。另外，该课题组最新研究表明il-36γ也可通过调节口腔上皮细胞抗 菌蛋白mmp9和ngal的mrna表达而增强粘膜免疫水平。另一项研究 发现70％牙周炎患者有较高的il-36激动剂/il-36ra mrna比值。因此， 以上研究表明il-36亚家族细胞因子可能是牙周炎发病机制中的重要调节 因子。
4.白细胞介素-38(il-38)是il-36亚家族最新成员，il-38主要表达于 皮肤的基底上皮细胞和扁桃体增殖b细胞。目前研究表明il-38参与调节 诸多炎症性疾病的病理过程。一方面，il-38抑制白念珠菌诱导的健康捐 赠者外周血单个核细胞(pbmc)中辅助t细胞(th)17细胞因子的产生， 并且能够抑制lps刺激的pbmc和巨噬细胞产生il-6和il-8。人凋亡细 胞所分泌的il-38能够抑制巨噬细胞il-6的分泌，进而调节辅助性t细胞 (th17)炎症反应；同时，il-38通过减少γδt细胞il-17的表达而抑制 皮肤炎症牛皮癣的发生。因此，il-38在上述研究中表现出抑炎作用。另 一方面，在系统性红斑狼疮患者血清中及原发性干燥病患者的腺体活检中 均发现il-38的表达水平升高。同时，il-38在自身炎症性中性脓疱性皮 肤病(hs)皮损附近区域(皮损周围区域)的表达明显高于正常皮肤和 皮损皮肤。有研究发现，在慢性乙型肝炎患者中，血清中il-38的升高与 持续的肝损伤相关。以上研究表明，il-38可能促进以上疾病的病理过 程。
5.目前治疗牙周炎的药物主要为阿莫西林、四环素、米诺环素等抗生 素，存在疗效
欠佳、毒副作用较大、药物作用机制较为单一等问题，缺乏 针对病因的特异性细胞因子疗法。


技术实现要素：

6.基于此，本发明提供了一种用于干扰白介素-38表达的短发夹rna片 段，该短发夹rna片段的序列如下：
7.正义链：5
’‑
ugcagaccagaaggcucuaua-3’(seq id no:5)；
8.反义链：5
’‑
uauagagccuucuggucugca-3’(seq id no: 6)。
9.进一步地，该短发夹rna片段具有化学修饰和/或具有化学插入和/或 具有化学替代。
10.进一步地，具有化学修饰和/或具有化学插入和/或具有化学替代的短 发夹rna片段是与该反义链和/或该正义链具有至少约90％、约91％、约 92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同 一性程度的核苷酸序列。
11.进一步地，该短发夹rna片段用作药物或与药学上可接受的载体联 合用作药物，用于预防和/或治疗与白介素-38基因表达相关的疾病和/或病 症。
12.进一步地，该疾病和/或病症为慢性炎症。
13.进一步地，该慢性炎症选自以下的一种或多种：牛皮癣、关节炎、结 肠炎、牙周炎、系统性红斑狼疮、原发性干燥病、脓疱性皮肤病和慢性乙 型肝炎。
14.进一步地，该慢性炎症为牙周炎。
15.进一步地，该牙周炎是由牙龈卟啉单胞菌脂多糖引起的牙周炎。
16.进一步地，该牙周炎是il-1β、tnfα、il-6、il-17a和il-38表达均 增高的牙周炎。
17.进一步地，该正义链或反义链末端偶联有1～3个核苷酸和/或1～3个 具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体。
18.进一步地，该正义链或反义链的序列内插入或删除1～3个核苷酸和/ 或1～3个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体。
19.进一步地，该正义链或反义链的序列内的1～3个核苷酸被1～3个核苷 酸和/或1～3个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体所替代。
20.根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包 含上述短发夹rna片段和药学上可接受的载体。
21.进一步地，该载体是慢病毒载体。
22.进一步地，该短发夹rna片段与该药学上可接受的载体的重量比为 1:(1～1000)。
23.进一步地，该短发夹rna片段与所述药学上可接受的载体的重量比 为1:(1～500)。
24.进一步地，该短发夹rna片段与所述药学上可接受的载体的重量比 为1:(1～100)。
25.根据本发明的另一个方面，提供了一种使用上述药物组合物转染原代 牙周膜干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
26.(1)细胞准备：原代牙周膜干细胞消化后以约2
×
105个/孔的浓度接 种至6孔板中，每孔加入约2ml的完全培养基后，置于细胞孵育箱中；
27.(2)病毒转染：当细胞密度达40％-50％时，吸去完全培养基，按照 感染复数(moi)值为40且聚凝胺的浓度为约8μg/ml计算所需的所述药 物组合物的用量，将所述用量的所述药物组合物和约8μg/ml的所述聚凝 胺在离心管中与完全培养基混合均匀后缓慢加入至6孔板中，转染约24 小时后更换为不含病毒的完全培养基，转染约72小时后，倒置荧光显微 镜下观察荧光表达效果，直至转染率大于80％；以及
28.(3)转染纯化：吸去完全培养基，将嘌呤霉素浓度为约3μg/ml的完 全培养基缓慢加入至6孔板中，培养约48小时后观察所述原代牙周膜干 细胞直至未转染的原代牙周膜干细胞死亡率达90％以上。
29.根据本发明的另一个方面，提供了一种上述短发夹rna片段或上述 药物组合物在制备用于治疗和/或预防与白介素-38基因表达相关的疾病和/ 或病症的药物中的应用。
30.进一步地，该疾病和/或病症为慢性炎症。
31.进一步地，该慢性炎症选自以下的一种或多种：牛皮癣、关节炎、结 肠炎、牙周炎、系统性红斑狼疮、原发性干燥病、脓疱性皮肤病和慢性乙 型肝炎。
32.进一步地，该慢性炎症为牙周炎。
33.进一步地，该牙周炎是由牙龈卟啉单胞菌脂多糖引起的牙周炎。
34.进一步地，该牙周炎是il-1β、tnfα、il-6、il-17a和il-38表达均 增高的牙周炎。
35.根据本发明的另一个方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含上述短 发夹rna片段或上述药物组合物。
36.本发明的有益效果：
37.本发明的研究为短发夹rna介导的细胞因子疗法预防和治疗牙周炎 提供可能性，同时也为牙周炎与系统性疾病的相关性研究提供理论依据。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述 中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅 是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些 附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
39.图1为lps-pg刺激后各炎症因子的mrna相对表达情况图。其中， *p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
40.图2为细胞转染最佳聚凝胺浓度摸索和moi摸索荧光结果图。
41.图3为四组hpdlscs中il-38的相对表达量示意图。其中，
#
p＜ 0.05。其中，四组分别使用了shrna nc、il-38-shrna-1(y16719)、 il-38-shrna-2(y16720)和il-38-shrna-3(y16721)。
42.图4为使用il-38-shrna-3(y16721)之后各炎症因子的mrna相 对表达情况图。其中，
#
p＜0.05，
##
p＜0.01，
###
p＜0.001。
具体实施方式
43.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进 行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发
明中的实施例，本领域技术人员在没有做出 创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明 领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实 施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何rna片段、药物 组合、制备方法、试剂或耗材，但本文描述了优选的药物组合、制备方法 或材料。
45.正如背景技术部分所描述的，现有上市的治疗牙周炎的药物存在疗效 欠佳、毒副作用较大、药物作用机制较为单一的问题。为了解决上述问 题，本发明提供了一种用于干扰白介素-38表达的短发夹rna片段，该短 发夹rna片段的序列如下：
46.正义链：5
’‑
ugcagaccagaaggcucuaua-3’(seq id no:5)；
47.反义链：5
’‑
uauagagccuucuggucugca-3’(seq id no:6) 。
48.在一种优选的实施方式中，该短发夹rna片段具有化学修饰和/或具 有化学插入和/或具有化学替代。
49.在一种优选的实施方式中，具有化学修饰和/或具有化学插入和/或具 有化学替代的短发夹rna片段是与该反义链和/或该正义链具有至少约 90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、 约98％或约99％同一性程度的核苷酸序列。
50.在本发明中，关于数值的术语“约”或“大约”意指该数值的
±
5％， 但明确地包括确切的数值。例如，“约90％”是指从85.5％至94.5％，但 也明确地包括90％；“约95％”是指从90.25％至99.75％，但也明确地包 括90％。
51.本发明的术语例如“90％同一性程度”是指除了10％的碱基序列与所 要求保护的短发夹rna不同外，90％的碱基序列与所要求保护的短发夹 rna相同，并且与所要求保护的短发夹rna具有90％同一性程度的短发 夹rna具有与所要求保护的短发夹rna相同或相似的性质，均能实现本 发明的技术效果。
52.在一种优选的实施方式中，该短发夹rna片段用作药物或与药学上 可接受的载体联合用作药物，用于预防和/或治疗与白介素-38基因表达相 关的疾病和/或病症。
53.在一种优选的实施方式中，该疾病和/或病症为慢性炎症。
54.在一种优选的实施方式中，该慢性炎症选自以下的一种或多种：牛皮 癣、关节炎、结肠炎、牙周炎、系统性红斑狼疮、原发性干燥病、脓疱性 皮肤病和慢性乙型肝炎。
55.在一种优选的实施方式中，该慢性炎症为牙周炎。
56.在一种优选的实施方式中，该牙周炎是由牙龈卟啉单胞菌脂多糖引起 的牙周炎。
57.在一种优选的实施方式中，该牙周炎是il-1β、tnfα、il-6、il-17a 和il-38表达均增高的牙周炎。
58.在一种优选的实施方式中，该正义链或反义链末端偶联有1～3个核苷 酸和/或1～3个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体。
59.在一种优选的实施方式中，该正义链或反义链的序列内插入或删除 1～3个核苷酸和/或1～3个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体。
60.在一种优选的实施方式中，该正义链或反义链的序列内的1～3个核苷 酸被1～3个核苷酸和/或1～3个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单 体所替代。
61.在本发明中，该正义链或反义链末端偶联有1～3个核苷酸和/或1～3 个具有生物
活性或细胞毒性的核苷类似物单体，或者序列内插入或删除 1～3个核苷酸和/或1～3个具有生物活性或细胞毒性的核苷类似物单体，或 者序列内的1～3个核苷酸被1～3个核苷酸和/或1～3个具有生物活性或细 胞毒性的核苷类似物单体所替代，均能实现本发明的技术效果，即该短发 夹rna片段能够干扰目的基因il-38的表达，干扰效率达到70％，具有 防治牙周炎的应用前景。
62.根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包 含上述短发夹rna片段和药学上可接受的载体。
63.在一种优选的实施方式中，该载体是慢病毒载体。
64.在一种优选的实施方式中，该短发夹rna片段与该药学上可接受的 载体的重量比为1:(1～1000)。
65.在本发明中，浓度、密度、重量比、个数、时间或者其它参数以范 围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这 应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选 值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。并且在 该范围内均能实现本发明的技术效果。例如，当公开了范围“1: (1～1000)”时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内 的所有点值，例如1:1、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1: 70、1:80、1:90、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1: 700、1:800、1:900、1:1000等等，不限于上述所列举的这些数值。
66.在一种优选的实施方式中，该短发夹rna片段与所述药学上可接受 的载体的重量比为1:(1～500)。
67.在一种优选的实施方式中，该短发夹rna片段与所述药学上可接受 的载体的重量比为1:(1～100)。
68.在一种优选的实施方式中，该药物组合物进一步包括可用于预防和/ 或治疗慢性炎症例如牙周炎的附加治疗剂。
69.在一种优选的实施方式中，该附加治疗剂包括阿莫西林、四环素、米 诺环素等抗生素以及六味地黄丸、补肾固齿丸等免疫调节类药物。
70.根据本发明的另一个方面，提供了一种使用上述药物组合物转染原代 牙周膜干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
71.(1)细胞准备：原代牙周膜干细胞消化后以约2
×
105个/孔的浓度接 种至6孔板中，每孔加入约2ml的完全培养基后，置于细胞孵育箱中；
72.(2)病毒转染：当细胞密度达40％-50％时，吸去完全培养基，按照 感染复数(moi)值为40且聚凝胺的浓度为约8μg/ml计算所需的所述药 物组合物的用量，将所述用量的所述药物组合物和约8μg/ml的所述聚凝 胺在离心管中与完全培养基混合均匀后缓慢加入至6孔板中，转染约24 小时后更换为不含病毒的完全培养基，转染约72小时后，倒置荧光显微 镜下观察荧光表达效果，直至转染率大于80％；以及
73.(3)转染纯化：吸去完全培养基，将嘌呤霉素浓度为约3μg/ml的完 全培养基缓慢加入至6孔板中，培养约48小时后观察所述原代牙周膜干 细胞直至未转染的原代牙周膜干细胞死亡率达90％以上。
74.在本发明中，关于数值的术语“约”或“大约”意指该数值的
±ꢀ
5％，但明确地包括确切的数值。例如，“约2
×
105个/孔”是指从1.9
×ꢀ
105个/孔至2.1
×
105个/孔，但也明确地
包括2
×
105个/孔；“约2ml”是 指从1.9ml至2.1ml，但也明确地包括2ml；“约8μg/ml”是指从7.6 μg/ml至8.4μg/ml，但也明确地包括8μg/ml；“约24小时”是指从22.8 小时至25.2小时，但也明确地包括24小时；“约72小时”是指从68.4 小时至75.6小时，但也明确地包括72小时；“约3μg/ml”是指从2.85 μg/ml至3.15μg/ml，但也明确地包括3μg/ml；“约48小时”是指从45.6 小时至50.4小时，但也明确地包括48小时。
75.根据本发明的另一个方面，提供了一种上述短发夹rna片段或上述 药物组合物在制备用于治疗和/或预防与白介素-38基因表达相关的疾病和/ 或病症的药物中的应用。
76.在一种优选的实施方式中，该疾病和/或病症为慢性炎症。
77.在一种优选的实施方式中，该慢性炎症选自以下的一种或多种：牛皮 癣、关节炎、结肠炎、牙周炎、系统性红斑狼疮、原发性干燥病、脓疱性 皮肤病和慢性乙型肝炎。
78.本发明所要求保护的慢性炎症包括但不限于上述所列举的那些，只是 是与白介素-38基因表达相关的慢性炎症均包括在本发明的范围内，均可 以使用本发明的短发夹rna片段进行治疗和/或预防。
79.在一种优选的实施方式中，该慢性炎症为牙周炎。
80.在一种优选的实施方式中，该牙周炎是由牙龈卟啉单胞菌脂多糖引起 的牙周炎。
81.在本发明中，牙龈卟啉单胞菌脂多糖(lps-pg)是从革兰氏阴性菌 porphyromonas gingivalis(牙龈卟啉单胞菌)分离得到的脂多糖 (lps)，lps是革兰氏阴性菌重要的组成成分，可活化天然免疫系统， lps-pg是引起牙周疾病的重要毒力因子。
82.在一种优选的实施方式中，该牙周炎是il-1β、tnfα、il-6、il-17a 和il-38表达均增高的牙周炎。
83.根据本发明的另一个方面，提供了一种上述短发夹rna片段或上述 药物组合物，用于预防和/或治疗受试者与白介素-38基因表达相关的疾病 和/或病症。
84.根据本发明的另一个方面，提供了一种预防和/或治疗受试者与白介 素-38基因表达相关的疾病和/或病症的方法，包括向该受试者施用有效量 的上述短发夹rna片段或上述药物组合物。
85.在本发明中，术语“受试者”、“个体”或“患者”在此可互换地使 用并且是指哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大 鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利 地用作代表牙周炎疾病模型的受试者。优选地，所述受试者是人。这样的 受试者们典型地遭受或易于患有一种可以通过给予本发明的上述药物组合 物来预防或治疗的病症。
86.本发明所用的药物组合物的“有效量”可以获得所需要的治疗和/或 预防效果。术语“治疗有效量”是指会对组织、系统、动物或者人引发研 究者、兽医、内科医生或者其它临床医生探寻的生物学或者医学应答的药 物组合物的剂量。术语“预防有效量”是指会预防或降低研究者、兽医、 内科医生或者其它临床医生探求在组织、系统、动物或者人中预防的生物 学或者医学事件的发生风险的药物组合物的剂量。对此用途有效的量将取 决于例如递送的途径、治疗的疾病的阶段和严重性、所采用的具体的药物 组合物的活性、疾病的类型、个体体重和总体健康状况、以及处方医师的 判断。
87.剂量的给予可以每周一次，或两天或每天一次，或甚至每天几次。可 以在短期(例如数周至数月)或更长时间段(数月至数年)给予剂量单 元。“有效量”具体指的是向所治疗
的受试者赋予治疗作用(例如，控 制、缓解、改善、缓和或减缓进展)；或预防(例如，延迟发作或降低发 展风险)疾病、病症或病状或其症状的上述本发明所用的药物组合物的 量。
88.根据本发明的另一个方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含上述短 发夹rna片段或上述药物组合物。
89.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的 特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
90.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理 解为限制本技术所要求保护的范围。
91.实施例
92.实施例一lps-pg刺激hpdlscs建立细胞炎症模型
93.1材料与方法
94.1.1主要实验材料
95.1.1.1实验细胞及来源
96.实验细胞：原代牙周膜干细胞(hpdlscs)；
97.细胞来源：取自遵义医科大学附属口腔医院拔除健康正畸牙或智齿的 牙周膜。
98.1.1.2实验仪器
99.表1实验仪器
100.[0101][0102]
1.1.3实验耗材
[0103]
表2实验耗材
[0104][0105]
1.2实验试剂
[0106]
表3实验试剂
t25细胞培养瓶常规培养，3-4天换一次液。1w左右细胞爬出组织块，2
‑ꢀ
4w能长满t25细胞培养瓶，传代培养，取第三代做实验。
[0116]
(4)hpdlscs细胞的传代
[0117]
①
传代前准备：无菌操作台用75％酒精棉球擦拭后，将一次性10ml 吸管、废液缸、封口膜、细胞培养瓶等放入无菌操作台中，紫外灯消毒 30min；
②
拿出细胞在倒置相差显微镜下观察细胞状态，75％酒精外喷培 养瓶后放入无菌操作台中，无菌操作台工作模式切换为白炽灯 通风模 式。弃掉原培养基，pbs清洗两遍，加入胰酶，放入培养箱中消化2
‑ꢀ
3min，显微镜下观察细胞，待细胞边缘收缩时停止反应，加入等量预热的 新鲜完全培养基终止消化，用移液枪轻轻的将细胞吹打下来，制成细胞悬 液，使用高速离心机离心，1000rpm/min离心5min，管底见白色细胞沉 淀，弃掉上清液，用1ml含10％fbs和1％双抗的完全培养基吹打混匀细 胞制成悬液，移入细胞培养瓶中，再加入适量完全培养基混合均匀，将培 养瓶放入37℃、5％co2恒温培养箱中培养。剩余的培养基和pbs放入 4℃冰箱，fbs和双抗放入-20℃冰箱保存备用。
[0118]
(5)hpdlscs细胞的换液
[0119]
①
换液前准备同(4)细胞传代；
②
从培养箱中取出细胞，镜下见细 胞密度未达80％，弃掉原培养基，加入pbs冲洗两遍，重新加入事先预 热好的含10％fbs和1％双抗的新鲜完全培养基，拧紧瓶盖后放回培养箱 中培养。
[0120]
(6)hpdlscs细胞的冻存
[0121]
①
冻存前准备，观察、消化及离心细胞同(4)细胞传代，离心后弃 掉上清液，用事先配置好的1ml细胞冻存液(比例为fbs：dmso＝9:1) 重悬细胞，再将细胞悬液转移至标记好的冻存管中，用封口膜封口，放入 程序降温盒中，再转移至-80℃冰箱中，次日移出程序降温盒，直接放置 在-80℃冰箱中。
[0122]
(7)hpdlscs细胞的复苏
[0123]
从-80℃冰箱中拿出所需细胞，放入37℃恒温水浴锅中来回晃动1min 快速升温，将细胞悬液吸入15ml离心管中，加入等量完全培养基吹打混 匀，置入离心机中离心，1000rpm/min离心5min，弃掉上清液，用1ml事 先预热好的含10％fbs和1％双抗的新鲜完全培养基重悬，移入细胞培养 瓶中，拧紧瓶盖后放入培养箱中培养。
[0124]
1.3.2lps-pg刺激hpdlscs
[0125]
(1)hpdlscs细胞的接板
[0126]
①
接板前准备同1.3.1(4)细胞传代；
②
取出一个t75细胞瓶的细 胞，镜下观察见细胞密度达80％左右，细胞消化同1.3.1(4)细胞传 代，离心后弃上清，加入1ml完全培养基重悬，吹打混匀后取10μl细胞 悬液到1.5ml离心管中，加入990μl培养基稀释100倍并吹打混匀，从稀 释液中吸取10μl细胞悬液至细胞计数板上，在显微镜下计数，平均一个 t75细胞培养瓶总共有6
×
106个细胞，以每孔2
×
105个细胞接种至6孔板 上，每孔总共2ml完全培养基，接板完成后放入培养箱中培养24h。
[0127]
(2)hpdlscs细胞的饥饿处理
[0128]
将培养了24h的6孔板细胞取出，显微镜下观察细胞密度达到70
‑ꢀ
80％，吸掉原培养基，pbs清洗一遍，重新加入不含fbs、只含1％双抗 的培养基培养12h，使细胞状态趋于一致。
[0129]
(3)hpdlscs细胞的lps刺激
[0130]
取出饥饿处理了12h后的6孔板细胞，显微镜下观察细胞形态趋于一致，弃掉原培养基，pbs清洗一遍，加入分别含0、10、20μg/mllps-pg的完全培养基，在24h时收样，将上清液和贴壁的细胞分别放入-80℃冰箱中保存备用。
[0131]
1.3.3rt-qpcr鉴定细胞炎症模型建立是否成功
[0132]
(1)总rna的提取
[0133]
①
从-80℃冰箱中取出收样后的6孔板细胞，放在装有碎冰的冰盒上解冻半小时以上，尽量弃去培养基，每孔加300μlbufferr
‑ⅰ
，用移液枪上下吹打8-10次，转移上述细胞悬浮液到1.5ml离心管(试剂盒内提供)中；
[0134]
②
加110μlbufferr
‑ⅱ
，漩涡振荡15-30s，在4℃下12,000
×
g离心5min；
[0135]
③
取上清至1.5ml离心管中，加200μl异丙醇，混和均匀；
[0136]
④
将制备管置于2ml离心管(试剂盒内提供)中，转移步骤
③
中的混合液到制备管中，在4℃下6,000
×
g离心1min；
[0137]
⑤
弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加500μlbufferw1a，12,000
×
g离心1min(确认在bufferw1aconcentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。)；
[0138]
⑥
弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加700μlbufferw2，12,000
×
g离心1min；以同样的方法再用700μlbufferw2洗涤一次(确认在bufferw2concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇)；
[0139]
⑦
弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12,000
×
g离心1min；
[0140]
⑧
将制备管放入一干净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加70-100μlbufferte或无酶水；
[0141]
⑨
室温静置1min，12,000
×
g离心1min，洗脱得rna。
[0142]
⑩
移液枪吸取2μlrna样品至超微量分光光度计测量台测量rna浓度，盖紧瓶盖标记后用于逆转录。
[0143]
(2)rna逆转录
[0144]
选用takara试剂盒，采用10μl体系，每个体系rna量为500ng，进行逆转录，具体如表4所示：
[0145]
表4逆转录加样体系
[0146][0147]
[0148]
反应条件如下：
[0149]
第一阶段：37℃15min
[0150]
第二阶段：85℃5s
[0151]
第三阶段：4℃∞
[0152]
逆转录好的cdna继续用于后续扩增实验，其余可放入-80℃长期保 存。
[0153]
(3)cdna扩增
[0154]
本实验扩增体系采用takara扩增试剂盒，采用10μl体系。
[0155]
表5扩增加样体系
[0156][0157]
扩增条件如下：
[0158]
第一阶段：预变性循环数：1 95℃30s
[0159]
第二阶段：pcr反应
[0160]
循环数：40 95℃5秒60℃30秒
[0161]
第三阶段：合成熔融曲线
[0162]
(4)pcr结果分析
[0163]
采用2-δct
法对数据进行分析，δct＝ct
(目的基因)-ct
(内参基因)
。
[0164]
2结果
[0165]
如图1所示，以0、10、20μg/ml浓度的lps-pg刺激hpdlscs 24h 后，收集细胞样品检测hpdlscs中牙周炎相关炎症因子(il-1β/tnfα/il
‑ꢀ
6/il-17a)mrna表达，结果显示差异具有统计学意义(p＜0.05)，证实 牙周炎炎症细胞模型建立成功。更重要的是，与未刺激组相比，我们发现 lps-pg刺激组中il-38细胞因子mrna表达水平显著升高，提示il-38 可能参与牙周炎的病理过程。
[0166]
实施例二il-38的沉默对炎症细胞因子表达情况的影响
[0167]
1材料与方法
[0168]
1.1主要实验材料
[0169]
主要实验耗材及试剂同实施例一
[0170]
1.2实验方法
[0171]
1.2.1细胞转染最佳浓度摸索实验
[0172]
(1)慢病毒载体设计、包装、浓缩与纯化
[0173]
慢病毒载体的构建和包装由和元生物技术(上海)股份有限公司完成。 具体如下
所示。
[0174]
①
shrna名称
[0175]
il-38-shrna-1(y16719)
[0176]
正义链(从5’端到3’端)
[0177]
uccuugugggcucaguuuaau(seq id no:1)
[0178]
反义链(从5’端到3’端)
[0179]
auuaaacugagcccacaagga(seq id no:2)。
[0180]
②
shrna名称
[0181]
il-38-shrna-2(y16720)
[0182]
正义链(从5’端到3’端)
[0183]
ggucuaugguaggcagaauaa(seq id no:3)
[0184]
反义链(从5’端到3’端)
[0185]
uuauucugccuaccauagacc(seq id no:4)。
[0186]
③
shrna名称
[0187]
il-38-shrna-3(y16721)
[0188]
正义链(从5’端到3’端)
[0189]
ugcagaccagaaggcucuaua(seq id no:5)
[0190]
反义链(从5’端到3’端)
[0191]
uauagagccuucuggucugca(seq id no:6)。
[0192]
④
shrna名称
[0193]
shrna nc(gl428nc2)
[0194]
正义链(从5’端到3’端)
[0195]
ccuaagguuaagucgcccucg(seq id no:7)
[0196]
反义链(从5’端到3’端)
[0197]
cgagggcgacuuaaccuuagg(seq id no:8)。
[0198]
(2)细胞接板：贴壁生长的hpdlscs细胞消化后以1.5
×
104个/孔浓 度接种至96孔板中，注意铺板均匀。
[0199]
(3)病毒转染：第二日，显微镜下观察，细胞密度达40％-50％时方可 转染。moi值设置为0、10、20、40，聚凝胺(polybrene)浓度设置为0、 2、3、4、5、6、7、8μg/ml。吸掉原培养基，按照公式计算所需的病毒 量，将病毒和聚凝胺(polybrene)在离心管中和完全培养基混合均匀后缓 慢加入孔中。24h后更换为不含病毒的完全培养基。转染期间通过显微镜 不断观察细胞状态，视细胞状态可以提前更换为不含病毒的培养基。
[0200]
(4)观察转染效果：转染72h后，显微镜下观察荧光表达效果，发 现聚凝胺(polybrene)浓度＝8μg/ml，moi＝40时荧光效果最佳，转染率 达80％左右，则该条件下的moi值及聚凝胺(polybrene)浓度值可用于 后续实验。
[0201]
(5)转染细胞纯化浓度摸索：事先将正常未转染的hpdlscs细胞接 至96孔板上，将纯化剂嘌呤霉素以0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10μg/ml的浓度加入孔中，分别在24h和48h时观察细胞状态，确定在 3μg/ml和48h时，正常细胞死亡率达到90％以上。
[0202]
1.2.2慢病毒转染hpdlscs细胞及鉴定
[0203]
(1)细胞准备：hpdlscs消化后以2
×
105个/孔的浓度种至6孔 板，每孔加入2ml的完全培养基后，置于细胞孵育箱中。
[0204]
(2)病毒转染：按照moi＝40，聚凝胺(polybrene)浓度＝8μg/ml， 计算好实验所需的病毒体积。按照上述方法转染，48h后倒置荧光显微镜 下初步观察荧光表达效果，荧光效果不佳时可继续置于细胞孵育箱中培 养。72h后，倒置荧光显微镜下观察荧光表达效果，大于80％时用于后续 实验。
[0205]
(3)转染纯化：按照嘌呤霉素浓度＝3μg/ml加入换好液的转染细胞 中，48h后观察细胞，未转染上的细胞死亡率达90％以上即可收样做后续 实验。
[0206]
(4)鉴定：rt-qpcr技术鉴定hpdlscs中il-38基因是否沉默成 功的实验操作及结果分析同实施例一的1.3.3。
[0207]
1.2.3慢病毒沉默il-38后相关炎症因子的表达情况
[0208]
(1)病毒转染及纯化：同本实施例1.2.2的(2)(3)。
[0209]
(2)炎症因子表达检测：rt-qpcr技术检测，方法同前。
[0210]
2实验结果
[0211]
2.1hpdlscs中il-38沉默的转染与鉴定
[0212]
按照1.2.1使用步骤对hpdlscs进行转染。首先利用阴性对照进行转 染条件优化，转染72h后，利用显微镜下观察各组细胞转染效果，如图2 所示，当moi＝40，聚凝胺(polybrene)浓度＝8μg/ml，荧光蛋白表达最 佳，因此，后续il-38干扰实验均按照moi＝40，聚凝胺(polybrene)浓 度＝8μg/ml的条件进行转染。另外，如图3所示，il-38-shrna-3 (y16721)沉默病毒，转染效果最佳，且对目的基因il-38的干扰效果 优于il-38-shrna-1(y16719)及il-38-shrna-2(y16720)，干扰效率 达70％。
[0213]
与il-38-shrna-1(y16719)及il-38-shrna-2(y16720)相比， il-38-shrna-3(y16721)干扰效率分别高出6.4％和14.3％。
[0214]
因此，后续il-38功能实验均采用il-38-shrna-3(y16721)沉默病 毒进行，同时证实了本实验成功构建了il-38沉默hpdlscs模型。
[0215]
2.2rt-qpcr检测il-38沉默后对相关炎症因子的表达影响
[0216]
通过qpcr检测各组hpdlscs中牙周炎相关炎性因子tnf-α、il
‑ꢀ
1β及il-17a的mrna表达影响，结果如图4所示，无论是在正常情况下 还是在lps-pg诱导炎症状态下，il-38基因沉默组与il-38阴性对照组相 比较，il-17a、il-1β和tnf-α的mrna表达均显著降低(p＜0.05)， 说明il-38促进牙周炎病理过程，进而说明il-38短发夹rna(即il-38
‑ꢀ
shrna-3(y16721))具有防治牙周炎的应用前景。
[0217]
以上仅是本发明的较佳实施例，并非是对本发明作其它形式的限制， 任何熟悉本专业的技术人员可以利用上述技术内容加以变更或改型为等同 变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的 技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本 发明技术方案的保护范围。
[0218]
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发 明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发 明的方法及其核心思想。
[0219]
综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。