一种与辣椒青熟果浅绿色性状紧密连锁的分子标记及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种与辣椒青熟果浅绿色性状紧密连锁的分子标记及其应用。


背景技术：

2.青熟果色(也称商品成熟果颜色)作为鲜食辣椒(capsicum annuum l.)重要外观品质之一，是消费者们选购鲜食辣椒的主要标准，常见的就有黄白、乳黄、绿色、紫和紫黑等5种。因此，关于控制辣椒青熟果果实实颜色基因的挖掘和相关标记的开发，对特色辣椒品种的选育具有重要意义。目前，虽已有关于辣椒青熟果(也称商品成熟果，详见李锡香编著的《辣椒种质资源调查标准与描述规范》)果实颜色性状连锁标记的开发，如indelp146、cams-454和caps-78-708等(江海坤等，2018；沈火林和刘金秋，2019；乐军，2020)，但大多为与辣椒青熟果紫色性状连锁的标记，对于辣椒青熟果绿色性状相关的连锁分子标记却还未见报道。
3.根据颜色深浅程度的差异，辣椒青熟果绿色又可细分为：黄绿、浅绿、绿、深绿、墨绿等5种差异明显的绿色类别，表明辣椒绿色青熟果的形成和遗传机制较为复杂，这给辣椒青熟果色遗传改良带来了挑战。直至近几年，才有与辣椒青熟果绿色相关的基因appr2-like(pan et al.,2013)、caglk2(brand et al.,2014)和cclol1(borovsky et al.,2019)先后被报道，但并未开发与其紧密连锁的分子标记。故若能开发与控制辣椒青熟果(也称商品成熟果)浅绿色基因连锁的分子标记，将对辣椒青熟果果色性状的遗传改良具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种与辣椒青熟果浅绿色性状紧密连锁的分子标记及其应用。
5.第一方面，本发明要求保护用于检测辣椒基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸是a还是g还是a和g的物质在如下任一中的应用：
6.(a1)鉴定或辅助鉴定辣椒青熟果颜色性状；
7.(a2)制备用于鉴定或辅助鉴定辣椒青熟果颜色性状的产品；
8.(a3)鉴定或辅助鉴定辣椒绿色青熟果果皮颜色深浅；
9.(a4)制备用于鉴定或辅助鉴定辣椒绿色青熟果果皮颜色深浅的产品。
10.在(a1)和(a2)中，所述鉴定或辅助鉴定辣椒青熟果颜色性状具体可为鉴定或辅助鉴定辣椒青熟果果皮颜色为绿色还是浅绿色。这里，所述青熟果果皮颜色为绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 141ab的颜色种类；所述青熟果果皮颜色为浅绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 140a的颜色种类(royal horticultural society，2001)。
11.在(a3)和(a4)中，所述绿色青熟果具体指青熟果果皮颜色为绿色或浅绿色。这里，所述青熟果果皮颜色为绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 141ab的颜色种类；所述青熟果果皮颜色为浅绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 140a的颜色种类(royal horticultural society，2001)。
12.进一步地，所述用于检测辣椒基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸是a还是g还是a和g的物质可为引物对或含有所述引物对的试剂或试剂盒。
13.其中，所述引物对由上游引物和下游引物组成；所述上游引物根据所述辣椒基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸的上游序列(如第174795744～174795768位)进行设计；所述下游引物根据所述辣椒基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸的下游序列(如第174795924～174795951位)进行设计。
14.在本发明的具体实施方式中，所述引物对为dcaps引物。所述上游引物为seq id no.1所示的dna分子；所述下游引物为seq id no.2所示的dna分子。另外，所述试剂盒中还含有限制性内切酶hinfi。
15.第二方面，本发明要求保护一种鉴定或辅助鉴定待测辣椒青熟果颜色性状的方法。
16.本发明要求保护的鉴定或辅助鉴定待测辣椒青熟果颜色性状的方法，可包括如下步骤：
17.(b1)检测待测辣椒基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸是a还是g还是a和g，然后按照如下确定基因型：
18.如果所述待测辣椒基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸是a的纯合体，则所述待测辣椒的基因型为a:a型；
19.如果所述待测辣椒基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸是g的纯合体，则所述待测辣椒的基因型为g:g型；
20.如果所述待测辣椒基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸是a和g的杂合体，则所述待测辣椒的基因型为a:g型；
21.(b2)根据所述待测辣椒基因型确定所述待测辣椒的青熟果颜色性状。
22.进一步地，步骤(b2)具体可为按照如下确定所述待测辣椒的青熟果果皮颜色为绿色还是浅绿色：如果所述待测辣椒的基因型为g:g型，则所述待测辣椒的青熟果果皮颜色为或候选为绿色；如果所述待测辣椒的基因型为a:a型或a:g型，则所述待测辣椒的青熟果果皮颜色为或候选为浅绿色。
23.这里，所述青熟果果皮颜色为绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 141ab的颜色种类；所述青熟果果皮颜色为浅绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’scolour chart标准色卡上代码为fan3 140a的颜色种类(royal horticultural society，2001)。
24.第三方面，本发明要求保护一种鉴定或辅助鉴定辣椒绿色青熟果果皮颜色深浅的方法。所述绿色青熟果具体指青熟果果皮颜色为绿色或浅绿色。这里，所述青熟果果皮颜色为绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart
horticultural society，2001)。
38.在(b)中，所述绿色青熟果具体指青熟果果皮颜色为绿色或浅绿色。这里，所述青熟果果皮颜色为绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’scolour chart标准色卡上代码为fan3 141ab的颜色种类；所述青熟果果皮颜色为浅绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 140a的颜色种类(royal horticultural society，2001)。
39.本发明所要求保护的物质具体可为前文所述的用于检测辣椒基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸是a还是g还是a和g的物质。
40.第五方面，本发明要求保护如下任一应用：
41.(d1)前文第四方面中所述的物质在鉴定或辅助鉴定辣椒青熟果颜色性状，或制备用于鉴定或辅助鉴定辣椒青熟果颜色性状的产品中的应用。
42.其中，所述鉴定或辅助鉴定辣椒青熟果颜色性状具体可为鉴定或辅助鉴定辣椒青熟果果皮颜色为绿色还是浅绿色。这里，所述青熟果果皮颜色为绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3141ab的颜色种类；所述青熟果果皮颜色为浅绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 140a的颜色种类(royal horticultural society，2001)。
43.(d2)前文第四方面中所述的物质在鉴定或辅助鉴定辣椒绿色青熟果果皮颜色深浅，或制备用于鉴定或辅助鉴定辣椒绿色青熟果果皮颜色深浅的产品中的应用。
44.其中，所述绿色青熟果具体指青熟果果皮颜色为绿色或浅绿色。这里，所述青熟果果皮颜色为绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 141ab的颜色种类；所述青熟果果皮颜色为浅绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 140a的颜色种类(royal horticultural society，2001)。
45.(d3)前文第二或第三方面中所述方法或前文第四方面中所述物质在辣椒育种中的应用。
46.在上述各方面中，所述辣椒为青熟果果皮颜色为绿色或者浅绿色的辣椒。这里，所述青熟果果皮颜色为绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 141ab的颜色种类；所述青熟果果皮颜色为浅绿色是指辣椒青熟果果皮颜色为the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 140a的颜色种类(royal horticultural society，2001)。
47.在本发明的具体实施方式中，所述辣椒具体选自：辣椒材料17c827(青熟果浅绿色)和17c658(青熟果绿色)的杂交后代(如f2代)，或者表1中的63份辣椒材料。
48.在本发明中，在辣椒基因组中的物理位置是以遵辣1号的基因组(版号v2.0)为参考序列的，网址：http://peppersequence.genomics.cn/page/species/download.jsp#5。
49.实验证明，本发明开发的dcaps10-1标记在所构建f2群体中的表型匹配率为95.92％。此外，利用标记dcaps10-1对实验室保存的126份已知青熟果颜色的辣椒材料进行基因型检测。结果显示，126份自交系材料用dcaps10-1标记验证的成功率为76.20％，表明这个标记的适用性较强，育种实际应用中可以利用此标记对青熟果色进行快速鉴定。
附图说明
50.图1为dcaps10-1在两亲本和不同混池中的扩增片段hinfi酶切结果(a，7％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色)和在f2中的连锁图(b)。
具体实施方式
51.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
52.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
53.实施例1、分子标记dcaps10-1的获得
54.本实施例中所涉及的在辣椒基因组中的物理位置均是以遵辣1号的基因组(版号v2.0)为参考序列的，网址：http://peppersequence.genomics.cn/page/species/download.jsp#5。
55.一、定位群体的构建
56.本试验以辣椒材料17c827(青熟果浅绿色)为母本，17c658(青熟果绿色)为父本(两个亲本均记载于“wu lang,wang peng,wang yihao,cheng qing,lu qiaohua,liu jinqiu,li ting,ai yixin,yang wencai,sun liang and shen huolin,2019.genome-wide correlation of 36agronomic traits in the 287pepper(capsicum)accessions obtained from the slaf-seq-based gwas.international journal of molecular sciences,20(22).”一文的附表2中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用)，通过杂交获得f1，f1自交获得f2分离群体941株，运用目测法调查辣椒青熟果颜色。经统计青熟果浅绿色(参照《辣椒种质资源质量控制规范》，按照最大相似性原则，经鉴定属于the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 140a的颜色种类(royal horticultural society，2001))726株，青熟果绿色(参照《辣椒种质资源质量控制规范》，按照最大相似性原则，经鉴定属于the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 141ab的颜色种类(royal horticultural society，2001))215株，卡方检测显示符合3:1的分离比(χ2＝2.324《6.64(df＝1,p＝0.01))。辣椒基因组dna的提取采用改良ctab法。
57.二、分子标记开发
58.将上述获得的f2群体中青熟果浅绿色、青熟果绿色单株进行混池简化重测序，其中青熟果浅绿色池单株数为30株，青熟果绿色池单株数为30株，根据简化重测序结果开发相关标记。
59.三、分子标记dcaps10-1的获得
60.利用f2群体中青熟果浅绿色池和青熟果绿色池简化重测序结果所定位到的候选基因，克隆候选基因表明青熟果浅绿色材料(17c827)同青熟果绿色(17c658)材料相比，在辣椒基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸处发生了g-a替换。
61.zunla-1：
[0062]5’‑
ctttgtttgcatatttggcaggggttgatttccatgtgtttct-3’[0063]
17c827：
[0064]5’‑
ctttgtttgcatatttggcagggattgatttccatgtgtttct-3’[0065]
17c658：
[0066]5’‑
ctttgtttgcatatttggcaggggttgatttccatgtgtttct-3’[0067]
根据该替换碱基设计dcaps标记dcaps10-1，标记dcaps10-1的引物序列如下所示：
[0068]
dcaps10-1f：5
’‑
ttcttcatgtctaaattcccagagg-3’(seq id no.1)；
[0069]
dcaps10-1r：5
’‑
gtatgtgaagaaacacatggaaatg(错配碱基/酶切位点)aa-3’(seq id no.2)。
[0070]
当辣椒基因组中10号染色体上第174795925位的snp位点为a时，扩增产物会形成hinfi的识别序列，经hinfi酶切后会得到大小分别为184和23bp的两个目的片段。当辣椒基因组中10号染色体上第174795925位的snp位点为g时，扩增产物不能形成hinfi的识别序列，经hinfi酶切后产物为207bp片段。
[0071]
实际应用中，以待测辣椒基因组为模板，采用dcaps10-1引物序列进行pcr扩增，然后对扩增产物进行hinfi酶切，得到酶切产物，然后进行跑胶检测(23bp目的条带由于太小跑胶时容易丢失，故而可不予考虑，不影响结果判定)。
[0072]
如果酶切产物含有207bp目的条带且不含184bp目的条带，则待测辣椒的基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸是g，即g:g型。
[0073]
如果酶切产物含有207bp目的条带和184bp目的条带，则所述待测辣椒的基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸是a和g，即a:g型。
[0074]
如果酶切产物不含有207bp目的条带但含184bp目的条带，则所述待测辣椒的基因组中10号染色体上第174795925位脱氧核糖核苷酸是a，即a:a型。
[0075]
利用该dcaps10-1标记对不同混池进行检测(具体方法参见实施例2步骤二)，结果发现：该dcaps10-1标记在两亲本和两极端池间具有稳定的多态性且该标记所扩增出的条带清晰，在它们之间差异明显(图1中a所示)。分子标记dcaps10-1在青熟果绿色极端池基因组dna扩增产物含有大小为207bp的片段(不含184bp的片段)，在青熟果浅绿色极端池dna扩增产物含有大小为207bp和184bp的片段(23bp目的条带由于太小跑胶时丢失，浅绿色极端池中有杂合情况！)。
[0076]
经统计分析，dcaps10-1标记在所构建f2群体中的表型匹配率为95.92％。
[0077]
四、遗传连锁分析
[0078]
利用筛选所得的多态性分子标记dcaps10-1分析f2群体的基因型(具体方法参见实施例2步骤二)，并结合群体的田间颜色表型观察结果做连锁分析，结果表明：分子标记dcaps10-1与辣椒青熟果浅绿色性状连锁紧密(图1中b)，可作为一个分子标记。
[0079]
以待测辣椒基因组为模板，采用dcaps10-1引物序列进行pcr扩增，然后对扩增产物进行hinfi酶切，得到酶切产物。
[0080]
如果酶切产物含有207bp目的条带且不含184bp目的条带，即g:g型，则相应辣椒的青熟果为绿色。
[0081]
如果酶切产物含有207bp目的条带和184bp目的条带，即a:g型，则相应辣椒的青熟果为浅绿色。
[0082]
如果酶切产物不含有207bp目的条带但含184bp目的条带，即a:a型，则相应辣椒的青熟果为浅绿色。
[0083]
实施例2、分子标记dcaps10-1的应用
[0084]
一、实验材料
[0085]
本发明利用126份已知辣椒青熟果色为浅绿或绿色(经过多年调查，参照《辣椒种质资源质量控制规范》，按照最大相似性原则，经鉴定63份属于the royal horticultural society’s colour chart标准色卡上代码为fan3 140a的颜色种类(royal horticultural society，2001)，即浅绿色；63份属于the royal horticultural society’scolour chart标准色卡上代码为fan3 141ab的颜色种类(royal horticultural society，2001)，即绿色)的辣椒材料(表1)，对分子标记dcaps10-1进行验证。所用126份材料可从中国农业大学园艺学院获得(均记载于“wu lang,wang peng,wang yihao,cheng qing,lu qiaohua,liu jinqiu,li ting,ai yixin,yang wencai,sun liang and shen huolin,2019.genome-wide correlation of 36agronomic traits in the 287pepper(capsicum)accessions obtained from the slaf-seq-based gwas.international journal of molecular sciences,20(22).”一文的附表2中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用)。
[0086]
表1、126份辣椒自交系和品种的鉴定结果
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091][0092]
注：a带：浅绿色；b带：绿色；h带：浅绿色。a带为只含184bp条带(不含207bp条带)，b带为只含207bp条带(不含184bp条带)，h带为既含有207bp，又含有184bp条带。
[0093]
二、实验方法
[0094]
利用分子标记dcaps10-1对上述供试材料进行基因型检测，模板为上述供试材料的基因组dna。
[0095]
pcr反应体系(10μl)为：dna工作液1μl、10
×
buffer缓冲液5μl、dntps 0.4μl、dna聚合酶0.2μl、正向引物(seq id no.1)和反向引物(seq id no.2)各0.5μl(10μm)，用2.9μl ddh2o将总体积补齐至10μl。
[0096]
pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
[0097]
酶切体系：每个反应体系加hinfi酶0.2μl、cutsmart 1.5μl、水3.3μl，之后37℃酶切3h。
[0098]
酶切产物用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。并对酶切产
物进行测序。
[0099]
三、实验结果
[0100]
利用标记dcaps10-1对实验室保存的126份已知青熟果颜色的辣椒材料进行基因型检测。结果显示，126份自交系材料用dcaps10-1标记验证的成功率为76.20％，其中在63份青熟果浅绿色材料中的表型匹配率为79.37％，在63份青熟果绿色材料中的表型匹配率为73.00％，表明这个标记的适用性较强，育种实际应用中可以利用此标记对青熟果色进行快速鉴定。
[0101]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。