用于基因组修饰的高保真SpCas9核酸酶的制作方法

技术特征：
1.一种改造的化脓性链球菌cas9 (spcas9)蛋白质变体，其包含在氨基酸位置526、562、652、661、691、780、810、848、855、1003和1060 (参考化脓性链球菌cas9——spcas9的编号系统)中的两个或更多个处的突变，其中在前述氨基酸位置中的一个或多个处的赖氨酸(k)改变为亮氨酸(l)或谷氨酰胺(q)，和/或在前述氨基酸位置中的一个或多个处的精氨酸(r)改变为亮氨酸(l)或谷氨酰胺(q)。2.权利要求1的spcas9蛋白质变体，其中所述spcas9蛋白质变体包含k855l/q突变，以及在氨基酸位置526、562、652、661、691、780、810、848、1003和1060 (参考化脓性链球菌cas9——spcas9的编号系统)处的至少一种其它突变。3.权利要求1的改造的spcas9蛋白质变体，其中所述spcas9蛋白质变体包含r661l/q突变，以及在氨基酸位置526、562、652、691、780、810、848、855、1003和1060 (参考化脓性链球菌cas9——spcas9的编号系统)处的至少一种其它突变。4.权利要求1的改造的spcas9蛋白质变体，其包含选自k526l/q、k562l/q、k652l/q、k810l/q、k848l/q、k855l/q、r661l/q、r691l/q、r780l/q、k1003l/q和r1060l/q (参考化脓性链球菌cas9——spcas9的编号系统)的两个不同氨基酸位置处的两种突变。5.权利要求1的改造的spcas9蛋白质变体，其包含选自k526l/q、k562l/q、k652l/q、k810l/q、k848l/q、k855l/q、r661l/q、r691l/q、r780l/q、k1003l/q和r1060l/q的三个不同氨基酸位置处的三种突变。6.权利要求5的改造的spcas9蛋白质变体，其中所述突变选自下述组：k562l-r661l-k855q；k562q-r661l-k855q；k652l-r661l-k855q；k652q-r661l-k855q；r661l-k855q-k1003q；和r661l-k855q-r1060q。7.权利要求5的改造的spcas9蛋白质变体，其中所述突变选自下述组：k562l-r661l-k855q；k562q-r661l-k855q；k652l-r661l-k855q；和k652q-r661l-k855q。8.权利要求5的改造的spcas9蛋白质变体，其中所述突变选自下述组：k526l-r661l-k855q；r661l-r691l-k855q；r661l-r780l-k855q；r661l-r780q-k855q；r661l-k810l-k855q，和r661l-k848l-k855q。9.权利要求5的改造的spcas9蛋白质变体，其中所述突变选自下述组：k526q-r661l-k855q；r661l-k810q-k855q；
r661l-k855q-k1003l；和r661l-k855q-r1060l。10.任何前述权利要求的改造的spcas9蛋白质变体，其进一步包含与n末端、c末端、内部位置或其组合融合的一个或多个异源结构域。11.权利要求10的改造的spcas9蛋白质变体，其中所述异源结构域选自核定位信号、细胞穿透结构域、促进检测的标记物或报告结构域、染色质修饰结构域、表观遗传修饰结构域、转录调控结构域、dna或rna脱氨酶结构域、尿嘧啶-dna-糖基化酶结构域、逆转录酶结构域、重组酶结构域、rna适体结合结构域和非cas9核酸酶结构域。12.任何前述权利要求的改造的spcas9蛋白质变体，其进一步包含与n末端、c末端、内部位置或其组合融合的至少一个核定位信号。13.任何前述权利要求的改造的spcas9蛋白质变体，其进一步包含在ruvc结构域中的至少一种突变、和/或在hnh结构域中的至少一种突变。14.权利要求13的改造的spcas9蛋白质变体，其中所述ruvc结构域中的至少一种突变，如果存在的话，包含选自d10a、d8a、e762a和d986a的至少一种突变；并且其中所述hnh结构域中的至少一种突变，如果存在的话，包含选自h840a、h559a、n854a、n856a和n863a的至少一种突变。15.一种改造的cas9系统，其包含任何前述权利要求的改造的spcas9蛋白质变体和至少一种改造的引导rna，其中所述至少一种改造的引导rna设计为与所述改造的spcas9蛋白质变体复合。16.多种核酸，其编码任何前述权利要求的改造的spcas9蛋白质变体。17.多种核酸，其编码权利要求15的改造的spcas9系统。18.权利要求17的多种核酸，所述多种核酸包含编码所述改造的spcas9蛋白质变体的至少一种核酸和编码所述改造的引导rna的至少一种核酸。19.权利要求16-18中任一项的多种核酸，其中至少一种核酸是rna。20.权利要求16-18中任一项的多种核酸，其中至少一种核酸是dna。21.权利要求16-20中任一项的多种核酸，其中所述编码改造的spcas9蛋白质变体的至少一种核酸进行密码子优化，用于真核细胞中的表达。22.权利要求21的多种核酸，其中所述真核细胞是人细胞、非人哺乳动物细胞、非哺乳动物脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞或单细胞真核生物。23.权利要求15的多种核酸，其中所述编码改造的引导rna的至少一种核酸是dna。24.权利要求15的多种核酸，其中所述编码改造的spcas9蛋白质变体的至少一种核酸可操作地连接到噬菌体启动子序列，用于体外rna合成或细菌细胞中的蛋白质表达，并且所述编码改造的引导rna的至少一种核酸可操作地连接到噬菌体启动子序列，用于体外rna合成。25.权利要求12的多种核酸，其中所述编码改造的cas9蛋白质变体的至少一种核酸可操作地连接到真核启动子序列，用于真核细胞中的表达，并且所述编码改造的引导rna的至少一种核酸可操作地连接到真核启动子序列，用于真核细胞中的表达。26.至少一种载体，其包含权利要求16-25中任一项的多种核酸。27.权利要求26的至少一种载体，其是质粒载体、病毒载体或自我复制的病毒rna复制
子。28.一种真核细胞，其包含权利要求15的至少一种改造的cas9系统或者权利要求17或18的核酸。29.权利要求28的真核细胞，其是人细胞、非人哺乳动物细胞、植物细胞、非哺乳动物脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞或单细胞真核生物。30.权利要求29的真核细胞，其是在体内的、离体的或在体外的。31.权利要求1-13中任一项的改造的spcas9蛋白质变体，其是cas9同源物。32.一种核糖核蛋白(rnp)复合物，其包含权利要求1-13中任一项的改造的spcas9蛋白质变体。33.一种融合蛋白，其包含权利要求1-13中任一项的改造的spcas9蛋白质变体。34.一种药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项的改造的spcas9蛋白质变体和至少一种药学上可接受的赋形剂。35.一种用于修饰真核细胞的染色体序列的方法，所述方法包括在真核细胞中表达权利要求1-13中任一项的改造的spcas9蛋白质变体连同引导rna。

技术总结
改造的Cas9蛋白质变体和系统，编码所述蛋白质变体和系统的核酸，以及制备和使用所述蛋白质变体和系统用于基因组修饰的方法。白质变体和系统用于基因组修饰的方法。白质变体和系统用于基因组修饰的方法。


技术研发人员：陈福强
受保护的技术使用者：西格马－奥尔德里奇有限责任公司
技术研发日：2021.03.11
技术公布日：2022/10/25