细胞含有液用保存容器以及保存液的制作方法

1.本发明涉及用于保存细胞含有液的保存容器。此外，本发明涉及用于保存细胞含有液的保存液。


背景技术：

2.血液、血浆、血清以及尿等体液中包含游离dna(cell free dna，cfdna)。已知，与健康人相比，在具有恶性肿瘤的人以及罹患了感染症的人等的体液中，cfdna以高浓度存在(非专利文献1)。
3.近年，在癌和基因疾病等领域中，正在进行以cfdna为检体的检查等。以cfdna为检体的检查与从患者处采取病变组织而进行的检查相比，对患者的负担更小。
4.此外，在母体血中包含来源于胎儿的游离dna(cell free fetal dna，cff dna)(非专利文献2)。在出生前遗传学的检查中，也会进行以cffdna为检体的检查。
5.以cfdna为检体的检查如果不是拥有qpcr装置或次世代测序器(next generation sequencer，ngs)等专用装置的专门机关的话是很难实施的。因此，在病院等处采取得到的血液等细胞含有液需要运送到专门机关处，从细胞含有液的采取到分析，需要一定程度的天数。该期间，所述细胞含有液用特定的容器保存。
6.在下述的专利文献1、2中，记载了通过使存在于全血中的细胞，特别是白细胞稳定化，而稳定地回收cfdna的方法。
7.此外，在下述的专利文献3中，公开了一种不包含血清，含有选自羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羟基乙基甲基纤维素中的至少一种水溶性纤维素类冻结保护物质作为冻结保护物质的动物细胞的玻璃化冻结保存液。在专利文献3中，记载了所述玻璃化冻结保存液优选包含特定的细胞膜透过性冻结保护物质或特定的细胞膜非透过性冻结保护物质。
8.现有技术文献
9.专利文献
10.专利文献1：wo2013/123030a1
11.专利文献2：cn107083382a
12.专利文献3：日本特开2011-111406号公报
13.非专利文献
14.非专利文献1：karen-lise garm spindler,ane l.appelt,niels pallisgaard,et al.cell-free dna in healthy individuals,noncancerous disease and strong prognostic value in colorectal cancer.int.j.cancer:135,2984-2991(2014)
15.非专利文献2：alberry m,maddocks d,jones m,et al.free fetal dna in maternal plasma in anembryonic pregnancies:confirmation that the origin is the trophoblast.prenat diagn.2007 may；27(5):415-8


技术实现要素：

16.本发明所要解决的技术问题
17.现在，以血液等细胞含有液中包含的cfdna为检体的检查正在被使用。血液等细胞含有液被采取至收纳有保存液的保存容器后，被运送至具有qpcr装置或次世代测序器的专门机关处。送至专门机关途中的输送也有在冻结环境下进行的，但从抑制输送成本的观点以及减少输送中的麻烦的观点出发，优选在室温环境下(例如15℃～25℃)进行。
18.然而，就以往的收纳有保存液的保存容器而言，如果在室温环境下保存细胞含有液，则该细胞含有液中包含的cfdna的保存稳定性容易降低。例如，就以往的保存容器而言，在室温环境下的保存中，可能会因为细胞含有液中包含的dna分解酶而发生cfdna的分解。此外，就以往的保存容器而言，在室温环境下的保存中，存在细胞含有液中包含的细胞被破坏，或死亡，而导致该细胞中的基因组dna(gdna)漏出至细胞含有液中的情况。在收纳有edta的以往的保存容器中，通过edta抑制dnase的活化，能够在一定程度上抑制cfdna，但无法抑制细胞的死亡等。
19.在所述专利文献1所述的方法中，虽然能够在一定程度上提高细胞含有液中包含的cfdna的保存稳定性。然而，本发明者们发现，即使是所述专利文献1所述的方法，由于甲醛供体化合物放出的甲醛，会发生核酸彼此交联或核酸与蛋白质交联，cfdna的片段长度在外观上变长等情况，cfdna的保存稳定性会降低。此外，在出生前遗传学的检查中，需要区分来源于胎儿的cfdna(cffdna)与来源于母体的cfdna。cffdna在通过胎盘等母体组织时会被降解，因此与来源于母体的cfdna相比，片段长度会变短。在出生前遗传学的检查中，是利用cffdna与cfdna的片段长度的不同来区分两者的，因此在由于甲醛而导致cffdna与cfdna交联，或cffdna和cfdna的片段长度发生了变化的情况下，对检查结果会产生重大的影响。
20.此外，即使是所述专利文献2所述的方法，要充分提高cfdna的保存稳定性也是很困难的。
21.此外，在使用如所述专利文献3所述的现有的玻璃化冻结保存液，保存体液等细胞含有液的情况下，玻璃化冻结保存液会因细胞含有液而被过度稀释，因此玻璃化冻结保存液的效果无法充分发挥。因此，难以提高细胞含有液中包含的cfdna的保存稳定性。
22.如此，在以往的方法中，如果在室温环境下保存细胞含有液，则难以充分提高cfdna的保存稳定性。
23.本发明的目的在于，提供一种即使在室温环境下进行保存，也能够提高细胞含有液中包含的cfdna的保存稳定性的细胞含有液用保存容器。此外，本发明的目的在于，提供一种即使在室温环境下进行保存，也能够提高细胞含有液中包含的cfdna的保存稳定性的保存液。
24.解决技术问题的技术手段
25.根据本发明的广泛方案，提供一种细胞含有液用保存容器，其为用于保存给定量的细胞含有液的容器，其中，
26.所述保存容器具备容器主体、以及收纳在所述容器主体内的保存液，
27.所述保存容器具备以下的第1构成或第2构成：
28.第1构成：所述保存液包含分子量为100以下，在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物，并且，在将所述给定量的细胞含有液采取至细胞含有液用保存容器中，将该细胞含有液
和所述保存液混合而得到混合液x时，所述混合液x中，所述细胞膜透过性化合物的含量为1vol％以上5vol％以下，
29.第2构成：所述保存液包含分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物，并且，在将所述给定量的细胞含有液采取至细胞含有液用保存容器中，将该细胞含有液和所述保存液混合而得到混合液x时，所述混合液x中，所述细胞膜非透过性化合物的含量为0.5μmol/l以上5μmol/l以下。
30.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，所述细胞含有液用保存容器具备所述第1构成，所述细胞膜透过性化合物为多元醇。
31.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，所述细胞含有液用保存容器具备所述第1构成，所述细胞膜透过性化合物为乙二醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亚砜、乙酰胺、1,3-丙二醇或丁二醇。
32.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，所述细胞含有液用保存容器具备所述第2构成，所述细胞膜非透过性化合物为分子量为1000以上的化合物。
33.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，所述细胞含有液用保存容器具备所述第2构成，所述细胞膜非透过性化合物为聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、多糖类、多糖类的衍生物、糖醇或ficoll。
34.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，所述细胞含有液用保存容器具备所述第1构成，所述保存液包含甲醛供体化合物作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物。
35.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，所述保存液包含甲醛供体化合物作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物，
36.得到相对于生理盐水1l混合有次氯酸钠7.4g的溶液y’，在将与待保存在细胞含有液用保存容器中的细胞含有液的给定量等量的所述溶液y’采取至细胞含有液用保存容器中，将该溶液y’和所述保存液混合而得到混合液y时，所述混合液y中，甲醛的含量为100mg/l以上400mg/l以下。
37.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，所述甲醛供体化合物为dmdm乙内酰脲或1-羟基甲基-5,5-二甲基乙内酰脲。
38.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，在将与待保存在细胞含有液用保存容器中的细胞含有液的给定量等量的生理盐水采取至细胞含有液用保存容器中，将该生理盐水和所述保存液混合而得到混合液z时，所述混合液z的渗透压为300mosm/l以上1100mosm/l以下。
39.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，所述保存液包含渗透压调节剂作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物，所述渗透压调节剂为葡萄糖或氯化钠。
40.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，所述保存液包含具有螯合作用的化合物作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物，所述具有螯合作用的化合物包含edta，所述混合液x中，所述edta的含量为4mmol/l以上7mmol/l以下。
41.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，所述保存液包含缓冲剂作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物，所述缓冲剂包含甘氨酸，所述混合液x中，所述甘氨酸的含量为0.5w/v％以下。
42.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，所述细胞含有液用保存容器具备所述第1构成以及所述第2构成。
43.在本发明的细胞含有液用保存容器的一种特定方案中，所述细胞含有液为血液。
44.根据本发明的广泛方案，提供一种保存液，其为用于保存细胞含有液的保存液，其中，所述保存液具备以下的第3构成或第4构成：
45.第3构成：包含分子量为100以下，在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物，并且，所述细胞膜透过性化合物的含量为2vol％以上50vol％以下，
46.第4构成：包含分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物，并且，所述细胞膜非透过性化合物的含量为1.0μmol/l以上100μmol/l以下。
47.在本发明的保存液的一种特定方案中，所述保存液具备所述第3构成，所述细胞膜透过性化合物为多元醇。
48.在本发明的保存液的一种特定方案中，所述保存液具备所述第3构成，所述细胞膜透过性化合物为乙二醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亚砜、乙酰胺、1,3-丙二醇或丁二醇。
49.在本发明的保存液的一种特定方案中，所述保存液具备所述第4构成，所述细胞膜非透过性化合物为分子量为1000以上的化合物。
50.在本发明的保存液的一种特定方案中，所述保存液具备所述第4构成，所述细胞膜非透过性化合物为聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、多糖类、多糖类的衍生物、糖醇或ficoll。
51.在本发明的保存液的一种特定方案中，所述保存液包含甲醛供体化合物作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物。
52.在本发明的保存液的一种特定方案中，所述甲醛供体化合物为dmdm乙内酰脲或1-羟基甲基-5,5-二甲基乙内酰脲。
53.在本发明的保存液的一种特定方案中，所述保存液包含渗透压调节剂作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物，所述渗透压调节剂为葡萄糖或氯化钠。
54.在本发明的保存液的一种特定方案中，所述保存液包含具有螯合作用的化合物作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物，所述具有螯合作用的化合物包含edta。
55.在本发明的保存液的一种特定方案中，所述保存液包含缓冲剂作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物，所述缓冲剂包含甘氨酸。
56.在本发明的保存液的一种特定方案中，所述保存液具备所述第3构成以及所述第4构成。
57.在本发明的保存液的一种特定方案中，所述细胞含有液为血液。
58.发明效果
59.本发明涉及的细胞含有液用保存容器为用于保存给定量的细胞含有液的容器，其
具备容器主体、以及收纳在所述容器主体内的保存液。本发明涉及的细胞含有液用保存容器具备以下的第1构成或第2构成。第1构成：所述保存液包含分子量为100以下，在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物，并且，在将所述给定量的细胞含有液采取至细胞含有液用保存容器中，将该细胞含有液和所述保存液混合而得到混合液x时，所述混合液x中，所述细胞膜透过性化合物的含量为1vol％以上5vol％以下。第2构成：所述保存液包含分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物，并且，在将所述给定量的细胞含有液采取至细胞含有液用保存容器中，将该细胞含有液和所述保存液混合而得到混合液x时，所述混合液x中，所述细胞膜非透过性化合物的含量为0.5μmol/l以上5μmol/l以下。在本发明涉及的细胞含有液用保存容器中，由于具备所述构成，即使在室温环境下进行保存，也能够提高细胞含有液中包含的cfdna的保存稳定性。
60.本发明涉及的保存液为用于保存细胞含有液的保存液。本发明涉及的保存液具备以下的第3构成或第4构成。第3构成：包含分子量为100以下，在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物，并且，所述细胞膜透过性化合物的含量为2vol％以上50vol％以下。第4构成：包含分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物，并且，所述细胞膜非透过性化合物的含量为1.0μmol/l以上100μmol/l以下。在本发明涉及的保存液中，由于具备所述构成，即使在室温环境下进行保存，也能够提高细胞含有液中包含的cfdna的保存稳定性。
附图说明
61.[图1]图1(a)～(c)是实施例1中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。
[0062]
[图2]图2(a)、(b)是实施例2中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。
[0063]
[图3]图3(a)～(c)是比较例1中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果，图3(d)是比较例4中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。
[0064]
[图4]图4(a)、(b)是比较例2中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。
[0065]
[图5]图5(a)～(c)是比较例3中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。
[0066]
[图6]图6(a)～(c)是实施例3～5中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。
[0067]
[图7]图7(a)～(c)是实施例6～8中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。
[0068]
[图8]图8(a)～(d)是实施例9～12中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。
[0069]
[图9]图9(a)、(b)是实施例13中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。
[0070]
[图10]图10(a)、(b)是实施例14中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。
[0071]
[图11]图11(a)、(b)是实施例15中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。
具体实施方式
[0072]
以下，将对本发明详细地进行说明。
[0073]
本发明涉及的细胞含有液用保存容器(以下，也简称为“保存容器”)是用于保存给定量的细胞含有液的容器，其具备容器主体、以及收纳在所述容器主体内的保存液。本发明涉及的细胞含有液用保存容器具备以下的第1构成或第2构成。
[0074]
第1构成：所述保存液包含分子量为100以下，在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物，并且，在将所述给定量的细胞含有液采取至细胞含有液用保存容器中，将该细胞含有液和所述保存液混合而得到混合液x时，所述混合液x中，所述细胞膜透过性化合物的含量为1vol％以上5vol％以下。
[0075]
第2构成：所述保存液包含分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物，并且，在将所述给定量的细胞含有液采取至细胞含有液用保存容器中，将该细胞含有液和所述保存液混合而得到混合液x时，所述混合液x中，所述细胞膜非透过性化合物的含量为0.5μmol/l以上5μmol/l以下。
[0076]
本发明涉及的保存液是用于保存细胞含有液的保存液。本发明涉及的保存液具备以下的第3构成或第4构成。
[0077]
第3构成：包含分子量为100以下，在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物，并且，所述细胞膜透过性化合物的含量为2vol％以上50vol％以下。
[0078]
第4构成：包含分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物，并且，所述细胞膜非透过性化合物的含量为1.0μmol/l以上100μmol/l以下。
[0079]
在本发明涉及的保存容器以及保存液中，以所述细胞含有液与所述保存液混合的状态，保存该细胞含有液。在本发明涉及的保存容器以及保存液中，由于具备所述构成，即使在室温环境下进行保存，也能够提高细胞含有液中包含的cfdna的保存稳定性。在本发明涉及的保存容器以及保存液中，例如，即使在15℃以上25℃以下的环境下进行保存，也能够提高细胞含有液中包含的cfdna的保存稳定性。在本发明中，能够在室温环境下的保存中，有效地抑制所述细胞含有液中包含的细胞破坏、死亡而导致该细胞中的gdna混入细胞含有液中。因此，在本发明中，能够提高cfdna的保存稳定性。在本发明中，例如，能够将细胞含有液中包含的cfdna在25℃下稳定地保存1天以上(例如7天)。
[0080]
所述细胞含有液是包含细胞的液。作为所述细胞含有液，可以举出体液等，具体而言，可以举出血液、尿以及脑脊液等。血液中，包含白细胞等作为细胞。
[0081]
从进一步有效地发挥本发明的效果的观点出发，所述细胞含有液优选为血液。
[0082]
本发明涉及的保存容器可以具备所述第1构成，可以具备所述第2构成，也可以具备所述第1构成和所述第2构成这两者。本发明涉及的保存容器可以仅具备所述第1构成和所述第2构成中的任一者，也可以具备这两者。从进一步有效地发挥本发明的效果的观点出发，本发明涉及的保存容器优选具备所述第1构成和所述第2构成。
[0083]
本发明涉及的保存液可以具备所述第3构成，可以具备所述第4构成，也可以具备所述第3构成和所述第4构成这两者。本发明涉及的保存液可以仅具备所述第3构成以及所
述第4构成中的任一者，也可以具备这两者。从进一步有效地发挥本发明的效果的观点出发，本发明涉及的保存液优选具备所述第3构成和所述第4构成。
[0084]
(保存液)
[0085]
所述保存液在25℃下为液态。
[0086]
所述保存液包含分子量为100以下，在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物，或，包含分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物。所述保存液可以包含所述细胞膜透过性化合物，可以包含所述细胞膜非透过性化合物，也可以包含所述细胞膜透过性化合物和所述细胞膜非透过性化合物这两者。
[0087]
一种化合物是细胞膜透过性化合物还是细胞膜非透过性化合物，通常，是根据其化合物的分子量、电荷、极性等来决定的。不具有电荷的化合物能够通过被动性的扩散而透过细胞膜，因此通常分类为细胞膜透过性化合物。此外，例如，具有电荷的化合物无法通过被动性的扩散而透过细胞膜，因此通常，分类为细胞膜非透过性化合物。
[0088]
《细胞膜透过性化合物》
[0089]
所述保存液优选包含分子量为100以下，在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物。所述细胞膜透过性化合物是能够透过细胞膜的化合物。在所述保存容器具备所述第1构成的情况下，所述保存液包含所述细胞膜透过性化合物。在所述保存液具备所述第3构成的情况下，该保存液包含所述细胞膜透过性化合物。通过使用所述细胞膜透过性化合物，能够使细胞内良好地脱水，并且能够使所述细胞膜透过性化合物良好地保持在细胞内。因此，能够在保存中，有效地抑制细胞破坏、死亡而导致该细胞中的gdna混入细胞含有液中。所述细胞膜透过性化合物也作为细胞的冻结保护剂而广为人知。所述细胞膜透过性化合物可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0090]
作为所述细胞膜透过性化合物，可以举出乙二醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亚砜、乙酰胺、1,3-丙二醇以及丁二醇等。
[0091]
所述细胞膜透过性化合物优选为乙二醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亚砜、乙酰胺、1,3-丙二醇或丁二醇，更优选为乙二醇、丙二醇、丙三醇或二甲基亚砜。此外，所述细胞膜透过性化合物优选为多元醇。在该情况下，能够进一步有效地发挥本发明的效果。
[0092]
就所述保存液中的所述细胞膜透过性化合物的含量而言，只要是所述混合液x中，细胞膜透过性化合物的含量为1vol％以上5vol％以下的含量就无特别限定。所述保存液中的所述细胞膜透过性化合物的含量可以根据所述细胞含有液和所述保存液的混合比等而适宜变更。
[0093]
所述保存液中的所述细胞膜透过性化合物的含量优选为2vol％以上，更优选为10vol％以上，进一步优选为20vol％以上，优选为50vol％以下，更优选为40vol％以下，进一步优选为30vol％以下。所述细胞膜透过性化合物的含量如果为所述下限以上以及所述上限以下，则易于将细胞含有液与保存液的混合液(混合液x)中的细胞膜透过性化合物的含量调节至所述范围，其结果，能够进一步有效地发挥本发明的效果。
[0094]
《细胞膜非透过性化合物》
[0095]
所述保存液优选包含分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物。在所述保存容器具备所述第2构成的情况下，所述保存液包含所述细胞膜非透过性化合物。在所述保存液具备所述第4构成的情况下，该保存液包含所述细胞膜非透过性化合物。通过使用所述细胞
膜非透过性化合物，能够有效地抑制细胞的凝聚，并且能够提高细胞膜的保护效果。因此，能够在保存中，有效地抑制细胞破坏、死亡而导致该细胞中的gdna混入细胞含有液中。所述细胞膜非透过性化合物可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0096]
作为所述细胞膜非透过性化合物，可以举出聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、多糖类、多糖类的衍生物、糖醇以及ficoll等。作为所述多糖类，可以举出纤维素、蔗糖以及葡聚糖等。作为所述多糖类的衍生物，可以举出羟基丙基纤维素等。
[0097]
从进一步有效地发挥本发明的效果的观点出发，所述细胞膜非透过性化合物优选为聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、多糖类、多糖类的衍生物、糖醇或ficoll。从使本发明的效果进一步有效地发挥的观点出发，所述细胞膜非透过性化合物更优选为聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖或羟基丙基纤维素，进一步优选为聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇或聚乙烯醇。
[0098]
从发挥本发明的效果的观点出发，所述细胞膜非透过性化合物的分子量为300以上。就所述细胞膜非透过性化合物的分子量而言，在能够特定该细胞膜非透过性化合物的结构式的情况下，是指根据该结构式能够算出的分子量，在无法特定结构式的情况下，是指重均分子量。
[0099]
所述细胞膜非透过性化合物的分子量(重均分子量)优选为1000以上，更优选为1万以上，进一步优选为10万以上，优选为400万以下，更优选为100万以下。所述细胞膜非透过性化合物的分子量(重均分子量)如果为所述下限以上以及所述上限以下，则能够进一步有效地发挥本发明的效果。
[0100]
所述重均分子量是指通过凝胶渗透色谱(gpc)测定的、以聚苯乙烯换算的重均分子量。
[0101]
就所述保存液中的所述细胞膜非透过性化合物的含量而言，只要在所述混合液x中，细胞膜非透过性化合物的含量为0.5μmol/l以上5μmol/l以下就无特别限定。所述保存液中的所述细胞膜非透过性化合物的含量可以根据所述细胞含有液和所述保存液的混合比等而适宜变更。
[0102]
所述保存液中的所述细胞膜非透过性化合物的含量优选为1.0μmol/l以上，更优选为5μmol/l以上，优选为100μmol/l以下，更优选为50μmol/l以下。所述细胞膜非透过性化合物的含量如果为所述下限以上以及所述上限以下，则易于将细胞含有液与保存液的混合液(混合液x)中的细胞膜非透过性化合物的含量调节至所述范围，其结果，能够进一步有效地发挥本发明的效果。
[0103]
《甲醛供体化合物》
[0104]
所述保存液优选包含甲醛供体化合物作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物。所述甲醛供体化合物是可以游离出甲醛的化合物。通过使用所述甲醛供体化合物，在将细胞含有液与保存液混合时，通过从甲醛供体化合物游离出的甲醛的作用，能够与细胞的膜蛋白交联，提高细胞的稳定性。在包含甲醛供体化合物的以往的保存液中，在室温环境下的保存中，容易发生细胞含有液中包含的cfdna的片段长度变化。与之相对，在本发明中，即使在保存液包含甲醛供体化合物的情况下，也能够使cfdna的片段长度变化不易发生。所述甲醛供体化合物可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0105]
作为所述甲醛供体化合物，可以举出乙内酰脲化合物、咪唑啉基尿素、二唑烷基脲、六亚甲基四胺、n,n
”‑
亚甲基双-[n
’‑
(3-羟基甲基-2,5-二氧代-4-咪唑烷基)尿素]、叔胺化合物、仲胺化合物以及伯胺化合物等。
[0106]
作为所述乙内酰脲化合物，可以举出dmdm乙内酰脲、1-羟基甲基-5,5-二甲基乙内酰脲、1,3-二羟甲基-5,5-乙内酰脲以及1,3-二氯-5,5-二甲基乙内酰脲等。
[0107]
从进一步有效地发挥本发明的效果的观点出发，所述甲醛供体化合物优选为乙内酰脲化合物，更优选为dmdm乙内酰脲或1-羟基甲基-5,5-二甲基乙内酰脲。
[0108]
所述保存液中的所述甲醛供体化合物的含量无特别限定。就所述保存液中的所述甲醛供体化合物的含量而言，例如，可以进行适宜变更以使得在后述的混合液y中，甲醛的含量满足后述范围。所述保存液中的所述甲醛供体化合物的含量可以根据所述细胞含有液与所述保存液的混合比、以及甲醛供体化合物的种类等进行适宜变更。
[0109]
《渗透压调节剂》
[0110]
所述保存液优选包含渗透压调节剂作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物。通过使用所述渗透压调节剂，能够有效地提高所述混合液的渗透压。所述渗透压调节剂可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0111]
作为所述渗透压调节剂，可以举出氯化钠以及盐化钾等无机离子类、葡萄糖以及蔗糖等糖类等。
[0112]
从进一步有效地发挥本发明的效果的观点出发，所述渗透压调节剂优选为葡萄糖、蔗糖或氯化钠，更优选为葡萄糖或氯化钠。
[0113]
所述保存液中的所述渗透压调节剂的含量无特别限定。所述保存液中的所述渗透压调节剂的含量例如可以适宜变更以使得后述的混合液z的渗透压满足后述的范围。
[0114]
《缓冲剂》
[0115]
所述保存液优选包含缓冲剂作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物。所述缓冲剂可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0116]
作为所述缓冲剂，可以举出甘氨酸、柠檬酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾等磷酸盐、碳酸钠以及碳酸氢钠等碳酸盐、硼酸钠等硼酸盐、羧酸、二羧酸、羧酸衍生物、羟基羧酸、苯胺、苯胺衍生物、氨基酸、胺化合物、咪唑化合物、醇化合物、乙二胺四乙酸、焦磷酸、吡啶、二甲胂酸、磷酸甘油酯、2,4,6-三甲基吡啶、n-乙基吗啉、吗啉、4-氨基吡啶、氨、麻黄碱、羟基脯氨酸、哌啶、三(羟基甲基)氨基甲烷等。
[0117]
从有效地发挥缓冲作用的观点出发，所述缓冲剂优选包含甘氨酸，优选为甘氨酸。
[0118]
就所述保存液中的所述缓冲剂的含量而言，只要是能够发挥缓冲作用的含量就无特别限定。所述保存液中的所述缓冲剂的含量可以根据所述细胞含有液和所述保存液的混合比等而适宜变更。
[0119]
《具有螯合作用的化合物》
[0120]
所述保存液优选包含具有螯合作用的化合物作为与所述细胞膜透过性化合物以及所述细胞膜非透过性化合物这两者不同的化合物。dnase通过镁离子而活化，因此通过使用具有螯合作用的化合物，能够有效地抑制细胞含有液中的cfdna的分解。在所述细胞含有液为血液的情况下，所述保存液优选包含抗凝固剂作为所述具有螯合作用的化合物。在该情况下，不仅能够有效地抑制cfdna的分解，还能够有效地抑制保存中的血液的凝固。所述
具有螯合作用的化合物可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0121]
作为所述抗凝固剂，可以举出乙二胺四乙酸(edta)、柠檬酸以及乙二醇醚二胺四乙酸(egta)等。
[0122]
从进一步有效地抑制cfdna的分解的观点以及在所述细胞含有液为血液的情况下，进一步有效地抑制保存中的血液的凝固的观点出发，所述抗凝固剂优选包含edta，优选为edta。
[0123]
所述保存液中的所述具有螯合作用的化合物的含量可以根据所述细胞含有液与所述保存液的混合比、以及具有螯合作用的化合物的种类等而适宜变更。
[0124]
《其他成分》
[0125]
所述保存液可以包含所述细胞膜透过性化合物、所述细胞膜非透过性化合物、所述甲醛供体化合物、所述渗透压调节剂、所述缓冲剂以及所述具有螯合作用的化合物以外的其他成分。作为所述其他成分，可以举出水、ph调节剂等。
[0126]
所述保存液优选包含水。在所述保存液100重量％中，水的含量优选为30重量％以上，更优选为40重量％以上，优选为60重量％以下，更优选为50重量％以下。
[0127]
所述保存液的渗透压优选为300mosm/l以上，更优选为600mosm/l以上，优选为4000mosm/l以下，更优选为3000mosm/l以下。所述保存液的渗透压如果为所述下限以上以及所述上限以下，则能够进一步有效地发挥本发明的效果。
[0128]
所述保存液的渗透压可以使用渗透压计(例如，advanced instruments公司制“osmometer 3250”)进行测定。
[0129]
所述保存液的ph优选为6.0以上，更优选为7.0以上，优选为8.0以下，更优选为7.5以下。所述ph如果为所述下限以上以及所述上限以下，则能够进一步有效地发挥本发明的效果。
[0130]
(细胞含有液用保存容器)
[0131]
本发明涉及的保存容器是用于保存给定量的细胞含有液的容器。在本发明涉及的保存容器具备所述第1构成的情况下，在将所述给定量的细胞含有液采取至保存容器中，将该细胞含有液和所述保存液混合而得到混合液x时，该混合液x中，所述细胞膜透过性化合物的含量为特定的范围。
[0132]
在本发明涉及的保存容器具备所述第2构成的情况下，在将所述给定量的细胞含有液采取至保存容器中，将该细胞含有液和所述保存液混合而得到混合液x时，该混合液x中，所述细胞膜非透过性化合物的含量为特定的范围。
[0133]
在本发明涉及的保存容器中，将所述给定量的细胞含有液与收纳在保存容器中的所述保存液混合，而得到所述混合液x。
[0134]
具体而言，所述混合液x如下调制。
[0135]
将待采取至所述保存容器中的给定量的细胞含有液采取至该保存容器中。例如，如果是待采取5ml的血液的保存容器，就将5ml的血液采取至该保存容器中。将采取的所述给定量的细胞含有液与所述保存液通过倒置混合而混合，得到混合液x。
[0136]
在具备所述第1构成的保存容器中，所述混合液x中，所述细胞膜透过性化合物的含量为1vol％以上5vol％以下。即，在具备所述第1构成的保存容器中，所述混合液100体积％中，所述细胞膜透过性化合物的含量为1体积％以上5体积％以下。在具备所述第1构成
的保存容器中，所述混合液x中的所述细胞膜透过性化合物的含量在所述范围内，因此能够使细胞内的水分良好地脱水，并且还能够使所述细胞膜透过性化合物良好地保持在细胞内。因此，能够在保存中，有效地抑制细胞破坏、死亡而导致该细胞中的gdna混入细胞含有液中。
[0137]
在所述混合液x中，所述细胞膜透过性化合物的含量优选为2vol％以上，优选为4vol％以下。所述细胞膜透过性化合物的含量如果为所述下限以上以及所述上限以下，则能够使细胞内进一步良好地脱水，并且还能够使所述细胞膜透过性化合物进一步良好地保持在细胞内。因此，能够在保存中，进一步有效地抑制细胞破坏、死亡而导致该细胞中的gdna混入细胞含有液中。
[0138]
在具备所述第2构成的保存容器中，所述混合液x中，所述细胞膜非透过性化合物的含量为0.5μmol/l以上5μmol/l以下。在具备所述第2构成的保存容器中，所述混合液x中的所述细胞膜非透过性化合物的含量在所述范围内，因此能够有效地抑制细胞的凝聚，并且能够提高细胞膜的保护效果。因此，能够在保存中，有效地抑制细胞破坏、死亡而导致该细胞中的gdna混入细胞含有液中。
[0139]
在所述混合液x中，所述细胞膜非透过性化合物的含量优选为1μmol/l以上，优选为4μmol/l以下。所述细胞膜非透过性化合物的含量如果为所述下限以上以及所述上限以下，则能够进一步有效地抑制细胞的凝聚，并且还能够进一步提高细胞膜的保护效果。因此，能够在保存中，进一步有效地抑制细胞破坏、死亡而导致该细胞中的gdna混入细胞含有液中。
[0140]
在所述保存液包含edta等具有螯合作用的化合物的情况下，在所述混合液x中，具有螯合作用的化合物或edta的含量优选为4mmol/l以上，更优选为4.5mmol/l以上，优选为7mmol/l以下，更优选为6.5mmol/l以下。所述具有螯合作用的化合物或所述edta的含量如果为所述下限以上以及所述上限以下，则能够进一步有效地抑制cfdna的分解。此外，所述edta的含量如果为所述下限以上以及所述上限以下，则在所述细胞含有液为血液的情况下，能够进一步有效地抑制血液的保存中的凝固。
[0141]
在所述保存液包含甘氨酸等缓冲剂的情况下，在所述混合液x中，缓冲剂或甘氨酸的含量优选为0.1w/v％以上，更优选为0.2w/v％以上，优选为0.5w/v％以下，更优选为0.4w/v％以下。所述缓冲剂或所述甘氨酸的含量如果为所述下限以上以及所述上限以下，则能够有效地发挥缓冲作用。
[0142]
本发明涉及的保存容器中，在所述保存液包含甲醛供体化合物的情况下，优选以下的混合液y中的甲醛的含量满足特定的范围。
[0143]
得到相对于生理盐水1ml混合有次氯酸钠7.4g的溶液y’，将与待保存在保存容器中的细胞含有液的给定量等量的所述溶液y’采取至保存容器中，将该溶液y’与所述保存液混合而得到混合液y。在本发明涉及的保存容器中，所述给定量的溶液y’与收纳在保存容器中的所述保存液被混合，而得到所述混合液y。需要说明的是，所述溶液y’是模拟细胞含有液的溶液。
[0144]
具体而言，所述混合液y如下调制。
[0145]
将与待采取至所述保存容器中的细胞含有液的给定量等量的所述溶液y’采取至该保存容器中。例如，如果是待采取5ml的血液的保存容器，则将5ml的溶液y’采取至该保存
容器中。将采取的所述给定量的溶液y’与所述保存液通过倒置混合而混合，得到混合液y。
[0146]
在所述保存液包含甲醛供体化合物的情况下，在本发明涉及的保存容器中，所述混合液y中，甲醛的含量优选为100mg/l以上，更优选为110mg/l以上。在所述保存液包含甲醛供体化合物的情况下，在本发明涉及的保存容器中，所述混合液y中，优选为400mg/l以下，更优选为300mg/l以下，进一步优选为200mg/l以下，特别优选为190mg/l以下。所述混合液y通过从所述甲醛供体化合物中游离出所述甲醛而包含甲醛。所述混合液y中的所述甲醛的含量如果为所述下限以上以及所述上限以下，则能够适宜地控制细胞含有液与保存液的混合液中的甲醛的浓度。因此，能够提高细胞的稳定性，并且，能够抑制cfdna的分解。需要说明的是，所述混合液y中的甲醛的含量如果超过400mg/l，则与为400mg/l以下的情况相比，cfdna彼此之间或cfdna与膜蛋白更易于交联，cfdna的保存稳定性可能会降低。
[0147]
所述混合液y中的所述甲醛的含量可以通过mbth比色法求得。
[0148]
在本发明涉及的保存容器中，将与待保存在保存容器中的细胞含有液的给定量等量的生理盐水采取至保存容器中，将该生理盐水与所述保存液混合而得到混合液z。所述混合液z的渗透压优选为300mosm/l以上，更优选为350mosm/l以上，优选为1100mosm/l以下，更优选为1000mosm/l以下。所述混合液z的渗透压如果为所述下限以上以及所述上限以下，则能够使细胞含有液与保存液的混合液中的渗透压变得良好。因此，能够进一步有效地发挥本发明的效果。
[0149]
具体而言，所述混合液z如下调制。
[0150]
将与待采取至所述保存容器中的细胞含有液的给定量等量的所述生理盐水采取至该保存容器中。例如，如果是待采取5ml的血液的保存容器，则将5ml的生理盐水采取至该保存容器中。将采取的所述给定量的生理盐水与所述保存液通过倒置混合而混合，得到混合液z。
[0151]
所述混合液z的渗透压可以使用渗透压计(例如，advanced instruments公司制“osmometer 3250”)进行测定。
[0152]
(容器主体)
[0153]
作为所述容器主体的形状，无特别限定。所述容器主体的形状优选为有底的容器，更优选为有底的管状容器。
[0154]
所述容器主体的原材料无特别限定。作为所述容器主体的原材料，可以举出聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯腈等热塑性树脂；不饱和聚酯树脂、环氧树脂、环氧-丙烯酸酯树脂等热固化性树脂；乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙基纤维素、乙基几丁质等改性天然树脂；钠钙玻璃、磷硅酸盐玻璃、硼硅酸盐玻璃等硅酸盐玻璃、石英玻璃等玻璃。所述容器主体的原材料可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
[0155]
(栓体)
[0156]
所述保存容器优选具备栓体。作为所述栓体，可以使用以往公知的栓体。所述栓体优选为具有可以气密地并且液密地安装至容器主体的开口的原材料、形状的栓体。在所述细胞含有液为血液的情况下，所述栓体优选以采血针能够刺通的方式而构成。
[0157]
作为所述栓体，可以举出具有与容器主体的开口嵌合的形状的栓体、片状的密封栓体等。
[0158]
此外，所述栓体也可以为具备橡胶栓等栓主体、以及由塑料等构成的帽部件的栓体。在该情况下，采取血液后，在将栓体从容器主体的开口处拔出时，能够减少血液与人体接触的风险。
[0159]
作为所述栓体(或所述栓主体)的材料，例如，可以举出合成树脂、弹性体、橡胶、金属箔等。作为所述橡胶，可以举出丁基橡胶以及卤化丁基橡胶等。作为所述金属箔，可以举出铝箔等。从提高密封性的观点出发，所述栓体的材料优选为丁基橡胶。所述栓体优选为丁基橡胶栓。
[0160]
(保存容器以及保存液的其他详细信息)
[0161]
所述保存容器是用于保存给定量的细胞含有液的容器。所述保存容器是用于采取以及保存给定量的细胞含有液的容器。所述保存容器是用于在所述细胞含有液与所述保存液混合的状态下进行保存的容器。所述细胞含有液的所述给定量可以根据该保存容器的尺寸等而适宜变更。作为所述细胞含有液的所述给定量，例如，可以为1ml、5ml、10ml或20ml。
[0162]
所述保存容器优选为用于以液态保存所述细胞含有液的容器，优选为用于不进行冻结地保存所述细胞含有液的容器。所述保存容器优选为用于在0℃以上保存所述细胞含有液的容器，更优选为用于在1℃以上进行保存的容器，进一步优选为用于在15℃以上进行保存的容器，特别优选为用于在18℃以上进行保存的容器。所述保存容器优选为用于在100℃以下保存所述细胞含有液的容器，更优选为用于在50℃以下进行保存的容器，进一步优选为用于在25℃以下进行保存的容器，特别优选为用于在24℃以下进行保存的容器。
[0163]
所述保存液优选用于在0℃以上保存所述细胞含有液，更优选用于在1℃以上进行保存，进一步优选用于在15℃以上进行保存，特别优选用于在18℃以上进行保存。所述保存液优选用于在100℃以下保存所述细胞含有液，更优选用于在50℃以下进行保存，进一步优选用于在25℃以下进行保存，特别优选用于在24℃以下进行保存。
[0164]
相对于待保存的细胞含有液1ml，收纳在所述容器主体内的保存液的含量优选为0.05ml以上，更优选为0.1ml以上，优选为1ml以下，更优选为0.5ml以下。所述保存液的含量如果为所述下限以上以及所述上限以下，则细胞含有液不会被过度地稀释，能够进一步有效地发挥本发明的效果。
[0165]
相对于待保存的细胞含有液1ml，所述保存液优选以0.05ml以上进行混合而使用，更优选以0.1ml以上进行混合而使用，优选以1ml以下进行混合而使用，更优选以0.5ml以下进行混合而使用。在该情况下，细胞含有液不会被过度地稀释，能够进一步有效地发挥本发明的效果。
[0166]
所述保存容器的内压无特别限定。所述保存容器也可以以内部进行了排气后，通过所述密闭部件而密闭的真空采血管的形式来使用。在为真空采血管的情况下，能够不受采血者技术差异的影响，简便地进行一定量的血液采取。
[0167]
从防止细菌感染的观点出发，优选保存容器的内部依照iso以及jis的基准进行了灭菌。
[0168]
以下，将举出实施例对本发明进行更详细的说明。但本发明不限于以下的实施例。
[0169]
作为保存液的材料，准备了以下的材料。
[0170]
(细胞膜透过性化合物)
[0171]
丙二醇
[0172]
丙三醇
[0173]
二甲基亚砜
[0174]
(细胞膜非透过性化合物)
[0175]
聚乙二醇(重均分子量50万)
[0176]
聚乙烯基吡咯烷酮(重均分子量3万)
[0177]
葡聚糖(重均分子量20万)
[0178]
(甲醛供体化合物)
[0179]
1-羟基甲基-5,5-二甲基乙内酰脲
[0180]
(渗透压调节剂)
[0181]
葡萄糖
[0182]
(抗凝固剂)
[0183]
edta
·
2na
[0184]
(缓冲剂)
[0185]
甘氨酸
[0186]
(其它)
[0187]
水
[0188]
(实施例1～15)
[0189]
保存液的制作：
[0190]
将表1～4所示的配合成分以表1～4所示的配合量进行配合，得到了保存液。
[0191]
保存容器的制作：
[0192]
作为容器主体，准备了长度100mm、开口部的内径14mm的聚对苯二甲酸乙二醇酯有底管(pet有底管)。在pet有底管中，收纳了得到的保存液0.5ml。使保存容器内部减压至50kpa，通过丁基橡胶栓进行了密封。如此制作了用于保存血液5ml的保存容器。
[0193]
(比较例1、4)
[0194]
使用了收纳有edta的真空采血管(sekisui medical公司制“insepack ii-d”)作为保存容器。该真空采血管中未收纳细胞膜透过性化合物、细胞膜非透过性化合物以及甲醛供体化合物。
[0195]
(比较例2、3)
[0196]
除了将配合成分的种类以及含量以表1所示的方式进行了变更以外，以与实施例1同样的方式，得到了保存液以及保存容器。
[0197]
(评价)
[0198]
(1)混合液x中的细胞膜透过性化合物、细胞膜非透过性化合物、甲醛供体化合物、渗透压调节剂、抗凝固剂以及缓冲剂的含量
[0199]
向实施例1～15以及比较例2、3中得到的保存容器中，添加血液5ml，将血液与保存液通过倒置混合进行混合而得到混合液x。求出了得到的混合液x中包含的细胞膜透过性化合物、细胞膜非透过性化合物、甲醛供体化合物、渗透压调节剂、抗凝固剂以及缓冲剂的含量。
[0200]
(2)混合液y中的甲醛的含量
[0201]
制作了相对于生理盐水1l混合有次氯酸钠7.4g的溶液y’。向实施例1、2以及比较
例2、3中得到的保存容器中，添加5ml的溶液y’，将溶液y’与保存液通过倒置混合而混合，得到了混合液y。通过mbth比色法求出了得到的混合液y中的甲醛含量。
[0202]
(3)混合液z的渗透压
[0203]
向实施例1～15以及比较例2中得到的保存容器中，添加生理盐水5ml，将生理盐水与保存液通过倒置混合进行混合而得到了混合液z。使用渗透压计(advanced instruments公司制“osmometer 3250”)测定了得到的混合液z的渗透压。
[0204]
(4)cfdna的保存稳定性
[0205]
(4-1)室温保存7天的cfdna的保存稳定性(实施例1、2以及比较例1～3)
[0206]
将血液5ml采取至实施例1、2以及比较例1～3中得到的保存容器中，将血液和保存液通过倒置混合而混合。接下来，使保存容器在15℃～25℃的环境下静置。在保存后立刻、开始保存起3天后、开始保存起7天后，从保存容器中采取了血液与保存液的混合液。通过离心分离从采取的混合液中回收了血浆。使用cfdna纯化试剂盒(qiagen公司制“qiaamp circulating nucleic acid kit”)，纯化了回收的血浆中包含的dna。
[0207]
对纯化的dna进行了荧光标记后，使用电泳系统(agilent公司制“agilent2100 bioanalyzer”以及“high sensivity dna试剂盒”)，进行了纯化了的dna的电泳。对电泳照片进行图像解析，观察了180bp附近的cfdna的峰形状、以及300bp以上的gdna的峰形状。
[0208]
(4-2)室温保存1天的cfdna的保存稳定性(实施例3～12以及比较例4)
[0209]
除了使用了实施例3～12以及比较例4中得到的保存容器、以及使保存容器在15℃～25℃的环境下静置1天后采取了血液与保存液的混合液以外，以与“(4-1)室温保存7天的cfdna的保存稳定性”同样的方式，进行了试验。
[0210]
(4-3)室温保存4天的cfdna的保存稳定性(实施例13～15)
[0211]
除了使用了实施例13～15中得到的保存容器、以及在将保存容器在15℃～25℃的环境下静置3天后和静置4天后采取了血液与保存液的混合液以外，以与“(4-1)室温保存7天的cfdna的保存稳定性”同样的方式，进行了试验。
[0212]
组成以及结果如下述的表1～4以及图1～11所示。
[0213]
[0214]
[0215]
[0216][0217]
在图1～图11中，横轴为dna的碱基对数(bp)，纵轴为荧光强度。此外，在图1～图11中，m1以及m2所示的峰为标记的峰，s所示的峰为来源于cfdna的峰。
[0218]
图1(a)～(c)是实施例1中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像
解析结果。图2(a)、(b)是实施例2中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。图3(a)～(c)是比较例1中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。图4(a)、(b)是比较例2中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。图5(a)～(c)是比较例3中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。图1(a)、图2(a)、图3(a)、图4(a)、图5(a)是使用刚将血液采取至保存容器中时的混合液而得到的结果。图1(b)、图3(b)、图4(b)、图5(b)是使用开始在保存容器中保存血液起3天后的混合液而得到的结果。图1(c)、图2(b)、图3(c)、图5(c)是使用开始在保存容器中保存血液起7天后的混合液而得到的结果。
[0219]
如图1、2所示，在实施例1、2中得到的纯化dna中，直到开始保存起的第7天，都没有观察到180bp附近的来源于cfdna的峰以外的峰。此外，来源于cfdna的峰的形状在15℃～25℃环境下开始保存起的7天之中，得到了良好的保持，可以看出cfdna的保存稳定性得到了提高。
[0220]
与之相对，如图3、4所示，在比较例1、2中得到的纯化dna中，检测到了300bp以上的来源于cfdna以外的成分的峰。可以认为，这些峰是因为gdna从白细胞等中混入了血液中而产生的峰。
[0221]
此外，如图5所示，在比较例3中得到的纯化dna中，可以看出，虽然在一定程度上抑制了来自白细胞等的gdna的混入，但cfdna的峰钝化，荧光强度有所降低。可以推测这是因为，由于甲醛，cfdna彼此之间进行了交联。
[0222]
图6(a)～(c)分别是实施例3～5中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。图7(a)～(c)分别是实施例6～8中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。图8(a)～(d)分别是实施例9～12中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。图3(d)是比较例4中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。图6(a)～(c)、图7(a)～(c)、图8(a)～(d)、图3(d)是使用开始在保存容器中保存血液起1天后的混合液而得到的结果。
[0223]
如图6所示，在实施例3～5中，虽然检测到了由于gdna从白细胞等中混入血液中而产生的峰，但与比较例4相比，cfdna的保存稳定性得到了提高。
[0224]
如图7所示，在实施例6～8中，cfdna的保存稳定性得到了提高。
[0225]
如图8(a)、(b)所示，在实施例9、10中，与比较例4相比，cfdna的保存稳定性得到了提高。
[0226]
如图8(c)、(d)所示，在实施例11、12中，cfdna的保存稳定性得到了提高。
[0227]
图9(a)、(b)是实施例13中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。图10(a)、(b)是实施例14中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。图11(a)、(b)是实施例15中的cfdna的保存稳定性的评价中得到的电泳照片的图像解析结果。图9(a)、图10(a)、图11(a)是使用开始在保存容器中保存血液起3天后的混合液而得到的结果。图9(b)、图10(b)、图11(b)是使用开始在保存容器中保存血液起4天后的混合液而得到的结果。
[0228]
符号的说明
[0229]
m1、m2
…
标记
[0230]s…
cfdna。