改善痘病毒稳定性的组合物的制作方法

universities2007,23:329-332中。wo2010/135495描述了用于在包含甘露醇的喷雾干燥粉末组合物中稳定病毒的方法。8.just和finke分析了包含稳定剂的冻干mva组合物，所述稳定剂包括白蛋白、山梨醇、葡聚糖、半胱氨酸或海脉素，并描述了5％(w/v)山梨醇和1％(w/v)人白蛋白在 4℃下储存时优于冻干组合物(just和finkezentralblbakterioloriga1979,245:276-282)。他们还分析了含有1％(w/v)人白蛋白的非冻干mva悬浮液的稳定性，但在-70℃下储存超过8个月时，观察到这些制剂的病毒滴度损失。9.prabhu等人描述了三种冻干的骆驼痘疫苗制剂(prabhu等人biologicals2014,42:169-175)，其中一种含有3.5％水解明胶和3.5％山梨醇，溶于ph6.2的磷酸钾缓冲液中，即使在4℃下复溶后也显示出病毒滴度的损失。10.虽然冷冻干燥的疫苗通常比非冻干替代品更热稳定，但冻干有一些缺点，包括成本、使用前复溶、复溶后的不稳定性以及冷冻和干燥对病毒颗粒的压力(capelle等人eurjpharmbiopharm2018,129:215-221)。此外，与液体疫苗相比，由于需要复溶，冻干疫苗更容易出现施用和给药错误，这可能导致疫苗浪费或疫苗剂量无效(capelle等人eurjpharmbiopharm2018,129:215-221)。11.也曾尝试将痘苗病毒用于口服疫苗应用(us6,969,345)。所描述的组合物包含甘露醇以及其他成分，诸如羟乙基淀粉、鱼油、甘油和明胶。12.此外，减毒活病毒疫苗的液体稳定性是最具挑战性的，因为降解动力学和动态过程更有利(tlaxca等人advdrugdelivrev2015,93:56-78)。13.wo2010/056991描述了包含mva病毒和甘露醇的液体或液体冷冻组合物，其中甘露醇是所述组合物的唯一稳定剂。14.在wo2016/087457中公开了使用螯合剂和乙醇在例如 5℃下储存12至24个月时对痘病毒稳定性的有益作用。15.wo2011/121301描述了使用n,n-二甲基甘氨酸或n,n,n-三甲基甘氨酸在37℃的液体环境中稳定mva一周。16.氨基酸在广泛的应用中用作稳定剂，包括抗体、融合蛋白和疫苗抗原(maity&goldstein；maity&davagnino；mistilis等人)。特别是组氨酸或精氨酸经常用作各种病毒溶液和病毒疫苗的稳定剂(cardoso等人)。对于稳定液体制剂中的病毒疫苗，至少5mm、并且优选高于10mm浓度的组氨酸可用于基于腺病毒的疫苗(无包膜dna病毒)(evans等人；wo2014/029702)，而流感减毒活疫苗(包膜rna病毒)可通过至少50mm浓度的精氨酸(white等人)(us2007/0161085)或甚至在至多300mm的范围内(wo2014/029702)来稳定。此外，在wo2014/029702中，诸如精氨酸和蛋氨酸的氨基酸被描述为四种犬病毒(犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬瘟热病毒、犬副流感病毒)的有效稳定剂。17.然而，仍然需要能够稳定基于痘病毒的材料的新制剂，从而允许大规模工业应用，提供用于储存的组合物而不影响产品的生物活性并保留病毒的所期望特征，更特别地是避免或减少病毒滴度损失。特别需要不需要在低于-60℃的温度下储存以提供长时间段稳定性的液体药用痘病毒制备物。进一步期望提供适用于在冰箱温度和/或在大约-20℃的温度下储存的高滴度低体积组合物。18.具体地说，仍然需要开发一种痘病毒液体组合物，所述组合物在约-20℃下稳定大约一年或更长时间，接着储存在 2至 8℃下储存(优选至少6或9个月)并与皮下、肌肉内和/或鼻内施用相容。还期望在 2至 8℃下稳定大约一年或更长时间的液体痘病毒组合物。此类液体组合物提供的优点包括商品成本较低、开发和/或生产时间减少以及方便用户。本发明通过提供修饰的痘病毒组合物，特别是mva组合物(显示出增强的储存稳定性)来解决和满足这些需求。技术实现要素：19.本发明提供了具有改善的活痘病毒诸如mva稳定性的水性组合物。20.因此，在一个方面，本发明提供了一种具有ph7.0至ph8.5的ph的水性组合物，其包含：21.(a)浓度为50mm至150mm的精氨酸；或22.(b)浓度为0.25％至1.0％(w/v)或0.25％至小于1.0％(w/v)的白蛋白；或23.(c)浓度为1.0％至3％(w/v)或1.0％至小于3％(w/v)的明胶。24.另一方面提供上述组合物，其还包含痘病毒，优选mva。25.另一方面提供上述组合物，其还包含痘病毒，优选mva，用作药物或疫苗。26.另一方面提供上述组合物用于储存痘病毒，优选mva的用途。27.另一方面提供制备还包含痘病毒，优选mva的组合物的方法，其包括以下步骤：28.(i)提供在药学上可接受的缓冲液中包含痘病毒，优选mva的制备物，以及29.(ii)将步骤(i)的痘病毒制备物与上述组合物组合。附图说明30.并入本说明书并且构成本说明书的一部分的附图说明了本发明的几个实施方案，并且连同描述一起用来解释本发明的原理。31.图1示出了制剂f1(10mmtris/140mmnacl)和制剂f23(含1％(w/v)rhsa、3％(w/v)明胶的10mmtris/140mmnacl、10％(w/v)蔗糖、2％(w/v)山梨醇)的病毒滴度斜率(mva-bn-rsv滴度随时间的变化，即滴度下降/天)。病毒滴度斜率通过在研究开始时(时间零点，t＝0)和在 25摄氏度下孵育3周(19天)和5周(33天)后确定的病毒滴度的线性回归分析来计算。误差线表示每个病毒滴度斜率的标准误差。32.图2示出了不同制剂(其组成在表1中指定)的分级病毒滴度斜率。33.图3示出了rhsa对病毒滴度斜率的作用。制剂在10mmtris/140mmnacl、10％(w/v)蔗糖、2％(w/v)山梨醇(基础缓冲液)中含有0-1.0％(w/v)rhsa。34.图4示出了明胶对病毒滴度斜率的作用。制剂在基础缓冲液中含有0-3.0％(w/v)明胶和指定浓度的rhsa。35.图5示出了精氨酸对病毒滴度斜率的作用。制剂在基础缓冲液不含精氨酸(0mm)或含有100mm精氨酸和指定浓度的rhsa。36.图6示出了制剂f1(10mmtris/140mmnacl)和制剂f23(含1％(w/v)rhsa、3％(w/v)明胶的基础缓冲液)的ph斜率(ph随时间的变化，即变化/天)。ph斜率通过在研究开始时(时间零点，t＝0)和在 25摄氏度下孵育3周(19天)和5周(33天)后确定的ph值的线性回归分析来计算。误差线表示每个ph斜率的标准误差。37.图7示出了不同制剂(其组成在表1中指定)的分级ph斜率。38.图8示出了rhsa对ph斜率的作用。制剂(f71、f73、f82、f84和f86)在基础缓冲液中含有0-1.0％(w/v)rhsa。39.图9示出了明胶对ph斜率的作用。制剂在基础缓冲液中不含明胶(0％)、含有1.5％(w/v)或3.0％(w/v)明胶和不同浓度的rhsa。40.图10示出了精氨酸对病毒滴度斜率的作用。制剂在基础缓冲液不含精氨酸(0mm)或含有100mm精氨酸和不同浓度的rhsa。41.图11示出了暴露于冻融(f/t)循环的制剂的分级病毒滴度斜率。病毒滴度斜率通过研究开始时(时间零点，t＝0)和5个f/t循环和10个f/t循环后(-50摄氏度/环境温度)确定的病毒滴度的线性回归分析来计算。具体实施方式42.发明人先前发现(pct/ep2019/073825)由含有10％(w/v)蔗糖、2％(w/v)山梨醇、1％(w/v)rhsa和3％(w/v)明胶的10mmtris/140mmnacl的水性组合物(本文称为制剂f23)提供储存稳定性，包括mva-bn-rsv保留的生物学功能。在具有ph7.0和ph8.5之间的ph范围的水性组合物中观察到优异的稳定性。43.然而，rhsa相当昂贵，并且因此在商业规模的批量生产中，其不会是首选的药用赋形剂。另一方面，明胶是一种动物产品，并且因此存在安全风险，例如转移病原体的可能性。另外，有一种趋势是避免动物产品(例如素食主义)。44.因此，本文所述研究的目的是探究是否可降低rhsa和/或明胶浓度，同时保持其痘病毒稳定特性。所述研究的另一个目的是探究替代赋形剂(诸如氨基酸)是否能够补偿降低的rhsa和/或明胶浓度。45.在这项研究中，含有mva-bn-rsv的不同制剂在“加速条件”下储存，即 25摄氏度/60％相对湿度(rh)，模拟长时间段内的“实时条件”。实时研究在 5℃和-20℃下平行启动。另外，进行了冻/融(f/t)实验。mva-bn-rsv的稳定性基于病毒滴度降低和ph变化进行评估。46.所述研究尤其得到以下发现：47.rhsa增加痘病毒的稳定性。0.5％(w/v)rhsa时达到最大效果；0.5％(w/v)rhsa与1.0％(w/v)rhsa之间没有差异。48.明胶(在存在rhsa的情况下)增加痘病毒的稳定性。1.5％(w/v)明胶达到最大效果；1.5％(w/v)与3％(w/v)明胶之间没有差异。49.精氨酸(100mm)增加痘病毒的稳定性。因此，精氨酸能够补偿降低的rhsa和/或明胶浓度。此外，精氨酸可替换rhsa和明胶50.优选的实施方案51.在一个实施方案中，包含精氨酸的组合物包含浓度为75mm至125mm、优选80mm至120mm、更优选90mm至110mm、甚至更优选95mm至105mm、最优选100mm的精氨酸。52.在一个实施方案中，包含白蛋白的组合物包含浓度为0.3％至小于1.0％(w/v)、优选0.4％至小于1％(w/v)、最优选0.5％至小于1％(w/v)的白蛋白。53.在一个实施方案中，包含白蛋白的组合物包含浓度为0.25％至0.9％(w/v)、优选0.3％至0.7％(w/v)、更优选0.4％至0.6％(w/v)、最优选0.5％(w/v)的白蛋白。54.在一个实施方案中，包含明胶的组合物包含浓度为1.0％至2％(w/v)、更优选1.5％至2％(w/v)、最优选1.5(w/v)的明胶。55.在一个实施方案中，包含白蛋白的组合物另外包含明胶。56.在一个实施方案中，组合物包含0.1％(w/v)白蛋白和1.5％(w/v)明胶或0.25％(w/v)白蛋白和1.5％(w/v)明胶。57.在一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的缓冲液、优选tris缓冲液、更优选10mmtris缓冲液。58.在一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的盐、优选氯化钠、最优选140mm氯化钠。59.在一个实施方案中，组合物还包含二糖、优选蔗糖、最优选10％(w/v)蔗糖。60.在一个实施方案中，组合物还包含山梨醇、最优选2％(w/v)山梨醇。61.在一个实施方案中，组合物包含浓度为50mm至150mm的精氨酸、tris缓冲液和氯化钠，并且优选不含螯合剂和/或谷氨酸。任选地，组合物还包含蔗糖和山梨醇。62.在一个实施方案中，组合物用于在-50摄氏度或-20摄氏度下将痘病毒储存至少2年。63.在一个实施方案中，组合物用于在 5摄氏度或 20摄氏度下将痘病毒储存至少6个月。64.在组合物、用途或方法的一个实施方案中，痘病毒是正痘病毒、更优选痘苗病毒、甚至更优选修饰的安卡拉痘苗病毒(mva)、最优选mva-65.在组合物、用途或方法的一个实施方案中，痘病毒是重组痘病毒、最优选重组mva，编码至少一种呼吸道合胞病毒(rsv)蛋白或其部分。66.在一个实施方案中，组合物(含或不含痘病毒)是根据如表1中定义的制剂f23和f69至f80中的任一种。67.在一个实施方案中，组合物(含或不含痘病毒)包含浓度如表1a中定义的制剂中的任一种的rhsa和明胶。68.在一个实施方案中，组合物(含或不含痘病毒)包含浓度如表1b中定义的制剂中的任一种的rhsa。69.在一个实施方案中，组合物(含或不含痘病毒)包含浓度为表1c中定义的制剂中的任一种的rhsa和白蛋白。70.在一个实施方案中，组合物(含或不含痘病毒)包含如表1d中定义的浓度的rhsa、明胶和精氨酸。71.痘病毒72.痘病毒是大型病毒，其通常是包膜病毒并且携带双链dna。痘病毒属于痘病毒科，包括71种病毒，分为16个属(virustaxonomy:2017年发布)。最知名的两种正痘病毒是天花病毒(天花的致病因子)和痘苗病毒，它们转化为疫苗能够根除天花。73.痘病毒，诸如痘苗病毒，是本领域技术人员已知的并且已被用于产生重组疫苗以对抗传染性生物体和最近的癌症(mastrangelo等人jclininvest2000,105:1031-1034)。74.在本公开的上下文中，痘病毒优选包括正痘病毒或禽痘病毒。在本发明的优选实施方案中，痘病毒是正痘病毒。75.正痘病毒包括但不限于天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒和猴痘病毒。优选地，正痘病毒是痘苗病毒。76.术语“痘苗病毒”可指复制型痘苗病毒(vacv)的各种毒株或分离株，包括例如安卡拉(ankara)、westernreserve(wr)、vacvcopenhagen(vacv-cop)、templeofheaven、paris、budapest、dairen、gam、mrivp、per、tashkent、tbk、tiantan、tom、bern、patwadangar、biem、b-15、em-63、ihd-j、ihd-w、ikeda、dryvax(也称为vacvwyeth或纽约市卫生委员会[nycbh]毒株)、nyvac、acam1000、acam2000、vaccinialister(也称为elstree)、lc16mo或lc16m8。[0077]在其他实施方案中，本发明的痘病毒是mva病毒。[0078]mva是通过对安卡拉痘苗病毒株的鸡胚成纤维细胞(cva)连续传代516次产生的(综述参见mayr等人infektion1975,3:6-14)。由于这些长期传代，产生的mva病毒的基因组缺失了大约31kb的基因组序列，并且因此被描述为高度限制复制到禽类细胞的宿主细胞(meyer等人jgenvirol1991,72(第5期):1031-1038)。在多种动物模型中显示，与完全可复制的起始材料相比，所得的mva是显著无毒的(mayr和dannerdevbiolstand1978,41:225-234)。[0079]适用于本发明实践的mva病毒可包括但不限于mva-572(1994年1月27日保藏为ecaccv94012707)；mva-575(2000年12月7日保藏为ecaccv00120707)、mva-i721(参考suter等人vaccine2009,27:7442-7450)、nih克隆1(2003年3月27日保藏为pta-5095)和mva-bn(2000年8月30日保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ecacc)，编号为v00083008)。[0080]更优选地，根据本发明使用的mva包括mva-bn和mva-bn衍生物。mva-bn已在国际pct公布wo02/042480中进行了描述。如本文所述，“mva-bn衍生物”是指表现出与mva-bn基本相同的复制特征但在其基因组的一个或多个部分中表现出差异的任何病毒。[0081]mva-bn以及mva-bn衍生物不能复制，意味着不能在体内和体外进行生殖复制。更具体地说，在体外，mva-bn或mva-bn衍生物已被描述为能够在鸡胚成纤维细胞(cef)中进行生殖复制，但不能在人角质形成细胞系hacat(boukamp等人(1988),j.cellbiol.106:761-771)、人骨骨肉瘤细胞系143b(ecacc保藏号91112502)、人胚肾细胞系293(ecacc保藏号85120602)和人宫颈腺癌细胞系hela(atcc保藏号ccl-2)中进行生殖复制。另外，mva-bn或其mva-bn衍生物在hela细胞和hacat细胞系中的病毒扩增率是mva-575的至少二分之一，更优选三分之一。mva-bn和mva-bn衍生物的这些特性的测试和测定描述于wo02/42480(美国专利申请号2003/0206926)和wo03/048184(美国专利申请号2006/0159699)中。[0082]如先前段落中所描述的术语在体外人细胞系中“不能进行生殖复制”或“无生殖复制的能力”例如描述于wo02/42480中，其还教导了如何获得具有如上所述的所期望特性的mva。所述术语适用于使用wo02/42480或美国专利号6,761,893中所描述的测定在感染后4天具有小于1的体外病毒扩增率的病毒。[0083]术语“无法进行生殖复制”是指病毒在感染后4天在如先前段落中所描述的体外人细胞系中的病毒扩增率低于1。wo02/42480或美国专利号6,761,893中所描述的测定可适用于病毒扩增率的测定。[0084]病毒在如先前段落中所描述的体外人细胞系中的扩增或复制通常表示为由受感染细胞产生的病毒(输出)与最初用于感染细胞的病毒量(输入)的比，称为“扩增率”。“1”的扩增率定义了一种扩增状态，其中从受感染细胞产生的病毒量与最初用于感染细胞的量相同，意味着受感染细胞允许病毒感染和繁殖。相反，小于1的扩增率，即与输入水平相比输出减少，表明缺乏繁殖复制，并且因此病毒减毒。[0085]在另一个实施方案中，本发明的痘病毒是禽痘病毒，诸如(但不限于)鸡痘病毒。[0086]术语“禽痘病毒”是指任何禽痘病毒，诸如鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、uncopoxvirus、八哥痘病毒、鸽痘病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、孔雀痘病毒、企鹅痘病毒、麻雀痘病毒、椋鸟痘病毒和火鸡痘病毒。优选的禽痘病毒是金丝雀痘病毒和鸡痘病毒。[0087]禽痘病毒是痘病毒科的一个属，其病毒能够感染鸟类并在鸟类中复制，但不能在非禽类物种中复制(vanderplasschen和pastoretcurrgenether2003,3:583-595)。当用于非禽类物种时，已经证明禽痘病毒诸如鸡痘病毒是一种安全且有效的非复制载体。同上。[0088]金丝雀痘病毒的一个实例是rentschler毒株。根据布达佩斯条约的条款与美国典型培养物保藏中心(atcc)保藏名为alvac(美国专利号5,766,598)的噬菌斑纯化的金丝雀痘毒株，登录号vr-2547。另一种金丝雀痘毒株是命名为lf2cep524241075的商业金丝雀痘疫苗毒株，可购自institutemerieux,inc。[0089]鸡痘病毒的实例是毒株fp-1、fp-5、trovac(美国专利号5,766,598)、poxvac-tc(美国专利7,410,644)、tbc-fpv(therionbiologics-fpv)。fp-1是一种经修饰以用作一日龄鸡的疫苗的duvette毒株。所述毒株是一种商业鸡痘病毒疫苗毒株，命名为odcep25/cep67/23091980年10月，并且可购自institutemerieux,inc。fp-5是鸡胚来源的商业鸡痘病毒疫苗毒株，可购自美国科学实验室(先灵公司分部)madison,wis.，美国兽医许可证编号165，序列号30321。[0090]在另一个实施方案中，本发明的实施方案中任一个的痘病毒或优选的痘病毒中的任一种是活病毒。[0091]痘病毒(特别是正痘病毒，更特别是痘苗病毒或优选mva)优选以至少107infu/ml的滴度存在于本发明的水性组合物中，优选为至少2x107infu/ml、至少3x107infu/ml、至少5x107infu/ml、至少6x107infu/ml、至少7x107infu/ml、至少8x107infu/ml、至少9x107infu/ml、至少1x108infu/ml、至少2x108infu/ml、至少3x108infu/ml、至少4x108infu/ml、至少5x108infu/ml、至少6x108infu/ml、至少7x108infu/ml、至少8x108infu/ml、至少9x108infu/ml、至少1x109infu/ml、至少2x109infu/ml、至少3x109infu/ml、至少4x109infu/ml、至少5x109infu/ml、至少6x109infu/ml或至少7x109infu/ml。出于实际原因，痘病毒(特别是正痘病毒，更特别是痘苗病毒或优选mva)以最多1×1011infu/ml、最多5x1010infu/ml或优选最多1x1010infu/ml的滴度存在于本发明的水性组合物中。[0092]具体地说，痘病毒(特别是正痘病毒，更特别是痘苗病毒或优选mva)以约1×107infu/ml至1x1011infu/ml之间的滴度存在于本发明的水性组合物中。[0093]具体地说，痘病毒(特别是正痘病毒，更特别是痘苗病毒或优选mva)以约1×107infu/ml至5x1010infu/ml之间的滴度存在于本发明的水性组合物中。[0094]具体地说，痘病毒(特别是正痘病毒，更特别是痘苗病毒或优选mva)以约1×approach(a.j.davison&r.m.elliott(编辑),thepracticalapproachseries,irlpressatoxforduniversitypress,oxford,uk(1993),参见例如第9章:expressionofgenesbyvacciniavirusvectors)；currentprotocolsinmolecularbiology(johnwiley&son,inc.(1998),参见例如第16章,第四节:expressionofproteinsinmammaliancellsusingvacciniaviralvector)；以及geneticengineering,recentdevelopmentsinapplications,appleacademicpress(2011),danam.santos,参见例如第3章:recombinant-mediatedgeneticengineeringofabacterialartificialchromosomecloneofmodifiedvacciniavirusankara(mva))。重组mva的构建和分离也描述于methodsandprotocols,vacciniavirusandpoxvirology,isbn978-1-58829-229-2(staib等人),humanapress(2004)，参见例如第7章。[0103]用于产生更大量重组痘病毒和纯化基于病毒的材料诸如根据本发明使用的病毒载体和/或病毒的方法是本领域技术人员已知的。可用的方法包括在cef细胞或细胞系，特别是df-1(us5,879,924)、ebx鸡细胞系(wo2005/007840)、eb66鸭细胞(wo08/129058)或cairinamoschata永生化禽细胞(wo2007/077256或wo2009/004016)中复制病毒。其可在本领域技术人员众所周知的条件下培养。用于病毒培养和病毒扩增的无血清方法是优选的。具体地说，用于在cef细胞中培养和扩增病毒的无血清方法描述于例如wo2004/022729中。用于产生病毒的上游和下游过程是技术人员众所周知的。它们可从wo2012/010280或wo2016/087457获得。可用于纯化本技术的病毒的方法公开于wo03/054175、wo07/147528、wo2008/138533、wo2009/100521和wo2010/130753中。用于在鸭胚衍生细胞中繁殖和纯化重组痘病毒的示例性方法描述于leon等人vaccine2016,34:5878-5885中。[0104]重组mva病毒的示例性产生[0105]对于本文公开的各种重组mva病毒的产生，可应用不同的方法。可将待插入至病毒中的dna序列置于大肠杆菌质粒构建体中，所述质粒构建体中插入了与痘病毒dna区段同源的dna。另外，可将待插入的dna序列与启动子连接。启动子-基因键联可定位在质粒构建体中，使得启动子-基因键联的两端侧接与dna序列同源的dna，所述dna序列侧接含有非必需基因座的痘病毒dna区域。所得质粒构建体可通过在大肠杆菌细菌中的繁殖进行扩增并分离。可将含有待插入的dna基因序列的分离质粒转染到例如鸡胚成纤维细胞(cef)的细胞培养物中，同时用mva病毒感染培养物。质粒中的同源mva病毒dna与病毒基因组之间的重组分别可产生被外来dna序列的存在修饰的痘病毒。[0106]根据一个优选的实施方案，合适的细胞培养物的细胞，例如cef细胞可用mva病毒感染。随后可用第一质粒载体转染受感染的细胞，所述第一质粒载体包含一个或多个外来或异源基因，诸如本公开中提供的核酸中的一种或多种；优选在痘病毒表达控制元件的转录控制下。如上所阐述，质粒载体还包含能够引导外源序列插入至mva病毒基因组的选定部分中的序列。任选地，质粒载体还含有一个盒，所述盒包含与痘病毒启动子可操作地连接的标记和/或选择基因。选择或标记盒的使用简化了产生的重组痘病毒的鉴定和分离。然而，重组痘病毒也可通过pcr技术进行鉴定。随后，可用如上所述获得的重组痘病毒感染另一细胞，并用包含一个或多个第二外来或异源基因的第二载体转染。如果将此基因引入至痘病毒基因组的不同插入位点中，则第二载体在引导一个或多个第二外来基因整合到痘病毒基因组中的痘病毒同源序列方面也不同。在发生同源重组后，可分离包含两个或更多个外来或异源基因的重组病毒。对于将额外的外来基因引入至重组病毒中，感染和转染的步骤可通过使用在先前步骤中分离的重组病毒进行感染和通过使用包含另外一个或多个外来基因的另一载体进行转染来重复。[0107]在其他实施方案中，本发明的实施方案中的任一个的重组痘病毒(特别是正痘病毒，更特别地是痘苗病毒或优选mva)包含编码抗原，优选至少一种抗原的核酸。[0108]例如，根据本发明的合适的抗原可包括一种或多种转基因，其具有编码一种或多种多肽的开放阅读框，当病毒用于疫苗接种目的时，需要针对所述多肽产生免疫反应。实例可包括例如适于产生针对病毒或病原体的免疫反应的转基因或几种转基因，所述病毒或病原体包括但不限于rsv、hiv、hpv、hbv、疟疾(malaria)、埃博拉病毒(ebola)、marv、fmdv、登革热(dengue)、马脑炎病毒(equineencephalitisvirus)或它们的任何组合。[0109]在一个优选的实施方案中，抗原是病毒抗原、共刺激分子和/或肿瘤相关抗原(taa)。[0110]在本发明的优选实施方案中，病毒抗原是选自以下的免疫原性抗原：丝状病毒、小核糖核酸病毒、乳头瘤病毒、肝炎病毒、黄病毒、逆转录病毒、正粘病毒、马脑炎病毒、副粘病毒和/或它们的组合。[0111]在本发明的优选实施方案中，免疫原性抗原是蛋白质，优选全长蛋白质。[0112]在本发明的一个优选实施方案中，副粘病毒是呼吸道合胞病毒(rsv)，例如，如wo2014/019718中所描述。[0113]在另一个优选实施方案中，本发明的实施方案中的任一个的重组痘病毒(特别是正痘病毒，更特别地是痘苗病毒或优选mva)包含编码rsv抗原的核酸。[0114]在另一个优选实施方案中，实施方案中的任一个的重组痘病毒(特别是正痘病毒，更特别地是痘苗病毒或优选mva)包含编码rsv蛋白的核酸。[0115]在另一个优选实施方案中，实施方案中的任一个的重组痘病毒(特别是正痘病毒，更特别地是痘苗病毒或优选mva)包含编码rsvf糖蛋白的核酸。[0116]在另一个优选实施方案中，实施方案中的任一个的重组痘病毒(特别是正痘病毒，更特别地是痘苗病毒或优选mva)包含编码rsvf糖蛋白和rsvg糖蛋白的核酸。[0117]在另一个优选实施方案中，实施方案中的任一个的重组痘病毒(特别是正痘病毒，更特别地是痘苗病毒或优选mva)包含编码rsvf糖蛋白和两种rsvg糖蛋白的核酸。[0118]在另一个优选实施方案中，实施方案中的任一个的重组痘病毒(特别是正痘病毒，更特别地是痘苗病毒或优选mva)包含编码rsvf糖蛋白、两种rsvg糖蛋白和rsvn蛋白的核酸。[0119]在另一个优选实施方案中，实施方案中的任一个的重组痘病毒(特别是正痘病毒，更特别地是痘苗病毒或优选mva)包含编码rsvf糖蛋白、两种rsvg糖蛋白、rsvn蛋白和rsv基质蛋白的核酸。[0120]在另一个优选实施方案中，实施方案中的任一个的重组痘病毒(特别是正痘病毒，更特别地是痘苗病毒或优选mva)包含编码rsvf糖蛋白、两种rsvg糖蛋白、rsvn蛋白和rsvm2-1蛋白的核酸。[0121]在本发明的一个优选实施方案中，丝状病毒是埃博拉病毒和/或马尔堡病毒(marv)，例如，如wo2016/036955、wo2016/036971或wo2016/034678中所描述。[0122]在本发明的一个优选实施方案中，小核糖核酸病毒是口蹄疫病毒(fmdv)，例如，如wo2016/202828中所描述。[0123]在本发明的一个优选实施方案中，乳头瘤病毒是人乳头瘤病毒，例如，如wo2017/192418、wo90/10459、wo05/09241、wo98/04705、wo99/03885或wo2007/121894中所描述。[0124]在本发明的一个优选实施方案中，肝炎病毒选自甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒的组，例如，如wo2004/111082中所描述。[0125]在本发明的一个优选实施方案中，黄病毒是登革病毒(denv)。[0126]在本发明的一个优选实施方案中，逆转录病毒是hiv-1。[0127]在本发明的一个优选实施方案中，正粘病毒是流感病毒。[0128]在本发明的一个优选实施方案中，马脑炎病毒(eev)是东方马脑炎病毒(eeev)、西方马脑炎病毒(weev)和/或委内瑞拉马脑炎病毒(veev)例如，如wo2017/129765中所描述。[0129]在本发明的优选实施方案中，病毒抗原是选自rsv、埃博拉病毒、marv、fmdv、hpv、hbv、hiv、流感病毒、denv、rsv、eev和它们的任何组合的组的免疫原性抗原。[0130]各种共刺激分子是本领域技术人员已知的。其包括但不限于icam-1、lfa-3、cd72、b7-1、b7-2、cd40、cd40配体(cd40l)或其他b7相关分子或它们的组合，诸如tricom。[0131]“tricom.”共刺激分子三联体(也称为tricom)包括b7-1(也称为b7.1或cd80)、胞内粘附分子1(icam-1，也称为cd54)和淋巴细胞功能相关抗原3(lfa-3，也称为cd58)，并且通常包含在表达特定抗原的重组病毒载体(例如痘病毒载体)中以增加抗原特异性免疫反应。tricom的单独组分可在相同或不同启动子的控制下，并且可在具有特定抗原的相同载体上或在单独的载体上提供。示例性载体公开于例如，hodge等人cancerres1999,59:5800-5807等人,“atriadofcostimulatorymoleculessynergizetoamplifyt-cellactivation,”cancerres.59:5800-5807(1999)和美国专利号7,211,432b2中，两者均以引用的方式并入本文。[0132]taa是技术人员众所周知的，并且是指与非肿瘤组织或非肿瘤细胞相比，在肿瘤组织或肿瘤细胞中以更高频率或密度检测到的自体细胞抗原。[0133]在一个优选的实施方案中，taa选自cea、muc-1、trp-1、ny-eso-1、trp-2、p53、psa、her-2、pap、生存素(survivin)、tyrp1、tyrp2或brachyury或它们的任何组合的组。[0134]在其他实施方案中，本发明的实施方案中的任一个的重组痘病毒(特别是正痘病毒，更特别地是痘苗病毒或优选mva)包含编码taa的组合的核酸。此类示例性组合可包括her2和brachyury、cea和muc-1、或pap和psa。[0135]蔗糖和山梨醇[0136]根据本发明的水性组合物含有蔗糖二糖。可考虑替代二糖，例如海藻糖或蔗糖和海藻糖的组合。[0137]在某些实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度范围在2％(w/v)与12％(w/v)之间、优选在4％(w/v)与12％(w/v)之间的二糖(优选蔗糖)。具体地说，根据本发明的水性组合物包含浓度范围在2％(w/v)与11％(w/v)之间、2％(w/v)与10％(w/v)之间、2％(w/v)与9％(w/v)之间、2％(w/v)与8％(w/v)之间、2％(w/v)与7％(w/v)之间、2％(w/v)与6％(w/v)之间、2％(w/v)与5％(w/v)之间、4％(w/v)与12％(w/v)之间、4％(w/v)与11％(w/v)之间、4％(w/v)与10％(w/v)之间、4％(w/v)与9％(w/v)之间、4％(w/v)与8％(w/v)之间、4％(w/v)与7％(w/v)之间、5％(w/v)与12％(w/v)之间、5％(w/v)与11％(w/v)之间、5％(w/v)与10％(w/v)之间、5％(w/v)与9％(w/v)之间、5％(w/v)与8％(w/v)之间、6％(w/v)与12％(w/v)之间、6％(w/v)与11％(w/v)之间、6％(w/v)与10％(w/v)之间、6％(w/v)与9％(w/v)之间、6％(w/v)与8％(w/v)之间、7％(w/v)与12％(w/v)之间、7％(w/v)与11％(w/v)之间、7％(w/v)与10％(w/v)之间、7％(w/v)与9％(w/v)或7％(w/v)与8％(w/v)之间的二糖(优选蔗糖)。[0138]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度范围在4％(w/v)与12％(w/v)之间的蔗糖。[0139]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度为10％(w/v)的蔗糖。[0140]此外，根据本发明的水性组合物包含山梨醇。[0141]在某些实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度范围在0.2％(w/v)与5％(w/v)之间的山梨醇。[0142]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度范围在0.2％(w/v)与4％(w/v)之间的山梨醇。[0143]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度范围在0.5％(w/v)与4％(w/v)之间、优选浓度范围在0.5％(w/v)与3％(w/v)之间的山梨醇。[0144]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度范围在0.2％(w/v)与2.2％(w/v)之间、优选在0.5％(w/v)与2.2％(w/v)之间的山梨醇。[0145]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度范围在1％(w/v)与4％(w/v)之间、优选浓度范围在1％(w/v)与3％(w/v)之间的山梨醇。[0146]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度为2％(w/v)的山梨醇。[0147]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度为2％(w/v)的山梨醇。[0148]明胶[0149]用于本发明的明胶是技术人员众所周知的。明胶是一种天然的水溶性蛋白质，胶凝或非胶凝，可通过部分水解从动物包括猪、牛、鱼和家禽的骨头、皮、腱和筋中产生的胶原蛋白而获得。a型明胶是通过对胶原蛋白原料进行酸处理而产生的，而b型明胶是通过对胶原蛋白原料进行碱处理而产生的。作为用于药物制备物的明胶，可提及例如欧洲药典(ph.eur.)或美国药典(usp)中描述的纯化明胶。[0150]根据本发明的术语“明胶(gelatin)水解物”也称为水解明胶、水解胶原蛋白、胶原蛋白水解物、胶原肽、明胶(gelatine)水解物和水解明胶。这些术语可以互换使用。[0151]术语“明胶水解物”意指通过对明胶进行水解裂解而获得的水解多肽或通过聚合上述水解多肽而获得的多肽。明胶水解物是水溶性的并且优选具有约35,000或更小的分子量。作为可用于本发明的明胶的例示性实例，可提及可商购获得的产品，诸如(由ag,germany制造和销售的水解明胶或其化学衍生物的商品名)、(由bblco.,ltd.,usa制造和销售的水解明胶或其化学衍生物的商品名)和药用明胶(由rousselotbv,nl制造和销售的水解明胶或其化学衍生物的商品名)。[0152]在其他实施方案中，本发明的水性组合物的明胶优选是牛或猪明胶，优选猪或牛明胶水解物。优选使用猪明胶。[0153]在本发明的其他实施方案中，明胶是猪a型明胶。在本发明的其他实施方案中，明胶是猪b型明胶。[0154]在其他实施方案中，本发明的水性组合物包含浓度在约0.02％(w/v)与5％(w/v)之间的明胶或明胶水解物或优选明胶中的任一种。在其他实施方案中，本发明的水性组合物包含浓度在约0.1％(w/v)与5％(w/v)之间的明胶或明胶水解物或优选明胶中的任一种。在其他实施方案中，本发明的水性组合物包含浓度在约0.2％(w/v)与5％(w/v)之间的明胶或明胶水解物或优选明胶中的任一种。在其他实施方案中，本发明的水性组合物包含浓度在约0.25％(w/v)与5％(w/v)之间的明胶或明胶水解物或优选明胶中的任一种。在其他实施方案中，本发明的水性组合物包含浓度在约0.25％(w/v)与4％(w/v)之间的明胶或明胶水解物或优选明胶中的任一种。在其他实施方案中，本发明的水性组合物包含浓度在约0.2％(w/v)与3.2％(w/v)之间的明胶或明胶水解物或优选明胶中的任一种。在其他实施方案中，本发明的水性组合物包含浓度在约1％(w/v)与3.2％(w/v)、优选2.5％(w/v)与3％(w/v)之间的明胶或明胶水解物或优选明胶中的任一种。在其他实施方案中，本发明的水性组合物包含浓度为0.25％(w/v)、0.5％(w/v)、1％(w/v)、1.5％(w/v)、2％(w/v)或3％(w/v)的明胶或明胶水解物或优选明胶中的任一种。[0155]在一个实施方案中，水性组合物包含tris缓冲液、氯化钠、蔗糖、山梨醇和精氨酸，但不添加明胶。[0156]血清白蛋白[0157]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含白蛋白。白蛋白是一种天然存在于哺乳动物血浆中的蛋白质，在血浆中其是最丰富的蛋白质。它在保持所需的血液渗透压以及在血流中运输各种物质方面具有重要作用。用于本发明的白蛋白优选是人、猪、小鼠、大鼠、兔或山羊白蛋白，但也包括如wo2011/051489、wo2011/051489、wo2010/092135、wo2012/150319、wo2014/072481、wo2011124718、wo2015/036579、wo2018/065491、wo2017/029407、wo2013/075066或otagiri和chuangbiolpharmbull2009,32:527-534所述的变体。本领域技术人员还将认识到可通过本领域已知的任何手段(例如通过重组dna技术、通过翻译后修饰、通过蛋白水解裂解和/或通过化学手段)对白蛋白进行修饰。在本文中考虑了对白蛋白提供基本上等同于没有取代或改变的稳定功能的那些对白蛋白的取代和改变。优选地，白蛋白是人血清白蛋白。在其他实施方案中，白蛋白是重组白蛋白、优选由巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)或水稻(oryzasativa)表达和纯化的重组人血清白蛋白(rhsa)。优选地，根据本发明使用的白蛋白是在酿酒酵母中表达的然而，其他重组白蛋白也适用于本发明，诸如例如在巴斯德毕赤酵母中表达的人重组白蛋白(例如albagentm，rhsa，cas编号70024-90-7，sigma-aldrich)。[0158]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度范围在0.02％(w/v)与3％(w/v)之间、优选浓度范围在0.02％(w/v)与2％(w/v)之间的白蛋白(优选本文提及的优选白蛋白中的任一种)。[0159]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度范围在0.2％(w/v)与2％(w/v)之间、优选浓度范围在0.2％(w/v)与1.5％(w/v)之间的白蛋白(优选本文提及的优选白蛋白中的任一种)。[0160]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度范围在0.5％(w/v)与2％(w/v)之间、优选浓度范围在0.5％(w/v)与1.5％(w/v)之间的白蛋白(优选本文提及的优选白蛋白中的任一种)。[0161]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度范围在0.8％(w/v)与1.2％(w/v)之间的白蛋白(优选本文提及的优选白蛋白中的任一种)。[0162]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含浓度为0.1％(w/v)、0.25(w/v)、0.5％(w/v)或1％(w/v)的白蛋白(优选本文提及的优选白蛋白中的任一种)。[0163]在一个实施方案中，水性组合物包含tris缓冲液、氯化钠、蔗糖、山梨醇和精氨酸，但不添加血清白蛋白。[0164]缓冲液和ph[0165]根据本发明的实施方案中的任一个的水性组合物优选具有在ph7.0与ph8.5之间的ph范围。[0166]在本发明的其他实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物具有在ph7.3与ph8.1之间的ph范围。[0167]在本发明的其他实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物具有7.7的ph。[0168]熟悉药物开发的技术人员非常了解可用于实现在例如ph7.0与ph8.5之间的ph的缓冲液。此类缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、tris-hcl(三(羟甲基)氨基甲烷-hcl)、tricine(n-[三(羟甲基)甲基)-甲基]-甘氨酸)和hepes(4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸)的组。磷酸盐缓冲液优选包含na2hpo4和kh2po4的混合物或na2hpo4和nah2po4的混合物。在某些实施方案中，水性组合物的缓冲液是tris缓冲液，优选tris-hcl缓冲液。[0169]在某些实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物不包含柠檬酸盐或柠檬酸盐缓冲液。[0170]在某些实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物的缓冲液优选以在1mm与50mm之间、优选在1mm与25mm之间的浓度存在。[0171]在某些实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物的缓冲液优选以在1mm与15mm之间、优选在5mm与11mm之间、更优选在7mm与10mm之间的浓度存在。[0172]在某些实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物的缓冲剂以10mm的浓度存在。[0173]在某些实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物的缓冲剂以7.5mm的浓度存在。[0174]在一个优选的实施方案中，缓冲液是10mmtris-hcl缓冲液。[0175]盐[0176]在其他实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物包含一价盐。所述一价盐优选是氯化钠(nacl)或氯化钾(kcl)，优选是nacl。所述nacl优选以在40mm与200mm之间、优选在40mm与150mm之间的浓度存在。[0177]在另一个实施方案中，nacl可以在40mm与140mm、40mm与130mm、40mm与120mm、40mm与110mm、40mm与100mm、40mm与90mm、40mm与80mm、50mm与150mm、50mm与140mm、50mm与130mm、50mm与120mm、50mm与110mm、50mm与100mm、50mm与90mm、50mm与80mm、60mm与150mm、60mm与140mm、60mm与130mm、60mm与120mm、60mm与110mm、60mm与100mm、60mm与90mm、60mm与80mm、70mm与150mm、70mm与140mm、70mm与130mm、70mm与120mm、70mm与110mm、70mm与100mm、70mm与90mm或70mm与80mm之间的浓度存在。[0178]在另一个实施方案中，nacl可以在60mm与80mm之间的浓度存在。[0179]在另一个实施方案中，nacl可以70mm之间的浓度存在。[0180]在其他实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物包含二价盐。所述二价盐优选是氯化镁(mgcl2)。所述mgcl2优选以在1mm与300mm之间的浓度存在。[0181]在另一个实施方案中，mgcl2可以在2mm与300mm、5mm与300mm、10mm与300mm、20mm与300mm、30mm与300mm、40mm与300mm、50mm与300mm、60mm与300mm、70mm与300mm、80mm与300mm、90mm与300mm、100mm与300mm、150mm与300mm、180mm与300mm、200mm与300mm、2mm与260mm、5mm与260mm、10mm与260mm、20mm与260mm、30mm与260mm、40mm与260mm、50mm与260mm、60mm与260mm、70mm与260mm、80mm与260mm、90mm与260mm、100mm与260mm、150mm与260mm、180mm与260mm、200mm与260mm、75mm与300mm、75mm与260mm、100mm与260mm、120mm与260mm、150mm与260mm、200mm与260mm、2mm与200mm、5mm与200mm、10mm与200mm、20mm与200mm、30mm与200mm、40mm与200mm、50mm与200mm、60mm与200mm、70mm与200mm、80mm与200mm、90mm与200mm、2mm与150mm、5mm与150mm、10mm与150mm、20mm与150mm、30mm与150mm、40mm与150mm、50mm与150mm、60mm与150mm、70mm与150mm、80mm与150mm、90mm与150mm、2mm与100mm、5mm与100mm、10mm与100mm、20mm与100mm、30mm与100mm、40mm与100mm、50mm与100mm、60mm与100mm、70mm与100mm、80mm与100mm、90mm与100mm、2mm与75mm、5mm与75mm、10mm与75mm、20mm与75mm、30mm与75mm、40mm与75mm、50mm与75mm、60mm与75mm、70mm与75mm、2mm与50mm、5mm与50mm、10mm与50mm、20mm与50mm、30mm与50mm、40mm与50mm、2mm与40mm、5mm与40mm、10mm与40mm、20mm与40mm或30mm与40mm之间的浓度存在。[0182]在另一个实施方案中，mgcl2可以在75mm与300mm之间的浓度存在。[0183]在另一个实施方案中，mgcl2可以在100mm与300mm之间的浓度存在。[0184]在另一个实施方案中，mgcl2可以在200mm与300mm之间的浓度存在。[0185]在另一个实施方案中，mgcl2可以在220mm与260mm之间的浓度存在。[0186]在另一个实施方案中，mgcl2可以在240mm与260mm之间的浓度存在。[0187]在其他实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物包含一价盐和二价盐，优选为如上所指定的任何浓度。[0188]在另一个实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物包含浓度在60mm与80mm之间的一价盐和浓度在220和260mm之间的二价盐。[0189]在另一个实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物包含浓度在40mm与150mm之间的nacl和浓度在220mm与260mm之间的mgcl2。[0190]在另一个实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物包含浓度在70mm与150mm之间的nacl和浓度在220mm和260mm之间的mgcl2。[0191]在另一个实施方案中，根据实施方案中的任一个的水性组合物包含浓度在60mm与80mm之间的nacl和浓度在220mm和260mm之间的mgcl2。[0192]在另一个实施方案中，水性组合物不含mgcl2和/或cacl2.。[0193]在一个优选的实施方案中，水性组合物包含140mmnacl。[0194]氨基酸[0195]根据本文所述的实施方案中的任一个的水性组合物可含有一种或多种氨基酸。优选的氨基酸是组氨酸、精氨酸、赖氨酸、甘氨酸和/或谷氨酸或其盐，特别是l-异构体l-组氨酸、l-精氨酸、l-赖氨酸、l-甘氨酸和/或l-谷氨酸或其盐。所述氨基酸不是由本发明的重组或非重组病毒编码的氨基酸。因此，氨基酸不是通过病毒(例如mva)的纯化过程包含在组合物中，而是在产生用于制造疫苗的组合物的过程中添加的。最优选的是l-精氨酸，例如l-精氨酸hcl。[0196]氨基酸优选以低于150mm、低于130mm、低于120mm、优选低于110mm的浓度存在。[0197]在其他实施方案中，氨基酸以在10mm与110mm、20mm与110mm、30mm与110mm、40mm与110mm、50mm与110mm、60mm与110mm、70mm与110mm或80mm与110mm之间的浓度存在。[0198]在其他实施方案中，氨基酸以在40mm与110mm之间的浓度存在。[0199]在其他实施方案中，氨基酸以在90mm与110mm之间的浓度存在。[0200]在其他实施方案中，氨基酸以100mm的浓度存在。[0201]在其他实施方案中，氨基酸以50mm的浓度存在。[0202]在其他实施方案中，本发明的水性组合物可含有浓度在40mm与60mm之间的组氨酸(优选l-组氨酸)。[0203]在其他实施方案中，本发明的水性组合物可含有浓度在40mm与60mm之间的精氨酸(优选l-精氨酸)。[0204]在其他实施方案中，本发明的水性组合物可含有浓度在40mm与60mm之间的赖氨酸(优选l-赖氨酸)。[0205]在其他实施方案中，本发明的水性组合物可含有浓度在40mm与60mm之间的甘氨酸(优选l-甘氨酸)。[0206]在其他实施方案中，本发明的水性组合物可含有组氨酸、精氨酸、赖氨酸和甘氨酸，优选各自的浓度在40mm与60mm之间。[0207]在其他实施方案中，本发明的水性组合物可含有组氨酸、精氨酸、赖氨酸和甘氨酸，优选各自的浓度在40mm与60mm之间。[0208]上述氨基酸的浓度可用于以上部分中提及的特定氨基酸中的任一种(例如，组氨酸、精氨酸、赖氨酸和/或甘氨酸)。[0209]谷氨酸或其盐(例如，谷氨酸一钠或谷氨酸一钠一水合物)优选以在2.5mm与7.5mm之间的浓度存在。[0210]在其他实施方案中，谷氨酸或其盐(例如，谷氨酸一钠一水合物或谷氨酸一钠一水合物)以在3mm与6mm之间的浓度存在。优选地，谷氨酸或其盐(例如，谷氨酸一钠一水合物或谷氨酸一钠一水合物)以5mm的浓度存在。[0211]在一个优选的实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含或不含谷氨酸。优选地，水性组合物基本上不含或不含添加的除精氨酸之外的氨基酸。[0212]在一个优选的实施方案中，本发明的水性组合物包含tris缓冲液、氯化钠、蔗糖、山梨醇和精氨酸，但不包含其他添加的氨基酸。[0213]其他赋形剂[0214]根据本文所述的实施方案中的任一个的水性组合物还可包含辛酸盐。优选地，根据实施方案中的任一个的水性组合物包含浓度小于或等于5mm、优选小于或等于1mm、更优选浓度为0.001至1mm的辛酸根离子。[0215]根据本文所述的实施方案中的任一个的水性组合物还可包含一种或多种额外的载剂、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂和/或稀释剂，优选地，额外的载剂、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂和/或稀释剂中的任一种是药学上可接受的。[0216]在其他实施方案中，本发明的水性组合物不含甘露醇。[0217]在其他实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含柠檬酸盐。[0218]在其他实施方案中，本发明的水性组合物不含柠檬酸盐。[0219]在其他实施方案中，本发明的水性组合物基本上是药学上可接受的或者是药学上可接受的。[0220]在其他实施方案中，本发明的水性组合物是疫苗或药物组合物。[0221]在其他实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含甘露醇。[0222]在其他实施方案中，水性组合物基本上不含螯合剂。螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸(edta)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-n,n,n',n'-四乙酸(bapta)、乙二醇四乙酸(egta)、二巯基丁二酸(dmsa)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)和2,3-二巯基-1-丙磺酸(dmps)。根据本发明的“基本上不含螯合剂”意指少于50μm的螯合剂。[0223]在其他实施方案中，本发明的水性组合物不含螯合剂。[0224]在其他实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含聚山梨酯。聚山梨酯的实例包括聚山梨酯80。[0225]在其他实施方案中，本发明的水性组合物不含聚山梨酯。[0226]在其他实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含c2-c3醇，其中c2-c3醇是乙醇和/或异丙醇。根据本发明的“基本上不含c2-c3醇”意指小于0.05(v/v)的乙醇或异丙醇。[0227]在其他实施方案中，本发明的水性组合物不含c2-c3醇，其中c2-c3醇是乙醇和/或异丙醇。[0228]在其他实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含甘露醇、柠檬酸盐、螯合剂、c2-c3醇(即乙醇和/或异丙醇)和/或聚山梨酯。[0229]在其他实施方案中，本发明的水性组合物不含甘露醇、柠檬酸盐、螯合剂、c2-c3醇(即乙醇和/或异丙醇)和/或聚山梨酯。[0230]在其他实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含hpbcd和甘露醇。[0231]在其他实施方案中，本发明的水性组合物不含hpbcd和甘露醇。[0232]在其他实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含hpbcd、甘露醇和柠檬酸盐。[0233]在其他实施方案中，本发明的水性组合物不含hpbcd、甘露醇和柠檬酸盐。[0234]在其他实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含hpbcd、甘露醇、柠檬酸盐和螯合剂和c2-c3醇(即乙醇和/或异丙醇)。[0235]在其他实施方案中，本发明的水性组合物不含hpbcd、甘露醇、柠檬酸盐、螯合剂和c2-c3醇(即乙醇和/或异丙醇)。[0236]在进一步的实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含hpbcd、甘露醇、柠檬酸盐、螯合剂、c2-c3醇(即乙醇和/或异丙醇)和聚山梨酯。[0237]在其他实施方案中，本发明的水性组合物不含hpbcd、甘露醇、柠檬酸盐、螯合剂、c2-c3醇(即乙醇和/或异丙醇)和聚山梨酯。[0238]在其他实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含或不含血清白蛋白。特别地，包含精氨酸的水性组合物可不含血清白蛋白。[0239]在其他实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含或不含明胶。特别地，包含精氨酸的水性组合物可不含明胶。[0240]在其他实施方案中，本发明的水性组合物基本上不含或不含精氨酸。特别地，包含血清白蛋白和/或明胶的水性组合物可不含精氨酸。[0241]其他事项[0242]在其他实施方案中，根据本发明的水性组合物包含在小瓶中。术语“小瓶”是指能够储存活性药物成分诸如如本文所公开的病毒的任何容器、器皿、药筒、装置、玻璃安瓿或注射器。术语小瓶、容器、器皿、药筒、装置、玻璃安瓿或注射器因此可以互换使用。小瓶通常由惰性材料制成，特别是玻璃(诸如din2ri型硼硅玻璃小瓶)或聚合材料。在一个优选的实施方案中，组合物包含在din2ri型硼硅玻璃小瓶中。在一个优选的实施方案中，组合物包含在注射器中。[0243]本发明的组合物可通过本领域已知的任何手段施用于受试者，优选人。施用途径包括但不限于肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、静脉内施用、鼻内施用、透皮施用、经皮(transcutaneous)施用或经皮(percutaneous)施用。本领域技术人员可以已知方法优化施用方式、剂量和施用次数。在一个优选的实施方案中，本发明的水性组合物适用于胃肠外施用或应用。在其他优选的实施方案中，本发明的水性组合物适用于鼻内施用或应用。在其他优选的实施方案中，本发明的水性组合物适用于肌肉内或皮下施用或应用。[0244]在某些实施方案中，本发明的实施方案中的任一个的水性组合物进一步定义为当在 5℃下储存三个月时，具有初始感染性(在第0天)的至少50％、60％、79％、80％或90％的感染性。[0245]在某些实施方案中，本发明的实施方案中的任一个的水性组合物进一步定义为当在-20℃下储存三个月时，具有初始感染性(在第0天)的至少70％、80％或90％的感染性。[0246]在某些实施方案中，本发明的实施方案中的任一个的水性组合物进一步定义为当在 5℃下储存六个月时，具有初始感染性(在第0天)的至少70％、80％或90％的感染性。[0247]在某些实施方案中，本发明的实施方案中的任一个的水性组合物进一步定义为当在-20℃下储存六个月时，具有初始感染性(在第0天)的至少、70％、80％或90％的感染性。[0248]在某些实施方案中，本发明的实施方案中的任一个的水性组合物进一步定义为当在 25℃/60％相对湿度下储存五个月时，具有初始感染性(在第0天)的至少70％、80％或90％的感染性。[0249]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物是稳定的。[0250]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物在 5℃下至少3个月的病毒滴度的总体损失小于0.5log10infu/ml、优选小于0.4log10infu/ml、更优选小于0.3log10infu/ml、最优选小于0.2log10infu/ml时是稳定的，优选如通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定。[0251]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物在 5℃下至少6个月的病毒滴度的总体损失小于0.5log10infu/ml、优选小于0.4log10infu/ml、更优选小于0.3log10infu/ml、最优选小于0.2log10infu/ml时是稳定的，优选如通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定。[0252]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物在 5℃下至少9个月的病毒滴度的总体损失小于0.5log10infu/ml、优选小于0.4log10infu/ml、更优选小于0.3log10infu/ml、最优选小于0.2log10infu/ml时是稳定的，优选如通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定。[0253]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物在 5℃下至少12个月的病毒滴度的总体损失小于0.5log10infu/ml、优选小于0.4log10infu/ml、更优选小于0.3log10infu/ml、最优选小于0.2log10infu/ml时是稳定的，优选如通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定。[0254]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物在-20℃下至少3个月的病毒滴度的总体损失小于0.5log10infu/ml、优选小于0.4log10infu/ml、更优选小于0.3log10infu/ml、最优选小于0.2log10infu/ml时是稳定的，优选如通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定。[0255]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物在-20℃下至少6个月的病毒滴度的总体损失小于0.5log10infu/ml、优选小于0.4log10infu/ml、更优选小于0.3log10infu/ml、最优选小于0.2log10infu/ml时是稳定的，优选如通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定。[0256]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物在-20℃下至少9个月的病毒滴度的总体损失小于0.5log10infu/ml、优选小于0.4log10infu/ml、更优选小于0.3log10infu/ml、最优选小于0.2log10infu/ml时是稳定的，优选如通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定[0257]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物在-20℃下至少12个月的病毒滴度的总体损失小于0.5log10infu/ml、优选小于0.4log10infu/ml、更优选小于0.3log10infu/ml、最优选小于0.2log10infu/ml时是稳定的，优选如通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定[0258]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物在 25℃/60％相对湿度下至少5个月的病毒滴度的总体损失小于0.5log10infu/ml、优选小于0.4log10infu/ml、更优选小于0.3log10infu/ml、最优选小于0.2log10infu/ml时是稳定的，优选如通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定。[0259]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物在约-20℃下稳定至少12个月的时间段，接着在 2至 8℃下储存3个月，其中在-20℃下至少12个月的指定时间段，接着在 2至 8℃下储存至少3个月的病毒滴度的总体损失小于0.5log10infu/ml。优选地，病毒滴度的总体损失小于0.4log10infu/ml、更优选小于0.3log10infu/ml、最优选小于0.2log10infu/ml，优选如通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定。[0260]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物在约-20℃下稳定至少12个月的时间段，接着在 2至 8℃下储存9个月，其中在-20℃下至少12个月的指定时间段，接着在 2至 8℃下储存至少9个月的病毒滴度的总体损失小于0.5log10infu/ml。优选地，病毒滴度的总体损失小于0.4log10infu/ml、更优选小于0.3log10infu/ml、最优选小于0.2log10infu/ml，优选如通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定。[0261]根据特定的实施方案，本发明的水性组合物在约-20℃下稳定至少24个月的时间段，接着在 2至 8℃下储存9个月，其中在-20℃下至少24个月的指定时间段，接着在 2至 8℃下储存至少9个月的病毒滴度的总体损失小于0.5log10infu/ml。优选地，病毒滴度的总体损失小于0.4log10infu/ml、更优选小于0.3log10infu/ml、最优选小于0.2log10infu/ml，优选如通过荧光激活细胞分选仪(facs)测定所测定。[0262]根据本发明的“病毒滴度的总体损失”定义为在以log10infu/ml给出的指定温度n(例如， 5℃)和时间t(例如，6个月)下储存组合物期间测量的病毒滴度的累积损失。病毒滴度的总体损失以xlog10(例如，在 5℃下六个月，以0.5log10)给出。[0263]根据特定实施方案，本发明的水性组合物是稳定的，其中组合物在-20℃下储存12个月时表现出小于0.3log10infu/ml的效力损失。[0264]根据特定实施方案，本发明的水性组合物是稳定的，其中组合物在 4℃至 8℃下储存12个月时表现出小于0.3log10infu/ml的效力损失。[0265]根据特定实施方案，本发明的水性组合物是稳定的，其中组合物在-20℃下储存12个月时表现出小于0.2log10infu/ml的效力损失。[0266]根据特定实施方案，本发明的水性组合物是稳定的，其中组合物在 4℃至 8℃下储存12个月时表现出小于0.2log10infu/ml的效力损失。[0267]根据特定实施方案，本发明的水性组合物是稳定的，其中组合物在-20℃下储存12个月时表现出小于0.1log10infu/ml的效力损失。[0268]根据特定实施方案，本发明的水性组合物是稳定的，其中组合物在 4℃至 8℃下储存12个月时表现出小于0.1log10infu/ml的效力损失。[0269]根据特定的其他实施方案，本发明的水性组合物是液体组合物或液体冷冻组合物。[0270]根据特定的其他实施方案，本发明的水性组合物是水性冷冻组合物。[0271]根据特定的其他实施方案，本发明的水性组合物是水性液体组合物。[0272]根据特定的其他实施方案，本发明的水性组合物不是干燥的组合物，优选不是冷冻干燥或冻干的组合物。[0273]另一方面提供本发明的水性组合物用于治疗或预防疾病，优选传染病或癌症。[0274]另一方面提供本发明的水性组合物在制造用于治疗或预防传染病或癌症的药物或疫苗中的用途。[0275]另一方面提供一种治疗或预防传染病的方法，向受试者施用本发明的实施方案中的任一个的组合物。[0276]定义和术语[0277]应理解，以上
发明内容和具体实施方式都仅是示例性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并非意图限定本发明的范围，本发明的范围只受所附权利要求限定。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有如由本领域普通技术人员普遍理解的相同的含义。[0278]定义和解释术语以便可更容易地理解本发明。在整个具体实施方式中阐述了附加定义。[0279]必须注意除非上下文另有明确指示，否则如在本文中使用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包括多个指示物。因此，例如，提及“一种核酸”包括一种或多种核酸序列，并且提及“所述方法”包括提及本领域普通技术人员已知的可修改或替代本文所述方法的等效步骤和方法。[0280]除非另外指定，在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指所述系列中的每个要素。本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或将能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效物。此类等效物意图由本发明所涵盖。[0281]如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为涵盖单独的和组合的选项。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一个选项是指第一个要素在没有第二个要素的情况下的适用性。第二个选项是指第二个要素在没有第一个要素的情况下的适用性。第三个选项是指第一个和第二个要素在一起的适用性。这些选项中的任一个都被理解为落入所述含义内，并且因此满足本文所用术语“和/或”的要求。多于一个选项的同时适用性也被理解为落入所述含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。[0282]在整个说明书和下面的权利要求书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”和诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变型应理解为包含规定的整数或步骤或整数或步骤的组但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。当在本发明的描述中的一个方面或实施方案的上下文中使用时，可修改术语“包含”并因此用术语“含有”或“包括”替换，或者当在本文中使用时替换为术语“具有”。类似地，上述术语(包含、含有、包括、具有)中的任一个，无论何时在本发明的描述中的一个方面或实施方案的上下文中使用，都包括术语“由……组成”或“基本上由……组成”，其各自表示取决于管辖权的特定法律含义。[0283]当在本文中使用时，“由......组成”排除了在权利要求要素中未指明的任何要素、步骤、或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成”不排除不会实质影响权利要求书的基本和新颖特征的材料或步骤。[0284]如本文所用的术语“基本上不含”成分不排除痕量的成分，如果本文没有另外说明，所述成分不会实质影响本发明的组合物的稳定性。例如甘露醇前的“不含”意指本发明的水性组合物不含有甘露醇。[0285]本技术中使用的“约”意指±10％，除非另有说明。还必须注意，除非另有说明，否则任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围，都应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。通过说明书，关于任何量或浓度的术语“约”预期包括所述量。例如，“约5mm”在本文中预期包括5mm以及相对于所描述的实体理解为大约5mm的值。如本文所用，数值范围的使用明确包括所有可能的子范围、所述范围内的所有单独数值，包括此类范围内的整数和值的分数，除非上下文另有明确指示。同样地，在本发明上下文中使用的任何数值或范围之前的术语“约”可被删除，并被替换为没有术语“约”的数值或范围，尽管不太优选。[0286]术语“核酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”和“多核苷酸”可互换使用，是指直链或支链、单链或双链的rna或dna，或它们的杂合体。多核苷酸可通过化学合成获得或衍生自微生物。与重组病毒结合使用时，术语“外源”核酸序列意指外来核酸序列，即不包含在用于产生重组病毒的非重组病毒中或在产生重组病毒时插入至病毒基因组中的核酸序列。[0287]“药学上可接受的”意指载剂、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂、稳定剂或赋形剂，在所采用的剂量和浓度下，将基本上不会在其所施用于的受试者中引起不希望的或有害的作用。“药学上可接受的”赋形剂是与活性分子(诸如病毒)组合以制备合意或方便剂型的任何惰性物质。“药学上可接受的”赋形剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且与包含病毒制备物的制剂的其他成分相容。赋形剂的实例是冷冻保护剂、非离子去污剂、缓冲剂、盐和自由基氧化抑制剂。“药学上可接受的载剂”例如描述于remington'spharmaceuticalsciences,第18版,a.r.gennaro，编辑，mackpublishingcompany(1990)；pharmaceuticalformulationdevelopmentofpeptidesandproteins,s.frokjaer和l.hovgaard,编辑,taylor&francis[2000]；以及handbookofpharmaceuticalexcipients,第3版,a.kibbe，编辑，pharmaceuticalpress(2000)中。[0288]“稳定的(stable)”、“稳定的(stabilized)”、“稳定性(stability)”或“稳定(stabilizing)”，它们都可互换使用，应理解本发明的组合物中所含的痘病毒在药物组合物的保质期所需的储存时基本上保持其物理稳定性、同一性、完整性和/或化学稳定性、同一性、完整性、粒子形态学和/或生物活性或效力。如本文所用，术语“保质期”意指根据产品特征在指定的储存条件下(例如，在 2℃至 8℃下储存)，产品在用作人类药物时保持活性和/或稳定的时间。保质期对应于超过给定规格的下限或上限的时间点。[0289]稳定性可通过确定一段时间内和某些储存条件下制剂中痘病毒(例如，mva)的不同特征诸如数量(制剂中痘病毒的数量)、效力和/或其他质量方面来评估。痘病毒(例如，mva)制剂的这些特症可在升高的温度(预测实时温度)或其他压力条件下测量，例如制剂可经历 20℃、 25℃、-20℃或 5℃的孵育，或经历冷冻/解冻循环和搅拌，以研究不同制剂最大限度延长保质期的效果。确定痘病毒(例如，mva)稳定性的方法是本领域技术人员众所周知的，并且可通过选自目视检查、ph测量、浊度测定、粒子形态学和效力(感染性)测定的组中的至少一种方法来确定。[0290]浊度法测量由于样品中颗粒的散射(表观吸光度)导致的透射光强度损失，在样品中的分子不吸收光的波长处检测(例如，对于其中蛋白质是主要发色团的样品，350nm)。当分子聚集或形成超分子复合物时，来自分离颗粒时的随机光散射现在变得相干，从而测量强度增加。这使得光散射和浊度法成为检测聚集和复合物形成或解离的有用技术。[0291]在浊度测定中，样品一式三份转移到紫外线透明的平底微孔板中。通过酶标仪记录230和500nm之间的吸光度光谱，并测量975nm处的吸光度以测定并可能校正光路长度的差异。如果需要，将由不含mva的制剂组成的对照样品包括在测定中以校正散射或吸收基质组分。350nm处的表观吸光度用作浊度的定量指标。[0292]浊度测定是mva样品的稳定性指示。mva聚集导致浊度增加，并且衣壳解离减少。浊度值》1ntu时，测定精度《5％(cv％)。[0293]确定粒子形态学的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，可使用透射电子显微镜和免疫电子显微镜(免疫-em)来确定粒子形态学，如例如schweneker等人jvirol2017,91:e00343-00317中所描述。确定粒子形态学的替代方法是描述于例如filipe等人pharmres2010,27:796-810中的纳米颗粒跟踪分析(nta)。纳米颗粒跟踪分析(nta)是一种用于直接和实时可视化和分析液体中颗粒大小分布和聚集的方法。基于激光照射显微技术，通过电荷耦合器件(ccd)相机实时分析纳米颗粒的布朗运动，每个颗粒同时但单独地通过专用颗粒跟踪图像分析程序进行可视化和跟踪。nta同时测量颗粒大小和颗粒散射强度的能力允许分辨异质颗粒混合物并直接估计颗粒浓度。[0294]术语“效力”或“感染性”在关于如本文所用的病毒使用时是指病毒感染细胞的能力，所述病毒感染细胞是指病毒在细胞或生物体中的入侵和增殖。传染性因此是指以传染单位(infu)表示的痘病毒(例如痘苗病毒或mva)的活性，通常以infu/ml给出。术语“效力”和“感染性”在本发明中可互换使用。可使用本领域技术人员已知的各种方法确定痘病毒诸如mva的效力，诸如例如确定病毒感染后病毒阳性细胞诸如幼仓鼠肾细胞21(bhk-21)的百分比。优选的测定是例如如实施例中所描述的荧光激活细胞分选仪(facs)测定。[0295]术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所用，受试者通常是哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人)，并且在一些优选实施方案中是人。[0296]根据本发明，“病毒”是指病毒、病毒颗粒和病毒载体。所述术语都可互换使用。这个术语包括野生型病毒、重组和非重组病毒、活病毒和减毒活病毒。[0297]根据本发明，以％(w/v)给出的浓度意指每100ml中的体积以克(g)为单位的重量，例如20％(w/v)意指20g/100ml。以％(v/v)给出的浓度意指每100ml体积中以ml为单位的重量，例如20％(v/v)意指20ml/100ml。[0298]在整个说明书中，除非另有说明，否则物理参数(诸如ph)的值是在 25℃或 25℃左右测量的值。特别地，ph测量可在环境温度下进行。[0299]在本说明书的全文中引用了几个文件。本文引用的文件中的每一个(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的规格、说明书等)，无论是在上文还是在下文，都特此以引用的方式整体并入。在某种程度上，以引用的方式并入的材料与本说明书相矛盾或不一致，本说明书将取代任何此类材料。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类公开。[0300]如果没有另外说明，本发明的实践将采用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组技术的常规技术，所述技术都在本领域的技术范围内。参见例如sambrook,fritsch和maniatis,molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,1989；currentprotocolsinmolecularbiology,ausubelfm,等人,编辑,1987；theseriesmethodsinenzymology(academicpress,inc.)；pcr2:apracticalapproach,macphersonmj,hamsbd,taylorgr,编辑,1995；antibodies:alaboratorymanual,harlow和lane,编辑,1988。[0301]实施例[0302]以下实施例说明本发明，但不应被解释为以任何方式限制权利要求的范围。其仅用于阐明本发明。[0303]实施例1：重组mva的产生[0304]用于稳定性研究的重组mva是如wo2015/136056中所描述的mva-bn-rsv(mva-mbn294b)，所述专利以引用的方式并入本文。mva-mbn294b编码rsv-f(along)蛋白、g(a)和g(b)蛋白，以及n和m2-1蛋白，其中n和m2-1序列由通过fmdv病毒的2a自切割蛋白酶结构域分开的单个开放阅读框编码。使用igr64/65和igr148/149作为抗原的整合位点。基因在痘病毒启动子pr7.5e/l(cochran等人jvirol1985,54:30-37)、prs(chakrabarti等人biotechniques1997,23:1094-1097)、prle1(baur等人jvirol2010,84:8743-8752)和prh5m(wennier等人plosone2013,8:e73511)下表达，如wo2015/136056中所描述。[0305]mva-bn-rsv(mva-mbn294b)是在鸡胚成纤维细胞(cef)中产生的。cef细胞使用技术人员众所周知的，诸如wo2012/010280中所描述的标准方法产生。有几种方法可用于扩增重组mva病毒和纯化原料药(bds)，所述方法也是本领域技术人员众所周知的(例如，如wo2006/052826中所描述)。[0306]mva-bn-rsv(mva-mbn294b)是使用生物反应器工艺在cef细胞中生产的。将细胞接种到具有添加剂(l-谷氨酰胺和泊洛沙姆(poloxamer))和vp-sfm培养基的生物反应器中。将细胞在微载剂上培养6-7天，直到获得所期望的细胞密度以用于感染。[0307]在感染和产生mva-bn-rsv(mva-mbn294b)后，通过搅拌回收细胞并通过筛分去除微载剂。通过超声处理回收细胞并匀质化以裂解细胞并释放产生的病毒颗粒。纯化的病毒通过离心浓缩，最终得到纯化的原料药。将bds储存在-80℃±10℃下。[0308]实施例2：重组mva的制剂[0309]关于重组人血清白蛋白(rhsa)、明胶和精氨酸的制剂f23和f69至f88的单独组成呈现在下表1中。使用随机序列生成器随机化制剂的数量以及由此制备它们的顺序。所有制剂均在10mmtris缓冲液、140mmnacl、10％(w/v)蔗糖和2％(w/v)山梨醇的水性组合物(ph7.6-7.9)中包含mva-bn-rsv(始终来自同一bds批次)。rhsa、明胶和精氨酸的浓度见表1。[0310]表1-1a：含有明胶(3％或1.5％)加0-1％rhsa的制剂。[0311]制剂rhsa(％)*明胶(％)*精氨酸(mm)f23130f770.530f690.2530f850.130f8011.50f760.51.50f750.251.50f870.11.50f8101.50[0312]*％＝w/v[0313]表1-1b：含有0-1％rhsa的制剂。[0314]制剂rhsa(％)*明胶(％)*精氨酸(mm)f82100f730.500f840.2500f710.100f86000[0315]*％＝w/v[0316]表1-1c：含有精氨酸(100mm)加0-1％rhsa的制剂。[0317]制剂rhsa(％)*明胶(％)*精氨酸(mm)f7810100f830.50100f740.250100f880.10100f7200100[0318]*％＝w/v[0319]表1-1d：含有rhsa、明胶和精氨酸的制剂。[0320][0321][0322]*％＝w/v[0323]制剂的制备：将如上述实施例1中产生的mva-bn-rsv的浓缩bds混合到分别含有三倍浓度的rhsa、明胶、精氨酸和组合的制剂缓冲液(10mmtris、140mmnacl、10％(w/v)蔗糖、2％(w/v)山梨醇)中(最终的一倍浓度，如表1所指定)。制剂缓冲液在使用前已使用0.2μm注射器过滤。将配制的mva-bn-rsv装入din2-r玻璃小瓶中(facs样品为0.5mlml，ph样品为0.8ml)。[0324]以下原材料用于制备制剂缓冲液：山梨醇exppheur,bp,nf,jpsi400lex,merck；蔗糖，exppheur,bp,jp,nf,lowendotoxinmerck；重组人白蛋白，albumedix；水解明胶，gelita；l-精氨酸，pharmagrade,usp,sigmaaldrich；氯化钠bioxtrasigma；tris盐酸盐，vwr。mva-mbn294b在10mmtris和140mm氯化钠中(ph7.7±0.4)用作对照。[0325]对于制剂中的每一种，样品已被等分以在 25℃/60％rh(0、3周/19天和5周/33天)的不同时间点使用一式三份进行储存和分析。对于每个时间点，用0.5ml对应的mva-bn-rsv制剂填充小瓶，并在相应温度下储存，以用于此后的稳定性分析。用于ph测量的小瓶装有0.8ml。[0326]在研究开始时，将含有不同制剂且对应于时间零点(t＝0)的小瓶转移到-80摄氏度，而将剩余的小瓶分别转移到 25摄氏度/60％rh(加速储存条件)、 5摄氏度(实时)和-20摄氏度(实时)。[0327]实施例3：病毒滴度的测定[0328]作为稳定性参数，测定了mva-bn-rsv的病毒滴度。病毒滴度的降低表明不稳定性，这通常是在储存期间预期的。[0329]mva-bn-rsv的滴度(infu/ml)通过使用荧光激活细胞分选(facs)的效力(感染性)测定来测定。mva-bn-rsv感染的幼仓鼠肾细胞21(bhk-21)细胞用对痘苗病毒(vacv)具有特异性的荧光染料偶联的抗体进行免疫染色，随后使用配备有用于定量细胞计数的bd流量传感器的facsversetm(bdbioscience)仪器对所述细胞进行量化。[0330]更详细地说，将2.5x105bhk21细胞(来源atcc)于gmem/9％fbs/1.8％ala-gln中接种至12孔板中。第二天用一系列稀释度的所关注的mva病毒原液感染细胞。在37度下孵育1h后添加利福平(在gmem/9％fbs/1.8％ala-gln中100μg/ml)。感染后19±2h收获细胞，并在抗体染色前用bdperm/washtm试剂盒固定和透化。将固定的细胞与抗痘苗fitc(fitzgeraldindustriesinternational,目录号60-v68)一起孵育60-90分钟。然后，使用bdfacsversetm血细胞计数器通过流式细胞术测定病毒阳性细胞的百分比。总细胞计数通过使用bdfacsversetm流量传感器对平行固定的未染色细胞进行测定。病毒滴度(infu/ml)的计算基于病毒阳性细胞的百分比、感染期间使用的病毒稀释度、感染体积和每孔的平均细胞数。为了限制细胞计数的孔对孔波动的影响，通过平均多个孔的细胞计数来确定细胞数。对于计算病毒样本的infu/ml，仅包括含有2％至35％vacv阳性细胞的稀释度。根据以下公式计算每个样品稀释度的infu/ml：[0331][0332]实施例4：rhsa、明胶和精氨酸在 25摄氏度下对病毒滴度的作用[0333]基于从facs测定获得的结果(参见上面的实施例4)，通过线性回归分析计算每种制剂的病毒滴度斜率(参见下表2)。通常，较高的斜率值表示给定制剂中mva-bn-rsv的稳定性增加。[0334]表2[0335][0336]*％＝w/v[0337]病毒滴度斜率数据和表2中示出的相应标准误差在图2至图5中进行了处理。图1中使用的数据是在单独的实验中获得的。[0338]图1显示出含有1％rhsa加3％明胶的制剂f23比含有10mmtris/140mmnacl的制剂(f1)产生显著更平的斜率。[0339]在图2中，f23代表一个参考。如图所示，几种制剂显示出与f23类似的病毒滴度斜率值。值得注意的是，至少制剂f23与f72之间没有差异，f23与f74至f81之间的差异非常小。相反，不含rhsa的制剂(f86)或分别含有浓度为0.1％(f71)和0.25％(f84)的rhsa的制剂不能充分保持mva-bn-rsv的稳定性。[0340]图3说明了从含有10％蔗糖和2％山梨醇的基础组合物(10mmtris/140mmnacl)中仅含有rhsa的制剂获得的数据。如图所示，mva-bn-rsv的稳定性从0.1％至0.5％rhsa是增加的。在0.5％与1.0％rhsa之间没有观察到病毒滴度斜率的显著差异。特别地，在0.5％与1％rhsa之间稳定性没有进一步增加。因此，0.5％的rhsa浓度足以产生可接受的病毒稳定性。[0341]图4显示出如果明胶以1.5％至3％的浓度存在，不同浓度的rhsa会产生类似的病毒滴度斜率值。因此，1.5％至3％明胶能够补偿降低的rhsa浓度。与含有3％明胶和1％rhsa的制剂f23相比，含有1.5％明胶和0.1％rhsa的制剂已经获得了可接受的稳定性。[0342]正如在图3的上下文中所讨论的(见上文)，rhsa的稳定能力取决于其浓度。图5显示出额外存在的100mm精氨酸对所有测试的rhsa浓度产生了类似的病毒滴度斜率。值得注意的是，在含有0.5％或1％rhsa的制剂中没有观察到精氨酸的显著作用。总而言之，图5中示出的结果表明，单独的100mm精氨酸能够产生与高浓度rhsa类似的病毒滴度斜率。[0343]总之，rhsa、明胶和精氨酸具有改善mva-bn-rsv稳定性的潜力。[0344]特别地，已知含有1％rhsa和3％明胶的制剂f23能很好地稳定mva-bn-rsv(图1和图2)。分别含有0.5％rhsa(f73)和0.1％rhsa加1.5％明胶(f87)的制剂显示出稍差的稳定能力，但仍处于与f23类似的等级(图2)。有利地，与f23相比，f73和f87含有较低浓度的rhsa和明胶。[0345]类似地，含有100mm精氨酸而非rhsa和明胶(f72)的制剂似乎在稳定mva-bn-rsv上比f23稍差(图2)。然而，有利的是，f72不含昂贵的rhsa以及明胶。[0346]实施例5：hsa、明胶和精氨酸对ph的作用[0347]作为稳定性的间接参数，测定了制剂的ph。ph的增加可能指向不稳定性。[0348]基于这些结果，使用线性回归分析计算每种制剂的ph斜率(参见下表3)。[0349]表3[0350][0351]*％＝w/v[0352]表3中所示的ph斜率数据和标准误差在图7至图10中进行了处理。图6中使用的数据是在单独的实验中获得的。[0353]图6示出了含有1％rhsa加3％明胶的制剂f23与含有10mmtris/140mmnacl的制剂f1之间的ph稳定性差异。[0354]如图7和图8所示，rhsa对制剂的ph没有稳定作用。相反，浓度为1.5％和3％的明胶增加了ph稳定性，而与rhsa的存在或浓度无关(图9)。类似地，100mm精氨酸增加了制剂的ph稳定性，而与rhsa无关(图10)。[0355]实施例6：rhsa、明胶和精氨酸对冻融循环中病毒滴度的作用[0356]在另一项研究中，将制剂暴露于冻融(f/t)周期(-50摄氏度/环境温度)[0357]对研究开始时(时间零点，t＝0)和5个f/t循环和10个f/t循环后获得的病毒滴度进行线性回归分析(见下表4)。[0358]表4[0359][0360]*％＝w/v；f89：0.25％rhsa、1.5％明胶、100mm精氨酸。[0361]病毒滴度斜率数据和表4中示出的相应标准误差在图11中进行了处理。[0362]图11显示出制剂f75(0.25％rhsa，1.5％明胶)和f72(100mm精氨酸)在f/t循环后具有良好的病毒稳定性。另外，ph不受f/t循环的影响(数据未示出)。[0363]参考文献[0364]alyaghchi，c.，zhang，z.，alusi，g.，lemoine，n.r.，andwang，y.(2015).vacciniavirus，apromisingnewtherapeuticagentforpancreaticcancer.immunotherapy7：1249-1258.[0365]baur，k.，brinkmann，k.，schweneker，m.，patzold，j.，meisinger-henschel，c.，hermann，j.，steigerwald，r.，chaplin，p.，suter，m.，andhausmann，j.(2010).immediate-earlyexpressionofarecombinantantigenbymodifiedvacciniavirusankarabreakstheimmunodominanceofstrongvector-specificb8rantigeninacuteandmemorycd8t-cellresponses.jvirol84：8743-8752.[0366]berhanu，a.，king，d.s.，mosier，s.，jordan，r.，jones，k.f.，hruby，d.e.，andgrosenbach，d.w.(2010).impactofst-246(r)onacam2000smallpoxvaccinereactogenicity，immunogenicity，andprotectiveefficacyinimmunodeficientmice.vaccine29：289-303.[0367]burke，c.j.，hsu，t.a.，andvolkin，d.b.(1999).formulation，stability，anddeliveryofliveattenuatedvaccinesforhumanuse.critrevtherdrugcarriersyst16：1-83.[0368]capelle，ma.h.，babich，l.，vandeventer-troost，j.p.e.，salerno，d.，krijgsman，k.，dirmeier，u.，raaby，b.，andadriaansen，j.(2018).stabilityandsuitabilityforstorageanddistributionofad26.zebov/mva-bn(r)-filoheterologousprime-boostebolavaccine.eurjpharmbiopharm129：215-221.[0369]chakrabarti，s.，sisler，j.r.，andmoss，b.(1997).compact，synthetic，vacciniavirusearly/latepromoterforproteinexpression.biotechniques23：1094-1097.[0370]choi，y.，andchang，j.(2013).viralvectorsforvaccineapplications.clinexpvaccineres2：97-105.[0371]cochran，m.a.，puckett，c.，andmoss，b.(1985).invitromutagenesisofthepromoterregionforavacciniavirusgene：evidencefortandemearlyandlateregulatorysignals.jvirol54：30-37.[0372]filipe，v.，hawe，a.，andjiskoot，w.(2010).criticalevaluationofnanoparticletrackinganalysis(nta)bynanosightforthemeasurementofnanoparticlesandproteinaggregates.pharmres27：796-810.[0373]hekker，a.c.，j.m.，b.，andsmith，l.(1973).astablefreeze-driedsmallpoxvaccinemadeinmonolayerculturesofprimaryrabbitkidneycells.journalofbiologicalstandardization1：21-32.[0374]hodge，j.w.，sabzevari，h.，yafal，a.g.，gritz，l.，lorenz，m.g.，andschlom，j.(1999).atriadofcostimulatorymoleculessynergizetoamplifyt-cellactivation.cancerres59：5800-5807.[0375]just，i.，andfinke，h.(1979).[acontributiontothestabilisationofthemva-vaccine(author’stransl)].zentralblbakterioloriga245：276-282.[0376]leon，a.，david，a.l.，madeline，b.，guianvarc′h，l.，dureau，e.，champion-arnaud，p.，hebben，m.，huss，t.，chatrenet，b.，andschwamborn，k.(2016).theeb66(r)celllineasavaluablecellsubstrateformva-basedvaccinesproduction.vaccine34：5878-5885.mastrangelo，m.j.，eisenlohr，l.c.，gomella，l.，andlattime，e.c.(2000).poxvirusvectors：orphanedandunderappreciated.jclininvest105：1031-1034.[0377]mayr，a.，anddanner，k.(1978).vaccinationagainstpoxdiseasesunderimmunosuppressiveconditions.devbiolstand41：225-234.[0378]mayr，a.，hochstein-mintzel，v.，andstickl，h.(1975).abstammung，eigenschaftenundverwendungdesattenuiertenvaccinia-stammesmva.infektion3：6-14[0379]meyer，h.，sutter，g.，andmayr，a.(1991).mappingofdeletionsinthegenomeofthehighlyattenuatedvacciniavirusmvaandtheirinfluenceonvirulence.jgenvirol72(pt5)：1031-1038.[0380]otagiri，m.，andchuang，v.t.(2009).pharmaceuticallyimportantpre-andposttranslationalmodificationsonhunanse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