用于诱导针对SARS-COV-2的特异性免疫的药物制剂的制作方法

cov)n核衣壳蛋白和/或其免疫原性片段，或编码mers-covn核衣壳蛋白和/或其免疫原性片段的核酸分子，用作疫苗。本发明进一步公开了选自由痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒、α病毒、弹状病毒和疱疹病毒组成的群组的遗传载体用于获得抗mers-cov的疫苗的用途。
12.存在一种解决方案(wo2006071250a2)，其建议使用包括含有sars-cov s蛋白基因及其抗原片段的痘病毒和杆状病毒的载体系统作为抗sars-cov的疫苗。
13.存在一种解决方案(cn1276777c)，其建议使用基于含有sars-cov病毒s蛋白序列的重组人腺病毒血清型5的针对严重急性呼吸综合征的疫苗。
14.系统发育分析表明，与在人类群体中循环的冠状病毒相比，sars-cov-2病毒与在蝙蝠中发现的冠状病毒(bat-sl-covzc45、bat-sl-covzxc21)更接近。例如，发现sars-cov-2的s蛋白与sars-cov s蛋白的同源性不超过75％(zhou p、yang xl、wang xg等人的与可能的蝙蝠起源的新型冠状病毒有关的肺炎暴发(a pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin)。《自然(nature)》。2020；579(7798)：270-273。doi：10.1038/s41586-020-2012-7)。因此，针对由sars-cov引起的疾病的候选疫苗对covid-19无效。
15.到目前为止，还没有用于诱导针对sars-cov-2冠状病毒的特异性免疫的注册产品。据了解，多家制药公司正在开发候选疫苗；它们中的一些基于利用重组腺病毒载体的技术。
16.制药公司cansinobio(中国天津)和北京生物技术研究所(beijing institute of biotechnology)(中国北京)共同开发了一种重组腺病毒5型载体的(其中删除了e1和e3区)候选疫苗，以保护免受covid-19，该疫苗含有优化的sars-cov-2(分离株wuhan-hu-1)s蛋白基因(genbank yp_009724390)和组织纤溶酶原激活剂信号肽基因。该疫苗被制成每0.5ml含有5
×
10
10
个病毒颗粒的液体制剂。该解决方案由要求保护的本发明的作者选择作为原型。
17.这种解决方案的很大的缺点与以下事实有关：由于存在针对人5型腺病毒的预先存在的免疫，疫苗在一些人群中可能无效。
18.例如，根据公布的数据，单次注射该候选疫苗不足以在55岁或以上的人群中诱导高水平的体液应答(zhu fc、guan xh、li yh等人的重组腺病毒5型载体covid-19疫苗在18岁或以上的健康成人中的免疫原性和安全性：随机的、双盲的、安慰剂对照的2期试验(immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored covid-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older：a randomised，double-blind，placebo-controlled，phase 2 trial)”[在印刷前在线发布，2020年7月20日]。《柳叶刀(lancet)》。2020；s0140-6736(20)31605-6。doi：10.1016/s0140-6736(20)31605-6)。然而，covid-19的严重临床病程的最高风险与退休年龄相关。
[0019]
因此，本发明的背景引发了对开发一种药物制剂的迫切需要，该药物制剂将是安全的并且能够在广泛的人群部分中诱导对sars-cov-2冠状病毒的免疫应答。


技术实现要素：

[0020]
要求保护的这组发明的技术目的是创建用于有效诱导对sars-cov-2病毒的免疫应答的药剂。
[0021]
技术结果是创建一种安全且有效的药物制剂，通过使用两种不同的腺病毒载体，确保在不同人群中对sars-cov-2病毒产生体液和细胞介导的免疫应答。此外，技术结果是创建一种药物制剂，确保对sars-cov-2病毒的增强的免疫应答。
[0022]
该技术结果是通过以下实现的：创建一种用于诱导针对严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2的特异性免疫的药物制剂，该药物制剂含有组分1，该组分包括基于重组人腺病毒血清型26的基因组的表达载体形式的药剂，其中e1和e3区被从基因组中删除并且orf6-ad26区被orf6-ad5替换，其中放置了选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3的表达盒，并且该药物制剂还含有组分2，该组分包括基于重组人腺病毒血清型5的基因组的表达载体形式的药剂，其中e1和e3区被从基因组中删除，并放置了选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3的表达盒(变体1)。
[0023]
此外，创建了一种用于诱导针对严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2的特异性免疫的药物制剂，该药物制剂含有组分1，该组分包括基于重组人腺病毒血清型26的基因组的表达载体形式的药剂，其中e1和e3区被从基因组中删除并且orf6-ad26区被orf6-ad5替换，其中放置了选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3的表达盒，并且该药物制剂还含有组分2，该组分包括基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的表达载体形式的药剂，其中e1和e3区被从基因组中删除，其中放置了选自seq id no：4、seq id no：2、seq id no：3的表达盒(变体2)。
[0024]
此外，创建了一种用于诱导针对严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2的特异性免疫的药物制剂，该药物制剂含有组分1，该组分包括基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的表达载体形式的药剂，其中e1和e3区被从基因组中删除，其中放置了选自seq id no：4、seq id no：2、seq id no：3的表达盒，并且该药物制剂还含有组分2，该组分包括基于重组人腺病毒血清型5的基因组的表达载体形式的药剂，其中e1和e3区被从基因组中删除，其中放置了选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3的表达盒(变体3)。
[0025]
其中，每种药物制剂均以液体制剂或冻干(冷冻干燥)制剂的形式存在。
[0026]
此时，用于液体制剂的药物制剂的缓冲溶液含有以下(质量％)：
[0027][0028]
用于冻干(冷冻干燥)制剂的药物制剂的缓冲溶液含有以下(质量％)：
[0029][0030][0031]
组分1和组分2被放置在不同的包装中。
[0032]
每种药物制剂均用于诱导针对严重急性呼吸综合征sars-cov-2病毒的特异性免疫，其中组分1和组分2以有效量顺序使用，其中时间间隔大于一周。
附图说明
[0033]
图1
[0034]
呈现了表达盒的方案，其中：
[0035]
1-启动子
[0036]
2-靶基因，
[0037]
3-聚腺苷酸化信号。
[0038]
图2
[0039]
示出了用所开发的药物制剂进行免疫的有效性评估的结果，如通过在实验动物免疫后第8天由sars-cov-2的s糖蛋白重新刺激的增殖性cd4 淋巴细胞的百分比所估计的。
[0040]
y轴-增殖细胞的数量，％
[0041]
x轴-创建的动物组：
[0042]
1.ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0043]
2.ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0044]
3.ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0045]
4.ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0046]
5.ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0047]
6.ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0048]
7.ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0049]
8.ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0050]
9.ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0051]
10.ad26-null(组分1)、ad5-null(组分2)；
[0052]
11.ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0053]
12.ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0054]
13.ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0055]
14.ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0056]
15.ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0057]
16.ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0058]
17.ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0059]
18.ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0060]
19.ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0061]
20.ad26-null(组分1)、simad25-null(组分2)；
[0062]
21.simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0063]
22.simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0064]
23.simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0065]
24.simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0066]
25.simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0067]
26.simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0068]
27.simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0069]
28.simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0070]
29.simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0071]
30.simad25-null(组分1)、ad5-null(组分2)；
[0072]
31.磷酸盐缓冲盐水。
[0073]
●‑
每只动物的数据
[0074]-针对每个组计算的几何平均值
[0075]
图3
[0076]
示出了用所开发的药物制剂进行免疫的有效性评估的结果，如通过在小鼠免疫后第8天由sars-cov-2病毒的s糖蛋白重新刺激的增殖性cd8 淋巴细胞的百分比所估计的。
[0077]
y轴-增殖细胞的数量，％
[0078]
x轴-创建的动物组：
[0079]
1.ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0080]
2.ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0081]
3.ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0082]
4.ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0083]
5.ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0084]
6.ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0085]
7.ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0086]
8.ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0087]
9.ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0088]
10.ad26-null(组分1)、ad5-null(组分2)；
[0089]
11.ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0090]
12.ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0091]
13.ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0092]
14.ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0093]
15.ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0094]
16.ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0095]
17.ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0096]
18.ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0097]
19.ad26-efl-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0098]
20.ad26-null(组分1)、simad25-null(组分2)；
[0099]
21.simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0100]
22.simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0101]
23.simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0102]
24.simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0103]
25.simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0104]
26.simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0105]
27.simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0106]
28.simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0107]
29.simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0108]
30.simad25-null(组分1)、ad5-null(组分2)；
[0109]
31.磷酸盐缓冲盐水。
[0110]
●‑
示出的每只动物的数据
[0111]-针对每个组计算的几何平均值
[0112]
图4
[0113]
示出了使用致死性sars-cov-2病毒感染模型用所开发的药物制剂和对照组免疫的金色叙利亚仓鼠的存活曲线。
[0114]
y轴-动物存活率，％
[0115]
x轴-用sars-cov-2病毒攻击后的天数。
[0116]
●‑
呈现了用所开发的药物制剂免疫的金色叙利亚仓鼠的存活率，创建的组：
[0117]
1)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0118]
2)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0119]
3)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0120]
4)ad26-cag-s-cov2组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0121]
5)ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0122]
6)ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0123]
7)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0124]
8)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0125]
9)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0126]
11)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0127]
12)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0128]
13)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0129]
14)ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0130]
15)ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0131]
16)ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0132]
17)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0133]
18)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0134]
19)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0135]
21)simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0136]
22)simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0137]
23)simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0138]
24)simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0139]
25)simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0140]
26)simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0141]
27)simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0142]
28)simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0143]
29)simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)，
[0144]
其在所有组中均达到100％。
[0145]
◆‑
阴性对照，组：
[0146]
10)ad26-null(组分1)、ad5-null(组分2)。
[0147]
■‑
阴性对照，组：
[0148]
20)ad26-null(组分1)、simad25-null(组分2)。
[0149]-阴性对照，组：
[0150]
30)simad25-null(组分1)、ad5-null(组分2)。
[0151]
▲‑
阴性对照，组：
[0152]
32.32)-磷酸盐缓冲盐水。
[0153]
图5
[0154]
示出了在用根据变体1的开发的药物制剂免疫的灵长类动物中针对sars-cov2病毒抗原的体液免疫应答的评估结果。
[0155]
y轴-针对sars-cov-2rbd的igg相互滴度。
[0156]
x轴-天数。
[0157]
●‑
用根据变体1(ad26-cmv-s-sars-cov-2；ad5-cmv-s-sars-cov-2)的开发的药物制剂免疫。
[0158]
○‑
安慰剂。
[0159]
图6
[0160]
示出了用所开发的药物制剂进行免疫的有效性评估的结果，如通过在灵长类动物免疫后第8天由sars-cov-2s抗原的rbd片段重新刺激的增殖性cd4 淋巴细胞的百分比所估计的。
[0161]
y轴-增殖细胞的数量，％
[0162]
x轴-天数。
[0163]
чepньiм цветом oбo3haчeha γpyппa жhbothbix，hmmyhh3hpobahhъix pa3paбotahhъim φapmaцebtичecκhm cpeдctbom ∏o bapиahty 1(ad26-cmv-s-sars-cov-2；ad5-cmv-s-sars-cov-2)。
[0164]
黑色用于描述用根据变体1(ad26-cmv-s-sars-cov-2；ad5-cmv-s-sars-cov-2)的开发的药物制剂免疫的动物组。
[0165]
对照组(未接种疫苗的动物)以灰色显示。
[0166]
算术平均值显示为每个数据组的虚线。针对免疫的动物和对照(未接种疫苗)动物
获得的值之间的统计学显著差异用括号和*符号示出(mann-whitney检验，p＜0.05)。
[0167]
图7
[0168]
示出了用所开发的药物制剂进行免疫的有效性评估的结果，如通过在灵长类动物免疫后第8天由sars-cov-2s抗原的rbd片段重新刺激的增殖性cd8 淋巴细胞的百分比所估计的。
[0169]
y轴-增殖细胞的数量，％
[0170]
x轴-天数。
[0171]
黑色用于描述用根据变体1(ad26-cmv-s-sars-cov-2；ad5-cmv-s-sars-cov-2)的开发的药物制剂免疫的动物组。
[0172]
对照组(未接种疫苗的动物)以灰色显示。
[0173]
算术平均值显示为每个数据组的虚线。针对免疫的动物和对照(未接种疫苗)动物获得的值之间的统计学显著差异用括号和符号*，p＜0.05示出(mann-whitney检验)。
[0174]
图8
[0175]
示出了用根据变体1的开发的药物制剂的液体制剂对志愿者进行免疫的有效性评估的结果，如通过由sars-cov-2s抗原重新刺激的增殖性cd8 淋巴细胞的百分比所估计的。
[0176]
y轴-增殖细胞的数量，％
[0177]
x轴-天数。
[0178]
●‑
在第0天用于每个志愿者的符号。
[0179]
■‑
在第14天用于每个志愿者的符号。
[0180]
▲‑
在第28天用于每个志愿者的符号。
[0181]
对于每个数据组，中位值被显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异用括号和符号*，p＜0.05；**，p＜0.01；****，p＜0.001示出(mann-whitney检验)。
[0182]
图9
[0183]
示出了用根据变体1的开发的药物制剂的液体制剂对志愿者进行免疫的有效性评估的结果，如通过由sars-cov-2s抗原重新刺激的增殖性cd4 淋巴细胞的百分比所估计的。
[0184]
y轴-增殖细胞的数量，％
[0185]
x轴-天数。
[0186]
●‑
在第0天用于每个志愿者的符号。
[0187]
■‑
在第14天用于每个志愿者的符号。
[0188]
▲‑
在第28天用于每个志愿者的符号。
[0189]
对于每个数据组，中位值被显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异用括号和符号*，p＜0.05；**，p＜0.01；****，p＜0.001示出(mann-whitney检验)。
[0190]
图10
[0191]
示出了用根据变体1的开发的药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂对志愿者进行免疫的有效性评估的结果，如通过由sars-cov-2s抗原重新刺激的增殖性cd8 淋巴细胞的百分比所估计的。
[0192]
y轴-增殖细胞的数量，％
[0193]
x轴-天数。
[0194]
●‑
在第0天用于每个志愿者的符号。
[0195]
■‑
在第14天用于每个志愿者的符号。
[0196]
▲‑
在第28天用于每个志愿者的符号。
[0197]
对于每个数据组，中位值被显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异用括号和符号*，p＜0.05；**，p＜0.01；****，p＜0.001示出(mann-whitney检验)。
[0198]
图11
[0199]
示出了用根据变体1的开发的药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂对志愿者进行免疫的有效性评估的结果，如通过由sars-cov-2s抗原重新刺激的增殖性cd4 淋巴细胞的百分比所估计的。
[0200]
y轴-增殖细胞的数量，％
[0201]
x轴-天数。
[0202]
●‑
在第0天用于每个志愿者的符号。
[0203]
■‑
在第14天用于每个志愿者的符号。
[0204]
▲‑
在第28天用于每个志愿者的符号。
[0205]
对于每个数据组，中位值被显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异用括号和符号*，p＜0.05；**，p＜0.01；****，p＜0.001示出(mann-whitney检验)。
[0206]
图12
[0207]
示出了在免疫前(第0天)和在研究的第14天和第28天，在它们被sars-cov-2s抗原重新刺激后，来自用根据变体1的开发的药物制剂的液体制剂免疫的志愿者的外周血单核细胞的培养基中的ifnγ浓度的增加(倍)。
[0208]
y轴-ifn-γ浓度的增加(倍)。
[0209]
x轴-天数。
[0210]
●‑
用于显示每个志愿者在第0天获得的值的符号。
[0211]
■‑
用于显示每个志愿者在第14天获得的值的符号。
[0212]
▲‑
用于显示每个志愿者在第28天获得的值的符号。
[0213]
对于每个数据组，中位值被显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异用括号和符号*，p＜0.05；****，p＜0.001示出(mann-whitney检验)。
[0214]
图13
[0215]
示出了在免疫前(第0天)和在研究的第14天和第28天，在它们被sars-cov-2s抗原重新刺激后，来自用根据变体1的开发的药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂免疫的志愿者的外周血单核细胞的培养基中的ifnγ浓度的增加(倍)。
[0216]
y轴-ifn-γ浓度的增加(倍)。
[0217]
x轴-天数。
[0218]
·-用于显示每个志愿者在第0天获得的值的符号。
[0219]
■‑
用于显示每个志愿者在第14天获得的值的符号。
[0220]
▲‑
用于显示每个志愿者在第28天获得的值的符号。
[0221]
点描绘了参与研究的每个志愿者的值。对于每个数据组，中位值被显示为黑线。在第0天、第14天和第28天获得的值之间的统计学显著差异用括号和符号*，p＜0.05；****，p＜0.001示出(mann-whitney检验)。
[0222]
图14
[0223]
示出了在用根据变体1的开发的药物制剂的液体制剂免疫的志愿者中针对sars-cov2病毒抗原的体液免疫应答的评估结果。
[0224]
y轴-针对sars-cov-2s糖蛋白rbd的igg滴度。
[0225]
x轴-天数。
[0226]-每个志愿者的数据。
[0227]
图15
[0228]
示出了在用根据变体1的开发的药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂免疫的志愿者中针对sars-cov2病毒抗原的体液免疫应答的评估结果。
[0229]
y轴-针对sars-cov-2s糖蛋白rbd的igg滴度。
[0230]
x轴-天数。
[0231]-每个志愿者的数据。
具体实施方式
[0232]
为了创建一种安全且有效的用于诱导针对sars-cov-2病毒的特异性免疫应答的药物制剂，选择了使用腺病毒的载体系统。腺病毒载体的特征在于以下许多优点：不能在人类细胞中复制；进入分裂性和非分裂性人类细胞的可能性；诱导细胞介导的和体液免疫应答的能力；以及确保靶抗原高水平表达的潜力。
[0233]
同时，这些载体的临床应用可能受到限制，因为在过去的病史中患有腺病毒感染的一些人可能对腺病毒具有预先存在的免疫应答。研究结果已经表明，针对腺病毒载体的抗体滴度随着年龄而增加，并且在不同的人群部分中有所不同。在这种情况下，在美国40-45％的人口和撒哈拉以南非洲高达90％的人口中报道了人腺病毒血清型5的高血清阳性率水平。(nwanegbo e、vardas e、gao w等人的在冈比亚、南非和美国的成人人群中针对腺病毒血清型5和35的中和抗体的阳性率(prevalence of neutralizing antibodies to adenoviral serotypes 5and 35in the adult populations of the gambia.south africa，and the united states)。《临床和诊断实验室免疫学(clin.diagn.lab.immunol.)》。2004；11(2)：351-357；dudareva m、andrews l、gilbert sc等人的在疫苗载体功效的背景下，肯尼亚儿童针对黑猩猩腺病毒63和人腺病毒5的血清中和抗体的阳性率(prevalence of serum neutralizing antibodies against chimpanzee adenovirus 63and human adenovirus 5 in kenyan children，in the context of vaccine vector efficacy)。《疫苗(vaccine)》。2009；27(27)：3501-3504；zhang s、huang w、zhou x、zhao q、wang q、jia b的健康中国成人中的针对人腺病毒5型和26型和黑猩猩腺病毒68型的中和抗体的血清阳性率(seroprevalence of neutralizing antibodies to human adenoviruses type-5and type-26 and chimpanzee adenovirus type-68in healthy chinese adults)。《医学病毒学杂志(j.med.virol.)》。2013；85(6)：1077-1084)。
[0234]
针对载体的中和抗体导致对转基因的特异性免疫应答的显著降低，并且可能降低免疫的有效性。
[0235]
基于所进行的研究，发明人鉴定了具有此类遗传差异的腺病毒载体血清型，所述遗传差异将排除在顺序免疫期间对针对疫苗抗原的抗原特异性免疫应答的产生的任何影响。
[0236]
选择三种病毒用于进一步研究-人腺病毒血清型26、人腺病毒血清型5和猿猴腺病毒血清型25。在下一阶段，选择通过较高生长动力学区分的病毒克隆。这些克隆用于创建基因工程改造的重组腺病毒载体。
[0237]
因此，所利用的几种类型的遗传载体的组合支持了一系列药物制剂的开发，以便克服与对一些腺病毒(特别是人腺病毒血清型5)的预先存在的人免疫应答相关的困难。
[0238]
由此，可以使用本发明，其中在评估患者的针对药剂配方中包含的腺病毒载体血清型(人腺病毒血清型26、人腺病毒血清型5、猿猴腺病毒血清型25)的免疫之后选择药物制剂的变体。
[0239]
利用基因工程改造技术，将表达盒置于重组腺病毒载体中。这些盒包含疫苗抗原基因和表达调控元件(启动子和聚腺苷酸化信号)。表达盒的示意图在图1上示出。
[0240]
为了最大化诱导免疫反应的有效性，作者要求保护表达盒的多种变体。
[0241]
针对在哺乳动物细胞中表达而优化的sars-cov-2病毒的刺突(s)蛋白被用作所有盒中的抗原。s蛋白是冠状病毒结构蛋白之一。它被暴露在病毒颗粒表面上，并且负责将病毒与ace2(血管紧张素转换酶2)受体结合。已完成研究的结果表明可产生针对s蛋白的病毒中和抗体，因此认为它是用于开发药物制剂的有前景的抗原。
[0242]
表达盒seq id no：1含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号。cmv启动子是巨细胞病毒的立即早期基因的启动子，其确保在多种细胞类型中组成型表达。然而，由cmv启动子控制的靶基因表达强度因不同的细胞类型而变化。此外，在cmv启动子控制下的转基因表达的水平显示随着细胞培养的持续时间的增加而下降。这是由于与dna甲基化相关的基因表达的抑制而发生的[wang w.、jia yl.、li yc.、jing cq.、guo x.、shang xf.、zhao cp.、wang ty的不同启动子、启动子突变和增强子对cho细胞中的重组蛋白表达的影响(impact of different promoters，promoter mutation，and an enhancer on recombinant protein expression in cho cells)。//《科学报告(scientific reports)》-2017-第8卷-第10416页]。
[0243]
表达盒seq id no：2含有cag启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号。cag启动子是一种合成启动子，其含有cmv启动子的早期增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和嵌合内含子(鸡β-肌动蛋白和兔β-珠蛋白)。实验表明，与cmv启动子相比，cag启动子具有更高的转录活性[yang c.q.、li x.y.、li q.、fu s.l.、li h.、guo z.k.、lin j.t.、zhao s.t.的通过使用体内电穿孔来评价三种不同启动子驱动鸡胚发育过程中的基因表达(evaluation of three different promoters driving gene expression in developing chicken embryo by using in vivo electroporation)。//《遗传学和分子研究(genet.mol.res.)》-2014-第13卷-第1270页-第1277页]。
[0244]
表达盒seq id no：3含有ef1启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号。ef1启动子是人类真核生物翻译延伸因子1α(ef-1α)的启动子。该启动子在多种细胞类
型中具有组成型活性[pmid：28557288。ef-1α启动子在转染的cho-k1细胞中维持来自附加型载体的高水平转基因表达(the ef-1α promoter maintains high-level transgene expression episomal vectors in transfected cho-k1 cells)]。ef-1α基因编码延伸因子1α，其是真核细胞中最常见的蛋白之一，并且几乎在所有哺乳动物细胞类型中显示出表达。ef-1α启动子经常在其中病毒启动子不能促进受控基因的表达的细胞中和在其中病毒启动子逐渐被消灭的细胞中显示其活性。
[0245]
表达盒seq id no：4含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号。
[0246]
因此，作为完成的任务的结果，开发了药物制剂的以下3种变体。
[0247]
1.用于诱导针对严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2的特异性免疫的药物制剂，该药物制剂含有组分1，该组分包括基于重组人腺病毒血清型26的基因组的表达载体形式的药剂，其中e1和e3区被从基因组中删除并且orf6-ad26区被orf6-ad5替换，其中放置了选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3的表达盒，并且所述药物制剂还含有组分2，该组分包括基于重组人腺病毒血清型5的基因组的表达载体形式的药剂，其中e1和e3区被从基因组中删除，其中放置了选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3的表达盒。
[0248]
2.用于诱导针对严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2的特异性免疫的药物制剂，该药物制剂含有组分1，该组分包括基于重组人腺病毒血清型26的基因组的表达载体形式的药剂，其中e1和e3区被从基因组中删除并且orf6-ad26区被orf6-ad5替换，其中放置了选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3的表达盒，并且该药物制剂还含有组分2，该组分包括基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的表达载体形式的药剂，其中e1和e3区被从基因组中删除，其中放置了选自seq id no：4、seq id no：2、seq id no：3的表达盒。
[0249]
3.用于诱导针对严重急性呼吸综合征病毒sars-cov-2的特异性免疫的药物制剂，该药物制剂含有组分1，该组分包括基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的表达载体形式的药剂，其中e1和e3区被从基因组中删除，其中放置了选自seq id no：4、seq id no：2、seq id no：3的表达盒，并且该药物制剂还含有组分2，该组分包括基于重组人腺病毒血清型5的基因组的表达载体形式的药剂，其中e1和e3区被从基因组中删除，其中放置了选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3的表达盒。
[0250]
这样，药物制剂的组分可以被放置在不同的包装中。
[0251]
此外，本发明的作者已经开发了药物制剂的液体制剂和冻干(冷冻干燥)制剂。
[0252]
此外，发明人选择了缓冲溶液的此类变体，其允许储存在低于-18℃的温度下冷冻和在 2℃至 8℃的温度范围内冻干(冷冻干燥)的所开发的药物制剂。
[0253]
此外，开发了使用该药物制剂以用于诱导针对严重急性呼吸综合征sars-cov-2病毒的特异性免疫的方法，其中组分1和组分2以有效量顺序使用，其中时间间隔超过一周。
[0254]
本发明的实现方式由以下实例证明：
[0255]
实例1.
[0256]
含有重组人腺病毒血清型26的基因组的表达载体的制备。
[0257]
在第一阶段，提出了质粒构建体pad26-ends的设计。它携带与重组人腺病毒血清型26的基因组同源的两个区域(两个同源臂)和氨苄青霉素抗性基因。同源臂之一是重组人腺病毒血清型26的基因组的起始部分(从左侧反向末端重复序列到e1区)和包含pix蛋白的
病毒基因组序列)。另一个同源臂含有位于orf3 e4区之后直至基因组的末端的核苷酸序列。pad26-ends构建体的合成由莫斯科公司“eurogen”zao(moscow company“eurogen”zao)进行。
[0258]
将从病毒体中分离的人腺病毒血清型26dna与pad26-ends混合。携带具有缺失的e1区的人腺病毒血清型26的基因组的质粒pad26-dle1通过pad26-ends与病毒dna之间的同源重组的过程来获得。
[0259]
然后，在获得的质粒pad26-dle1中，使用标准克隆技术，含有开放阅读框6(orf6-ad26)的序列被来自人腺病毒血清型5的基因组的类似序列替换。该操作的目的是确保人腺病毒血清型26能够在hek293细胞培养物中有效复制。结果，衍生出质粒pad26-dle1-orf6-ad5。
[0260]
此外，使用标准基因工程改造技术，从构建的质粒pad26-dle1-orf6-ad5中删除腺病毒基因组的e3区(基因pviii与u-外显子之间的约3321个碱基对)，以便扩大载体的包装能力。最终，获得了基于人腺病毒血清型26的基因组的重组载体pad26-only-null，其具有人腺病毒血清型5的开放阅读框orf6并具有缺失的e1和e3区。序列seq id no：5被用作人腺病毒血清型26的亲本序列。
[0261]
此外，作者开发了表达盒的多种设计：
[0262]-表达盒seq id no：1含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号；
[0263]-表达盒seq id no：2含有cag启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号；
[0264]-表达盒seq id no：3含有ef1启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号。
[0265]
基于质粒构建体pad26-ends，利用基因工程改造技术，获得了构建体parms-26-cmv-s-cov2、parms-26-cag-s-cov2、parms-26-ef1-s-cov2。后面的构建体分别含有表达盒seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3，以及携带人腺病毒血清型26的基因组的同源臂。
[0266]
接下来，构建体parms-26-cmv-s-cov2、parms-26-cag-s-cov2、parms-26-ef1-s-cov2通过同源臂之间的独特水解位点被线性化；将每个质粒与重组载体pad26-only-null混合。
[0267]
同源重组允许获得质粒pad26-only-cmv-s-cov2、pad26-only-cag-s-cov2、pad26-only-ef1-s-cov2，它们携带重组人腺病毒血清型26的基因组，其具有人腺病毒血清型5的开放阅读框orf6和e1和e3区的缺失，分别具有表达盒seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3。
[0268]
在第四阶段期间，用特异性限制性内切酶水解质粒pad26-only-cmv-s-cov2、pad26-only-cag-s-cov2、pad26-only-ef1-s-cov2以除去载体部分。衍生的dna产物用于转染hek293细胞培养物。
[0269]
因此，获得了含有重组人腺病毒血清型26的基因组的表达载体，其中e1和e3区被删除并且rf6-ad26区被orf6-ad5替换，其中整合了选自seq id no：1、seq idno：2、seq id no：3的表达盒。
[0270]
实例2.
[0271]
基于重组人腺病毒血清型26的基因组生产表达载体形式的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除并且orf6-ad26区被orf6-ad5替换，其中整合了选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3的表达盒。
[0272]
在此阶段，使用阴离子交换和排阻色谱法来纯化在实例1中获得的表达载体。最终的悬浮液在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中或在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中含有腺病毒颗粒。
[0273]
因此，基于重组人腺病毒血清型26的基因组产生了以下免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除并且orf6-ad26区被orf6-ad5替换：
[0274]
1.基于重组人腺病毒血清型26的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除并且orf6-ad26区被orf6-ad5替换，其中含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：1(ad26-cmv-s-cov2)在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中。
[0275]
2.基于重组人腺病毒血清型26的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除并且orf6-ad26区被orf6-ad5替换，其中含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：1(ad26-cmv-s-cov2)在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中。
[0276]
3.基于重组人腺病毒血清型26的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除并且orf6-ad26区被orf6-ad5替换，其中含有cag启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：2(ad26-cag-s-cov2)在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中。
[0277]
4.基于重组人腺病毒血清型26的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除并且orf6-ad26区被orf6-ad5替换，其中含有cag启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：2(ad26-cag-s-cov2)在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中。
[0278]
5.基于重组人腺病毒血清型26的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除并且orf6-ad26区被orf6-ad5替换，其中含有ef1启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：3(ad26-ef1-s-cov2)在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中。
[0279]
6.基于重组人腺病毒血清型26的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除并且orf6-ad26区被orf6-ad5替换，其中含有ef1启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：3(ad26-ef1-s-cov2)在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中。
[0280]
每种呈现的免疫生物制剂均是所开发的药物制剂的变体1和变体2中的组分1。
[0281]
实例3.
[0282]
含有重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的表达载体的制备。
[0283]
在第一阶段，提出了质粒构建体psim25-ends的设计。它携带与猿猴腺病毒血清型25的基因组同源的两个区域(两个同源臂)。同源臂之一是猿猴腺病毒血清型25的基因组的起始部分(从左侧反向末端重复序列到e1区)和从e1区的末端到piva2蛋白的序列。另一个
同源臂含有腺病毒基因组的末端的序列，包含右侧反向末端重复序列。psim25-ends构建体的合成由莫斯科公司“eurogen”zao进行。
[0284]
将从病毒体中分离的猿猴腺病毒血清型25的dna与psim25-ends混合。通过psim25-ends与病毒dna之间的同源重组的过程，获得了质粒psim25-dle1，其携带具有缺失的e1区的猿猴腺病毒血清型25的基因组。
[0285]
此外，使用标准基因工程改造技术，从构建的质粒psim25-dle1中删除腺病毒基因组的e3区(从基因12，5к到基因14.7k的起始部分的约3921个碱基对)，以便扩大载体的包装能力。最终，获得了质粒构建体psim25-null，其编码具有缺失的e1和e3区的猿猴腺病毒血清型25的全基因组。序列seq id no：6被用作猿猴腺病毒血清型25的亲本序列。
[0286]
此外，作者开发了表达盒的多种设计：
[0287]-表达盒seq id no：4含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号；
[0288]-表达盒seq id no：2含有cag启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号；
[0289]-表达盒seq id no：3含有ef1启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号。
[0290]
然后，基于质粒构建体psim25-ends，利用基因工程改造技术，获得构建体parms-sim25-cmv-s-cov2、parms-sim25-cag-s-cov2、parms-sim25-ef1-s-cov2。后面的构建体分别含有表达盒seq id seq id no：4、seq id no：2或seq id no：3，以及携带来自猿猴腺病毒血清型25的基因组的同源臂。接下来，构建体parms-sim25-cmv-s-cov2、parms-sim25-cag-s-cov2、parms-sim25-ef1-s-cov2通过同源臂之间的独特水解位点被线性化；将每个质粒与重组载体psim25-null混合。同源重组允许获得质粒载体psim25-cmv-s-cov2、psim25-cag-s-cov2、psim25-efl-s-cov2，其分别含有重组人腺病毒血清型26(具有猿猴腺病毒血清型25(具有缺失的e1和e3区)的开放阅读框orf6)的完整基因组，以及表达盒seq id no：4、seq id no：2或seq id no：3。
[0291]
在第三阶段期间，用特异性限制性核酸内切酶水解质粒psim25-cmv-s-cov2、psim25-cag-s-cov2、psim25-ef1-s-cov2以除去载体部分。衍生的dna产物用于转染hek293细胞培养物。产生的材料用于生成制备量的重组腺病毒。
[0292]
结果，获得了重组人腺病毒血清型25，其含有sars-cov-2病毒s蛋白基因；simad25-cmv-s-cov2(含有表达盒seq id no：2)、simad25-ef1-s-cov2(含有表达盒seq id no：3)。
[0293]
因此，获得了含有重组猿猴腺病毒25的基因组的表达载体，其中e1和e3区被删除，其中整合了选自seq id no：4、seq id no：2、seq id no：3的表达盒。
[0294]
实例4.
[0295]
基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的表达载体形式的免疫生物制剂的生产，其中e1和e3区被删除，其中整合了选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3的表达盒。
[0296]
在此阶段，使用阴离子交换和排阻色谱法来纯化实例3中获得的表达载体。最终的悬浮液在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中或在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中含有腺病毒颗粒。
[0297]
因此，基于猿猴腺病毒血清型25的基因组生产了下列免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除：
[0298]
1.基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除，其中含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：1(simad25-cmv-s-cov2)在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中。
[0299]
2.基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除，其中含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：1(simad25-cmv-s-cov2)在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中。
[0300]
3.基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除，其中含有cag启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：2(simad25-cag-s-cov2)在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中。
[0301]
4.基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除，其中含有cag启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：2(simad25-cag-s-cov2)在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中。
[0302]
5.基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除，其中含有ef1启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：3(simad25-ef1-s-cov2)在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中。
[0303]
6.基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除，其中含有ef1启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：3(simad25-ef1-s-cov2)在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中。
[0304]
每种呈现的免疫生物制剂均包括所开发的药物制剂的变体1中的组分2和所开发的药物制剂的变体3中的组分1。
[0305]
实例5.
[0306]
含有重组人腺病毒血清型5的基因组的表达载体的制备。
[0307]
在第一阶段，提出了质粒构建体pad5-ends的设计。它携带与重组人腺病毒血清型5的基因组同源的两个区域(两个同源臂)。同源臂之一是重组人腺病毒血清型5的基因组的起始部分(从左侧反向末端重复序列到e1区)和包含pix蛋白的病毒基因组的序列。另一个同源臂含有位于orf3 e4区之后直至基因组的末端的核苷酸序列。pad26-ends构建体的合成由莫斯科公司“eurogen”zao进行。
[0308]
将从病毒体中分离的人腺病毒血清型5dna与pad26-ends混合。通过pad26-ends与病毒dna之间的同源重组的过程，获得了质粒pad26-dle1，其携带具有缺失的e1区的人腺病毒血清型5的基因组。
[0309]
此外，使用标准基因工程改造技术，从构建的质粒pad5-dle1中删除腺病毒基因组的e3区(从基因12.5k的末端到u-外显子的序列的起始部分的2685个碱基对)，以便扩大载体的包装能力。最终，获得了基于人腺病毒血清型5的基因组的缺失了e1和e3区的重组质粒载体pad5-too-null。序列seq id no：7被用作人腺病毒血清型5的亲本序列。
[0310]
此外，作者开发了表达盒的多种设计：
[0311]-表达盒seq id no：1含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号；
[0312]-表达盒seq id no：2含有cag启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号；
[0313]-表达盒seq id no：3含有ef1启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号。
[0314]
然后，基于质粒构建体pad5-ends，利用基因工程改造技术，获得parms-ad5-cmv-s-cov2、parms-ad5-cag-s-cov2、parms-ad5-ef1-s-cov2。后面的构建体分别含有表达盒seq id no：1、seq id no∶2或seq id no：3，以及携带人腺病毒血清型5的基因组的同源臂。
[0315]
接下来，构建体parms-ad5-cmv-s-cov2、parms-ad5-cag-s-cov2、parms-ad5-ef1-s-cov2通过同源臂之间的独特水解位点被线性化；将每个质粒与重组载体pad5-too-null混合。同源重组允许获得质粒pad5-too-cmv-s-cov2、pad5-too-gac-s-cov2、pad5-too-ef1-s-cov2，其分别携带缺失了e1和e3区的重组人腺病毒血清型5的基因组，以及表达盒seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3。
[0316]
在第四阶段期间，用特异性限制性核酸内切酶水解质粒pad5-too-cmv-s-cov2、pad5-too-gac-s-cov2、pad5-too-ef1-s-cov2以除去载体部分。衍生的dna产物用于转染hek293细胞培养物。产生的材料用于积累制备量的重组腺病毒。
[0317]
结果，获得了重组人腺病毒血清型5，其包含sars-cov-2病毒s蛋白基因；ad5-cmv-s-cov2(含有表达盒seq id no：1)、ad5-cag-s-cov2(含有表达盒seq id no：2)、ad5-ef1-s-cov2(含有表达盒seq id no：3)。
[0318]
因此，获得了含有重组人腺病毒5的基因组的表达载体，其中e1和e3区被删除，其中整合了选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3的表达盒。
[0319]
实例6.
[0320]
基于重组人腺病毒血清型5的基因组的表达载体形式的免疫生物制剂的生产，其中e1和e3区被删除，其中整合了选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3的表达盒。
[0321]
在此阶段，使用阴离子交换和排阻色谱法来纯化实例5中获得的表达载体。最终的悬浮液在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中或在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中含有腺病毒颗粒。
[0322]
因此，基于重组人腺病毒血清型5的基因组生产了下列免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除：
[0323]
1.基于重组人腺病毒血清型5的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除，其中含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：1(ad5-cmv-s-cov2)在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中。
[0324]
2.基于重组人腺病毒血清型5的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除，其中含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：1(ad5-cmv-s-cov2)在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中。
[0325]
3.基于重组人腺病毒血清型5的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除，其中含有cag启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：2(ad5-cag-s-cov2)在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中。
[0326]
4.基于重组人腺病毒血清型5的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除，其中含有cag启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：2
(ad5-cag-s-cov2)在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中。
[0327]
5.基于重组人腺病毒血清型5的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除，其中含有ef1启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：3(ad5-ef1-s-cov2)在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中。
[0328]
6.基于重组人腺病毒血清型5的基因组的免疫生物制剂，其中e1和e3区被删除，其中含有ef1启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和聚腺苷酸化信号的表达盒seq id no：3(ad5-ef1-s-cov2)在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中。
[0329]
每种呈现的免疫生物制剂均包括所开发的药物制剂的变体1和变体2中的组分1。
[0330]
每种呈现的免疫生物制剂均包括所开发的药物制剂的变体1和变体3中的组分2。
[0331]
实例7.
[0332]
缓冲溶液的生产
[0333]
根据本发明开发的药物制剂由置于不同小瓶中的两种组分组成。由此，每种组分在缓冲溶液中包括基于具有表达盒的重组腺病毒的免疫生物制剂。
[0334]
发明人已经选择了确保重组病毒颗粒的稳定性的缓冲溶液的组成。溶液包含：
[0335]
1.维持溶液ph值所需的三(羟甲基)氨基甲烷(tris)。
[0336]
2.添加以用于达到必要的离子力和渗透压的氯化钠。
[0337]
3.用作冷冻保护剂的蔗糖。
[0338]
4.需要作为二价阳离子的来源的氯化镁六水合物。
[0339]
5.用作自由基氧化的抑制剂的edta。
[0340]
6.用作表面活性剂的来源的聚山梨醇酯-80。
[0341]
7.用作自由基氧化的抑制剂的95％乙醇。
[0342]
8.用作溶剂的水。
[0343]
本发明的作者开发了缓冲溶液的两种变体：用于药物制剂的液体制剂和用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂。
[0344]
为了估计包含在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液的组成中的物质的浓度，产生了实验组的几个选项(表1)。将药物制剂的组分之一加入到每种生产的缓冲溶液中：
[0345]
1.基于重组人腺病毒血清型26的基因组的免疫生物制剂，带有表达盒，该表达盒含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和腺苷酸化信号，1*10
11
个病毒颗粒。
[0346]
2.基于重组人腺病毒血清型5的基因组的免疫生物制剂，带有表达盒，该表达盒含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和腺苷酸化信号，1*10
11
个病毒颗粒。
[0347]
3.基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的免疫生物制剂，带有表达盒，该表达盒含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和腺苷酸化信号，1*10
11
个病毒颗粒。
[0348]
因此，证实了药物制剂配方中包含的每种腺病毒血清型的稳定性。获得的药物制剂在-18℃和-70℃下储存3个月，然后解冻；并评估重组腺病毒的滴度的变化。
[0349]
表1-药物制剂的液体制剂的实验缓冲溶液的组成
[0350]
表1.
[0351][0352]
所进行的实验的结果表明，在-18℃和-70℃的温度下，重组腺病毒的滴度在重组腺病毒在用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液中储存3个月后没有变化。
[0353]
因此，所开发的用于药物制剂的液体制剂的缓冲溶液确保了所开发的药物制剂的所有组分在以下活性部分(质量％)范围内的稳定性：
[0354]
tris：0.1831质量％至0.3432质量％；
[0355]
氯化钠：0.3313质量％至0.6212质量％；
[0356]
蔗糖：3.7821质量％至7.0915质量％；
[0357]
氯化镁六水合物：0.0154质量％至0.0289质量％；
[0358]
edta：0.0029质量％至0.0054质量％；
[0359]
聚山梨醇酯-80：0.0378质量％至0.0709质量％；
[0360]
乙醇95％：0.0004质量％至0.0007质量％；
[0361]
溶剂：剩余部分。
[0362]
为了估计用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液的组成中包含的物质的浓度，提出了实验组的几个选项(表2)。将药物制剂的组分之一加入到每种生产的缓冲溶液中：
[0363]
1.基于重组人腺病毒血清型26的基因组的免疫生物制剂，带有表达盒，该表达盒含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和腺苷酸化信号，1*10
11
个病毒颗粒。
[0364]
2.基于重组人腺病毒血清型5的基因组的免疫生物制剂，带有表达盒，该表达盒含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和腺苷酸化信号，1*10
11
个病毒颗粒。
[0365]
3.基于重组猿猴腺病毒血清型25的基因组的免疫生物制剂，带有表达盒，该表达盒含有cmv启动子、sars-cov-2病毒s蛋白基因和腺苷酸化信号，1*10
11
个病毒颗粒。
[0366]
因此，证实了药物制剂配方中包含的每种腺病毒血清型的稳定性。获得的药物制剂在 2℃和 8℃下储存3个月，然后解冻；并评估重组腺病毒的滴度的变化。
[0367]
表2-实验缓冲溶液的组成
[0368]
表2.
[0369][0370]
所进行的实验的结果表明，在 2℃和 8℃的温度下，重组腺病毒的滴度在重组腺病毒在用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液中储存3个月后没有变化。
[0371]
因此，所开发的用于药物制剂的冻干(冷冻干燥)制剂的缓冲溶液确保了所开发的药物制剂的所有组分在以下活性部分范围内的稳定性：
[0372]
tris：0.0180质量％至0.0338质量％；
[0373]
氯化钠：0.1044质量％至0.1957质量％；
[0374]
蔗糖：5.4688质量％至10.2539质量％；
[0375]
氯化镁六水合物：0.0015质量％至0.0028质量％；
[0376]
edta：0.0003质量％至0.0005质量％；
[0377]
聚山梨醇酯-80：0.0037质量％至0.0070质量％；
[0378]
溶剂：剩余部分。
[0379]
实例8.
[0380]
基于体液免疫应答的评估来评估用所开发的药物制剂进行免疫的有效性
[0381]
免疫的有效性的关键特征之一是抗体滴度。该实例引出了与在向实验动物施用药物制剂后第21天针对sars-cov-2糖蛋白的抗体滴度的变化有关的数据。
[0382]
在实验中使用了哺乳动物物种-balb/c小鼠，雌性，体重18g。所有动物被分成31组，每组5只动物，以108个病毒颗粒/100μl的剂量向动物肌内注射药物制剂的组分1，并且在两周后以108个病毒颗粒/100μl的剂量注射组分2。因此，形成了以下动物组：
[0383]
1)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0384]
2)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0385]
3)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0386]
4)ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0387]
5)ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0388]
6)ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0389]
7)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0390]
8)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0391]
9)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0392]
10)ad26-null(组分1)、ad5-null(组分2)；
[0393]
11)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0394]
12)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0395]
13)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0396]
14)ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0397]
15)ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0398]
16)ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0399]
17)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0400]
18)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0401]
19)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0402]
20)ad26-null(组分1)、simad25-null(组分2)；
[0403]
21)simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0404]
22)simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0405]
23)simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0406]
24)simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0407]
25)simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0408]
26)simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0409]
27)simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0410]
28)simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0411]
29)simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0412]
30)simad25-null(组分1)、ad5-null(组分2)；
[0413]
31)磷酸盐缓冲盐水。
[0414]
三周后，从动物的尾静脉抽取血液样品，并分离血清。使用酶联免疫吸附测定(elisa)来根据以下方案测量抗体滴度：
[0415]
1)在 4℃下，将蛋白质(s)吸附到96孔elisa板的孔中持续16小时。
[0416]
2)然后，为了防止非特异性结合，用溶解在tpbs中的5％乳以每孔100μl的量“封闭”板。将板在37℃下在摇床中孵育一小时。
[0417]
3)使用2倍稀释法稀释来自免疫小鼠的血清样品。共制备了每份样品的12份稀释液。
[0418]
4)将50μl的每种稀释的血清样品加入到板孔中。
[0419]
5)然后，在37℃下孵育1小时。
[0420]
6)在孵育后，用磷酸盐缓冲液洗涤孔三次。
[0421]
7)然后，加入与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠免疫球蛋白的二级抗体。
[0422]
8)接下来，在37℃下孵育1小时。
[0423]
9)在孵育后，用磷酸盐缓冲液洗涤孔三次。
[0424]
10)然后，加入四甲基联苯胺(tmb)溶液，该溶液用作辣根过氧化物酶的底物，并通过反应被转化为有色化合物。在15分钟后通过加入硫酸停止反应。接下来，使用分光光度
计，在450nm的波长下测量每个孔中溶液的光密度(od)。
[0425]
抗体滴度被测定为溶液的光密度显著高于阴性对照组中的光密度的最后一次稀释。获得的结果(几何平均值)在表3中呈现。
[0426]
表3-小鼠的血清中针对s蛋白的抗体滴度(抗体滴度的几何平均值)
[0427]
表3
[0428]
编号动物组的名称抗体的滴度1ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)33，7792ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)29，4073ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)33，7794ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)38，8025ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)38，8026ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)38，8027ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)33，7798ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)38，8029ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)33，77910ad26-null(组分1)、ad5-null(组分2)011ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)38，80212ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)38，80213ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)33，77914ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)33，77915ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)33，77916ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)33，77917ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)38，80218ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)33，77919ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)33，77920ad26-null(组分1)、simad25-null(组分2)021ad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)33，77922simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)29，40723simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)25，60024simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)33，77925simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)29，40726simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)29，40727simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)33，77928simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)38，80229simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)33，77930simad25-null(组分1)、ad5-null(组分2)031磷酸盐缓冲盐水0
[0429]
如在呈现的数据中所示，药物制剂的所有变体均诱导针对sars-cov-2糖蛋白的体液免疫应答。
[0430]
实例9.
[0431]
与含有一种血清型重组腺病毒的对照产品相比，评价用开发的药物制剂进行免疫的有效性
[0432]
该实验的目的是比较在用含有2种不同血清型重组腺病毒的所开发的药物制剂的不同变体进行免疫之后在小鼠的血清中针对sars-cov-2病毒s蛋白的抗体滴度，与用含有一种血清型重组腺病毒的对照产品免疫两次的小鼠的血清中针对sars-cov-2病毒s蛋白的抗体滴度。
[0433]
在本实验中，使用了balb/c小鼠，18g，35只。
[0434]
以2周的间隔对动物进行免疫：
[0435]
1)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)，5*106v.p.；
[0436]
2)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)，5*106v.p.；
[0437]
3)simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)，5*106v.p.；
[0438]
4)ad26-cmv-s-cov2、ad26-cmv-s-cov2，5*106v.p.；
[0439]
5)ad5-cmv-s-cov2、ad5-cmv-s-cov2，5*106v.p.；
[0440]
6)simad25-cmv-s-cov2、simad25-cmv-s-cov2，5*106v.p.；
[0441]
7)pbs。
[0442]
一个月后，使用酶联免疫吸附测定(elisa)来确定抗sars-cov-2病毒s抗原的抗体滴度。实验结果在下表中呈现。
[0443]
表4-在使用所开发的药物制剂和对照产品免疫小鼠一个月后，小鼠的血液中抗sars-cov-2病毒s抗原的抗体滴度。
[0444]
表4.
[0445]
组名称抗体滴度ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)3，104ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)2，702simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)3104ad26-cmv-s-cov2、ad26-cmv-s-cov2588ad5-cmv-s-cov2、ad5-cmv-s-cov2512simad25-cmv-s-cov2、simad25-cmv-s-cov2446pbs0
[0446]
呈现的数据表明，使用药物制剂对动物进行免疫对免疫应答具有增强作用。与用单一载体类型免疫的组中的抗体滴度的总和相比，在用含有两种载体类型的药物制剂免疫的动物的血清中，通过针对sars-cov-2病毒s抗原的抗体滴度显著更高而证明了这种效应。
[0447]
实例10.
[0448]
基于增殖淋巴细胞的百分比的评估来评估用开发的药物制剂进行免疫的有效性
[0449]
在用冠状病毒s蛋白的重组rbd片段第二次重新刺激细胞后，通过测定体外培养的小鼠外周血中的增殖性cd4 和cd8 淋巴细胞的数量，评估了针对sars-cov2病毒的细胞介导的免疫水平。为了测定增殖性cd4 和cd8 淋巴细胞的数量，使用了用cfse染料对淋巴细胞染色的方法。该方法基于荧光无毒cfse染料容易掺入细胞的能力。用抗原刺激细胞后，淋巴细胞开始增殖，并且来自亲代细胞的染料被均匀地分布在子代细胞之间。标记浓度以及
lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester)，《自然协议(nature protocols)》，2007，no2(9)，2049-2056)用cfse对分离的细胞进行染色，并在抗原(sars-cv-2病毒s糖蛋白)的存在下培养。
[0483]
然后，使用细胞荧光测定法分析细胞。获得的结果显示在图1、2、3、4中。因此，可以得出结论，所开发的药物制剂的所有变体均诱导抗原特异性免疫应答(cd4 和cd8 )。
[0484]
实例11.
[0485]
在实验动物中评估所开发的药物制剂针对covid-19的保护效力
[0486]
使用由sars-cov-2病毒引起的致死性感染的模型，在具有诱导的免疫缺陷的叙利亚金色仓鼠中评估了所开发的药物制剂针对covid-19的保护效力。
[0487]
将动物分成31组(每组8只动物)并免疫两次：使用所开发的药物制剂的组分1(剂量为108个病毒颗粒/动物)和组分2(剂量为108个病毒颗粒/动物)，其中间隔21天。
[0488]
因此，形成了以下动物组：
[0489]
1)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0490]
2)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0491]
3)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0492]
4)ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0493]
5)ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0494]
6)ad26-cag-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0495]
7)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0496]
8)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0497]
9)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0498]
10)ad26-null(组分1)、ad5-null(组分2)；
[0499]
11)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0500]
12)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0501]
13)ad26-cmv-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0502]
14)ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0503]
15)ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)
[0504]
16)ad26-cag-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0505]
17)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-cmv-s-cov2(组分2)；
[0506]
18)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-cag-s-cov2(组分2)；
[0507]
19)ad26-ef1-s-cov2(组分1)、simad25-ef1-s-cov2(组分2)；
[0508]
20)ad26-null(组分1)、simad25-null(组分2)
[0509]
21)simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0510]
22)simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0511]
23)simad25-cmv-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0512]
24)simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0513]
25)simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0514]
26)simad25-cag-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0515]
27)simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cmv-s-cov2(组分2)；
[0516]
28)simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-cag-s-cov2(组分2)；
[0517]
29)simad25-ef1-s-cov2(组分1)、ad5-ef1-s-cov2(组分2)；
[0518]
30)simad25-null(组分1)、ad5-null(组分2)；
[0519]
31)磷酸盐缓冲盐水。
[0520]
从加强免疫后的第7天开始施用免疫抑制剂；在加强免疫后的第14天，以每只动物106tcid50的剂量用sars-cov-2病毒对动物进行鼻内攻击，量为50μl。
[0521]
在实验过程中，对照组中未接种疫苗的动物的体重在攻击后急剧下降(在第10天，平均体重下降为基线体重的32％)。同时，在攻击后的第一天期间，用该药物制剂的所有变体免疫的动物的体重略微下降，然后增加(在第10天，平均体重增加量为基线体重的11％)。
[0522]
图4示出了攻击后动物的存活率。研究结果已经表明，使用该药物制剂的所有变体进行的免疫为100％的具有诱导的免疫缺陷的动物提供了针对由sars-cov-2病毒引起的致死性感染的保护。在未接种疫苗的对照组中，致死率为100％。
[0523]
因此，在具有诱导的免疫缺陷的叙利亚金色仓鼠模型中，表明了用所开发的药物制剂的免疫诱导了保护性免疫应答，这确保了保护100％的动物免受由sars-cov-2病毒引起的致死性感染。
[0524]
实例12：
[0525]
所开发的药物制剂的毒性研究
[0526]
在性成熟的远缘雄性和雌性小鼠中评估了毒性。使用药物制剂变体1(组分1：ad26-cmv-s-cov2、组分2：ad5-cmv-s-cov2)；药物制剂变体2(组分1：ad26-cmv-s-cov2、组分2：simad25-cmv-s-cov2)；药物制剂变体3(组分1：simad25-cmv-s-cov2、组分2：ad5-cmv-s-cov2)进行实验研究。每种药物制剂组分均以递增的剂量进行肌内和静脉内注射：108v.p.；109v.p.；10
10
v.p.；和10
11
v.p.。
[0527]
在实验期间，既没有报告动物死亡，也没有中毒迹象。发现疫苗对实验动物的体重或内脏器官的重量没有影响。小鼠内脏器官的结构没有受到影响，如在施用基于载体的疫苗14天后进行的尸检中所证实的。在所进行的实验研究中，未记录到局部刺激性作用。
[0528]
因此，研究结果表明所开发的药物制剂没有毒性。
[0529]
实例13.
[0530]
根据变体1的开发的药物制剂在灵长类动物中的免疫原性研究
[0531]
本实验研究的目的是评估灵长类动物在其使用所开发的药物制剂免疫后的体液和t细胞介导的免疫的水平。
[0532]
通过在灵长类动物的血液中针对sars-cov-2病毒s蛋白的抗体滴度和病毒中和抗体滴度的升高来评估体液免疫应答的演变。通过测定增殖性cd4 и cd8 t淋巴细胞的数量来评估细胞介导的免疫应答的演变。
[0533]
该研究涉及17只雄性恒河猴，其中体重在2.0kg至2.2kg之间。动物用所开发的药物制剂变体1(组分1：ad26-cmv-s-cov2、组分2：ad5-cmv-s-cov2)接种疫苗。它们按人类治疗剂量10
11
个病毒颗粒/剂量接受组分1，并且21天后按人类治疗剂量10
11
个病毒颗粒/剂量接受组分2。
[0534]
在接种疫苗前(第0天)和接种疫苗后第7天、第14天和第28天，从所有动物采集血
液样品。使用如下elisa技术，在灵长类动物用所开发的药物制剂免疫后，在它们的血清中测量针对sars-cov-2病毒s蛋白rbd的特异性抗体的滴度：
[0535]-将浓度为100ng/孔的sars-cov-2病毒rbd抗原固定在板上；
[0536]-在封闭缓冲液(稀释度1∶50-1∶51200)中进行灵长类动物血清的两倍稀释，在具有固定的rbd抗原的板(条)孔中孵育；
[0537]-在洗涤后，用对猴抗体igg(抗猴igg(γ链)(山羊)抗体-617-101-012，rockland)的fc-片段特异的辣根过氧化物酶标记的偶联物检测形成的ag-ab复合物。
[0538]-在洗涤后，向形成的复合物中加入显色底物；然后，为了终止酶促反应，使用终止试剂。
[0539]
使用分光光度计multiskan fc(thermo)以两种波长记录显色(吸收)：主滤光片-450nm，参考滤光片-620nm。
[0540]
针对sars-cov-2病毒s蛋白的igg抗体滴度被定义为血清稀释度，其中在相同稀释度下，光密度的值比阴性对照(药剂施用前同一灵长类动物的血清)中的光密度的值高两倍。实验结果在图5上示出。
[0541]
这些结果表明，在用开发的药物制剂免疫的所有动物中，抗sars-cov-2病毒的抗体滴度均增加。然后，在注射组分2一周后(在实验的第28天)记录峰值抗体滴度。
[0542]
在中和反应中测定了恒河猴的血液中的病毒中和抗体的水平，该中和反应基于在琼脂覆盖培养基下在为期一天的vero c1008细胞的单层中对由sars-cov-2病毒形成的阴性集落的抑制。中和反应设计如下：恒定剂量的病毒-血清稀释液。
[0543]
该研究包含在接种疫苗前(第0天)和接种疫苗后第7天、第14天和第28天从灵长类动物获得的免疫血清；阳性对照样品(来自人类恢复期患者的血清样品，其中存在针对sars-cov-2病毒的特异性抗体)；阴性对照样本(胎牛血清(fcs)，其中不存在针对sars-cov-2病毒的特异性抗体)；和sars-cov-2病毒的培养物。
[0544]
在中和反应中使用1∶5稀释的血清。基于sars-cov-2病毒(“抗原”)的含病毒悬浮液的工作稀释液在hanks溶液中用2％fcs和抗生素(硫酸链霉素和苄青霉素钠盐)制备，各100u/ml，使用系列十进制稀释。制备的稀释液中sars-cov-2病毒的浓度达到200pfu
·
ml-1
。
[0545]
为了进行该实验，选择工作表面积为25cm2的塑料小瓶用于与vero c1008细胞的每日单层进行中和反应。将等体积的血清和sars-cov-2病毒培养物的混合物在36.5℃和37.5℃之间的温度范围内孵育60分钟，然后以0.5ml的量添加到vero c1008细胞的单层中(初步移除生长培养基)。在抗原 抗体复合物在36.5-37.5℃下吸附在细胞上持续60分钟后，倾析接种物。然后，应用针对sars-cov-2病毒设计的初级琼脂覆盖层，并将单层在36.5℃与37.5℃之间的温度范围内进一步孵育2天。
[0546]
在2天后，用0.1％中性红的溶液对感染的细胞单层进行染色。为此，应用第二层琼脂覆盖层，在36.5-37.5℃下孵育24小时，并计数小瓶中的阴性菌落的数量。测试的血清中的抗体滴度被定义为血清的最高稀释度，其中由sars-cov-2病毒形成的阴性菌落的测定的抑制比阴性对照中至少高50％。
[0547]
研究表明，在实验的第14天，17.6％的动物体内的病毒中和抗体水平高于1∶5，而在实验的第28天，100％的动物体内的病毒中和抗体水平高于该比率。
[0548]
因此，结果表明了施用所开发的药物制剂在灵长类动物中诱导针对sars-cov-2病
毒的体液免疫应答。
[0549]
为了评估t细胞介导的免疫应答，在接种疫苗前(第0天)以及接种疫苗后第7天、第14天和第28天，在聚蔗糖溶液中通过密度梯度离心从灵长类动物的血液中分离单核细胞。
[0550]
该方法基于血细胞的浮动密度梯度。使用在水中的多糖聚蔗糖溶液的密度梯度离心法，可以分离外周血细胞并分离单核细胞级分(mf)，其包含淋巴细胞、单核细胞的亚群、原始造血细胞和含有粒细胞和红细胞的级分。
[0551]
mf的密度低于聚蔗糖的密度，因此在离心后，其在聚蔗糖试剂上方分层。
[0552]
粒细胞和红细胞的密度高于梯度密度，它们穿过梯度并迁移到试管底层(boyum a的从血液和骨髓中分离白细胞(separation of leukocytes from blood and bone marrow)//《斯堪的纳维亚临床与实验室调查杂志(scand.j.clin.lab.investig.)》-1968-第21卷-补刊97第1页-第9页)。当以适当的速度进行离心时，最小的细胞血小板保留在血清中，没有到达“水/聚蔗糖”相的界面。
[0553]
在从灵长类动物的外周血中分离单核细胞级分后，用荧光染料cfse(invivogen，美国)对细胞进行染色，并置于板孔中。
[0554]
在将单核细胞接种在板孔中后，通过向培养基中添加冠状病毒s蛋白的rbd片段(最终蛋白浓度-1μg/ml)，淋巴细胞在体外被重新刺激。没有添加抗原的完整细胞被用作阴性对照。添加抗原72小时后测量增殖细胞的百分比。
[0555]
实验结果显示在图6和7中。
[0556]
实验数据表明，在免疫后第28天，记录了通过用所开发的药物制剂进行免疫而在灵长类动物中诱导的t细胞介导的免疫的最大水平，如通过增殖性cd4 t淋巴细胞和cd8 t淋巴细胞的百分比的平均算术值所评估的。这一结果与在研究的第21天进行的第二次(加强)免疫有关(1.2％相对于未免疫组的0.1％)。在这种情况下，增殖性cd4 和cd8 t淋巴细胞被再次刺激以用于增殖，增加了它们在接种疫苗动物中的存在百分比。
[0557]
总之，可以得出结论，用在测试的剂量和免疫方案中使用的开发的药物制剂对灵长类动物进行免疫诱导了显著的(与未免疫动物的对照组中的值具有统计学上显著的差异)体液免疫应答，其特征在于针对sars-cov-2病毒s蛋白的抗体滴度和中和抗体滴度的增加。它还诱导t细胞介导的免疫，包含cd4 和cd8 淋巴细胞。
[0558]
实例14.
[0559]
通过测定增殖性cd4 和cd8 淋巴细胞的数量来评估细胞介导的免疫水平
[0560]
通过评估接种疫苗后不同时间段志愿者的血液中对sars-cov-2病毒抗原的细胞介导的免疫应答，评估所开发的药物制剂的免疫原性
[0561]
在根据变体1的开发的药物制剂的临床试验中评估了细胞介导的免疫水平。
[0562]
该试验涉及40名志愿者，他们用以下免疫：
[0563]
1)组分1和21天后-使用所开发的药物制剂的液体制剂变体1的组分2(组分1：ad26-cmv-s-cov2、组分2：ad5-cmv-s-cov2)，剂量为1x10
11
个病毒颗粒(20个个体)。
[0564]
2)组分1和21天后-使用所开发的药物制剂变体1的冻干(冷冻干燥)制剂的组分2(组分1：ad26-cmv-s-cov2、组分2：ad5-cmv-s-cov2)，剂量为1x10
11
个病毒颗粒(20个个体)。
[0565]
在第0天(接种疫苗前)、第7天、第14天和第28天从志愿者采集血液样品，并且通过在聚蔗糖溶液中的密度梯度离心法从血液中分离单核细胞。然后，将分离的细胞用荧光染
料cfse(invivogen，美国)染色并接种在板孔中。
[0566]
然后，通过向培养基中加入冠状病毒s蛋白(最终蛋白浓度-1μg/ml)在体外重新刺激淋巴细胞。没有添加抗原的完整细胞被用作阴性对照。在添加抗原72小时后测定增殖细胞的百分比，并对培养基进行取样以用于测量γ-干扰素。
[0567]
为了测定增殖细胞的％，使用针对t淋巴细胞cd3、cd4、cd8(抗cd3 pe-cy7(bd biosciences，克隆sk7)、抗cd4 apc(bd biosciences，克隆sk3)、抗cd8percp-cy5.5(bd biosciences，克隆sk1))的标记物分子的抗体对它们进行染色。使用高效细胞荧光计bd facs ariaiii(bd biosciences，美国)测定细胞混合物中增殖性(具有较低量的cfse染料的细胞)cd4 和cd8 t淋巴细胞。
[0568]
通过从由冠状病毒s抗原重新刺激的细胞的分析中获得的结果中减去在完整细胞的分析中获得的结果，来测定每份样本中增殖细胞的所得百分比。获得的结果显示在图8和9(对于疫苗的液体制剂)和图10和11(对于疫苗的冻干制剂)上。
[0569]
根据制造商的说明，使用“γ-干扰素-ifa-best”(vector-best，俄罗斯)试剂盒，定量测定用冠状病毒s蛋白重新刺激72小时后来自人血液的单核细胞的培养基中γ-干扰素(ifnγ)的浓度。接收的数据显示在图12(对于疫苗的液体制剂)和图13(对于疫苗的冻干制剂)上。
[0570]
所进行的研究的结果表明，通过用药物制剂变体1(基于增殖性cd4 和cd8 t淋巴细胞的中位数目)的两种制剂对志愿者进行顺序免疫所诱导的细胞介导的免疫水平随着自免疫日起经过的天数的增加而增加。
[0571]
在两个组中，在免疫后第28天记录了增殖性cd4 和cd8 t淋巴细胞的峰值。据报道，在研究的第0天和第28天在它们的值之间，增殖性cd4 和cd8 t淋巴细胞的值存在最大的统计学显著差异(p＜0.001)。
[0572]
基于图12和13所示的结果，可以得出结论，通过用药物制剂变体1(根据ifnγ浓度的中位增长)的两种制剂对志愿者进行顺序免疫所诱导的细胞介导的免疫水平随着自免疫日起经过的天数的增加而增加。
[0573]
免疫前(第0天)和接种疫苗后第14天ifnγ浓度增加的值的统计学显著差异为p＜0.001。免疫后第28天发现ifnγ浓度的最大增加。在研究的第0天和第28天之间，ifnγ浓度增加的值的最大统计显著差异(p＜0.001)被报道。
[0574]
因此，基于这些结果，可以得出结论，用所开发的药物制剂进行的免疫能够诱导形成强的抗原特异性细胞介导的抗感染免疫，其通过免疫之前和之后测量的参数中的高水平的统计学显著性来证实。
[0575]
实例15.
[0576]
通过在评估接种疫苗后不同时间段志愿者的血液中针对sars-cov-2病毒抗原的抗体滴度评估所开发的药物制剂的免疫原性
[0577]
该试验涉及40名志愿者，他们用以下免疫：
[0578]
1)组分1和21天后-使用所开发的药物制剂变体1的液体制剂的组分2(组分1：ad26-cmv-s-cov2、组分2：ad5-cmv-s-cov2)，剂量为1x10
11
个病毒颗粒(20个个体)。
[0579]
2)组分1和21天后-使用所开发的药物制剂变体1的冻干(冷冻干燥)制剂的组分2(组分1：ad26-cmv-s-cov2、组分2：ad5-cmv-s-cov2)，剂量为1x10
11
个病毒颗粒(20个个体)。
[0580]
在第7天、第14天和第28天从志愿者中采集血液样品，并从血液中分离血清。
[0581]
使用酶联免疫吸附测定(elisa)和检测试剂盒“sars-cov-2-rbd-ifa-gamaleya”来测量针对sars-cov-2病毒s蛋白rbd的抗体滴度。按照制造商的说明进行测定。
[0582]
在图14上示出了在接受该产品的液体制剂后志愿者的血清中针对sars-cov-2病毒抗原的抗体滴度的所得的测定测量结果。
[0583]
在图15上示出了在接受该产品的冻干(冷冻干燥)制剂后志愿者的血清中针对sars-cov-2病毒抗原的抗体滴度的所得的测定测量结果。
[0584]
如由这些结果所示，使用所开发的药物制剂(作为液体制剂和冻干(冷冻干燥)制剂)对志愿者进行免疫有助于实现强的(与对照未免疫志愿者组的值具有统计学上的显著差异)体液免疫，其特征是针对sars-cov-2病毒s蛋白的抗体滴度增加。因此，体液免疫应答的水平随着自免疫日起经过的天数的增加而增加。
[0585]
因此，如由所提供的实例所证明的，完成了指定的技术目标，特别是开发确保有效诱导针对sars-cov-2病毒的免疫应答的药剂。
[0586]
工业适用性
[0587]
所有提供的实例均证实了确保有效诱导针对sars-cov-2病毒的免疫应答的药物制剂的有效性和工业适用性。