用于治疗癌症的表达IRF调节剂的溶瘤病毒

用于治疗癌症的表达irf调节剂的溶瘤病毒
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年3月6日提交的美国临时专利申请序列号62/985,979的优先权，其全部内容在此通过引用纳入本文。
3.资助信息
4.本发明是在国立卫生研究院授予的基金号ca178766的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
5.序列表
6.本技术包含以ascii格式电子提交的序列表并通过引用其全部内容纳入本文。在2021年3月5日创建的所述ascii副本命名为072396_0849_st25.txt，大小为6,375字节。
1.技术领域
7.本公开提供了表达干扰素调节因子(irf)的调节剂(即irf调节剂)的溶瘤病毒，以及包含其的组合物。本公开进一步提供了使用所述溶瘤病毒和组合物用于治疗癌症和改进对象对免疫调节剂(例如，免疫检查点抑制剂)的反应性的方法。
2.

背景技术：

8.免疫疗法，例如免疫检查点抑制剂(例如抗-pd-1抗体或抗-ctla-4抗体)，已进入癌症治疗的主流。然而，这些疗法作为单一形式的治疗，或甚至相互组合，只能使部分患者亚群受益。越来越多的文献表明，先前对免疫检查点抑制剂有反应的患者之后可能会对免疫检查点抑制剂产生耐药性。
9.基于溶瘤病毒(ov)的癌症疗法是一种免疫疗法形式，它采用可以选择性感染和裂解肿瘤细胞的病毒，而对正常的非肿瘤宿主细胞发挥极小的或没有致病性。除了直接杀伤(溶瘤)能力外，溶瘤病毒还可以诱导宿主的抗肿瘤免疫反应。然而，基于ov的癌症治疗在临床应用中的有效性有限。
10.因此，仍然需要改进癌症患者对免疫疗法(例如免疫检查点抑制剂)的反应性和改进基于ov的癌症疗法的功效的方法和组合物。
3.

技术实现要素：

11.本公开提供了表达干扰素调节因子(irf)的调节剂的溶瘤病毒，以及包含其的组合物。它至少部分地基于以下发现：将表达irf1抑制剂的溶瘤病毒递送至肿瘤抑制了体内肿瘤的生长。
12.一方面，本公开提供了一种溶瘤病毒，其包含编码干扰素调节因子(irf)的调节剂的核酸分子。
13.在某些实施方式中，所述irf是irf1、irf3、irf7或其组合。在某些实施方式中，irf是irf1。在某些实施方式中，调节剂抑制irf的活性。在某些实施方式中，调节剂抑制irf1的活性。
14.在某些实施方式中，调节剂是irf2。在某些实施方式中，irf2是人irf2或小鼠irf2。
15.在某些实施方式中，调节剂减少irf-介导的基因表达。在某些实施方式中，调节剂减少cd274基因的表达。
16.在某些实施方式中，核酸分子是外源核酸分子。在某些实施方式中，核酸分子被整合到溶瘤病毒的基因组中。
17.某些实施方式中，溶瘤病毒是溶瘤痘苗病毒。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒缺乏功能性胸苷激酶(tk)的表达。
18.在另一方面，本公开提供了一种治疗患有癌症的对象的方法，包括给予对象本公开的溶瘤病毒。在某些实施方式中，该对象是人对象。
19.在某些实施方式中，本公开的方法还包括给予对象免疫调节剂。在某些实施方式中，免疫调节剂选自下组：免疫检查点抑制剂、t细胞、树突细胞、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、卡介苗(bcg)及其任意组合。在某些实施方式中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自下组：抗-pd1抗体、抗-pd-l1抗体、抗-ctla-4抗体、抗-btla抗体、抗-tim3抗体、抗-lag-3抗体及其任意组合。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗-pd-l1抗体或抗-ctla-4抗体。
20.在某些实施方式中，癌症是实体瘤。在某些实施方式中，癌症选自下组：腺癌、骨肉瘤、宫颈癌、黑色素瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肾癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、十二指肠癌、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肉瘤及其组合。在某些实施方式中，癌症是黑色素瘤或肾癌。
21.在另一方面，本公开提供了一种改进对象对免疫调节剂的反应性的方法，包括给予对象本公开的溶瘤病毒，其中对象患有癌症。在某些实施方式中，该对象是人对象。
22.在某些实施方式中，对象先前经免疫调节剂治疗过。在某些实施方式中，对象已经对免疫调节剂发展出耐药性。在某些实施方式中，本公开的方法还包括给予对象免疫调节剂。在某些实施方式中，免疫调节剂选自下组：免疫检查点抑制剂、t细胞、树突细胞、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、卡介苗(bcg)及其任意组合。在某些实施方式中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自下组：抗-pd1抗体、抗-pd-l1抗体、抗-ctla-4抗体、抗-btla抗体、抗-tim3抗体、抗-lag-3抗体及其任意组合。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗-pd-l1抗体或抗-ctla-4抗体。
23.在某些实施方式中，癌症是实体瘤。在某些实施方式中，癌症选自下组：腺癌、骨肉瘤、宫颈癌、黑色素瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肾癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、十二指肠癌、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肉瘤及其组合。在某些实施方式中，癌症是黑色素瘤或肾癌。
24.在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本公开的溶瘤病毒。
25.在某些实施方式中，本公开的药物组合物还包含免疫调节剂。在某些实施方式中，免疫调节剂选自下组：免疫检查点抑制剂、t细胞、树突细胞、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、卡介苗(bcg)及其任意组合。在某些实施方式中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自下组：抗-pd1抗体、抗-pd-l1抗体、抗-ctla-4抗体、抗-btla抗体、抗-tim3抗体、抗-lag-3抗体及其任意组合。在某些实施方式中，免疫检查点
抑制剂是抗-pd-l1抗体或抗-ctla-4抗体。
26.在某些实施方式中，本公开的药物组合物还包括药学上可接受的运载体。
27.在某些实施方式中，本公开的药物组合物用于治疗患有癌症的对象或改进对象对免疫调节剂的反应性。
28.在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含本公开的溶瘤病毒或本公开的药物组合物。在某些实施方式中，本公开的试剂盒还包含免疫调节剂。在某些实施方式中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自下组：抗-pd1抗体、抗-pd-l1抗体、抗-ctla-4抗体、抗-btla抗体、抗-tim3抗体、抗-lag-3抗体及其任意组合。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗-pd-l1抗体或抗-ctla-4抗体。
29.在某些实施方式中，该试剂盒还包含用于治疗患有癌症的对象或改进对象对免疫调节剂的反应性的说明书。
30.4.附图简要说明
31.图1a-1d显示了irf2促进肿瘤消退。图1a-1b提供了通过流式细胞术进行的对人mel-285黑色素瘤细胞(图1a)和小鼠b16黑色素瘤细胞(图1b)中pd-l1表达的定量。用表达人irf2的载体或对照载体转染人mel-285黑色素瘤细胞，然后进行ifn-γ刺激。用表达小鼠irf2(mirf2)的载体或对照载体转染小鼠b16黑色素瘤细胞，然后进行ifn-γ刺激。图1c提供了在植入小鼠b16黑色素瘤细胞并接受携带小鼠irf2的溶瘤痘苗病毒(vv-mirf2)或对照痘苗病毒(vv-对照)治疗的小鼠中从第0天到第22天测量的肿瘤体积。图1d提供了在注射了renca肿瘤，随后进行了vv-mirf2或vv-对照治疗的balb/c小鼠中测量的肿瘤体积。
5.具体实施方式
32.本公开的非限制性实施方式由本说明书和实施例描述。出于公开的清楚目的而非限制的目的，详细描述分为以下小节：
33.5.1.定义；
34.5.2.表达irf调节剂的溶瘤病毒；
35.5.3.药物组合物；
36.5.4.治疗方法；和
37.5.5.试剂盒。
38.5.1.定义
39.本说明书中使用的术语通常在本领域、本公开的上下文中以及在使用各术语的特定上下文中具有其普通含义。下文或说明书中的其他地方讨论了某些术语，以在描述所公开的组合物和方法以及如何制备和使用它们时附加指导。
40.词语“一”或“一个”当与“包含”在权利要求和说明书中联用时，可表示“一”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或超过一个”的意思一致。此外，术语“具有”、“包括”、“包含”和“含有”可互换使用，且本领域技术人员知晓其为开放式术语。
41.术语“约”或“大约”表示就某特定数值而言在本领域普遍技术人员能够确定的可接受的误差范围内，这将部分取决于该数值的测量或确定方式，例如，测量体系的极限。例如，根据本领域的实践，“约”可以指3个或超过3个标准偏差。或者，“约”可以是指给定值的至多20％、优选至多10％、更优选至多5％、更优选至多1％的范围。或者，尤其对于生物系统
或过程而言，该术语可表示某值的一定数量级内，优选5倍内，更优选2倍内。
42.如本文所用的术语“调节剂”作为“干扰素调节因子(irf)的调节剂”或可互换的“irf调节剂”是指可以调节irf活性的分子。在某些实施方式中，调节剂可以抑制irf的活性。在某些实施方式中，调节剂是蛋白质分子(例如，irf2)。
43.如本文所用，术语“溶瘤病毒”或“ov”是指能够在体外或体内选择性地在癌细胞中复制并减缓癌细胞生长或诱导癌细胞死亡，同时不影响正常细胞或对正常细胞的影响极小的病毒。在某些实施方式中，溶瘤病毒在肿瘤内传播而不对非癌组织造成损伤。在某些实施方式中，与在癌细胞中相比，溶瘤病毒在非癌细胞中不复制或以降低的速度复制。非限制性示例性溶瘤病毒包括柯萨奇病毒(coxsackieviruse)、马拉巴病毒(maraba viruse)(弹状病毒(rhabdovirus))、细小病毒、塞内卡谷病毒(senecavalleyviruses)、水疱性口炎病毒(vsv)、新城疫病毒(ndv)、逆转录病毒、呼肠孤病毒(reoviruse)、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒(hsv)、仙台病毒、痘苗病毒(vv)和腺病毒及其变体。
44.如本文所用，术语“痘苗病毒”或“vv”是指属于痘病毒家族的一种包膜dna病毒。在某些实施方式中，vv包含约200kb的线性双链dna基因组。痘苗病毒毒株的非限制性例子包括：西储(wr)株、塔什干株(tashkent strain)、李斯特株(lister strain)(也称为埃尔斯特里(elstree))、dryvax株(也称为惠氏株(wyeth strain))、ihd-j株和ihd-w株、布莱顿株(brighton strain)、安卡拉株(ankara strain)、改良型痘苗安卡拉(modified vaccinia ankara)(mva)株、大连株(dairen strain)(例如，大连i型株(di))、lipv株、李斯特克隆16m8(lc16m8)株、lc16mo株、livp株、wr 65-16株、康诺特株(connaught strain)、纽约市卫生部门(nycbh)株、em63株、acam2000
tm
株、cv-1株、巴黎株(paris strain)、哥本哈根(copenhagen)(cop)株、伯尔尼株(bem strain)和天坛(tian tan)(vtt)株的毒株、衍生或修饰形式。
45.如本文所用，术语“突变”是指氨基酸序列或核苷酸序列中的突变。在某些实施方式中，氨基酸序列中的突变可以是氨基酸序列中至少一个氨基酸的取代(替换)、插入(添加)或缺失(截短)。在某些实施方式中，核苷酸序列中的突变可以是核苷酸序列的至少一个核苷酸的取代(替换)、插入(添加)或缺失(截短)。
46.本文的“个体”或“对象”是脊椎动物，例如，人或非人动物，例如，哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，人、非人灵长类、农场动物、竞技动物、啮齿动物和宠物。非人动物对象的非限制性示例包括啮齿动物，例如，小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔；狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；和非人灵长类动物，例如，猩猩和猴子。
47.如本文所用，术语“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官正常功能的任何病症或紊乱。
48.如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指足以在体外或体内减少、抑制或消除肿瘤细胞生长的溶瘤病毒组合物的量。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长的减少、抑制或消除可能是坏死、细胞凋亡或免疫反应的结果。治疗有效或有效的溶瘤病毒组合物的量可以根据情况而变化。可在一次或多次给药中给予有效量。
49.如本文所用和如本领域中所理解的，“治疗”是一种用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。对于本主题的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于减轻或改善一种或多种迹象或症状、减轻疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、预防疾病、延迟或减缓
疾病进展，和/或疾病状态的改善或缓解。该降低可以是并发症或症状的严重程度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。“治疗”也可以指与不接受治疗的期望存活相比延长生存期。
50.5.2.表达irf调节剂的熔瘤病毒
51.本公开提供了表达irf的调节剂(即irf调节剂)的溶瘤病毒。在某些实施方式中，溶瘤病毒包括编码irf调节剂的核酸分子。在某些实施方式中，核酸分子是外源核酸分子。在某些实施方式中，核酸分子被整合到溶瘤病毒的基因组中。编码irf调节剂的核酸分子可以是dna分子、rna分子或cdna分子，以符合它所整合进的溶瘤病毒基因组的核酸。
52.干扰素调节因子(irf)是转录因子家族，其可以调节参与先天性和适应性免疫的蛋白质的表达。当前哺乳动物中有九种irf，包括irf1、irf2、irf3、irf4(即pip、icsat)、irf5、irf6、irf7、irf8(即icsbp)和irf9(即p48、isgf3γ)。本公开发现，在体内给予抑制肿瘤中irf活性的试剂(例如，irf调节剂)可以促进抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤的生长。本公开还发现抑制irf的试剂可以降低程序性死亡配体1(pd-l1)的表达。pd-l1在生理免疫稳态中发挥重要作用，并参与癌细胞所采用的免疫逃避活性。减少pd-l1的表达可以改进宿主的抗肿瘤免疫反应，增加癌细胞对免疫疗法的反应性。
53.在某些实施方式中，本公开的溶瘤病毒表达调节irf活性的irf调节剂，其中irf抑制抗肿瘤免疫。可以抑制抗肿瘤免疫的irf包括但不限于irf1、irf3和irf7。
54.在某些实施方式中，irf调节剂(例如irf2)抑制(例如减少或消除)irf1、irf3、irf7或其组合的活性。在某些实施方式中，irf调节剂抑制irf1的活性。在某些实施方式中，irf调节剂抑制(例如，减少或消除)由irf1调节的基因的表达。在某些实施方式中，irf调节剂抑制、减少和/或消除cd274基因(编码pd-l1)、itga8基因、enah基因、pmp22基因、sulf2基因、ciita基因、pgf基因、col4a1基因、erap1基因、nnmt基因、axl基因或其组合的表达。在某些实施方式中，irf调节剂抑制、减少和/或消除由cd274基因、itga8基因、enah基因、pmp22基因、sulf2基因、ciita基因、pgf基因、col4a1基因、erap1基因、nnmt基因、axl基因或其组合表达的蛋白质的水平。在某些实施方式中，irf调节剂减少cd274基因的表达。在某些实施方式中，irf调节剂减少pd-l1蛋白的水平。
55.在某些实施方式中，irf调节剂是irf2。irf2可以竞争性抑制irf介导的(例如，irf1介导的)干扰素α和β的转录激活，以及使用irf进行转录激活的其他基因。在某些实施方式中，本公开的溶瘤病毒包含编码irf2的核酸分子。
56.在某些实施方式中，该核酸分子编码人irf2。在某些实施方式中，该核酸分子编码具有seq id no：1所示的氨基酸序列的人irf2。
57.mpvermrmrpwleeqinsntipglkwlnkekkifqipwmhaarhgwdvekdaplfrnwaihtgkhqpgvdkpdpktwkanfrcamnslpdieevkdksikkgnnafrvyrmlplserpskkgkkpktekedkvkhikqepvesslglsngvsdlspeyavltstiknevdstvniivvgqshldsnienqeivtnppdicqvvevttesdeqpvsmselyplqispvssyaesettdsvpsdeesaegrphwrkrniegkqylsnmgtrgsyllpgmasfvtsnkpdlqvtikeesnpvpynsswppfqdlplsssmtpassssrpdretrasvikktsditqarvksc[seq id no：1]
[0058]
在某些实施方式中，人irf2与genbank/ncbi数据库登录号np_002190中列出的氨基酸序列具有至少约80％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％(，例如约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约
92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％)的同源性或同一性。在某些实施方式中，该核酸分子编码人irf2，其相对于genbank/ncbi数据库登录号np_002190中列出的氨基酸序列可以包含不显著改变人irf2的功能或活性的取代(例如，保守取代)、插入或缺失。
[0059]
在某些实施方式中，该核酸分子编码小鼠irf2。在某些实施方式中，该核酸分子编码具有seq id no.：2所示的氨基酸序列的小鼠irf2。
[0060]
mpvermrmrpwleeqinsntipglkwlnkekkifqipwmhaarhgwdvekdaplfrnwaihtgkhqpgidkpdpktwkanfrcamnslpdieevkdrsikkgnnafrvyrmlplserpskkgkkpktekeervkhikqepvesslglsngvsgfspeyavltsaiknevdstvniivvgqshldsniedqeivtnppdicqvvevttesddqpvsmselyplqispvssyaesettdsvasdeenaegrphwrkrsiegkqylsnmgtrntyllpsmatfvtsnkpdlqvtikedscpmpynsswppftdlplpapvtptpsssrpdretrasvikktsditqarv[seq id no：2]
[0061]
在某些实施方式中，小鼠irf2与genbank/ncbi数据库登录号np_032417中列出的氨基酸序列具有至少约80％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％(例如约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％)的同源性或同一性。在某些实施方式中，该核酸分子编码小鼠irf2，其相对于genbank/ncbi数据库登录号np_032417中列出的氨基酸序列可以包含不显著改变小鼠irf2的功能或活性的取代(例如，保守取代)、插入或缺失。
[0062]
在某些实施方式中，保守性氨基酸取代即氨基酸残基被同组内的氨基酸取代。例如，氨基酸可按电荷分类：带正电荷的氨基酸，包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸，中性电荷氨基酸，包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。氨基酸也可以按极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性)、丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸，色氨酸和缬氨酸。某些实施方式中，特定序列内不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个残基被改变。示例性的保守氨基酸取代如下表1所示。
[0063]
表1
[0064]
原残基示例性保守氨基酸取代ala(a)val；leu；ilearg(r)lys；gln；asnasn(n)gln；his；asp，lys；argasp(d)glu；asncys(c)ser；aiagin(q)asn；gluglu(e)asp；glngly(g)alahis(h)asn；gln；lys；arg
ile(i)leu；val；met；ala；pheleu(l)ile；val；met；ala；phelys(k)arg；gln；asnmet(m)leu；phe；ilephe(f)trp；leu；val；ile；ala；tyrpro(p)alaser(s)thrthr(t)val；sertrp(w)tyr；phetyr(y)trp；phe；thr；serval(v)ile；leu；met；phe；ala
[0065]
如本文所用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分比。考虑到用于两个序列的最佳比对而需要引入的缺口数和每个缺口的长度，两条序列之间的相同性百分比与序列共有相同位置的数目相关(即，同源性％＝相同位置数/总位置数x100)。序列的比较和两个序列之间百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成。
[0066]
两条氨基酸序列之间的同源性百分比也可以使用e.meyers和w.miller(comput.appl.biosci.，4：11-17(1988))的算法确定，该算法已被并入align程序(版本2.0)，使用pam120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的同源性百分比可以使用needleman和wunsch(j.mol.biol.(48)：444-453(1970))算法确定，该算法已经纳入到gcg软件包(可在www.gcg.com获得)中的gap程序中，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
[0067]
任何合适的溶瘤病毒都可以与本公开的主题使用。可以与本公开主题使用的溶瘤病毒的非限制性例子包括柯萨奇病毒(coxsackieviruse)、粘液瘤病毒(myxoma viruses)、马拉巴病毒(maraba viruse)(弹状病毒(rhabdovirus))、细小病毒、塞内卡谷病毒(seneca valley viruses)、水疱性口炎病毒(vsv)、新城疫病毒(ndv)、逆转录病毒、呼肠孤病毒(reoviruse)、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒(hsv)、仙台病毒、痘苗病毒(vv)和腺病毒及其变体。
[0068]
某些实施方式中，本文公开的溶瘤病毒是溶瘤痘苗病毒。任何合适的痘苗病毒毒株都可以与本公开的主题使用。可以与本公开的主题使用的痘苗病毒毒株的非限制性例子包括：西储(wr)株、塔什干株(tashkent strain)、李斯特株(lister strain)(也称为埃尔斯特里(elstree))、dryvax株(也称为惠氏株(wyeth strain))、ihd-j株和ihd-w株、布莱顿株(brighton strain)、安卡拉株(ankara strain)、改良型痘苗安卡拉(modified vaccinia ankara)(mva)株、大连株(dairen strain)(例如，大连i型株(di))、lipv株、李斯特克隆16m8(lc16m8)株、lc16mo株、livp株、wr 65-16株、康诺特株(connaught strain)、纽约市卫生部门(nycbh)株、em63株、acam2000
tm
株、cv-1株、巴黎株(paris strain)、哥本哈根(copenhagen)(cop)株、伯尔尼株(bern strain)、ussr株、埃文斯株(evans strain)和天坛(tian tan)(vtt)株的毒株、衍生或修饰形式。
[0069]
可以与本公开一起使用的溶瘤病毒的其他非限制性例子包括：塔利兰帕(talimogene laherparepvec)(t-vec)(安进公司(amgen))、tbi-1401(hf10)(宝生物公司
(takara))、hsv1716(virtu生物技术公司(virtu biologics))、adv/hsv-tk(默克公司(merk))、load703(洛肯(loken))、cg0070(cold genesys)、coload1(enadenotucirev)(psioxus)、oncos-102(targovax oy)、dnx-2401(dnatrix)、vcn-01(vcn)、ad-magea3和mg1-magea3(turnstone)、nsc-crad-生存素-pk7(西北(northwestern))、ad5-ycd/muttksr39rep-hil12(亨利福特(henry ford))、ad5-ycd/muttksr39rep-adp(亨利福特(henry ford))、mv-nis(mayo)、mv-nis(阿肯萨斯大学(university of arkansas))、gl-onc1(genelux)、迪-派替莫近(pexastimogene devacirepvec)(pexa-vec)(詹纳克斯(jennerx))、reolysin(溶瘤生物科技(oncolytics))、cva21(cavatak)(viralytics)、h-1pv(parvoryx)(oryx gmbh)、pvsripo(杜克(duke))、vvdd(nih)、tbio-6517(turnstone)和vsv-hifnbeta-nis(mayo)。
[0070]
在某些实施方式中，编码irf调节剂的核酸分子被整合到溶瘤病毒的基因组中，其中核酸分子的表达操作性地连接至在溶瘤病毒感染的细胞中具有活性或可激活的启动子，例如，溶瘤病毒的启动子。如本文所用，“操作性地连接”是指启动子相对于核酸基因座处于正确的功能位置和/或取向以控制该基因座的转录起始和/或表达。
[0071]
某些实施方式中，启动子是痘苗病毒(vaccinia virus)启动子。某些实施方式中，痘苗病毒启动子是合成的痘苗启动子。可以与本公开的主题使用的痘苗启动子的非限制性例子包括pse/l和p7.5。
[0072]
在某些实施方式中，溶瘤病毒被减毒以削弱病毒致病性并改进溶瘤病毒治疗用途的安全性。某些实施方式中，溶瘤病毒是天然减毒毒株。在某些实施方式中，溶瘤病毒被遗传修饰以削弱病毒致病性。
[0073]
在某些实施方式中，本文公开的溶瘤痘苗病毒缺乏功能性胸苷激酶(tk)的表达。某些实施方式中，本文公开的溶瘤痘苗病毒是tk阴性的。tk由j2r基因(也称为tk基因)编码，是嘧啶脱氧核糖核苷酸合成的补救途径的一部分。缺乏功能性tk的表达可以改进溶瘤痘苗病毒的安全性。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒包含j2r基因的突变。在某些实施方式中，j2r基因的突变可以是j2r基因核苷酸序列的至少一个核苷酸的缺失、取代和/或插入。在某些实施方式中，j2r基因的突变包括核酸分子插入到j2r基因的基因座中。
[0074]
在某些实施方式中，基因(例如，j2r基因)中的突变是失活突变，其中该基因的表达显著降低，或者由该基因编码的产物(例如，tk)变得无功能，或其发挥功能的能力显著下降。在某些实施方式中，编码irf调节剂(例如，irf2)的核酸分子被整合到j2r基因座中。
[0075]
除了改变tk表达外，其他方法也可用于产生减毒溶瘤病毒并改进溶瘤病毒治疗用途的安全性。减毒溶瘤病毒的非限制性例子包括vsp病毒(guo等，cancer res.2005年11月1日；65(21)：9991-8)、修饰型痘苗安卡拉(modified vaccinia ankara)(mva)(harrop等，clin cancer res.2006年6月1日；12(11pt1)：3416-24)、vvdd、双病毒基因缺失(tk-和vgf-)的痘苗病毒，如公开于mccart等，cancer res 2001；61：8751-7和acam200(osbome等，vaccine.2007年12月17日；25(52)：8807-32)，其内容通过整体引用纳入本文。
[0076]
5.3药物组合物
[0077]
本公开提供了包含含有编码irf调节剂的核酸分子的溶瘤病毒(例如，第5.2节中公开的溶瘤病毒)的药物组合物。在某些实施方式中，该药物组合物包含有效量的本公开的溶瘤病毒。
[0078]
在某些实施方式中，药物组合物包含约103个噬斑形成单位(pfu)至约10
13
pfu的溶瘤病毒的量。在某些实施方式中，药物组合物包含溶瘤病毒的量为：约105pfu至约10
13
pfu、约105pfu至约10
12
pfu、约105pfu至约10
11
pfu、约105pfu至约10
10
pfu、约105pfu至约109pfu、约105pfu至约108pfu、约105pfu至约107pfu、约105pfu至约106pfu、约106pfu至约10
13
pfu、约106pfu至约10
12
pfu、约106pfu至约10
11
pfu、约106pfu至约10
10
pfu、约106pfu至约109pfu、约106pfu至约108pfu、约106pfu至约107pfu、约107pfu至约10
13
pfu、约107pfu至约10
12
pfu、约107pfu至约10
11
pfu、约107pfu至约10
10
pfu、约107pfu至约109pfu、约107pfu至约108pfu、约108pfu至约10
13
pfu、约108pfu至约10
12
pfu、约108pfu至约10
11
pfu、约108pfu至约10
10
pfu、约108pfu至约109pfu或约109pfu至约10
10
pfu。在某些实施方式中，药物组合物包含溶瘤病毒的量为至少约1
×
105pfu、至少约5
×
105pfu、至少约1
×
106pfu、至少约5
×
106pfu、至少约1
×
107pfu、至少约5
×
107pfu、至少约1
×
108pfu、至少约5
×
108pfu、至少约1
×
109pfu、至少约5
×
109pfu、至少约1
×
10
10
pfu、至少约5
×
10
10
pfu、至少约1
×
10
11
pfu、至少约5
×
10
11
pfu、至少约1
×
10
12
pfu、至少约5
×
10
12
pfu或至少约1
×
10
13
pfu。在某些实施方式中，药物组合物包含溶瘤病毒的量为约1
×
105pfu、约5
×
105pfu、约1
×
106pfu、约5
×
106pfu、约1
×
107pfu、约5
×
107pfu、约1
×
108pfu、约5
×
108pfu、约1
×
109pfu、约5
×
109pfu、约1
×
10
10
pfu、约5
×
10
10
pfu、约1
×
10
11
pfu、约5
×
10
11
pfu、约1
×
10
12
pfu、约5
×
10
12
pfu或约1
×
10
13
pfu。在某些实施方式中，药物组合物包含溶瘤病毒的量为约1
×
106pfu至约3
×
109pfu。在某些实施方式中，药物组合物包含溶瘤病毒的量为约108pfu至约109pfu、约109pfu至约10
10
pfu或约106pfu至约107pfu。在某些实施方式中，药物组合物包含溶瘤病毒的量为约2.5
×
106pfu、约1
×
107pfu、约5
×
108pfu、约6
×
108pfu、约2
×
109、约2.5
×
109或约3
×
109pfu。
[0079]
在某些实施方式中，药物组合物可以制备成溶液、在甘油、液体聚乙二醇中的分散体，以及它们在油、固体剂型中的任何组合，作为可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合。
[0080]
在某些实施方式中，本文所述的药物组合物进一步包含药学上可接受的运载体，例如，赋形剂。在某些实施方式中，药学上可接受的运载体包括不干扰活性成分的生物活性的有效性和/或对被给予它的患者无毒的任何运载体。合适的药物运载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液，水，乳液，例如油/水乳液，各种类型的润湿剂和无菌溶液。药学上可接受的运载体的其他非限制性示例包括含有溶瘤病毒的植入元件、凝胶、生物可吸收的基质材料，和任何其它合适载剂、递送或分配装置或材料。
[0081]
在某些实施方式中，药学上可接受的运载体可以是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性例子可包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。作为缓冲剂，碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡萄糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、醋酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙等钙盐及其组合。
[0082]
在某些实施方式中，本文公开的溶瘤病毒可以在合适的宿主细胞中繁殖，从宿主细胞中分离出来，并在促进病毒的稳定性和完整性的条件下储存，从而使感染性随时间的推移损失最小。在某些实施方式中，可以通过冷冻或干燥，例如通过冻干来储存本文公开的溶瘤病毒。在某些实施方式中，在给药前，可以重建储存的溶瘤病毒(如果为储存而干燥)并
将其稀释在药学上可接受的运载体中，以便给药。
[0083]
在某些实施方式中，本文公开的药物组合物可进一步包含免疫调节剂(例如，第5.4节中公开的免疫调节剂)。
[0084]
在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf的调节剂的核酸分子的溶瘤病毒(例如，第5.2节中公开的溶瘤病毒)和药学上可接受的运载体。在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf的调节剂的核酸分子的溶瘤病毒(例如，第5.2节中公开的溶瘤病毒)和赋形剂和/或缓冲剂。
[0085]
在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf调节剂(其抑制irf(例如irf1)的活性)的核酸分子的溶瘤病毒和药学上可接受的运载体。在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf调节剂(其抑制irf(例如irf1)的活性)的核酸分子的溶瘤病毒和赋形剂和/或缓冲剂。
[0086]
在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒和药学上可接受的运载体。在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒和赋形剂和/或缓冲剂。
[0087]
在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf的调节剂的核酸分子的溶瘤病毒(例如第5.2节中公开的溶瘤病毒)和免疫调节剂(例如第5.2节中公开的免疫调节剂)。在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf调节剂(其抑制irf(例如irf1)的活性)的核酸分子的溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂。
[0088]
在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒和选自下组的免疫检查点抑制剂：抗-pd1抗体、抗-pd-l1抗体、抗-ctla-4抗体、抗-btla抗体、抗-tim3抗体、抗-lag-3抗体及其任意组合。在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒和抗-pd-l1抗体。在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒和抗-ctla-4抗体。
[0089]
在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf的调节剂的核酸分子的溶瘤病毒(例如第5.2节中公开的溶瘤病毒)和免疫调节剂(例如第5.4节中公开的免疫调节剂)和药学上可接受的运载体。在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒、免疫检查点抑制剂和药学上可接受的运载体。在某些实施方式中，本文公开的药物组合物包含含有编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒、抗-pd-l1抗体或抗-ctla-4抗体和药学上可接受的运载体。
[0090]
5.4治疗方法
[0091]
本公开提供了治疗患有癌症的对象的方法。在某些实施方式中，该方法包括给予对象包含编码irf调节剂的核酸分子的溶瘤病毒(例如第5.2节中公开的溶瘤病毒)，或包含所述溶瘤病毒的药物组合物(例如第5.3节中公开的药物组合物)。在某些实施方式中，该方法包括给予对象包含编码irf调节剂(其抑制irf(例如irf1)的活性)的核酸分子的溶瘤病毒，或包含所述溶瘤病毒的药物组合物。在某些实施方式中，该方法包括给予对象包含编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒，或包含所述溶瘤病毒的组合物。
[0092]
在某些实施方式中，本文公开的方法减少聚集的癌细胞团、降低癌细胞生长速度、减少癌细胞增殖、减少肿瘤块、减少肿瘤体积、减少肿瘤重量、减少肿瘤细胞增殖、减少肿瘤
生长速度和/或减少对象的肿瘤转移。
[0093]
本文公开的方法可用于治疗任何合适的癌症。可通过本文公开的方法治疗的癌症的非限制性例子包括：腺癌、骨肉瘤、宫颈癌、黑色素瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肾癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、十二指肠癌、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肉瘤及其组合。
[0094]
在某些实施方式中，本文公开的方法可用于治疗实体瘤。在某些实施方式中，本文公开的方法可用于治疗黑色素瘤。在某些实施方式中，本文公开的方法可用于治疗肾癌。
[0095]
在某些实施方式中，该对象是人对象。在某些实施方式中，对象为非人对象，例如但不限于非灵长类动物、狗、猫、马、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、家禽、牛、山羊或绵羊。
[0096]
在某些实施方式中，本文公开的方法包括以约103至约10
13
pfu的量给予对象溶瘤病毒。在某些实施方式中，本文公开的方法包括以约105至约10
13
pfu的量给予对象溶瘤病毒。在某些实施方式中，本文公开的方法包括给予对象溶瘤病毒，所述溶瘤病毒的量为约105pfu至约10
13
pfu、约105pfu至约10
12
pfu、约105pfu至约10
11
pfu、约105pfu至约10
10
pfu、约105pfu至约109pfu、约105pfu至约108pfu、约105pfu至约107pfu、约105pfu至约106pfu、约106pfu至约10
13
pfu、约106pfu至约10
12
pfu、约106pfu至约10
11
pfu、约106pfu至约10
10
pfu、约106pfu至约109pfu、约106pfu至约108pfu、约106pfu至约107pfu、约107pfu至约10
13
pfu、约107pfu至约10
12
pfu、约107pfu至约10
11
pfu、约107pfu至约10
10
pfu、约107pfu至约109pfu、约107pfu至约108pfu、约108pfu至约10
13
pfu、约108pfu至约10
12
pfu、约108pfu至约10
11
pfu、约108pfu至约10
10
pfu、约108pfu至约109pfu。在某些实施方式中，本文公开的方法包括给予对象溶瘤病毒，所述溶瘤病毒的量为至少约1
×
105pfu、至少约5
×
105pfu、至少约1
×
106pfu、至少约5
×
106pfu、至少约1
×
107pfu、至少约5
×
107pfu、至少约1
×
108pfu、至少约5
×
108pfu、至少约1
×
109pfu、至少约5
×
109pfu、至少约1
×
10
10
pfu、至少约5
×
10
10
pfu、至少约1
×
10
11
pfu、至少约5
×
10
11
pfu、至少约1
×
10
12
pfu、至少约5
×
10
12
pfu或至少约1
×
10
13
pfu。在某些实施方式中，本文公开的方法包括给予对象溶瘤病毒，所述溶瘤病毒的量为约1
×
105pfu、约5
×
105pfu、约1
×
106pfu、约5
×
106pfu、约1
×
107pfu、约5
×
107pfu、约1
×
108pfu、约5
×
108pfu、约1
×
109pfu、约5
×
109pfu、约1
×
10
10
pfu、约5
×
10
10
pfu、约1
×
10
11
pfu、约5
×
10
11
pfu、约1
×
10
12
pfu、约5
×
10
12
pfu或约1
×
10
13
pfu。在某些实施方式中，本文公开的方法包括给予对象溶瘤病毒，所述溶瘤病毒的量为约1
×
106pfu至约3
×
109pfu、约108pfu至约109pfu、约109pfu至约10
10
pfu或约106pfu至约107pfu。在某些实施方式中，本文公开的方法包括给予对象溶瘤病毒，所述溶瘤病毒的量为约2.5
×
106pfu、约1
×
107pfu、约5
×
108pfu、约6
×
108pfu、约2
×
109pfu、约2.5
×
109pfu或约3
×
109pfu。
[0097]
在某些实施方式中，本文公开的方法包括以单一剂量或多剂量给予对象溶瘤病毒。在某些实施方式中，在以多剂量给予对象溶瘤病毒的情况下，可以依次给予，例如以每天、每周或每月的间隔给予，或根据对象的特定需要。
[0098]
任何合适的给药方法都可以与本公开的主题使用，用于给予对象溶瘤病毒。某些实施方式中，本文公开的溶瘤病毒是全身给予的。在某些实施方式中，本文公开的溶瘤病毒可以直接给予肿瘤部位，例如，通过直接瘤内注射。
[0099]
例如，但并不限于此，给药途径可以是吸入、鼻内、静脉内、动脉内、鞘内、瘤内、腹膜内、肌肉内、皮下、局部、皮内、局部区域、口服，或其组合。在某些实施方式中，本文公开的
溶瘤病毒从植入对象体内的源给予对象。某些实施方式中，通过在选定的时间段内连续输注，将本文公开的溶瘤病毒给予对象。
[0100]
本公开进一步提供了改进对象对免疫调节剂反应性的方法。在某些实施方式中，该方法包括给予对象包含含有编码irf调节剂的核酸分子的溶瘤病毒(例如第5.2节中公开的溶瘤病毒)，或包含所述溶瘤病毒的药物组合物(例如第5.3节中公开的药物组合物)。在某些实施方式中，对象先前经免疫调节剂治疗过。在某些实施方式中，对象已经对免疫调节剂发展出耐药性。在某些实施方式中，该方法进一步包括将免疫调节剂与本文公开的溶瘤病毒组合给予对象。
[0101]
本公开还提供了治疗患有癌症的对象的方法，包括给予对象包含编码irf调节剂的核酸分子的溶瘤病毒(例如第5.2节中公开的溶瘤病毒)与免疫调节剂组合。
[0102]
任何合适的抗癌的靶向免疫系统组分的免疫调节剂都可以与本公开的方法使用。免疫调节剂的非限制性例子包括免疫检查点抑制剂、t细胞、树突细胞、治疗性抗体(例如，抗-cd33抗体、抗-cd11b抗体)、癌症疫苗、细胞因子(例如，il-12、gm-csf、il-2、ifnβ、ifn-γ、mip-1、mcp-1、il-8)、卡介苗(bcg)及其任何组合。在某些实施方式中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自：抗-pd1抗体、抗-pd-l1抗体、抗-ctla-4抗体、抗-btla抗体、抗-tim3抗体、抗-lag-3抗体及其任意组合。抗-pd1抗体的非限制性例子包括派姆单抗(keytruda)、纳武单抗(opdivo)、切米普单抗(cemiplimab)(libtayo)及其组合。抗-pd-l1抗体的非限制性例子包括阿特珠单抗(tecentriq)、阿维鲁单抗(bavencio)、度伐鲁单抗(imfinzi)及其组合。抗-ctla-4抗体的非限制性例子包括伊匹单抗(yervoy)。在某些实施方式中，免疫调节剂是抗-pd-l1抗体。在某些实施方式中，免疫调节剂是抗-ctla-4抗体。
[0103]
在某些实施方式中，该方法包括给予对象包含含有编码irf调节剂(其抑制irf(例如irf1)的活性)的核酸分子的溶瘤病毒与免疫调节剂组合。在某些实施方式中，该方法包括给予对象包含含有编码irf调节剂(其抑制irf(例如irf1)的活性)的核酸分子的溶瘤病毒与免疫检查点抑制组合。在某些实施方式中，该方法包括给予对象包含编码irf调节剂(其抑制irf(例如irf1)的活性)的核酸分子的溶瘤病毒与抗-pd-l1抗体或抗-ctla-4抗体组合。
[0104]
在某些实施方式中，该方法包括给予对象包含编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒与免疫调节剂组合。在某些实施方式中，该方法包括给予对象包含编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒与免疫检查点抑制剂组合。在某些实施方式中，该方法包括给予对象包含编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒与抗-pd-l1抗体或抗-ctla-4抗体组合。在某些实施方式中，溶瘤病毒和免疫调节剂可以作为治疗方案的部分给予对象。在某些实施方式中，溶瘤病毒和免疫调节剂可以同时给予对象。在某些实施方式中，溶瘤病毒和免疫调节剂可以同时给予。在某些实施方式中，可以按任何顺序依次给予溶瘤病毒和免疫调节剂(例如，在给予免疫调节剂之前给予对象溶瘤病毒；或在给予免疫调节剂之后给予对象溶瘤病毒)或在不同的时间点(例如，溶瘤病毒和免疫调节剂在同一天但在不同的时间给予对象；溶瘤病毒和免疫调节剂在同一周但在不同的日给予对象)。
[0105]
5.5试剂盒
[0106]
本发明还提供了试剂盒，其包含含有编码irf调节剂的核酸分子的溶瘤病毒(例如
第5.2节中公开的溶瘤病毒)，或包含所述溶瘤病毒的药物组合物(例如第5.3节中公开的药物组合物)。在某些实施方式中，该试剂盒包含含有编码irf调节剂(其抑制irf(例如irf1)的活性)的核酸分子的溶瘤病毒，或包含所述溶瘤病毒的药物组合物。在某些实施方式中，该试剂盒包含含有编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒，或包含所述溶瘤病毒的组合物。
[0107]
在某些实施方式中，本文公开的试剂盒可以进一步包含说明书。在某些实施方式中，说明书包括对溶瘤病毒的描述，以及任选地对试剂盒中包含的其他组分的描述。在某些实施方式中，该试剂盒包含用于治疗患有癌症的对象或改进对象对免疫调节剂的反应性的说明书。在某些实施方式中，说明书还包括对给药方法的描述，包括确定给予修饰的病毒的对象的适当状态、适当的剂量和/或适当给药方法的方法。在某些实施方式中，说明书还可包括在治疗期间监测对象的指导。
[0108]
在某些实施方式中，本文公开的试剂盒包括用于给予对象溶瘤病毒或药物组合物的装置。本文公开的试剂盒可包含本领域所知任何用于给予药物和药物组合物的合适的装置。举例而非限制，合适的装置包括：皮下注射用针头、静脉内针头、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如点眼药器。某些实施方式中，将全身递送(例如通过静脉内注射)的溶瘤病毒可与皮下注射用针头和注射器一同包含在试剂盒中。
[0109]
在某些实施方式中，本文公开的试剂盒可进一步包含免疫调节剂(例如，第5.4节中公开的免疫调节剂)。在某些实施方式中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自：抗-pd1抗体、抗-pd-l1抗体、抗-ctla-4抗体、抗-btla抗体、抗-tim3抗体、抗-lag-3抗体及其任意组合。在某些实施方式中，免疫调节剂是抗-pd-l1抗体。在某些实施方式中，免疫调节剂是抗-ctla-4抗体。
[0110]
在某些实施方式中，该试剂盒包含含有编码irf调节剂的核酸分子的溶瘤病毒(例如，第5.2节中公开的溶瘤病毒)和免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，该试剂盒包含含有编码irf调节剂(其抑制irf(例如irf1)的活性)的核酸分子的溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，该试剂盒包含含有编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂。在某些实施方式中，该试剂盒包含含有编码irf2的核酸分子的溶瘤病毒和抗-pd-l1抗体或抗-ctla-4抗体。
[0111]
6.实施例
[0112]
通过参考以下实施例将更好地理解本文公开的主题，所述实施例作为本公开主题的示例而非限制提供。
[0113]
.实施例1：靶向irf：靶向irf2的表达抑制肿瘤生长
[0114]
能够影响对象对免疫疗法反应性的一个因素是肿瘤微环境中的干扰素(ifn)反应。与免疫细胞相比，ifn可能在肿瘤细胞中发挥相反的作用。本公开的主题通过调节调控ifn反应的分子(如irf)来利用这种相反的ifn反应，以改进免疫疗法的疗效和反应性。创建了许多基于crispr/cas9的基因编辑的同系(syngeneic)肿瘤细胞，以建立特定irf(例如irf1、irf3和irf7)的肿瘤内在功能(tumor intrinsic function)可能是肿瘤细胞与宿主非肿瘤免疫细胞的相反ifn反应的基础。本公开还发现，使用溶瘤病毒靶向肿瘤微环境中的irf具有治疗益处。本公开进一步开发了基于irf2的转录调节剂，利用工程改造的溶瘤病毒在肿瘤微环境中调节irf功能。本公开发现，表达irf2的溶瘤痘苗病毒在临床前小鼠模型中成功减少了肿瘤负荷。
[0115]
已经发现irf2在原发性人癌症中是缺乏的，如肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌和其他癌症。本公开发现，irf2可以抑制irf1介导的基因诱导(如pd-l1)，并可以促进抗肿瘤免疫反应。
[0116]
癌细胞中irf2的体外过表达
[0117]
为了评估irf2是否能调节irf1活性和irf1介导的基因表达，在人黑色素瘤细胞(mel-285)和小鼠黑色素瘤细胞(b16)中过表达了irf2。创建了携带人irf2基因或鼠irf2基因的病毒载体。分别用携带irf2的载体或携带irf2的载体转染mel-285和b16肿瘤细胞。然后用ifnγ刺激这些转染的细胞。通过流式细胞仪评估mel-285和b16肿瘤细胞中pd-l1蛋白的表达。在人mel-285和小鼠b16黑色素瘤细胞中过表达irf2，减少了两种细胞系中pd-l1的表达(图1a-1b)。
[0118]
在临床前小鼠模型中体内给予表达mirf2的溶瘤痘苗病毒
[0119]
通过将小鼠irf2基因插入溶瘤痘苗病毒的病毒基因组的tk基因座，创建了表达irf-2的溶瘤痘苗病毒。该插入破坏了tk基因。在两种不同的小鼠肿瘤模型中，进行了体内研究以检查表达mirf2的溶瘤病毒的抗肿瘤活性。小鼠在第0天被植入b16肿瘤细胞(黑色素瘤肿瘤细胞)。植入后10天，荷瘤小鼠被瘤内注射pbs、2.5
×
106pfu胸苷激酶缺陷(tk-)痘苗病毒(vv-对照)或2.5
×
106pfu表达mirf2的溶瘤痘苗病毒(vv-mirf2)。肿瘤体积被监测和测量了22天。与pbs和vv-对照相比，瘤内注射表达mirf2的溶瘤痘苗病毒显著抑制了b16肿瘤的生长(图1c)。
[0120]
在临床前renca肿瘤(肾癌)小鼠模型中，进一步评估了表达mirf2的溶瘤病毒的抗肿瘤活性。通过皮下注射在balb/c小鼠中建立renca肿瘤。荷瘤小鼠被瘤内注射pbs、1
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107pfu胸苷激酶缺陷(tk-)痘苗病毒(vv-对照)或1
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107pfu表达mirf2的溶瘤痘苗病毒(vv-mirf2)。监测并测量肿瘤生长。与pbs对照相比，瘤内注射vv-mirf2显著抑制了renca肿瘤的生长(图1d)。此外，vv-对照的抗肿瘤效果通过mirf-2表达显著改进。
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pd-l1/pd-1轴是一个必需的免疫检查点，可被癌细胞利用来逃避免疫检测和消除。已经做出努力来阻断包括pd-l1和pd-1在内的免疫检查点蛋白，以克服癌症逃避免疫反应的能力，并刺激宿主防御癌症的免疫反应。本公开证明，irf2可以有效地下调癌细胞中pd-l1蛋白的表达，从而抑制pd-l1/pd-1通路的激活。本公开进一步提出，在癌细胞中过表达irf2可以改进宿主攻击癌细胞的免疫反应，并可以提高癌细胞对免疫疗法(如免疫检查点抑制剂(如抗pd-l1抗体))的反应性。
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溶瘤病毒可以选择性地感染和裂解肿瘤细胞，并可以诱导抗肿瘤免疫反应。本公开证明，将免疫调节基因irf2纳入溶瘤病毒的基因组中显著改进溶瘤病毒的抗肿瘤活性。这些结果表明，irf蛋白在肿瘤微环境中具有多方面的功能。
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尽管已经详细描述了本公开主题和一些其优势，但是应当理解，可对本文进行各种变化、取代和改变而不背离本公开的精神和范围。而且，本技术的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成和方法的特定实施方式。本领域的普通技术人应从本公开主题的内容中容易地理解，目前存在或今后将要开发的、执行与本文相应实施方式基本相同的功能或实现基本相同的结果的过程、机器、制造、物质组成或方法可以根据本公开主题来使用。因此，所附权利要求旨在将这样的过程、机器、制造、物质组成或方法包括在其
范围内。
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