一种用于胸水来源类器官的培养基及培养方法与流程

1.本发明涉及类器官培养技术领域，具体涉及一种用于胸水来源类器官的培养基及培养方法。


背景技术：

2.近年来，随着干细胞技术的发展，hans clever等建立了一种体外3d培养干细胞获得组织类器官的方法。类器官是指将具有干细胞潜能的细胞进行3d培养，从而形成相应器官的类似组织，并具有自我更新和自我组织的能力，维持了其来源组织的部分生理结构和功能的特点。过去的几十年，肿瘤研究的主要模型仍然是2d肿瘤细胞系，但肿瘤细胞系并不具有肿瘤细胞的异质性和肿瘤细胞在体内的特征，且在实验室的长期传代下，发生了基因组学的变异，无法反应对应肿瘤的真实情况；另外一种重要模型是人体肿瘤组织小鼠移植模型（pdx），虽然pdx模型能够很大程度地维持肿瘤的异质性，而且目前已经应用于肿瘤的药物测试和筛选，但是该模型仍然面临着包括移植成功率低、肿瘤样本量大和实验周期较长在内的诸多问题。与之相比，肿瘤类器官模型不仅在体外培养条件下能够无限增殖，很好地保持了肿瘤异质性，适用于大规模的药物筛选。
3.目前类器官培养主要集中在肿瘤手术/穿刺样本，胸水来源的类器官报道较少，而胸水样本获取在临床上较手术/穿刺样本更容易，为更有利于获取构建肿瘤类器官的样本来源。有文献报道利用微孔芯片去除胸水标本中的成纤维细胞，并在培养基中添加胸水上清扩增胸水来源类器官的方法，该方法可提高胸水来源类器官的成功率，但该方法要求微孔芯片的孔径为7-20μm，技术要求高，成本高，不适合规模化应用，且该孔板只能保留富集大尺寸的肿瘤细胞或细胞团，类器官损失较多。胸水上清的保存时间较短，不易保存，只能用于自身来源的标本类器官的培养，不具有通用性。此外，也有向普通体外培养基中加入部分细胞因子，但是这样不能很好的体现体内环境，影响检测数据的准确性和真实性，且普通培养基体外培养的成功率低，培养周期相对较长，增加了培养成本，延后了后续的药敏实验进程。总之，成本高、培养成功率低、耗时长，仍是目前胸水来源类器官用于体外抗肿瘤药物评价临床实用性低的重要原因。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种用于胸水来源类器官的培养基及培养方法，以解决现有成本高、培养成功率低、耗时长的问题。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种用于胸水来源类器官的培养基，包括：胸水上清冻干粉、基础培养基和添加剂；添加剂包括以下终浓度的组分：人重组蛋白r-spondin 1，20-40ng/ml；头蛋白，80-120ng/ml；人重组蛋白rhegf，6-10ng/ml；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.8-1.2mm；l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，1
×
；青链双抗，1
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；n2添加剂，1
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；b27添加剂，1
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；n-乙酰-l-半胱氨酸，0.08-0.1mm；alk抑制剂a83-01，0.3-0.6μm；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑，0.2-0.4μm；烟酰胺，3-6mm。
6.本发明的有益效果为：胸水中含有大量的成纤维细胞和肿瘤细胞，在构建肿瘤细胞类器官的过程中，成纤维细胞和肿瘤细胞同时混杂生长，并且成纤维细胞通常比肿瘤细胞生长的更快，并且能抑制肿瘤细胞的生长，进而培养的肿瘤细胞类器官生长速度较慢，产量较低。
7.将胸水上清冻干制成冻干粉，首先，制备后的胸水上清冻干粉可随用随取，保存时间长，批次稳定，能定量，可用于不同的样品类器官的培养，且不用使用额外的耗材，大大节约了成本；其次，胸水中含有促细胞附着物质如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、ⅲ型胶原、血清扩展因子等，在培养基中加入了胸水上清冻干粉后，可促进成纤维细胞的贴壁，利于成纤维细胞和类器官的分离，达到去除成纤维细胞的目的；最后，培养基中的胸水上清冻干粉、基础培养基和添加剂能够共同促进类器官的生长，去除杂质，提高肿瘤细胞占比，进而有效的提高胸水来源肿瘤类器官的构建效率和成功率。
8.基础培养基为常用基础培养基，如advanced dmem/f-12培养基。
9.进一步地，胸水上清冻干粉在培养基中的浓度为100-200μg/ml。
10.进一步地，胸水上清冻干粉在培养基中的浓度为200μg/ml。
11.进一步地，添加剂包括以下终浓度的组分：人重组蛋白r-spondin 1，30ng/ml；头蛋白，100ng/ml；人重组蛋白rhegf，8ng/ml；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1mm；l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，1
×
；青链双抗，1
×
；n2添加剂，1
×
；b27添加剂，1
×
；n-乙酰-l-半胱氨酸，0.09mm；alk抑制剂a83-01，0.5μm；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑，0.3μm；烟酰胺，5mm。
12.采用上述培养基培养胸水来源类器官的方法，包括以下步骤：（1）收取癌性胸水，离心，将胸水上清制成冻干粉，将沉淀清洗；（2）将胸水上清冻干粉溶解，制成胸水上清冻干粉溶液，然后加入培养器皿中进行包被，包被结束后吸出胸水上清冻干粉溶液；（3）将步骤（1）中的沉淀重悬后加入包被后的培养器皿中进行培养，培养结束后将未贴壁溶液离心，得沉淀；（4）将步骤（3）中的沉淀重悬，然后和基质胶混合，凝固，最后加入上述培养基进行培养。
13.本发明的有益效果为：将癌性胸水离心，上清液制成胸水上清冻干粉，沉淀为细胞沉淀。胸水上清冻干粉保存时间长，在使用时，需将胸水上清冻干粉溶解形成胸水上清冻干粉溶液，用胸水上清冻干粉溶液对培养器皿包被后，可更快更好地促进成纤维细胞的贴壁，因类器官体积较大，贴壁慢，这样操作，可使得成纤维细胞先贴壁，而此时类器官还未贴壁，这样吸取未贴壁的溶液，离心，就可以将成纤维细胞和类器官分开，达到去除成纤维细胞的目的。本发明采用这种方法可有效解决直接沉降法去除成纤维细胞方法时成纤维细胞贴壁慢，贴壁细胞少，去除不干净的难题。
14.当将未贴壁溶液离心，所得沉淀重悬后与基质胶混合，待凝固后再加入上述含有胸水上清冻干粉的培养基进行培养，可制得胸水来源肿瘤类器官。
15.本发明培养过程中不需要添加胰蛋白酶和胶原酶去除杂细胞，不会对类器官生长产生干扰；本发明培养过程也不需要采用微孔芯片，其成本低，操作简单，能有效去除成纤维细胞，也解决了现有制备方法中类器官损失多的问题。
16.总之，本发明培养过程中加入胸水上清冻干粉，使类器官生长状态得到改善，且很好的解决了胸水来源类器官生长缓慢的问题，同时也大大提高了胸水来源类器官培养的成功率，基于培养基中各成分的配合，较好的模拟类器官体内生存环境，降低了培养成本，同时还解决了目前直接使用胸水上清批次不稳定，保存时间较短，不具备通用性的问题。
17.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：进一步，步骤（1）中胸水来源于以下病人或动物：乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌或腹膜癌。
18.采用上述进一步技术方案的有益效果为：本发明可适用范围广泛，可适用于多种癌种胸水来源类器官的培养。
19.进一步，步骤（1）中将收取的癌性胸水离心，经滤膜过滤除杂后，灭活，最后冷冻干燥，制得胸水上清冻干粉，具体过程为：将收取的癌性胸水于4℃，1300rpm条件下离心，收集胸水上清，胸水上清经0.22μm滤膜过滤后去除杂质，56℃水浴灭活30min，然后置于-80℃冻存凝固后，抽真空，升华干燥，除去冰晶，制得冻干粉。
20.进一步，还包括：将步骤（1）中的沉淀重悬后，加入红细胞裂解液，去除红细胞，具体过程为：将步骤（1）中的沉淀重悬后，加入细胞悬液3倍体积的红细胞裂解液，混匀，冰上孵育15min，然后于4℃，450
×
g离心10min收集细胞，吸弃上清液，沉淀重悬后进行下一步操作，若得到的细胞沉淀中仍有较多的红细胞，需继续重复上述步骤。
21.进一步，步骤（2）中将胸水上清冻干粉溶解，制成0.8-2mg/ml胸水上清冻干粉溶液，然后加入培养器皿中于35-40℃包被15-40min。优选胸水上清冻干粉溶液浓度为1mg/ml，包被温度为37℃，包被时间为30min。
22.采用上述进一步技术方案的有益效果为：用高浓度的胸水上清冻干粉溶液对培养器皿预先包被，可更快更好的促进成纤维细胞 贴壁，利于将成纤维细胞去除。
23.进一步，步骤（3）中培养条件为：37℃培养15-30min，优选20min。
24.采用上述进一步技术方案的有益效果为：将沉淀重悬即得到细胞悬液，将细胞悬液加入包被后的培养器皿中于37℃培养15-30min，可使成纤维细胞贴壁，尤其是培养时间为20min，贴壁效果好，成本低。
附图说明
25.图1为实施例1所制得的类器官形态图。
26.图2为对比例1所制得的类器官形态图。
27.图3为对比例2所制得的类器官形态图。
28.图4为对比例3所制得的类器官形态图。
29.图5为对比例5不同癌种胸水类器官的培养成功率。
具体实施方式
30.以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
31.实施例1：
一种用于胸水来源类器官的培养基，包括胸水上清冻干粉、基础培养基和添加剂；添加剂包括以下终浓度的组分：人重组蛋白r-spondin 1，30ng/ml；头蛋白，100ng/ml；人重组蛋白rhegf，8ng/ml；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1mm；l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，1
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；青链双抗，1
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；n2添加剂，1
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；b27添加剂，1
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；n-乙酰-l-半胱氨酸，0.09mm；alk抑制剂a83-01，0.5μm；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑，0.3μm；烟酰胺，5mm；基础培养基为advanced dmem/f-12培养基；胸水上清冻干粉在培养基中的浓度为200μg/ml。
32.采用上述培养基培养胸水来源类器官的方法，包括以下步骤：（1）制备胸水上清冻干粉：在无菌环境下收取病人的乳腺癌胸水样本，于1300rpm条件下离心，收集胸水上清，胸水上清经0.22μm滤膜过滤后去除杂质，56℃水浴灭活30min，然后置于-80℃冻存凝固后，抽真空，升华干燥，除去冰晶，制得胸水上清冻干粉；收集的胸水离心后的沉淀用pbs清洗3次；（2）去除红细胞：步骤（1）所得细胞沉淀呈现红色，说明红细胞比较多，需将红细胞去除，具体过程为：将细胞沉淀重悬，形成细胞悬液，向细胞悬液中加入细胞悬液3倍体积的红细胞裂解液，轻轻旋涡或颠倒混匀，然后冰上孵育15min，期间轻轻旋涡混匀两次，然后于4℃，450
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g离心10min收集细胞，小心吸弃上清液，重复此操作直至细胞沉淀不再呈现红色；（3）去除成纤维细胞：将1ml无菌的pbs中加1mg胸水上清冻干粉制备高浓度（1mg/ml）的胸水上清冻干粉溶液，之后加入到培养皿中包被，37℃放置30min，吸出胸水上清冻干粉溶液，将步骤（2）收集的细胞重悬后加入包被后的培养皿中，置于37℃培养箱培养20min，使成纤维细胞贴壁，小心吸取上层未贴壁细胞进行离心，即得到去除成纤维细胞的类器官；（4）将步骤（3）中的细胞沉淀通过细胞计数板计数，根据计数结果重悬于含50%的matrigel基质胶中，按每50μl含5000个细胞，滴于24孔板的孔中，然后于37℃，5%co2条件下放置5min，凝固胶液，最后向每孔中加入1ml上述含有胸水上清冻干粉的培养基，于37℃，5%co2条件下进行培养，定期拍照并统计类器官数量和表面积。
33.实施例2：实施例2与实施例1不同之处在于，胸水上清冻干粉在培养基中的浓度为100μg/ml。
34.实施例3：实施例3与实施例1不同之处在于，步骤（3）中将胸水上清冻干粉溶液浓度为0.8mg/ml，包被时间为40min；培养时间为30min。
35.实施例4：实施例4与实施例1不同之处在于，步骤（3）中将胸水上清冻干粉溶液浓度为2mg/ml，包被时间为15min；培养时间为15min。
36.实施例5：实施例5与实施例1不同之处在于，添加剂含量不同，具体为：添加剂包括以下终浓度的组分：人重组蛋白r-spondin 1，20ng/ml；头蛋白，80ng/ml；人重组蛋白rhegf，6ng/ml；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.8mm；l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，1
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；青链双抗，1
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；n2添加剂，1
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；
b27添加剂，1
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；n-乙酰-l-半胱氨酸，0.08mm；alk抑制剂a83-01，0.3μm；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑，0.2μm；烟酰胺，3mm。
37.实施例6：实施例6与实施例1不同之处在于，添加剂含量不同，具体为：添加剂包括以下终浓度的组分：人重组蛋白r-spondin 1，40ng/ml；头蛋白，120ng/ml；人重组蛋白rhegf，10ng/ml；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.2mm；l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，1
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；青链双抗，1
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；n2添加剂，1
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；b27添加剂，1
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；n-乙酰-l-半胱氨酸，0.1mm；alk抑制剂a83-01，0.6μm；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑，0.4μm；烟酰胺，6mm。
38.实施例7：实施例7中胸水上清冻干粉还是病人乳腺癌胸水上清液制得的冻干粉，但与实施例1不同之处为：培养的类器官为病人肺癌胸水来源的类器官，即将病人肺癌胸水离心，所得沉淀用pbs清洗3次后用于步骤（2）-步骤（4），步骤（2）-步骤（4）过程与实施例1相同，培养基也相同。
39.实施例8：实施例8中胸水上清冻干粉还是病人乳腺癌胸水上清液制得的冻干粉，但与实施例1不同之处为：培养的类器官为病人胃癌胸水来源的类器官，即将病人胃癌胸水离心，所得沉淀用pbs清洗3次后用于步骤（2）-步骤（4），步骤（2）-步骤（4）过程与实施例1相同。
40.实施例9：实施例9中胸水上清冻干粉还是病人乳腺癌胸水上清液制得的冻干粉，但与实施例1不同之处为：培养的类器官为病人食管癌胸水来源的类器官，即将病人食管癌胸水离心，所得沉淀用pbs清洗3次后用于步骤（2）-步骤（4），步骤（2）-步骤（4）过程与实施例1相同。
41.实施例10：实施例10中胸水上清冻干粉还是病人乳腺癌胸水上清液制得的冻干粉，但与实施例1不同之处为：培养的类器官为病人胰腺癌胸水来源的类器官，即将病人胰腺癌胸水离心，所得沉淀用pbs清洗3次后用于步骤（2）-步骤（4），步骤（2）-步骤（4）过程与实施例1相同。
42.实施例11：实施例11中胸水上清冻干粉还是病人乳腺癌胸水上清液制得的冻干粉，但与实施例1不同之处为：培养的类器官为病人腹膜癌胸水来源的类器官，即将病人腹膜癌胸水离心，所得沉淀用pbs清洗3次后用于步骤（2）-步骤（4），步骤（2）-步骤（4）过程与实施例1相同。
43.对比例1：对比例1与实施例1不同之处在于，未进行成纤维细胞的去除。
44.对上述制得的类器官做如下检测，以实施例1为例，实施例1所制得的类器官形态图见图1，对比例1所制得的类器官形态图见图2。
45.由图1和图2可知，经过成纤维细胞去除过程，培养10天的类器官数量高于未去成纤维细胞的类器官数量，图1中贴壁分化的细胞也少于图2，并且去除成纤维细胞后，类器官尺寸也大于对比例1。
46.培养10天后，类器官总数量和平均表面积结果见表1：表1 实施例1和对比例1培养所得类器官数量和平均表面积由表1可知，实施例1进行成纤维细胞去除过程，培养10天的类器官数量明显高于未去除成纤维细胞的数量，实施例1类器官平均表面积也明显高于对比例1。
47.对比例2：对比例2与实施例1不同之处在于，成纤维细胞去除时，培养皿不用胸水上清冻干粉包被，直接将收集的细胞重悬后加入培养皿中，置于37℃培养箱培养20min，小心吸取上层未贴壁细胞进行离心。
48.对比例2所制得的类器官形态图见图3；培养10天后，类器官总数量和平均表面积结果见表2。
49.由图1和图3可知，采用胸水上清冻干粉溶液包被培养皿去除成纤维细胞，培养10天后，类器官数量高于未采用胸水上清冻干粉溶液包被培养皿的类器官数量，图1中贴壁分化的细胞也少于图3，并且去除成纤维细胞后，类器官尺寸也大于对比例2。
50.表2 实施例1和对比例2培养所得类器官数量和平均表面积由表2可知，实施例1采用胸水上清冻干粉溶液包被培养皿去除成纤维细胞，培养10天后，类器官数量高于未采用胸水上清冻干粉溶液包被培养皿的类器官数量，实施例1类器官平均表面积也明显高于对比例2。
51.对比例3：对比例3与实施例1不同之处在于，成纤维细胞去除时，使用孔径为20μm的微孔芯片进行过滤去除尺寸较小的成纤维细胞，收集未过滤下去的肿瘤类器官进行培养。
52.对比例3所制得的类器官形态图见图4；培养10天后，类器官总数量和平均表面积结果见表3。
53.由图1和图4可知，与微孔芯片去除成纤维细胞的对比例3相比，实施例1用胸水上清冻干粉进行培养皿中包被去除成纤维细胞，培养10天后贴壁分化的细胞和类器官大小上两者接近，但类器官数量远高于微孔芯片去除成纤维细胞的对比例3。
54.表3 实施例1和对比例3培养所得类器官数量和平均表面积
由表3可知，实施例1采用胸水上清冻干粉溶液包被培养皿去除成纤维细胞，培养10天后，类器官数量明显高于采用微孔芯片去除成纤维细胞的对比例3。
55.对比例4：对比例4与实施例1不同之处在于，培养基中胸水上清冻干粉的添加比例不同，添加不同浓度的胸水上清冻干粉对所得类器官总数量和平均表面积的影响结果见表4。
56.表4 不同浓度的胸水上清冻干粉对类器官总数量和平均表面积的影响对比例5：对比例5与实施例1以及实施例7-11不同之处在于，培养基中未加入病人乳腺癌胸水上清冻干粉，其不同癌种胸水类器官的培养成功率见图5。
57.由图5可知，培养10天后，培养基中加入乳腺癌胸水上清冻干粉组，乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、腹膜癌类器官培养成功率明显优于未加入乳腺癌胸水上清冻干粉组，说明胸水上清冻干粉可用于不同样品类器官的培养，具有通用性。
58.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。