一种蛋白核小球藻胞外高聚物的提取方法

1.本发明涉及了一种细胞外高聚物的提取方法，尤其是是涉及了一种蛋白核小球藻胞外高聚物的提取方法。


背景技术：

2.胞外高聚物(eps)是微生物在特定环境条件下产生的高分子物质，其主要由蛋白质、多糖、腐殖质、脂肪、核酸以及无机物质组成。其中蛋白质和多糖含量最高，两者的总有机碳含量约占总eps的70％-80％。这些高分子物质粘附在细胞表面，可以为饥饿环境中的细胞提供碳源和能量，并在细胞外形成保护层，阻止有害外源物质对细胞的毒害作用。根据与藻细胞表面结合的紧密程度，eps可分为附着型胞外高聚物(b-eps)和溶解型胞外高聚物(s-eps)。为研究eps的成分及功能，首先需要选择合适的提取eps的方法。eps提取的方法有很多，主要包括物理提取法和化学提取法。物理提取法是通过物理外力提取eps，主要包括离心法超声法和热提取法；化学提取法是利用化学添加剂提取eps，主要包括naoh提取法、戊二醛提取法等。eps的提取既要保证提取效率，又要避免对细胞的破坏。
3.而且，eps的提取尚无标准方法：使用同一方法提取不同微生物的eps，其提取效率不同；不同方法提取同一微生物的eps，提取效率相差较大，且对细胞的损害程度也不同。现有的提取方法均不能做到微生物eps的全部提取，且所有方法在一定程度上都会造成微生物细胞的破裂。而评价一个提取方法是否适用于相关微生物eps的提取，不仅要考虑eps产量的高低，也要考虑该提取方法对eps中大分子物质和微生物细胞的破坏程度以及是否干扰后续分析等。


技术实现要素：

4.为了解决背景技术中存在的问题，本发明所提供了一种提取效率高、基本不破坏细胞微观结构且化学试剂干扰较小的蛋白核小球藻eps提取方法。
5.本发明采用的技术方案是：
6.(1)取蛋白核小球藻的藻液，离心取上清液，得到溶解态胞外高聚物；
7.(2)步骤(1)中取上清液后剩余了底层剩余物，将底层剩余物用悬浮于磷酸盐缓冲液的方式洗涤多次，具体实施可以是3次，随后将底层剩余物重悬于磷酸盐缓冲液中，加入阳离子交换树脂再磁力搅拌，经高速离心取上清液，得到附着态胞外高聚物。
8.从而将蛋白核小球藻的藻液分离出溶解态胞外高聚物和附着态胞外高聚物。
9.所述步骤(2)中，在600rpm下磁力搅拌2h。
10.所述的步骤(1)中，高速离心条件为：在4℃下以3000g离心15min。
11.更进一步优选地，所述的步骤(1)中，高速离心条件为：在4℃下以12000g离心15min。
12.所述的蛋白核小球藻为fachb-9。
13.所述的缓冲液为0.01mol/l磷酸盐缓冲液。
14.所述的阳离子交换树脂为20-50目的marathintm c。
15.所述的附着型胞外高聚物b-eps提取所使用的阳离子交换树脂和底层剩余物的湿重之间的质量比为w
阳离子交换树脂
/w
藻细胞
＝2.5/1。
16.所述的蛋白核小球藻预先进行培养，培养条件为25℃，光暗比为14:10，转速为120rpm/min。
17.所述的蛋白核小球藻的培养基为oecd。
18.本发明利用离心法获得富含溶解态胞外高聚物的上清液；将藻细胞的底层剩余物悬浮于磷酸盐缓冲液洗涤，随后再重悬于磷酸盐缓冲液中，加入阳离子交换树脂，磁力搅拌再经高速离心后获得富含附着态胞外高聚物的上清液。
19.本发明采用“离心 阳离子交换”的组合方法进行胞外高聚物的提取，不仅能大量提取蛋白核小球藻的胞外高聚物，而且不影响藻细胞的活性。
20.具体实施中，将收集的一部分附着态胞外高聚物(藻细胞)于恒温摇床培养中培养不同时间(12、24、48、72、96、120h)后，利用血细胞计数板于光学显微镜(lm,olympus,cx21,日本)下计数藻细胞，绘制生长曲线，以验证本发明的提取效果。
21.将收集的一部分附着态胞外高聚物(藻细胞)培养于oecd培养基中培养不同时间(1、3、8、24h)后，通过离心方式收集藻细胞，并通过上述阳离子交换法提取藻细胞分泌的b-eps，并用bca法进行测定其中蛋白质浓度，以测试本发明的提取效果。
22.本发明的有益效果是：
23.本发明采用“离心 阳离子交换”的组合方式进行胞外高聚物eps的提取，不仅能大量提取蛋白核小球藻的eps，而且不影响藻细胞的活性。
附图说明
24.图1为去除/未去除两种eps藻细胞的生长曲线图；
25.图2为去除/未去除两种eps藻细胞的胞外蛋白分泌动力学结果图；
26.图3为实施例2中不同提取方法下s-eps有机组分的含量结果图；
27.图4为实施例3中不同提取方法下b-eps有机组分的含量结果图；
28.图5为实施例4中不同提取方法下b-eps有机组分的含量结果图；
29.图6为四个实施例中不同提取方法下两种eps中各有机组分的含量结果图。
具体实施方式
30.下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
31.以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。
32.去除/未去除eps藻细胞的生长曲线和去除/未去除eps藻细胞的胞外蛋白分泌动力学分别如1和2所示。
33.本发明下列实施案例中，各指标的测定方法如下：
34.(1)两种eps中toc含量的测定利用总有机碳分析仪(shimadzu toc-vcpn analyzer)。
35.(2)两种eps中多糖的测定eps的多糖采用蒽酮法测定，其最小检出限为0.028mg/l。蒽酮-硫酸溶液：0.4g蒽酮试剂置于烧杯中，缓慢加入100ml浓硫酸(约84体积97％浓硫酸
与16体积水混合)中，溶解后将其用磨口瓶密封，置于冰水中冷却至5℃备用，此液现用现配。葡萄糖于105℃下烘干2h，准确称取100mg烘干的葡萄糖，配成1g/l的溶液。吸取10ml定容为100ml的100mg/l的标准糖工作液。用1ml移液枪吸取一系列标准糖工作液于8ml样品瓶中，并用蒸馏水调整各支试管总体积为1ml，摇匀，获得不同浓度的标准液。1ml的eps待测液和不同浓度的葡萄糖标液中加入4ml蒽酮后，立即浸于冰水浴中冷却，标准液及样品全部加完后，同时浸于沸水浴(加盖)，10min后再置于冰水浴中冷却至室温后，利用酶标仪(m200 pro,ltd.,澳大利亚)于620nm处比色，以超纯水作为空白对照，测定各个样品的吸收值，绘制标准曲线，计算出eps中多糖含量。
36.(3)两种eps中的蛋白质含量通过bca法测定，其最小检出限为0.072mg/l。bca试剂盒购于西格玛奥德里奇公司。利用1.5mg/ml的标准液配制不同浓度的蛋白质标液。准确吸取20μl eps待测液及蛋白质标液于96孔板中，加入bca试剂200μl，混匀后于37℃保温30min，冷却至室温后，利用酶标仪于562nm处比色，以纯水为空白对照绘制标准曲线，并计算出eps的蛋白质含量。
37.(4)两种eps中dna的浓度利用紫外分光光度计于260nm处测定其吸光值，再根据公式dna的浓度＝a
260nm
/0.02得到eps中dna的浓度。
38.本发明的实施例如下：
39.实施例一
40.1.小球藻购自中国科学院野生生物种质库—淡水藻种库的蛋白核小球藻fachb-9，使用国际经合组织(oecd)推荐的培养液培养蛋白核小球藻(25
±
0.5℃,明:暗＝14:10)，培养基的化学成分包括(mg/l)：nh4cl,15；mgcl2·
6h2o,12；cacl2·
2h2o,18；mgso4·
7h2o,15；kh2po4,1.6；nahco3,50；fecl3·
6h2o,0.08；na2edta
·
2h2o,0.1；h3bo3,0.185；mncl2·
4h2o,0.415,zncl2,0.003；cocl2·
6h2o,1.5
×
10-3
；cucl2·
2h2o,10-5
；na2moo4·
2h2o,7
×
10-3
。
41.2.蛋白核小球藻eps的提取
42.具体步骤如下：
43.(1)取藻液1l，在离心机中，在4℃下以3000g离心15min，上层清液即富含s-eps；
44.(2)将步骤(1)中离心后的底层剩余物悬浮于0.01mol/l磷酸盐缓冲液洗涤3次；
45.(3)将步骤(2)藻细胞重悬于0.01mol/l磷酸盐缓冲液中，加入20-50目的marathintmc阳离子交换树脂，600rpm磁力搅拌2h，经高速离心(4℃，12000g，15min)后获得富含b-eps的上清液。
46.实施例二
47.本实施例采用不同方法提取蛋白核小球藻的s-eps，即改变实施例一中步骤(1)中离心的条件，将3000g离心力分别调整为2000g和4000g。
48.测定上述方法中获得的s-eps的toc、多糖、蛋白质和dna含量，不同离心条件下s-eps中toc、多糖、蛋白质和dna含量结果如图3所示。
49.实施例三
50.本实施例采用不同方法提取蛋白核小球藻的b-eps，即改变实施例一中步骤(3)中阳离子交换树脂的添加量由w
阳离子交换树脂
/w
藻细胞
＝2.5/1分别调整为1/1和4/1。
51.测定上述方法中获得的b-eps的toc、多糖、蛋白质和dna含量，不同阳离子交换树
脂添加量的条件下b-eps中toc、多糖、蛋白质和dna含量结果如图4所示。
52.实施例四
53.本实施例采用不同方法提取蛋白核小球藻的b-eps，即改变实施例一中步骤(3)中离心的条件，将12000g离心力分别调整为10000g和14000g。
54.测定上述方法中获得的b-eps的toc、多糖、蛋白质和dna含量，不同离心条件下b-eps中toc、多糖、蛋白质和dna含量结果如图5所示。
55.不同实施例中两种eps中各有机组分的含量结果如图6所示。由图1可知，“离心 阳离子交换”的组合方法提取eps对藻细胞的存活情况影响不大；由图2可知，去除eps藻细胞的胞外蛋白浓度远低于未去除eps的藻细胞，可见本实验中eps的提取/去除方法是有效的。
56.由图3可知，离心力由3000g调整为2000g，toc、多糖、蛋白质和dna含量均降低；离心力由3000g调整为4000g，toc含量上升，多糖和蛋白质含量有所降低，但dna含量显著上升，说明细胞破损程度升高。因此，图3表明3000g离心力能保证s-eps提取效率的同时，最大程度地避免细胞的损伤。
57.由图4可知，阳离子交换树脂的添加量由w
阳离子交换树脂
/w
藻细胞
＝2.5/1调整为1/1，toc、多糖、蛋白质和dna含量均降低；阳离子交换树脂的添加量调整为w
阳离子交换树脂
/w
藻细胞
＝4/1，toc和多糖含量上升，蛋白质含量有所降低，但dna含量显著上升，说明细胞破损程度升高。因此，图4表明w
阳离子交换树脂
/w
藻细胞
＝2.5/1的阳离子交换树脂的添加量能保证b-eps提取效率的同时，最大程度地避免细胞的损伤。
58.由图5可知，离心力由12000g调整为10000g，toc、多糖、蛋白质和dna含量均降低；离心力调整为14000g，toc含量无变化，多糖和蛋白质含量有所降低，但dna含量显著上升，说明细胞破损程度升高。因此，图5表明12000g离心力能保证b-eps提取效率的同时，最大程度地避免细胞的损伤。
59.图6总结了不同提取方法下两种eps中各有机成分的含量，表明，3000g离心力是s-eps的最佳提取的条件；阳离子交换树脂的添加量w
阳离子交换树脂
/w
藻细胞
＝2.5/1，且高速离心力为12000g是b-eps的最佳提取的条件。
60.本专利所述的方法能在有效提取蛋白核小球藻两种eps的同时避免藻细胞的损伤，对后续实验的影响降到最低。