一种可见光双光梳高分辨超快显微成像装置及方法

1.本发明涉及显微成像领域和超快激光领域，具体涉及一种采用两个具有一定重复频率差的可见光波段光学频率梳进行照明的显微成像装置，以及利用双光梳实现高分辨显微成像的方法。


背景技术：

2.显微镜的发明打开了人们观察微观世界的大门，可以说每一次显微成像技术的进步，都推动了材料、医学、生命科学等领域的飞速发展，相比于其他类型显微镜，光学显微镜有着非接触、损伤小、成像机制丰富等优点，成为诸多研究和应用领域中不可缺少的工具。提高显微成像的空间分辨率一直是光学显微技术发展的主线。近几十年来，超分辨显微成像技术取得了长足的发展，出现了受激发射损耗显微镜(sted)、基态损耗显微成像技术(gsd)、光激活定位显微成像技术(palm)、随机光学重构显微成像技术(storm)、傅里叶叠层显微成像技术(fpm)以及结构光照明显微成像技术(sim)等一系列超分辨显微成像技术，在成像空间分辨率上早已突破光学衍射极限，获得10～100nm的空间分辨能力，在生物、医学、材料等前沿研究中得到了广泛应用。
3.提高成像的时间分辨率在显微技术中变得越来越重要，当研究对象在微米到纳米尺度时，即使是缓慢移动的现象也需要非常高的时间分辨率才能进行捕获。比如，在观察一个缓慢移动的物体(v＝1m/s)时，若希望获得1μm的空间成像分辨率，那么需要1μs的高时间分辨率，这对应于1mfps的成像帧率。而这样的现象广泛存在于光化学、等离子体物理、微流控生物技术、半导体物理、冲击波治疗和神经科学等诸多领域中。因此，提高空间和时间分辨率(成像速度)是显微成像研究的核心问题。现有技术中，将双光梳技术与显微成像结合的工作还非常少，在已报道的工作中利用了红外波段的光学频率梳，明显提高了显微成像的速度，但成像的空间分辨率上还没有明显改善，目前还没有基于光学频率梳的高分辨超快显微成像相关研究报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对显微成像现有技术中成像速度与空间分辨率之间的矛盾，提出一种基于可见光双光梳的显微成像系统和方法，将光学频率梳与显微成像相结合，利用双光梳光谱技术在可见光超快显微成像中实现高精度光谱测量，可以明显提高成像的空间分辨率，并提出通过光频梳频移将波长编码点阵移相，利用波长和偏振复用从不同角度照明样品，在超快显微成像中实现光频梳点阵结构光照明，实现具有高时间和空间分辨的显微成像。
5.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种可见光双光梳高分辨超快显微成像装置，其特征在于：该成像装置包括激光光源、声光移频器、波分复用器、二维色散-空间展开元件、显微成像系统、双光梳探测装置以及数据采集和处理装置；
6.所述激光光源采用双光梳，所述二维色散-空间展开元件用于将光频梳展开为波
长-空间编码点阵光场进行照明，所述双光梳探测装置用于开展双光梳光谱测量，获取波长所包含的信息，所述声光移频器用于改变光频频率实现结构光照明，所述波分复用器用于实现结构光多角度照明，实现高分辨超快显微成像，所述数据采集和处理装置用于获得高分辨图像。
7.所述激光光源中具有两个可见光光频梳光源，分别作为信号源l1和参考源l2；所述信号源l1进入声光移频器，然后经过波分复用器分为三路l1-1、l1-2和l1-3，分别经过具有不同角度的二维色散-空间展开元件，展开为具有不同角度分布的二维波长-空间编码点阵照明光场，再利用波分复用器进行共线合束后，经过显微成像系统对样品照明；携带样品信息的信号光首先通过二维色散-空间展开元件转化为点光束，然后与参考光l2合束，输入至双光梳探测装置中开展双光梳光谱测量，最后经过数据采集和处理装置得到具有更高时间和空间分辨能力的显微图像。
8.进一步地，所述样品可采用反射的方式，将二维波长-空间编码点阵照明光场通过原路返回转化为点光束，或者样品采用透射的方式，采用另一套波分复用器、显微成像系统和二维色散-空间展开元件将透过的二维照明光场转化为点光束。
9.进一步地，所述激光光源为两个具有固定重复频率差的可见光光学频率梳光源，波长采用可见光波段，采用光频梳主动参考锁定、激光器谐振腔复用、微腔频率梳、电光频率梳、倍频等方法实现，所述光学频率梳光源的重复频率和重复频率差根据成像的视场大小和速率进行选择。
10.进一步地，所述声光移频器由声光晶体构成，采用声光移频的方法用于光频梳光源的移频，其工作波长范围与采用的激光源波长匹配，声光移频移频量小于光频梳光源的重复频率。
11.进一步地，所述波分复用器用于将信号光频率梳分为三路，采用具有不同滤波特性的双色镜和反射镜来实现。
12.进一步地，所述二维色散-空间展开元件由柱透镜、虚拟成像相位阵列和光栅构成，光束经柱透镜聚焦入射在虚拟成像相位阵列上，光束一维展开，然后入射至光栅上，展开为二维点阵，每一个点对应于不同的波长，也用于将二维照明点阵合束为一个脉冲；虚拟成像相位阵列的光谱自由范围与采用的光频梳带宽和重频相匹配。
13.进一步地，所述显微成像系统由光束整形模块和显微成像物镜构成，光束整形模块用于照明光场的优化和扩束，显微成像物镜用于将光场聚焦于样品上，使光斑大小接近衍射极限。
14.进一步地，所述双光梳探测装置用于双光梳拍频信号的获取进行双光梳测量，采用平衡光电探测器、雪崩光电探测器或高速光电探测器。
15.进一步地，所述数据采集和处理装置用于光电信号数据的获取、图像重构和显示。
16.本发明还提供了一种基于所述的显微成像装置的可见光双光梳高分辨超快显微成像方法，该方法包括以下步骤：
17.(1)采用两个可见光光频梳作为激光光源，分别为信号源l1和参考源l2；信号源l1进入声光移频器，在声光移频器上加载射频信号，使得光频梳的梳齿产生频移，实现了结构光照明；
18.(3)信号源l1经过波分复用器分为三路l1-1、l1-2和l1-3，分别经过具有不同角度
的二维色散-空间展开元件，展开为具有不同角度分布的二维波长-空间编码点阵照明光场；照明光场经过显微成像系统后对样品照明，经样品透射、反射或衍射的光场被汇聚接收后，通过二维色散-空间展开元件恢复为单点光束脉冲信号，通过照明在样品上的每一个点获取对应位置的样品信息；
19.(4)利用波分复用器进行共线合束后，与参考光l2合束，输入至双光梳探测装置中开展双光梳光谱测量，或者将l2分为三路分别与l1-1、l1-2和l1-3合束，然后输入至双光梳探测装置中开展双光梳光谱测量，获取信号源l1波长的强度和相位信息，其精度能够分辨每一个照明点对应的波长；最后经过数据采集和处理装置得到具有更高时间和空间分辨能力的显微图像。
20.本发明的有益效果是：
21.1、本发明利用双光梳光谱测量方法，能在可见光波段实现高精度光谱测量，克服传统超快测量技术中时域拉伸对可见光超快显微成像的限制。
22.2、本发明利用可见光超短脉冲激光实现超快显微成像，可以有效减小照明光束的光斑大小，提高成像的空间分辨率。
23.3、本发明利用光学频率梳实现一种点阵结构光照明无标记超分辨显微成像，可以进一步提高超快显微成像的分辨率。
24.4、本发明通过将单点探测超快显微成像与光学频梳研究结合，克服成像速度与空间分辨率之间的矛盾，可以实现成像速率达mhz的超分辨显微成像。
附图说明
25.图1为本发明的整体结构示意图；
26.图2为本发明中光场调控部分和显微成像部分结构示意图；
27.图3为本发明中返回信号光调控、双光梳探测、数据采集和处理示意图；
28.图4为本发明中返回信号光分三路光谱探测结构示意图；
29.图5为本发明中二维色散-空间展开元件示意图。
30.图中，1—激光光源；2—光束特性控制装置；3—显微成像系统；4—双光梳探测装置；5—数据采集和处理装置；6—声光移频器；7—双色镜；8—二维色散-空间展开元件；9—反射镜；10—光束整形模块；11—显微成像物镜；12—样品；13—光电探测器；14—模数转换器；15—数据和图像处理模块；16—显示器；17—半透半反镜；18—偏振合束器；19—柱透镜；20—虚拟成像相位阵列；21—光栅。
具体实施方式
31.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
32.如图1所示，本发明提供的一种可见光双光梳高分辨超快显微成像装置，包括激光光源1、光束特性控制装置2、显微成像系统3、双光梳探测装置4、数据采集和处理装置5等五个部分，激光光源1采用双光梳光源，两个光频梳的重复频率为10ghz左右，重频差可在10khz-10mhz范围调节。所述激光光源为两个具有固定重复频率差的可见光光学频率梳光源，波长采用可见光波段，采用光频梳主动参考锁定、激光器谐振腔复用、微腔频率梳、电光频率梳、倍频等方法实现，所述光学频率梳光源的重复频率和重复频率差根据成像的视场
大小和速率进行选择。激光光源1输出的信号光l1先经过光束特性控制装置2将时域脉冲进行二维空间展开，然后通过显微成像系统3对样品照明，可以采用透射或者反射的方式，携带样品信息的信号光经过光束特性控制装置2恢复为时域脉冲，并将信号光l1和参考光l2合束后进入双光梳探测装置4，经数据采集和处理装置5后获取显微成像。所述双光梳探测装置用于双光梳拍频信号的获取进行双光梳测量，采用平衡光电探测器、雪崩光电探测器或高速光电探测器。所述样品可采用反射的方式，将二维波长-空间编码点阵照明光场通过原路返回转化为点光束，或者样品采用透射的方式，采用另一套波分复用器、显微成像系统和二维色散-空间展开元件将透过的二维照明光场转化为点光束。
33.如图2所示，声光移频器6由声光晶体构成，采用声光移频的方法用于光频梳光源的移频，其工作波长范围与采用的激光源波长匹配，声光移频移频量小于光频梳光源的重复频率。信号光l1在光束特性控制装置2中首先通过声光移频器6，在声光移频器6上加载射频信号，使得光频梳的梳齿产生频移，导致照射在样品上的点阵相位发生变化，从而实现了结构光照明，然后利用双色镜7和反射镜9将信号光l1分为三路，每一路分别通过二维色散-空间展开元件8，三个二维色散-空间展开元件8放置在不同角度，展开的二维点阵光场具有不同的分布角度，再通过双色镜7和反射镜9共线合束，三路信号光的延时小于信号光的脉冲间隔。然后，合束后的信号光进入光束整形模块10，对二维点阵光场进行整形和准直，再经过显微成像物镜11聚焦至光束的衍射极限，照明在样品12上。激光光源1的波长为780nm，其照明光斑的衍射极限小于600nm，为成像的空间分辨率，若采用更短波长光源可以进一步提高成像分辨率。
34.透过或反射的信号光携带有样品信息，其光束特性控制和探测过程如图3所示。利用双色镜7和反射镜9将三路信号光分开，再分别通过不同角度放置的二维色散-空间展开元件8恢复为时域脉冲，再采用双色镜7和反射镜9将三路脉冲合束。该过程可以通过将信号光原路返回，实现对时域信号的恢复，也可以采用相同的光束特性控制装置2和显微成像系统3以实现上述功能，通过照明在样品上的每一个点获取对应位置的样品信息，该信息通过该位置对应信号源l1波长的强度和相位进行测量，其精度能够分辨每一个梳齿对应的波长，由此实现对于样品的一次测量，其测量速度达到百万帧每秒，取决于光频梳的重复频率和双光梳的重频差。如图1中所示。通过偏振合束器18将信号光l1和参考光l2合束，利用光电探测器13将其转化为电信号，通过模数转换器14对信号进行数字采样，模数转换器14的工作带宽应该与使用的双光梳重频和重频差匹配。利用数据和图像处理模块15对采集的数据进行处理和图像恢复，最终输出至显示器16。双光梳光谱测量方法的速率受限于两个光学频率梳的频率差，这里设置为1mhz左右，因此可以实现mhz量级的成像速度。通过对三路照明成像的处理，可以实现对样品的结构无标记光照明超分辨成像，其成像空间分辨率可突破衍射极限。
35.上述光束特性控制和探测过程也可采用另一种方案，如图4所示。参考光l2经半透半反镜17和反射镜9分为三路，分别利用偏振分束器18与三路信号光合束，输入至光电探测器13中转换为电信号，后续过程和上述过程一致。
36.本发明中采用二维色散-空间展开元件8如图5所示，由柱透镜19、虚拟成像相位阵列20和光栅21构成。光束经柱透镜19聚焦入射在虚拟成像相位阵列20上，光束会被一维展开，虚拟成像相位阵列20的再入射至光栅21上，展开为二维点阵。
37.本发明还提供了一种基于所述的显微成像装置的可见光双光梳高分辨超快显微成像方法，该方法包括以下步骤：
38.(1)采用两个可见光光频梳作为激光光源，分别为信号源l1和参考源l2；信号源l1进入声光移频器，在声光移频器上加载射频信号，使得光频梳的梳齿产生频移，实现了结构光照明；
39.(3)信号源l1经过波分复用器分为三路l1-1、l1-2和l1-3，分别经过具有不同角度的二维色散-空间展开元件，展开为具有不同角度分布的二维波长-空间编码点阵照明光场；照明光场经过显微成像系统后对样品照明，经样品透射、反射或衍射的光场被汇聚接收后，通过二维色散-空间展开元件恢复为单点光束脉冲信号，通过照明在样品上的每一个点获取对应位置的样品信息；
40.(4)利用波分复用器进行共线合束后，与参考光l2合束，输入至双光梳探测装置中开展双光梳光谱测量，或者将l2分为三路分别与l1-1、l1-2和l1-3合束，然后输入至双光梳探测装置中开展双光梳光谱测量，获取信号源l1波长的强度和相位信息，其精度能够分辨每一个照明点对应的波长；最后经过数据采集和处理装置得到具有更高时间和空间分辨能力的显微图像。
41.上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。