一种用微生物植物提取的生物农药及其应用的制作方法

1.本发明属于生物农药技术领域，具体地说，涉及一种以植物、其衍生物或植物来源材料为底物微生物法制备的生物农药，应用于农作物等植物病防治领域。


背景技术：

2.生物防治是指以物种间的竞争关系为依据，利用一种或一类生物抑制另一种或另一类生物，从而达到对有害生物的治理，对目标生物的保护的目的。生物农药是指以生物体本身或其分泌物为原料，经过合成加工，保护目标作物免受有害生物侵害的农药制剂。
3.生物农药较之化学药剂的优点是多方面的：(1)、低毒高效，容易被环境中的微生物所降解，对环境友好；(2)、生产原料来源广泛，研发、利用途径多；(3)、病原生物不易产生抗药性；(4)、针对性强，仅对病原微生物或防治对象产生作用，不会危害作物本身；(5)、可塑性强，可通过分子生物学手段不断改善性能，提升效果。生物农药其具有广阔的市场空间和极大的发展前景，符合我国在新形势下的农业发展要求，农业病虫害综合防治项目是需要我们长期面对的重要问题，而生物农药将在其中将发挥不可替代的作用。
4.水稻疾病(如稻瘟病、稻曲病等)是水稻生产过程中的重要病害之一，发生严重时可导致水稻大量减产。目前防控稻瘟病有效的方式是选择抗病品种，但由于品种的适应性要求因地制宜正确栽培，因此树立良好的防御理念，采取科学的防治措施才最为关键。
5.水稻疾病是水稻生产上的三大主要病害之一，在我国水稻产区均有不同程度的发生，根据发病时水稻为害部位，稻瘟病分为苗瘟、叶瘟、叶枕瘟、节瘟、穗颈瘟、谷粒瘟等，其中穗颈瘟对产量影响最严重，可造成水稻白穗、减产40％～50％，甚至绝产。防控稻瘟病的主要方式通常有：最有效的方式是种植抗病良种，这是防治的基础，如糯稻、粳稻高感稻瘟病，防治难度大费用高；同时由于品种的适应性要求因地制宜正确栽培，因此树立良好的防御理念，采取科学的防治措施才最为关键。其次是及时进行化学农药防治，特别是对减产严重的穗颈瘟，必须在破口前和齐穗期进行2次药剂预防，一旦水稻品种选定以后，药剂防治是防治稻瘟病的第二道防线，也是我国当前稻瘟病最主要的防治方式。
6.我国登记防治稻瘟病的药剂证件数量多达979个，包括了单剂620个和复配剂300多个，农药生产企业仍多达2000多家，农药重复登记现象普遍，这些稻瘟病单剂涉及的农药有效成分却并不多，总数不超过30个，真正专业用于防治稻瘟病的成分才4个。随着农村人居环境改善及食品安全的要求，这种药剂已经很少使用了；且目前农药增加原药的生产成本，导致该产品性价比不佳、进而丧失市场竞争力，在农资市场渠道上并不多见。因此开发环保、健康、低碳、低成本的生物农药对经济作物的稳产和增产、保证粮食安全具有重大意义。
7.如中国发明专利，申请号：cn201610902279.1，公开号：cn106561745a，公开了一种纯天然生物农药，其技术方案如下：
[0008]“一种纯天然生物农药，其组份的重量百分比为：水松10～15％、桑叶10～15％、蛇床子10～15％、皂角8～12％、穿心莲8～12％、土槿皮8～12％、射干8～12％、防风5～8％、
朝天椒5～8％、千里光5～8％、贯众5～8％、花椒5～8％、冰片1～3％；各组份之和为100％。
[0009]
采用上述各组份制备生物农药的具体步骤为：
[0010]
(1)称量：根据所需用量称取各生物农药原料，除冰片外其余生物农药原料混匀备用；
[0011]
(2)煎煮：将混匀的生物农药原料投入提取罐中煎煮提取2次，第一次加药物重量15倍的自来水浸泡药物2小时，煮沸后小火熬制20分钟，过滤，滤液备用；第二次加药物重量10倍的自来水煎煮提取30分钟，过滤，将上述两次滤液混合，；
[0012]
(3)浓缩：将上述混合滤液在60℃时，减压浓缩至相对密度为1.03～1.05，冷却备用；
[0013]
(4)混和：将备好的冰片用适量的75％酒精溶解后加入冷却浓缩液中，不断搅拌，直至混匀为止；
[0014]
(5)灭菌：将混匀的药液通过紫外线灭菌得到生物农药原液；
[0015]
(6)质检：将生物农药按照生物农药标准检测合格，备用；
[0016]
(7)包装入库：将质检合格的生物农药按1kg/瓶进行分装，贴上标签并标明生产日期和失效日期；将包装好的生物农药存放在通风的干燥的仓库内”。
[0017]
但上述专利存在以下问题：对病原菌的抑制效果差、制备过程中易于造成活性组分失活、部分中草药组分成本高。


技术实现要素：

[0018]
1、要解决的问题
[0019]
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种用微生物植物提取的生物农药及其应用，具体来说，是一种以植物、其衍生物或植物来源材料为底物微生物法制备的生物农药及其应用，该生物农药是以不同类型微生物为发酵菌种，对植物、其衍生物或植物来源的材料进行转化、生化反应、提取等过程得到的生物活性组分。
[0020]
2、技术方案
[0021]
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
[0022]
一种用微生物植物提取的生物农药，所述的生物农药由微生物菌剂与发酵原料进行发酵得到的发酵液经分离、浓缩、混合而得到；
[0023]
其中所述的微生物菌剂的菌种包括假单胞菌pseudomonas、链霉菌属streptomyces、红球菌rhodococcus、黑粉菌pseudozyma、黑穗菌目ustilaginales、莫氏黑粉菌属moesziomyces、分支杆菌属mycobacterium；
[0024]
其中所述的发酵原料，以重量百分比计，包括以下组分：
[0025][0026]
上述所述的用微生物植物提取的生物农药，所述的碳源包括植物油脂、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木质纤维素及其水解液、淀粉及其水解液。
[0027]
上述所述的用微生物植物提取的生物农药，所述的生物农药的制备方法至少包括以下的步骤(1)：
[0028]
(1)采用不同的微生物菌剂与发酵原料进行发酵培养，分别得到不同的发酵液；
[0029]
(2)将步骤(1)得到的发酵液，经高温灭菌、过滤除菌体及离心的处理，得到上清液；
[0030]
(3)将步骤(2)得到的上清液，经提取与浓缩的处理，得到浓缩液；
[0031]
(4)将步骤(3)得到不同的浓缩液，按照比例混合，即可。
[0032]
上述所述的用微生物植物提取的生物农药，步骤(1)中微生物菌剂的获取方法如下：
[0033]
从含有微生物菌种的固体平板上挑去菌落，同时接种到预培养基中，接着转移至于30℃的恒温培养中，培养1d-3d，得到微生物菌种的种子液，即可；
[0034]
其中所述的预培养基，以重量百分比计，包括以下组分：
[0035][0036]
步骤(1)中微生物菌剂与发酵原料之间的质量比为(0.01-0.1)：1。
[0037]
上述所述的用微生物植物提取的生物农药，步骤(1)中发酵培养的条件如下：
[0038]
发酵培养的温度为20℃-40℃，发酵培养的搅拌强度为100rpm-300rpm，发酵培养的通气量0.1vvm-1.0vvm，发酵培养的时间为5d-10d。
[0039]
上述所述的用微生物植物提取的生物农药，步骤(2)中发酵液经过过80℃-120℃高温灭菌2h后，将高温灭菌后的发酵液进行过滤去除菌体的处理，得到除掉菌体的液体，接
着进行高速离心去除残余发酵原料，将离心后得到的上清液，同时将上清液的ph值调节至3以下，并在4℃-10℃下冷藏24h，待用；
[0040]
其中所述的过滤的方式为采用膜或者过滤袋。
[0041]
上述所述的用微生物植物提取的生物农药，步骤(3)中上清液利用有机溶剂、有机膜或陶瓷膜进行提取，接着收集提取后的有机相并在40℃-60℃下真空浓缩，即可；
[0042]
其中所述的有机溶剂包括乙酸乙酯与氯仿；
[0043]
其中所述的有机溶剂的提取还包括如下：
[0044]
将提取后的溶液与不同体积的有机溶剂充分混合后，进行静置分离，在40℃-60℃下真空浓缩2-15倍，收集有机溶剂以便循环使用；
[0045]
其中所述的有机膜或陶瓷膜的截留分子量为20kd-100kd。
[0046]
上述所述的用微生物植物提取的生物农药，将步骤(1)得到不同的发酵液，按照比例混合，即可得到生物农药。
[0047]
一种用微生物植物提取的生物农药在农作物病害防治中的应用。
[0048]
上述所述的用微生物植物提取的生物农药在农作物病害防治中的应用，所述的农作物病害包括稻瘟病、稻曲病、绿黑穗病、稻热病、玉米小斑病、水稻纹枯病。
[0049]
上述涉及对植物、其衍生物或植物来源的材料进行转化、生化反应、提取等过程得到的生物活性组分。本发明提出了该生物农药合成、分离、浓缩、提纯、调制以及在农作物病理防止的应用
[0050]
3、有益效果
[0051]
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0052]
本发明的用微生物植物提取的生物农药对于常见的农作物病害稻瘟病、稻曲病、绿黑穗病、稻热病、玉米小斑病、水稻纹枯病等具有较好的防治作用。具体来说，结合实施例来看，生物农药由微生物菌剂与发酵原料进行发酵得到的发酵液经分离、浓缩、混合而得到，其中微生物菌剂创造性引入假单胞菌pseudomonas、链霉菌属streptomyces、红球菌rhodococcus、黑粉菌pseudozyma、黑穗菌目ustilaginales、莫氏黑粉菌属moesziomyces、分支杆菌属mycobacterium之组合，同时优化了发酵原料，并利用有机溶剂、有机膜或陶瓷膜进行有效提取，经测试，即使生物农药抑制很高倍数后，仍然有很高的抑制效率，尤其在稀释2000倍以内仍然保持70％以上有效抑制率。
附图说明
[0053]
图1为本发明实施例1中生物农药对稻瘟病菌的抑制效果图；
[0054]
图2为本发明实施例2中生物农药对绿黑穗病菌的抑制效果图；
[0055]
图3为本发明实施例3中生物农药对稻热病菌的抑制效果图；
[0056]
图4为本发明实施例4中生物农药对bipolaris maydis的抑制效果图；
[0057]
图5为本发明实施例5中生物农药对rhizoctonia solani的抑制效果图。
具体实施方式
[0058]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0059]
实施例1
[0060]
本实施例的用微生物植物提取的生物农药及其应用，具体如下：
[0061]
(1)种子制备：从假单胞菌(pseudomonas)、链霉菌属(streptomyces)、红球菌(rhodococcus)、黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)、分支杆菌属(mycobacterium)等菌的固体平板上挑去菌落接种到如下培养基中：以质量百分比计，酵母粉0.3％、蛋白胨0.6％、葡萄糖0.4％、麦芽糖0.1％、氯化钠0.5％、其余为水，转移至于30℃的恒温培养中，培养3d，分别得到各个菌种的种子液。
[0062]
(2)合成：
[0063]
接种8％的接种量，将黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)等三个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括木质纤维素及其水解液、植物油脂、葡萄糖等为主要碳源，通气量1.0vvm下培养，温度控制在28℃，搅拌强度200rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源15％(木质纤维素及其水解液：植物油脂：葡萄糖＝1：6：3，质量比)、硝酸钠1％、酵母粉：0.2％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁0.05％、二水合氯化钙0.01％、七水合硫酸亚铁0.01％、硫酸锰0.001％，余量为水。培养10d，得到各个菌的发酵液。
[0064]
接种8％的接种量，将假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)等两个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括植物油脂、麦芽糖等为主要碳源，通气量0.4vvm下培养，温度控制在37℃，搅拌强度200rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源8％(植物油脂：麦芽糖＝8：2，质量比)、硝酸钠0.5％、酵母粉0.04％、磷酸二氢钾0.45％、七水硫酸镁0.05％、二水合氯化钙0.02％、七水合硫酸亚铁0.01％，余量为水。培养6d，得到各个菌的发酵液。
[0065]
接种10％的接种量，将分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)等两个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括蔗糖、淀粉及其水解液、麦芽糖等为主要碳源，通气量0.8vvm下培养，温度控制在34℃，搅拌强度300rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源5％、硝酸钠0.2％、酵母粉：0.3％、磷酸二氢钾1％、七水硫酸镁0.05％、二水合氯化钙0.06％、七水合硫酸亚铁0.03％、硫酸锰0.006％，余量为水。培养8d，得到各个菌的发酵液。
[0066]
(3)分离：上述步骤(2)发酵过程得到的发酵液，经过120℃高温灭菌2h后；将灭菌后发酵液进行过滤去除菌体，得到除掉菌体的液体，进过高速离心去除残余原料；将离心后得到的液体，调节ph至于3以下，在温度4℃下冷藏24h。
[0067]
(4)提取与浓缩：
[0068]
采用乙酸乙酯分别萃取黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)等分离液，然后收集有机相；将上述分离得到的液体，与不同体积的溶剂充分混合后，静置分离。然后在40℃下真空浓缩5倍，并收集溶剂以便循环使用。
[0069]
同时，还采用有机膜和无机陶瓷膜组合对假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)等分离液提取，膜的截留分子量为20kd-100kd，得到的滤液然后在40℃下真空浓缩5-10倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在40-60℃下真空浓缩。
[0070]
此外，采用有机膜和无机陶瓷膜组合分别对假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)、分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)等分离液提取，膜
的截留分子量为20kd-100kd，得到的滤液然后在60℃下真空浓缩10倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在60℃下真空浓缩。
[0071]
(5)混合：将第4步分离后的发酵液按照比例混合。其中黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)、假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)、分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)分离液等7个浓缩液比例为6：6：6：3：3：2：1，得到生物农药制品。
[0072]
(6)应用测试：将上述过程得到的生物农药用于农作物病害防治测试。制备固体培养基，将生物农药稀释一定倍数(200,2000,20000倍)，均匀涂布在固体培养基表面，然后将农作物病菌(magnaporthe grisea，稻瘟病菌)点样在固定平板的中央。最后放置于培养箱下培养观察其抑制功能。从表1和图1结果可以看出，在生物农药抑制很高倍数后，仍然有很高的抑制效率，尤其在稀释2000倍以内仍然保持70％以上有效抑制率。
[0073]
表1 生物农药对magnaporthe grisea的抑制效果
[0074]
不同稀释倍数抑制率％200倍93.072000倍74.3420000倍56.54
[0075]
此外，设置对比试验，进行生物农药的效果验证。对比试验基本上同实施例1，不同之处在于：
[0076]
a-仅选择假单胞菌(pseudomonas)；稀释倍数为200时，抑制率为32.1％；
[0077]
b-仅选择链霉菌属(streptomyces)；稀释倍数为200时，抑制率为35.4％；
[0078]
c-碳源仅选择葡萄糖；稀释倍数为200时，抑制率为38.2％。
[0079]
实施例2
[0080]
本实施例的用微生物植物提取的生物农药及其应用，具体如下：
[0081]
(1)种子制备：从假单胞菌(pseudomonas)、链霉菌属(streptomyces)、红球菌(rhodococcus)、黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)、分支杆菌属(mycobacterium)等菌的固体平板上挑去菌落接种到如下培养基中：以重量百分比计，酵母粉0.3％、蛋白胨0.6％、葡萄糖0.4％、麦芽糖0.1％、氯化钠0.5％、其余为水，转移至于30℃的恒温培养中，培养1d，分别得到各个菌种的种子液。
[0082]
(2)合成：
[0083]
接种10％的接种量，将黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)等三个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括木质纤维素及其水解液、植物油脂、葡萄糖等为主要碳源，通气量1.0vvm下培养，温度控制在28℃，搅拌强度200rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源10％(木质纤维素及其水解液：植物油脂：葡萄糖＝1：7：2，质量比)、硝酸钠0.5％、酵母粉：0.3％、磷酸二氢钾0.25％、七水硫酸镁0.05％、二水合氯化钙0.005％、七水合硫酸亚铁0.005％、硫酸锰0.002％，余量为水。培养14d，得到各个菌的发酵液。
[0084]
接种8％的接种量，将假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)等两个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括植物油脂、麦芽糖等为主要碳源，通气量0.4vvm下培养，温度控制在37℃，搅拌强度200rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源8％
(植物油脂：麦芽糖＝6：4，质量比)、硝酸钠0.5％、酵母粉：0.04％、磷酸二氢钾0.45％、七水硫酸镁0.05％、二水合氯化钙0.02％、七水合硫酸亚铁0.01％，余量为水。培养10d，得到各个菌的发酵液。
[0085]
接种5％的接种量，将分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)等两个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括蔗糖、淀粉及其水解液、麦芽糖等为主要碳源，通气量0.8vvm下培养，温度控制在30℃，搅拌强度300rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源4％、硝酸钠0.4％、酵母粉：0.4％、磷酸二氢钾0.7％、七水硫酸镁0.1％、二水合氯化钙0.1％、七水合硫酸亚铁0.01％，余量为水。培养6d，得到各个菌的发酵液。
[0086]
(3)分离：上述步骤(2)发酵过程得到的发酵液，经过80℃高温灭菌2h后；将灭菌后发酵液进行过滤去除菌体，过滤方式可以采用膜或者过滤袋等；得到除掉菌体的液体，进过高速离心去除残余原料；将离心后得到的液体，调节ph至于3以下，在温度4℃下冷藏24h。
[0087]
(4)提取与浓缩：
[0088]
采用乙酸乙酯分别萃取黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)等分离液，然后收集有机相；将上述分离得到的液体，与不同体积的溶剂充分混合后，静置分离。然后在40℃下真空浓缩2倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在60℃下真空浓缩。
[0089]
采用有机膜和无机陶瓷膜组合对假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)等分离液提取，膜的截留分子量为20kd-100kd，得到的滤液然后在40℃下真空浓缩5倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在60℃下真空浓缩。
[0090]
采用有机膜和无机陶瓷膜组合分别对假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)、分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)等分离液提取，膜的截留分子量为20kd-100kd，得到的滤液然后在60℃下真空浓缩10倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在60℃下真空浓缩。
[0091]
(5)混合：将第4步分离后的发酵液按照比例混合。其中黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)、假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)、分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)分离液等7个浓缩液比例为3：3：1：1：1：1：1，得到生物农药制品。
[0092]
(6)应用测试：将上述过程得到的生物农药用于农作物病害防治测试。制备固体培养基，将生物农药稀释一定倍数(200,2000,20000倍)，均匀涂布在固体培养基表面，然后将农作物病菌(ustilaginoidea virens(cke,)tak，绿黑穗病)点样在固定平板的中央。最后放置于培养箱下培养观察其抑制功能。从表2和图2结果可以看出，在生物农药抑制很高倍数后，仍然有很高的抑制效率，尤其在稀释2000倍以内仍然保持75％以上有效抑制率。
[0093]
表2 生物农药对ustilaginoidea virens的抑制效果
[0094][0095]
[0096]
实施例3
[0097]
本实施例的用微生物植物提取的生物农药及其应用，具体如下：
[0098]
(1)种子制备：从假单胞菌(pseudomonas)、链霉菌属(streptomyces)、红球菌(rhodococcus)、黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)、分支杆菌属(mycobacterium)等菌的固体平板上挑去菌落接种到如下培养基中：以重量百分比计，酵母粉0.3％、蛋白胨0.6％、葡萄糖0.4％、麦芽糖0.1％、氯化钠0.5％、其余为水，转移至于30℃的恒温培养中，培养3d，分别得到各个菌种的种子液。
[0099]
(2)合成：
[0100]
接种5％的接种量，将黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)等三个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括木质纤维素及其水解液、植物油脂、葡萄糖等为主要碳源，通气量1.0vvm下培养，温度控制在25℃，搅拌强度200rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源9％(木质纤维素及其水解液：植物油脂：葡萄糖＝0.3：8：1.7，质量比)、硝酸钠0.5％、酵母粉：0.3％、磷酸二氢钾0.25％、七水硫酸镁0.05％、二水合氯化钙0.005％、七水合硫酸亚铁0.005％、硫酸锰0.002％，余量为水。培养14d，得到各个菌的发酵液。
[0101]
接种8％的接种量，将假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)等两个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括植物油脂、麦芽糖等为主要碳源，通气量0.4vvm下培养，温度控制在37℃，搅拌强度200rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源8％(植物油脂：麦芽糖＝9：1，质量比)、硝酸钠0.5％、酵母粉：0.4％、磷酸二氢钾0.25％、七水硫酸镁0.05％、二水合氯化钙0.01％、七水合硫酸亚铁0.01％，余量为水。培养15d，得到各个菌的发酵液。
[0102]
接种5％的接种量，将分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)等两个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括蔗糖、淀粉及其水解液、麦芽糖等为主要碳源，通气量1.0vvm下培养，温度控制在34℃，搅拌强度300rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源6％、硝酸钠0.2％、酵母粉：0.6％、磷酸二氢钾0.35％、七水硫酸镁0.21％、二水合氯化钙0.05％、七水合硫酸亚铁0.02％，余量为水。培养10d，得到各个菌的发酵液。
[0103]
(3)分离：上述步骤(2)发酵过程得到的发酵液，经过120℃高温灭菌2h后；将灭菌后发酵液进行过滤去除菌体，过滤方式可以采用膜或者过滤袋等；得到除掉菌体的液体，进过高速离心去除残余原料；将离心后得到的液体，调节ph至于3以下，在温度4℃下冷藏24h。
[0104]
(4)提取与浓缩：
[0105]
采用乙酸乙酯分别萃取黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)等分离液，然后收集有机相；将上述分离得到的液体，与不同体积的溶剂充分混合后，静置分离。然后在40℃下真空浓缩5倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在40℃下真空浓缩。
[0106]
采用有机膜和无机陶瓷膜组合对假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)等分离液提取，膜的截留分子量为20kd-100kd，得到的滤液然后在50℃下真空浓缩8倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在40℃下真空浓缩。
[0107]
采用有机膜和无机陶瓷膜组合分别对假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)、分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)等分离液提取，膜的截留分子量为20kd-100kd，得到的滤液然后在60℃下真空浓缩15倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在40℃下真空浓缩。
[0108]
(5)混合：将第4步分离后的发酵液按照比例混合。其中黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)、假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)、分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)分离液等7个浓缩液比例为6：6：3：3：3：1：1，得到生物农药制品。
[0109]
(6)应用测试：将上述过程得到的生物农药用于农作物病害防治测试。制备固体培养基，将生物农药稀释一定倍数(200,2000,20000倍)，均匀涂布在固体培养基表面，然后将农作物病菌(magnaporthe oryzae，稻热病菌)点样在固定平板的中央。最后放置于培养箱下培养观察其抑制功能。从表3和图3结果可以看出，在生物农药抑制很高倍数后，仍然有很高的抑制效率，尤其在稀释2000倍以内仍然保持80％以上有效抑制率。
[0110]
表3 生物农药对magnaporthe oryzae的抑制效果
[0111]
不同稀释倍数抑制率％200倍93.022000倍82.3520000倍47.39
[0112]
实施例4
[0113]
本实施例的用微生物植物提取的生物农药及其应用，具体如下：
[0114]
(1)种子制备：从假单胞菌(pseudomonas)、链霉菌属(streptomyces)、红球菌(rhodococcus)、黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)、分支杆菌属(mycobacterium)等菌的固体平板上挑去菌落接种到如下培养基中：以重量百分比计，酵母粉0.3％、蛋白胨0.6％、葡萄糖0.4％、麦芽糖0.1％、氯化钠0.5％、其余为水，转移至于30℃的恒温培养中，培养2d，分别得到各个菌种的种子液。
[0115]
(2)合成：
[0116]
接种5％的接种量，将黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)等三个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括淀粉及其水解液、植物油脂、葡萄糖等为主要碳源，通气量1.0vvm下培养，温度控制在26℃，搅拌强度300rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源12％(淀粉水解液：植物油脂：葡萄糖＝0.3：9.2：0.4，质量比)、硝酸钠0.4％、酵母粉：0.3％、磷酸二氢钾0.25％、七水硫酸镁0.05％、二水合氯化钙0.005％、七水合硫酸亚铁0.005％、硫酸锰0.002％，余量为水。培养14d，得到各个菌的发酵液。
[0117]
接种8％的接种量，将假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)等两个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括植物油脂、麦芽糖等为主要碳源，通气量0.4vvm下培养，温度控制在37℃，搅拌强度200rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源8％(植物油脂：麦芽糖＝9：1，质量比)、硝酸钠0.5％、酵母粉：0.4％、磷酸二氢钾0.25％、七水硫酸镁0.05％、二水合氯化钙0.01％、七水合硫酸亚铁0.01％，余量为水。培养15d，得到各个菌的发酵液。
[0118]
接种5％的接种量，将分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)等两个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括蔗糖、淀粉及其水解液、麦芽糖等为主要碳源，通气量1.0vvm下培养，温度控制在34℃，搅拌强度300rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源10％(比例为2：4：4，质量比)、硝酸钠0.6％、酵母粉：1％、磷酸二氢钾0.35％、七水硫酸镁0.21％、二水合氯化钙0.05％、七水合硫酸亚铁0.02％，余量为水。培养10d，得到各个菌的发酵液。
[0119]
(3)分离：上述步骤(2)发酵过程得到的发酵液，经过120℃高温灭菌2h后；将灭菌后发酵液进行过滤去除菌体，过滤方式可以采用膜或者过滤袋等；得到除掉菌体的液体，进过高速离心去除残余原料；将离心后得到的液体，调节ph至于3以下，在温度4℃下冷藏24h。
[0120]
(4)提取与浓缩：
[0121]
采用乙酸乙酯分别萃取黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)等分离液，然后收集有机相；将上述分离得到的液体，与不同体积的溶剂充分混合后，静置分离。然后在40℃下真空浓缩2倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在60℃下真空浓缩。
[0122]
采用有机膜和无机陶瓷膜组合对假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)等分离液提取，膜的截留分子量为20kd-100kd，得到的滤液然后在60℃下真空浓缩5倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在60℃下真空浓缩。
[0123]
采用有机膜和无机陶瓷膜组合分别对假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)、分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)等分离液提取，膜的截留分子量为20kd-100kd，得到的滤液然后在40℃下真空浓缩10倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在40℃下真空浓缩。
[0124]
(5)混合：将第4步分离后的发酵液按照比例混合。其中黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)、假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)、分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)分离液等7个浓缩液比例为1：1：1：1：1：1：1，得到生物农药制品。
[0125]
(6)应用测试：将上述过程得到的生物农药用于农作物病害防治测试。制备固体培养基，将生物农药稀释一定倍数(2000倍)，均匀涂布在固体培养基表面，然后将农作物病菌(bipolaris maydis，小班病)点样在固定平板的中央。最后放置于培养箱下培养观察其抑制功能。从图4结果可以看出，在生物农药抑制很高倍数后，仍然有很高的抑制效率，尤其在稀释2000倍以内仍然保持60％以上有效抑制率。
[0126]
实施例5
[0127]
本实施例的用微生物植物提取的生物农药及其应用，具体如下：
[0128]
(1)种子制备：从假单胞菌(pseudomonas)、链霉菌属(streptomyces)、红球菌(rhodococcus)、黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)、分支杆菌属(mycobacterium)等菌的固体平板上挑去菌落接种到如下培养基中：以重量百分比计，酵母粉0.3％、蛋白胨0.6％、葡萄糖0.4％、麦芽糖0.1％、氯化钠0.5％、其余为水，转移至于30℃的恒温培养中，培养3d，分别得到各个菌种的种子液。
[0129]
(2)合成：
[0130]
接种5％的接种量，将黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)等三个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括淀粉及其水解液、植物油脂、葡萄糖等为主要碳源，通气量1.0vvm下培养，温度控制在30℃，搅拌强度300rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源10％(淀粉水解液：植物油脂：葡萄糖＝0.3：9.2：0.4，质量比)、硝酸钠0.4％、酵母粉：0.3％、磷酸二氢钾0.25％、七水硫酸镁0.05％、二水合氯化钙0.005％、七水合硫酸亚铁0.005％、硫酸锰0.002％，余量为水。培养14d，得到各个菌的发酵液。
[0131]
接种8％的接种量，将假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)等两个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括植物油脂、麦芽糖等为主要碳源，通气量0.4vvm下培养，温度控制在33℃，搅拌强度200rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源8％(植物油脂：麦芽糖＝9：1，质量比)、硝酸钠0.5％、酵母粉：0.4％、磷酸二氢钾0.25％、七水硫酸镁0.05％、二水合氯化钙0.01％、七水合硫酸亚铁0.01％，余量为水。培养15d，得到各个菌的发酵液。
[0132]
接种5％的接种量，将分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)等两个种子液分别转移到已配制的培养基中，以所述的原料包括蔗糖、淀粉及其水解液、麦芽糖等为主要碳源，通气量1.0vvm下培养，温度控制在30℃，搅拌强度300rpm。培养基为：以重量百分比计，碳源10％(比例为2：4：4，质量比)、硝酸钠0.6％、酵母粉：1％、磷酸二氢钾0.35％、七水硫酸镁0.21％、二水合氯化钙0.05％、七水合硫酸亚铁0.02％，余量为水。培养10d，得到各个菌的发酵液。
[0133]
(3)分离：上述步骤(2)发酵过程得到的发酵液，经过120℃高温灭菌2h后；将灭菌后发酵液进行过滤去除菌体，过滤方式可以采用膜或者过滤袋等；得到除掉菌体的液体，进过高速离心去除残余原料；将离心后得到的液体，调节ph至于3以下，在温度4℃下冷藏24h。
[0134]
(4)提取与浓缩：
[0135]
采用乙酸乙酯分别萃取黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)等分离液，然后收集有机相；将上述分离得到的液体，与不同体积的溶剂充分混合后，静置分离。然后在40℃下真空浓缩2倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在40℃下真空浓缩。
[0136]
采用有机膜和无机陶瓷膜组合对假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)等分离液提取，膜的截留分子量为20kd-100kd，得到的滤液然后在40-60℃下真空浓缩5-10倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在40-60℃下真空浓缩。
[0137]
采用有机膜和无机陶瓷膜组合分别对假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)、分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)等分离液提取，膜的截留分子量为20kd-100kd，得到的滤液然后在60℃下真空浓缩15倍，并收集溶剂以便循环使用。该过程也可以通过有机膜或者陶瓷膜进行提取，然后在60℃下真空浓缩。
[0138]
(5)混合：将第4步分离后的发酵液按照比例混合。其中黑粉菌(pseudozyma)、黑穗菌目(ustilaginales)、莫氏黑粉菌属(moesziomyces)、假单胞菌(pseudomonas)、红球菌(rhodococcus)、分支杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)分离液等7个浓缩液比例为1：6：3：1：1：1：1，得到生物农药制品。
[0139]
(6)应用测试：将上述过程得到的生物农药用于农作物病害防治测试。制备固体培养基，将生物农药稀释一定倍数(2000倍)，均匀涂布在固体培养基表面，然后将农作物病菌(rhizoctonia solani，纹枯病)点样在固定平板的中央。最后放置于培养箱下培养观察其抑制功能。从图5结果可以看出，在生物农药抑制很高倍数后，仍然有很高的抑制效率，尤其在稀释2000倍以内仍然保持90％以上有效抑制率。
[0140]
实施例6
[0141]
采用高效液相色谱和质谱联用，气相色谱、nmr等手段对7种生物活性物进行结构鉴定，得出其包含且不仅限于糖酯、脂肽、短肽、有机酸、阳离子多糖等酵母菌发酵提取物、真菌发酵提取物、细菌提取物。
[0142]
实施例7
[0143]
如表4所示，成本估算包括，原料成本、能耗、人工、设备损耗等综合成本，对通过该方法生产的生物农药的成本与目前已有市场购买的农药对比，统一固含量后，比整体降低了30％以上。
[0144]
表4 成本估算
[0145]
成本来源成本(人民币/吨)本生物农药25000-30000市场已有40000-6000
[0146]
以上通过比较实施例说明本发明属于合成生物学和微生物学技术的应用，其制备生物农药方法合理，且合成的生物农药成本低、低碳、环保、安全。
[0147]
从以上结果可以看出，本发明的用微生物植物提取的生物农药对于常见的农作物病害稻瘟病、稻曲病、绿黑穗病、稻热病、玉米小斑病、水稻纹枯病等具有较好的防治作用。具体来说，结合实施例来看，生物农药由微生物菌剂与发酵原料进行发酵得到的发酵液经分离、浓缩、混合而得到，其中微生物菌剂创造性引入假单胞菌pseudomonas、链霉菌属streptomyces、红球菌rhodococcus、黑粉菌pseudozyma、黑穗菌目ustilaginales、莫氏黑粉菌属moesziomyces、分支杆菌属mycobacterium之组合，同时优化了发酵原料，并利用有机溶剂、有机膜或陶瓷膜进行有效提取，经测试，即使生物农药抑制很高倍数后，仍然有很高的抑制效率，尤其在稀释2000倍以内仍然保持70％以上有效抑制率。
[0148]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0149]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。