一种具有ACE抑制活性的沙棘低聚肽的制备方法与流程

一种具有ace抑制活性的沙棘低聚肽的制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物质提取制备技术领域，尤其涉及一种具有ace抑制活性的低聚肽的制备方法。


背景技术：

2.沙棘，拉丁文名：hippophae rhamnoides linn.沙棘是植物和其果实的统称。据测定，沙棘果实中含有多种维生素、脂肪酸、微量元素、亚油素、沙棘黄酮、超氧化物等活性物质和人体所需的各种氨基酸，素有维c之王、生命能源之称。沙棘果实入药具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效。现代医学研究，沙棘可降低胆固醇，缓解心绞痛发作，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用。沙棘籽粕是沙棘提炼完沙棘油后的废料，籽粕中含有丰富的蛋白质、糖类和可食纤维素等多种营养成分，但目前却仅仅是被用作饲料。
3.ace血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme)在人体血压调节系统中发挥着重要的作用，广泛分布在全身的各个组织中，可将血管紧张素i 转化为血管紧张素ⅱ，从而使血管收缩，血压升高。还可以与降压系统中的缓激肽结合使其失去活性，导致人体降压系统失衡。活性肽可以与ace的活性位点结合，抑制其发挥作用。
4.现有技术缺乏对沙棘籽粕在ace抑制肽制备方面的研究，目前沙棘籽粕活性肽的制备工艺首先是沙棘蛋白提取，然后以蛋白为原料进行酶解制备多肽，产品工艺复杂，产品得率不高。此外，现有的工艺未解决肽产品色素残留问题，因而产品纯度不高。因此，如何提高沙棘籽粕活性肽的得率及纯度，并使活性肽具有ace抑制活性，这对沙棘肽的生产应用具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是针对现有技术的缺点，提供一种能制备出ace 抑制肽粉，制备条件温和，方法简单，肽抑制活性高的具有ace抑制活性的沙棘低聚肽的制备方法。
6.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种具有ace抑制活性的沙棘低聚肽的制备方法，其特征在于：以沙棘籽粕粉为原料经酶解、膜分离获得沙棘ace抑制肽，具体包括以下步骤：
7.步骤1，原料预处理：将沙棘籽粕经超微粉碎形成沙棘籽粉后与水混合得到沙棘籽粉悬液；
8.步骤2，蛋白酶解：将沙棘籽粉悬液升温至50-60℃，调节ph至9.5-10.5 后加入沙棘籽粉质量1％的碱性蛋白酶进行水解；水解完成后再分别加入沙棘籽粉质量1％的中性蛋白酶和沙棘籽粉质量0.05％的漆酶继续水解；水解完成后灭活酶然后离心操作，上清液为沙棘蛋白水解溶液；
9.步骤3，膜分离与脱色：将沙棘蛋白水解溶液过超滤膜获得2000da以下组分，通过纳滤膜除盐及小分子量杂质，分离液经活性炭纤维脱色，再经浓缩、喷雾干燥后获得沙棘ace抑制肽。
10.在步骤1中，将沙棘籽粕经超微粉碎过100目筛得到沙棘籽粉，然后与水按1：10的比例混合。
11.在步骤2中，采用碱性蛋白酶(型号为ap200)水解5h，然后加入中性蛋白酶(型号为ef108)和漆酶继续水解3h。
12.在步骤3中，所述活性炭纤维采用500l蒸馏水配合10英寸活性炭纤维制成，脱色时间为1h。
13.本发明的优点如下：1、现有技术首先通过碱提酸沉工艺从沙棘籽粕中提取蛋白，然后再以蛋白为原料进行酶解，由于不同蛋白的等电点不同，部分蛋白未沉淀出来，造成蛋白资源的浪费。本发明直接以沙棘籽粕为原料进行酶解，将蛋白提取与酶解步骤合并，工艺更加简单，同时提高了肽的得率。
14.2、本发明采用ace抑制定向酶解技术，在酶解条件发明中，是以ace抑制活性为指标，在本发明酶解条件下获得的活性肽具有较好的ace抑制活性。同时，现有技术所采用酶主要为生化级别的酶，因而已公开的制备工艺无法应用于实际生产。而本发明紧贴实际生产，采用食品添加剂级别的酶制剂，其工艺条件可应用于功能性食品配料生产。
15.3、脱色采用漆酶与活性炭纤维复合处理，避免了传统化学脱色法对肽产品的破坏，脱色效果更好。
16.另外，得到的超滤液或粉末可以随意添加到其他食品中，可作为功能性食品的添加剂或保健品，应用广泛。
附图说明
17.图1为沙棘ace抑制肽的浓度与抑制活性之间的关系曲线图；
18.图2为沙棘低聚肽抑制ace动力学双倒数图；
19.图3为不同温度处理后沙棘低聚肽的ace抑制率变化状态图；
20.图4为不同ph处理后沙棘低聚肽ace抑制率变化状态图；
21.图5为沙棘低聚肽组分的总离子流图。
具体实施方式
22.下面结合附图通过具体实施方式对本发明做进一步说明：
23.本实施例中，沙棘籽粕ace抑制肽的制备：
24.步骤1，原料预处理：沙棘籽粕经超微粉碎过100目筛得到沙棘籽粉，将沙棘籽粉与水按1：10的比例混合。
25.步骤2，蛋白酶解：沙棘籽粉悬液升温至55℃，调ph至10加入沙棘籽粉质量1％的碱性蛋白酶(安琪公司的ap200)水解5h，再加入沙棘籽粉质量1％的中性蛋白酶(型号为ef108)和沙棘籽粉质量0.05％的漆酶继续水解3h，灭活酶后离心，上清液为沙棘蛋白水解溶解。
26.步骤3，膜分离与脱色：沙棘蛋白水解溶液过超滤膜获得2000da以下组分，通过纳滤膜除盐及小分子量杂质，分离液经活性炭纤维脱色(500l蒸馏水配10 英寸活性炭纤维)1h，再经浓缩、喷雾干燥获得沙棘ace抑制肽。
27.特性研究：
28.1、ace抑制率及ic50的测定
29.配制ph为8.3的硼酸盐缓冲液、8mm的hhl溶液及0.1u/ml的ace溶液，准备三根试管，分别按照表1的参数加入试剂使其反应。反应完成后，在各个试管中加入1.7ml的乙酸乙酯，振荡20s，静置待液体分层。取出1ml 的乙酸乙酯层，放入120℃的恒温干燥箱，干燥30min。干燥完成后，取出试管加入3ml超纯水复溶，调紫外分光光度计228nm，测复溶后溶液的吸光值，计算公式如下：
[0030][0031]
式中：ab：对照管的吸光值；aa：样品管的吸光值；ac：空白管的吸光值
[0032]
表1测定ace抑制率试验的加样量
[0033][0034]
经计算沙棘低聚肽ace抑制率为84.98％，沙棘籽粕ace抑制肽的浓度与抑制率的关系如图1所示，可以看出ace抑制肽的浓度与抑制活性呈现正相关趋势，根据关系曲线可以计算得出ic50为4.358mg/ml。
[0035]
2、计算抑制常数km和vmax
[0036]
将本发明所制备的沙棘多肽稀释为19.5、9.75、0mg/ml，三种浓度的酶解液分别与8.0、4.0、2.0、0.8mmol/l的hhl进行反应。测定其反应速率，以1/v 为纵坐标，1/[s]为横坐标，做lineweaver-burk双倒数图，分析抑制模式，通过直线与横纵坐标的截距，计算抑制常数km和vmax。
[0037]
根据图2分析多肽抑制ace的动力学模式。沙棘低聚肽的双倒数直线与1/[s] 轴相交，说明沙棘低聚肽的抑制类型属于非竞争性抑制。这证明沙棘低聚肽与底物没有竞争关系，可以与ace-hhl复合物或ace活性位点以外的位点结合，改变ace的空间构象，降低其活性。通过横纵坐标的截距可知，19.5、9.75、0 mmol/l的沙棘低聚肽的vmax分别为0.015、0.008、0.006，km为4.29
×
10-3 mol/l，由图2也可得知，沙棘低聚肽的ace抑制率与浓度存在正相关变化，沙棘低聚肽的浓度越高，抑制速率越高，抑制能力越强。
[0038]
3、沙棘低聚肽稳定性研究
[0039]
将本发明所制备的沙棘低聚肽进行稳定性研究，(1)热稳定性研究：肽液在温度为4、20、40、60、80、100℃的水浴锅中水浴2h，冷却至室温，测定肽的ace抑制率。(2)ph稳定性研究：肽液的ph为2、4、6、8、10、12，37℃保温2h后，将其ph调节至8.3，测定其肽的ace抑制率。(3)消化道稳定性：称取0.1g肽冻干粉溶于0.1m的hcl溶液中，配制为1％(w/v)的溶液，调 ph为2，加入1％(w/w)的胃蛋白酶，37℃水解3h，沸水浴灭酶15min，再用 1m的naoh调酶解体系ph至8，加入1％(w/w)的胰蛋白酶，37℃水解3h，沸水浴灭酶活，测定最终酶解体系的
ace抑制率。
[0040]
由图3和图4沙棘低聚肽不同温度和不同ph处理2h后的抑制率测定结果可知，抑制率并未发生较大变化，具有良好的热稳定性及ph稳定性。若将其应用于工业生产是完全可行的，且小肽的结构不易被酸碱及高温的条件所破坏。
[0041]
利用胃蛋白酶及胰蛋白酶对肽进行消化，检测出1％(w/v)浓度的肽液消化后的ace抑制率为67.46
±
3.83％，未消化的同浓度的肽液的ace抑制率为 70.24
±
2.06％，稍高于被消化后的肽的ace抑制率。这是由于多肽被胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解，结构被破坏，变成了无活性片段。因此，沙棘籽粕ace抑制肽在消化后依旧具有较好的抑制能力，这与抑制肽中含有大量的疏水性残基有关，疏水性残基含量越多，肽的抑制活性可留存的能力越强。
[0042]
4、沙棘低聚肽氨基酸组成研究及肽段特性检测
[0043]
取一定量沙棘低聚肽样品，以6m hcl在110℃下水解22小时，取出后以 naoh中和，然后进行过滤离心，取上清液测定。高效液相色谱仪参数，色谱条件：柱温40℃；流速稳定在1.0ml/min；紫外检测器条件：波长338nm；22.5min 时波长改为262nm；荧光检测器条件：激发波长340nm，发射波长450nm；22.5 min时改变激发波长为266nm，发射波长为305nm。
[0044]
根据表2分析可知，沙棘籽粕多肽中氨基酸种类丰富，包含17种氨基酸，氨基酸总量为53.61g/100g，其中有27.88％的8种必须氨基酸，含量多的为谷氨酸、精氨酸、天门冬氨酸，这三个氨基酸含量达到了总量的55.47％，蛋氨酸、胱氨酸为限制氨基酸。根据氨基酸的性质进行分类比较发现，酸性氨基酸有 39.33％，百分比最大，其次是疏水性氨基酸，含量为29.24％，碱性氨基酸和中性氨基酸含量较少，分别占比20.92％、11.27％，芳香族氨基酸含量最少，仅为 5.88％，赖氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及脯氨酸这类带正电荷的氨基酸含量也在总量的2～4％。
[0045]
表2沙棘低聚肽氨基酸组成分析表
[0046]
[0047][0048]
采用三合一超高分辨液质联用仪鉴定肽段，毛细管液相色谱条件：分析柱：流动相a：0.1％甲酸；流动相b：0.1％甲酸和80％乙腈；流速：300nl/min。质谱条件：一级质谱参数：resolution：60000；agc target：4.0e5；maximum it： 100ms；scanrange：375-1500；二级质谱参数：resolution：15000；agc target： 5.0e4；maximum it：256ms；scan range mode:auto：m/z normal；hcd collisionenergy(％)：30。利用肽特性计算网站(https://pepcalc.com)计算多肽的等电点(pi)、净电荷及溶解性。
[0049]
利用ace抑制肽的ncbi、uniprot数据库比对检出10条ace抑制肽，测定结果如图5和表3所示。此次测定出的肽段分子量分布在1000-3000da之间，这其中肽段aggggggggggsrrl和ddearinqlfl的分子量较小，稍微大于1kda，其余检测出的肽段均大于1.5kda，原因是由于酶解得到的肽段大多数并未被记录在数据库中而导致结果未被检测出。由此结果可看出这10条肽段中大多数肽c端或n端含有疏水性氨基酸，或是带正电荷的氨基酸残基，而且肽段中也含有大量的疏水性、芳香族氨基酸。另外，现有研究表明肽中的精氨酸也会提高肽抑制ace的活性，而此次筛选出的肽段中绝大多数均含有精氨酸，这与其他研究中筛选出的ace抑制肽的氨基酸序列具有相似结果。
[0050]
表3肽段检测结果及理化特性
[0051]
序号氨基酸序列质荷比等电点静电荷溶解性1frvawtekndgqraplann2187.105ph9.861good2liisvayarvakklwlcnmigdvtteqy3198.705ph8.70.9poor3virsrasdgclevkefedipp2360.191ph4.16-2.1good4aggggggggggsrrl1172.588ph12.12good5lqpregpaggttalreelslgpeaaldtppagp3268.681ph3.88-3good6ddearinqlfl1333.675ph3.54-2good7favstltsydwsdrddatqgrkl2632.264ph4.19-1good8rqlslegsglgvedlkdn1929.988ph3.93-2good9gggggggggggggggigggggggggggar1841.798ph10.841good10kealgegcfgnridrigdvsgmgcnrrtpap3276.578ph8.070.9good
[0052]
通过肽特性计算网站，显示出这10条肽的等电点分布范围广泛，分布在ph 3-12之间，静电荷分布在-2.1到2，肽段2的溶解性较差，多数肽的溶解性好，这表明可利用这些肽良好的溶解性，将其作为粉剂型或冲泡型保健品辅料或原料进行加工生产。
[0053]
以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明的实施范围，即凡依本技术范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。