一种鼠源IgM亚型单克隆抗体纯化方法与流程

一种鼠源igm亚型单克隆抗体纯化方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种鼠源igm亚型单克隆抗体纯化方法。


背景技术：

2.单克隆抗体共有5种亚型，其中igm亚型抗体占血清免疫球蛋白总量的5％～10％，它是五聚体，由五个单体igg组成，通过二硫键连接，分子量大约是900kda。
3.igm是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，是机体抗感染的先头部队，血清中检出igm，提示新近发生感染，可用于感染的早期诊断。经过一段时间，igm抗体量逐渐减少而消失。igm的临床意义，增高：胎儿宫内感染、慢性或亚急性感染、疟疾、支原体肺炎、巨球蛋白血症等；降低：遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合症、选择性igm缺乏症，蛋白丢失性肠病、烧伤、免疫抑制剂治疗等。
4.硫酸铵沉淀是免疫球蛋白分离的常用方法，高浓度盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质分子竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，从而从溶液中沉淀下来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质，也称为盐析。硫酸铵的分级沉淀则是利用每种蛋白质的溶解度的不同，从而实现不同蛋白质的分离，低溶解度的硫酸铵能够沉淀少部分杂蛋白，再使用高一点溶解度的硫酸铵，将目的蛋白与更难沉淀的蛋白分离开，这一步骤能够有效去除杂蛋白，得到较为纯净的目的蛋白。
5.在过去的纯化方法中，大多数采用辛酸硫酸铵或者亲和层析的方法，该方法得到的抗体不稳定，容易出现沉淀，特别是对分子量大且含量低的igm亚型抗体来说，而且纯度较低，在后期运用中达不到检测标准。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种鼠源igm亚型单克隆抗体纯化方法，在硫酸铵分级沉淀后再添加一步离子交换层析，可以得到更加纯净的蛋白。
7.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.一种鼠源igm亚型单克隆抗体纯化方法，包括以下步骤：
9.s1、鼠源igm亚型腹水的深层过滤，得到浊度低于40ntu的溶液；
10.s2、取步骤s1溶液，加入饱和硫酸铵至其浓度为33％，充分搅拌，使其沉淀，低温高速冷冻离心机离心；
11.s3、得到步骤s2上清溶液，添加饱和硫酸铵溶液至其浓度达到45％，充分搅拌，使其沉淀，低温高速冷冻离心机离心，弃去上清，留沉淀；
12.s4、用平衡缓冲液重悬步骤s3的沉淀，使其溶解，溶解后的溶液透析在平衡缓冲液中；
13.s5、装填100ml q柱填料至中空层析柱中，安装完后将层析柱连接akta设备，用0.1m naoh冲洗q柱2-3个柱体积，再用纯化水洗涤5个柱体积，最后用平衡缓冲液平衡q柱4个柱体积进行柱准备；
14.s6、将步骤s4得到的溶液过滤后，上步骤s5的q柱，上样结束后使用平衡缓冲液平衡，再用解离缓冲液进行解离；
15.s7、步骤s6解离完成的样品用0.22-0.45μm滤膜过滤后，添加proclin 300，-20℃长期保存。
16.所述步骤s1中，深层过滤的方法是：首先水浴解冻腹水，解冻后的腹水先用脱脂棉过滤去除油脂；然后使用孔径为0.04-9μm的深层过滤器过滤并收集滤液，收集的滤液为浊度低于40ntu的溶液。深层过滤后可以发现腹水透光率明显提升。
17.所述步骤s2中，低温高速冷冻离心机的设置参数为9000rpm、4℃、10分钟。
18.所述步骤s3中，低温高速冷冻离心机的设置参数为9000rpm、4℃、10分钟。
19.所述步骤s4中，透析去除饱和硫酸铵，并置换成平衡缓冲液10mm pb 30mm nacl，透析比例1:50，每次透析时间不短于4h，不超过24h，透析两次。
20.所述步骤s6中，s4透析好的溶液进行上样，使溶液中的目的蛋白充分与q柱结合，杂蛋白则不和q柱结合从而流出，在线监测uv值，上样结束后并用平衡缓冲液平衡至uv至为0保持不变；
21.所述步骤s6中，所述解离缓冲液为10mm pbs，解离与q柱结合的目的蛋白，得到igm亚型单克隆抗体，在线监测uv值，当uv值升至200mau时，开始收集，降至200mau以下，收集结束。
22.所述步骤s6解离结束后，使用10mm pb 1.4m nacl清洗q柱，洗干净q柱中其他杂蛋白，至uv值显示为0，再用纯化水洗涤5个柱体积；q柱长期不使用则柱内填充20％乙醇，4-8℃保存。
23.所述pb和pbs的ph＝7.4。
24.q柱是强阴离子交换层析柱，它的缓冲液ph的范围更广，解离过程中可以通过不同蛋白的带电荷量洗脱不同的蛋白，从而实现蛋白分离过程。
25.硫酸铵分级沉淀与离子交换层析结合的方法，进一步提高了抗体的纯度，且纯化方法较其他纯化方法温和，对抗体活性没有任何损伤。硫酸铵分级沉淀的成本较低，一次性可处理大体积的腹水，自动化设备akta的使用，实现了抗体稳定生产的批量化和规模化。辛硫工艺与新工艺得到的产品hplc纯度对比图，新工艺的产品的纯度达到96％。
26.有益效果：
27.本发明属于igm抗体纯化的一种方法，腹水进行深层过滤，纯化使用硫酸铵分级沉淀和离子交换层析联合的方法，该纯化方法对抗体没有伤害，抗体稳定无沉淀，并且纯度达到96％以上，通过自动化设备的生产，大大提高了纯化效率，实现igm抗体的生产化，具有重大价值。
附图说明
28.图1是步骤s6自动化设备纯化图谱；
29.图2是步骤s6抗体优化后纯度色谱图；
30.图3是步骤s6纯化得到的抗体的电泳图，泳道1为鼠源igm抗体还原条带；泳道2为鼠源igm抗体经过冻融三次的还原条带；泳道3为marker；泳道4为鼠源igm抗体非还原条带；泳道5为鼠源igm抗体经过冻融三次的非还原条带；
31.图4辛硫工艺与本发明工艺得到的产品hplc纯度对比图，上图是辛硫工艺的，下图是本发明优化后的；
32.图5对照实验辛硫工艺做出来的igm的电泳图，可以看出纯度较优化后的低很多，前两条泳道是辛酸硫酸铵工艺纯化出来的igm的还原性sds-page条带，后面两条是它对应的非还原条带，因为igm分子量较大，所以它下不来，在泳道槽上方，下面则是杂带；
33.图6深层过滤前后对比图。
具体实施方式
34.下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
35.一种鼠源igm亚型单克隆抗体纯化方法，包括以下步骤：
36.s1、鼠源igm亚型腹水的深层过滤，去除腹水中的杂质，得到浊度低于40ntu的溶液；
37.s2、取100ml步骤s1溶液，加入等体积的平衡缓冲液10mm pb 30mm nacl搅拌均匀，随后添加等体积的饱和硫酸铵溶液，充分搅拌10分钟，低温高速冷冻离心机离心，留上清、弃沉淀；
38.s3、得到步骤s2上清溶液，添加63.6ml饱和硫酸铵溶液，充分搅拌10分钟，低温高速冷冻离心机离心，弃去上清，留沉淀；
39.s4、取50ml平衡缓冲液10mm pb 30mm nacl重悬步骤s3的沉淀，使其溶解，溶解后的溶液透析在平衡缓冲液10mm pb 30mm nacl中；
40.s5、装填50mlq柱填料至中空层析柱中，安装完后将层析柱连接akta设备，用0.1m naoh冲洗q柱5个柱体积，用纯化水洗涤5个柱体积，用平衡缓冲液10mm pb 30mm nacl平衡q柱4个柱体积进行柱准备；
41.s6、将步骤s4得到的溶液过滤后，上步骤s5的q柱，上样结束后使用平衡缓冲液平衡，再用解离缓冲液进行解离；
42.s7、步骤s6解离完成的样品用0.22μm滤膜过滤后，添加0.1％proclin 300，-20℃长期保存。
43.进一步的，所述步骤s1中，深层过滤的方法是：首先水浴解冻腹水，解冻后的腹水先用脱脂棉过滤去除油脂；然后使用孔径为0.04-9μm的深层过滤器过滤并收集滤液，收集的滤液为浊度低于40ntu的溶液。
44.进一步的，所述步骤s2、s3中，低温高速冷冻离心机的设置参数为9000rpm、4℃、10分钟。
45.进一步的，所述步骤s4中，透析条件为溶解液：平衡缓冲液＝1:50，每次透析时间不短于4h，不超过24h，透析两次。
46.进一步的，所述步骤s6中，平衡缓冲液10mm pb 30mm nacl平衡至uv值为0；
47.进一步的，所述步骤s6中，解离收集方法为用10mm pb 150mm nacl解离，在线监测uv值，当uv值升至200mau时，开始收集，降至200mau以下，收集结束。
48.进一步的，所述步骤s6解离结束后，使用10mm pb 1.4m nacl清洗q柱，至uv值显示为0，再用纯化水洗涤5个柱体积；q柱长期不使用则柱内填充20％乙醇，4-8℃保存。
49.优选的所述pb的ph＝7.4。
50.实施例1
51.腹水的深层过滤采用的滤器型号为cdcfcdcsd0140pcp(cobetter filtration equipment co.,ltd)。抗体的纯度由高效液相色谱法(hplc)和凝胶电泳(sds-page)检测。将6μg(300μg/ml，20μl)上样到高效液相色谱柱(aglient technologies sec-300)，以高效液相层析系统进行分离15分钟。凝胶电泳(sds-page)采用12％凝胶进行电泳，marker购自于solarbio life science。
52.1、取鼠源igm亚型腹水水浴解冻，解冻后的腹水先用脱脂棉过滤以去除较大颗粒的杂质，如油脂等杂质，后用孔径为0.04-9.0μm的深层过滤器过滤并收集滤液，得到浊度低于40ntu的溶液。
53.2、取步骤1的腹水用等体积的平衡缓冲液(10mm pbs(ph7.4))稀释，用搅拌器充分混匀，使腹水置于缓冲体系中，边搅拌边缓慢加入1倍腹水体积的饱和硫酸铵溶液使硫酸铵终浓度为33％，加完后继续搅拌10分钟，搅拌结束用高速冷冻离心机(湘仪，gl-21m)4℃、9000rpm离心10分钟，留上清，去沉淀，此时的沉淀为腹水中的杂蛋白。然后再边搅拌边缓慢加入0.636倍腹水体积的饱和硫酸铵溶液使硫酸铵终浓度为45％，充分搅拌10分钟，搅拌结束后高速冷冻离心机(湘仪，gl-21m)4℃、9000rpm离心10分钟，留沉淀，去上清。沉淀用一定腹水体积的平衡缓冲液(10mm pbs(ph7.4))重悬，保证此时溶液的浓度不低于6mg/ml，不高于10mg/ml。重悬完成后用缓冲液(10mm pbs(ph7.4))透析，以去除饱和硫酸铵，置换缓冲液，透析次数不少于两次，每次的透析比例为1：50，透析时间不低于4小时，不超过24小时。
54.3、取步骤2透析后的样品，用0.02μm的滤器过滤后，采用ge healthcare公司的q sepharose fast flow基质进行阴离子交换层析。(柱体积在200ml)使用的层析系统为sepure(sdl 030-f2)，层析柱先用0.1m naoh清洗两倍柱体积，后用去离子水冲洗两倍柱体积，最后用平衡缓冲液(10mm pbs(ph7.4))平衡至少四倍柱体积，直至uv检测值不变，平衡结束后调零。上过滤后的样品，流速10ml/min，压力值不超过0.5mpa，收集流出，当uv检测值升至200mau开始收集，直到降至200mau。此时收集得到的为目的抗体。再用高盐溶液清洗柱子，此时流出来的蛋白为杂蛋白，最后用水冲洗，层析柱用20％乙醇保存并至于4℃环境中。收集到的目的抗体的ph应在7.3-7.5之间，浓度在3-5mg/ml左右。
55.4、取步骤3得到的目的抗体用0.02-0.2μm的深层过滤器(cdfcdcsdh0hppcp,cobetter filtration equipment co.,ltd)过滤并收集滤液，并添加防腐剂proclin 300，-20℃长期保存。
56.得到的抗体纯度相较于之前工艺提高很多，达到了98％以上，可从图2色谱图看出。
57.对比例1：
58.优化前的实验：采用的是辛酸硫酸铵沉淀的方法，原理是辛酸是短链脂肪酸，在酸性条件下加入辛酸沉淀杂蛋白(白蛋白和非ig蛋白)，再用硫酸铵盐析将ig沉淀下来。
59.包括如下步骤：
60.1)取过滤好的腹水，加入三倍腹水体积的60mm醋酸缓冲液(ph4.4)，充分混匀，搅拌状态下再缓慢加入0.1倍腹水体积的辛酸，加完后搅拌30分钟；
61.2)搅拌完成，4℃离心30分钟，离心后过滤去除辛酸，将上清的ph调至7.2，4℃放置1小时以上；
62.3)取出上清，搅拌状态下加入上清的0.277倍硫酸铵固体，搅拌30分钟，搅拌完成，4℃离心30分钟，离心后留沉淀，沉淀用透析缓冲液10mm pbs(ph7.4)重悬，并透析于此，透析四次，透析比例1:50。
63.缺点：此方法得到的igm抗体的得率较低，而且在长时间处于酸性条件下抗体不稳定，受到破坏。对于大批量腹水的辛酸处理，所需试剂较多，离心时间也多。抗体纯度达不到要求。
64.图5是通过对照实验做出来的igm的电泳图。可以看出纯度较优化后的低很多，前两条泳道是辛酸硫酸铵工艺纯化出来的igm的还原性sds-page条带，后面两条是它对应的非还原条带，因为igm分子量较大，所以它下不来，在泳道槽上方，下面则是杂带。
65.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。