一种基于适配体构象变化的NAP2电化学传感检测方法

一种基于适配体构象变化的nap2电化学传感检测方法
技术领域
1.本发明属于传感器的技术领域，具体涉及一种基于适配体构象变化的nap2电化学传感检测方法。


背景技术：

2.肺癌作为全球第二大癌症，同时也是全世界最致命的癌症，是一个重大的公共卫生问题。由于其一般于晚期被诊断出来，此时的治疗效果不如早期的治疗效果显著，所以肺癌的存活率极低。目前诊断肺癌的常规方法有超声、电子计算机断层扫描(ct)、核磁共振成像(mri)、正电子发射型计算机断层显像(pet)、骨扫描和活检。其中，病理学检查是诊断肺癌的金标准。这些方法大都基于肿瘤的表型特征进行检测，对于亚毫米大小的肿瘤的分辨能力很差，因此，对于早期肿瘤的诊断与检测效率低下，此外，这些方法的操作性也十分复杂，分辨率很低，很有可能延误疾病的诊治，造成更大的损失。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于：针对现有技术的不足，提供一种基于适配体构象变化的nap2电化学传感检测方法，能够精准检测出nap2的浓度，为肺癌临床诊疗提供实时定量依据，同时也可根据测量的生物标志物对修饰电极的适配体进行相应变换，完成对其他种类生物标志物的定量检测。
4.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
5.一种基于适配体构象变化的nap2电化学传感检测方法，包括：
6.步骤一、基于适配体修饰的电极，对nap2的特异性捕获，适配体变为发卡结构，使双螺旋茎进行螺旋间堆叠，产生电化学信号；
7.步骤二、通过方波伏安法和差分脉冲伏安扫描法对适配体构象变进行测定。
8.优选的，所述步骤二中，采用方波伏安法对传感器的捕获性能进行测定，包括：
9.对空白浓度的缓冲液以及加入nap2溶液分别进行方波伏安法扫描，含有nap2的扫描曲线峰值电流大于空白缓冲液的电流。
10.优选的，所述步骤二中，采用差分脉冲伏安法对一系列nap2标准液进行扫描，包括：
11.采用pbs溶液对nap2标准品进行稀释，根据浓度梯度所对应的差分脉冲曲线峰值电流与空白对照电流差值与nap2浓度的对数绘制浓度梯度曲线，并对浓度分别进行拟合，得到线性拟合曲线。
12.优选的，初始电压为0.45v，终止电压为-0.1v，增量为2mv，振幅为0.2v，频率为15hz。
13.优选的，初始电压为-0.4v，终止电压为0.4v，增量为5mv，振幅为50mv，脉宽为0.05s，周期为0.5s。
14.优选的，浓度梯度范围设置为0-1000ng/ml，共九个浓度，在-0.1v附近出现峰值电
流，并且随着nap2浓度的提高，差分脉冲电化学曲线的峰值电流逐渐增加，对前四个浓度与后五个浓度分别进行拟合，得到线性拟合曲线。
15.优选的，还包括：
16.通过计时电流法将金离子还原为金纳米颗粒后，修饰在丝网印刷电极上；
17.通过化学吸附，将带有巯基的适配体与金键合，最后用巯基己醇对电极进行封闭。
18.优选的，包括：
19.2.1、将1％的氯金酸与0.5m的硫酸钠1：1等体积混合，取100μl的混合溶液滴加到洗净后的丝网印刷电极上，利用计时电流法在电极上修饰金纳米颗粒；
20.2.2、在金纳米颗粒修饰电极上，通过化学键和作用固定nap2适配体；
21.2.3、对适配体修饰的电极进行封闭；
22.2.4、对修饰电极进行特异性实验测量。
23.本发明的有益效果在于，本发明采用成键刚性较强的鸟嘌呤和胞嘧啶组成适配体的双螺旋茎，适配体对nap2进行特异性捕获后改变构象，变为发卡结构，使双螺旋茎进行螺旋间堆叠，较强的刚性使其更容易直立，促进电子转移，通过π-π堆叠产生电流，增加检测的灵敏度。检测构象变化采用电化学传感的方法，将生物变化可视化，首先通过计时电流法将金纳米颗粒电沉积在丝网印刷电极上；然后利用金硫键将适配体捕获链键合在电极表面；并且将互补链与捕获链相结合；接着用巯基己醇对电极进行封闭；最后采用差分脉冲伏安法，实现对nap2的高灵敏特异性检测。基于适配体构象变化的电化学传感检测方法能够精准检测出nap2的浓度，为肺癌临床诊疗提供实时定量依据，同时也可根据测量的生物标志物对修饰电极的适配体进行相应变换，完成对其他种类生物标志物的定量检测。本发明的适配体可以特异性识别nap2并将其捕获，捕获nap2后会发生构象变化，双螺旋茎进行螺旋间堆叠，促进电子转移，电子通过π-π堆叠转移至适配体另一端，产生电化学信号。此外，本发明采用金纳米颗粒和适配体修饰电极，电活性物质采用二茂铁，其中，金纳米颗粒具有高导电性，可以增大电极活性表面积，二茂铁可以促进氧化还原反应中电子的转移效率，可以极大地提高检测的灵敏度和精度。最终通过差分脉冲伏安法的扫描结果对nap2的浓度进行分析。
附图说明
24.下面将参考附图来描述本发明示例性实施方式的特征、优点和技术效果。
25.图1为本发明的适配体序列的示意图。
26.图2为本发明的捕获nap2后的适配体构象变化示意图。
27.图3为本发明的适配体修饰镀金电极方波伏安表征图。
28.图4为本发明的不同浓度nap2差分脉冲电化学检测曲线图。
29.图5为本发明的不同浓度nap2的差分脉冲电流峰值与pbs缓冲液下检测的电流峰值差和nap2浓度的对数之间的拟合曲线图。
30.图6为本发明的金纳米颗粒修饰电极过程计时电流图。
31.图7为本发明的金纳米颗粒修饰电极循环伏安表征图。
32.图8为本发明的适配体传感器的特异性分析图。
具体实施方式
33.如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接受的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决技术问题，基本达到技术效果。
34.此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
35.在发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
36.以下结合附图1～8对本发明作进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。
37.基于适配体构象变化的nap2电化学传感检测方法，包括：
38.步骤一、基于适配体修饰的电极，对nap2的特异性捕获，适配体变为发卡结构，使双螺旋茎进行螺旋间堆叠，产生电化学信号；
39.步骤二、通过方波伏安法和差分脉冲伏安扫描法对适配体构象变进行测定。
40.(1.1)采用方波伏安法对传感器的捕获性能进行测定。采用初始电压0.45v终止电压-0.1v，增量2mv，振幅0.2v，频率15hz的参数设置。对空白浓度的缓冲液以及加入一定浓度的nap2溶液分别进行方波伏安法扫描，含有nap2的扫描曲线峰值电流要大于空白缓冲液的电流，参见图3所示，适配体成功将nap2捕获，并在捕获后改变构象，参见图2所示，变为发卡结构，使双螺旋茎进行螺旋间堆叠，促进电子转移，产生电流。
41.(1.2)采用差分脉冲伏安法对一系列nap2标准液进行扫描，参数设置为初始电压-0.4v，终止电压0.4v，增量5mv，振幅50mv，脉宽0.05s，周期0.5s，采用pbs溶液对nap2标准品进行稀释，浓度梯度范围设置为0-1000ng/ml，共9个浓度，测试曲线如图4所示，其中，(a)0ng/ml，(b)0.0001ng/ml，(c)0.001ng/ml，(d)0.01ng/ml，(e)0.1ng/ml，(f)1ng/ml，(g)10ng/ml，(h)100ng/ml，(i)1000ng/ml，首先电极上滴加对照组70μl的pbs缓冲液，得到第一条测试曲线，在电压为-0.090v时，出现峰值电流为60.56μa；之后在电极上滴加70μl的0.0001ng/ml的nap2溶液，得到第二条测试曲线，在电压为-0.095v时，出现峰值电流为62.36μa；在电极上滴加70μl的0.001ng/ml的nap2溶液，得到第三条测试曲线，在电压为-0.090v时，出现峰值电流为63.33μa；在电极上滴加70μl的0.01ng/ml的nap2溶液，得到第四条测试曲线，在电压为-0.090v时，出现峰值电流为63.92μa；在电极上滴加70μl的0.1ng/ml的nap2溶液，得到第五条测试曲线，在电压为-0.090v时出现峰值电流为64.27μa；在电极上滴加70μl的1ng/ml的nap2溶液，得到第六条测试曲线，在电压为-0.090v时出现峰值电流为64.71μa；在电极上滴加70μl的10ng/ml的nap2溶液，得到第七条测试曲线，在电压为-0.090v时出现峰值电流为65.14μa；在电极上滴加70μl的100ng/ml的nap2溶液，得到第八条测试曲线，在电压为-0.090v时出现峰值电流为65.4μa；在电极上滴加70μl的1000ng/ml的
nap2溶液，得到第九条测试曲线，在电压为-0.090v时出现峰值电流为65.53μa。可以得出，在-0.1v附近出现峰值电流，并且随着nap2浓度的提高，差分脉冲电化学曲线的峰值电流逐渐增加。根据浓度梯度所对应的差分脉冲曲线峰值电流与空白对照电流差值δi与nap2浓度的对数绘制浓度梯度曲线，并对前四个浓度与后五个浓度分别进行拟合，得到线性拟合曲线，参见图5所示。
42.通过计时电流法将金离子还原为金纳米颗粒后修饰在丝网印刷电极上；然后通过化学吸附，将带有巯基的适配体与金键合，最后用巯基己醇对电极进行封闭。
43.(2.1)金纳米颗粒修饰：将1％的氯金酸与0.5m的硫酸钠1：1等体积混合，取100μl的混合溶液滴加到洗净后的丝网印刷电极上，利用计时电流法在电极上修饰金纳米颗粒，其中设置电势为e＝-0.8v，沉积时间为300s，参见图6所示。使用循环伏安法对金纳米颗粒修饰电极进行电化学性能表征，裸电极在电压0.22v处出现峰值为11.12ma的氧化峰，沉积300s后在电压0.175v处出现峰值电流为14.85ma，参见图7所示。
44.(2.2)在步骤(2.1)制备的金纳米颗粒修饰电极上通过化学键和作用固定nap2适配体，将90μl的10μm适配体捕获链滴加在步骤(2.1)制备的修饰电极上，静置12h后用纯水冲洗掉多余未吸附的适配体，再加入90μl的10μm5’端修饰二茂铁的适配体互补链，静置3h。
45.(2.3)对步骤(2.2)适配体修饰的电极进行封闭，将3ml的酒精与0.1μl的6-巯基-1-己醇分别添加到塑料管中混合，将步骤(2.2)制备的电极泡在混合液中，静置1h，进行电极的封闭。制成用于检测的适配体修饰的镀金电极。
46.(2.4)对步骤(2.3)修饰电极进行及特异性实验测量，采用4种生物标志物进行特异性实验，分别是癌胚抗原、糖类抗原125、人附睾蛋白4、前列腺特异抗原，取1ng/ml的四种生物标志物各100μl进行差分脉冲伏安法扫描，获得相对应的δi，与1ng/ml的nap2对应的δi进行比较，得到此传感检测方法的特异性，参见图8所示。
47.根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。