一种生物体液样本中多种类固醇激素的提取方法与流程

1.本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种生物体液样本中同时提取多种类固醇激素的液液萃取方法。


背景技术：

2.生物体液中类固醇激素主要包含肾上腺皮质激素和性激素，由胆固醇生成一系列结构类似的代谢物。类固醇激素主要涉及下丘脑-垂体-肾上腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴两大轴。下丘脑-垂体-肾上腺轴在维持体内平衡和快速适应环境中起着关键作用，在个体的情绪调节、行为控制和认知功能中起着重要作用；下丘脑-垂体-性腺轴以正、负反馈调节为基础，在生殖功能方面形成了一个不可分割的相互关系、相互影响的功能单位，影响生物的生长发育和生殖功能。
3.类固醇激素在内分泌疾病的诊断鉴别和治疗监测中发挥了重要作用，如继发性高血压、高雄血症、生长发育异常、不孕不育等。但其在生物体内的含量范围跨度很大，从微克级（μg）到皮克级（pg）不等，因此多种激素在生物样本中同时进行高效快速的提取十分复杂但又非常重要。
4.目前，主要的分离富集纯化激素的方法有液液萃取(lle)、固相萃取(spe)、固相微萃取(spme)等。专利文献cn112051348a公开了19种类固醇激素的固相萃取提取方法，具体包括如下步骤：
①
在血清或血浆样品中加入内标物的溶液进行蛋白沉淀，再加入水调整有机相与水相的体积比，离心，获得预处理样本；
②
对固相萃取板孔进行活化处理，向活化处理后的固相萃取板孔中加入步骤
①
预处理后的样本，然后依次用淋洗液和洗脱液进行处理，采用收集板收集洗脱液处理后的馏分，再向收集板孔内加入水，涡旋混匀，封膜，即萃取得到类固醇激素。但经过进一步研究发现，对于固相萃取操作繁琐，目标物在操作过程中由于固相吸附剂、淋洗液和洗脱液不合适，会导致无法将其有效地洗脱下来。造成回收率偏低，使得检测结果出现较大的误差，尤其是在对痕量化合物的提取过程中，固相萃取可能造成检测结果具有较大的误差。本发明采用液液萃取(lle)，选用有机试剂做萃取剂，通过氮吹复溶，对目标物可以达到较高的萃取率，有机溶剂种类及用量减少、操作简单、环保，富集倍数高。较固相萃取(spe)具有更明显的优势，合适的萃取溶剂和萃取条件影响着液液萃取的回收率。
5.现有技术（刘飞.高效液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中11种合成类固醇类激素多残留.）公开了采用10%碳酸钠溶液3 ml和10 ml乙酸乙酯提取动物源性食品中的合成类固醇类激素药物，氮吹，用50%乙腈水溶液复溶后，冷冻除脂肪，滤膜过滤。现有技术仅公开了动物源性食品中的11种合成类固醇类激素，没有公开生物体液中的类固醇激素的液液萃取方法。生物体液基质相较于动物源性食品更为复杂，且生物体液原始样本更为珍贵，在微量体积的生物体液样本中同时提取多达二十余中类固醇激素的方法更具有挑战性。
6.专利文献cn113933412a公开了一种血液中类固醇激素的检测方法，用含内标的甲
醇和乙腈的混合溶液萃取干血斑样本，其提取方法针对固体的血斑样本，不适用于体液样本，另外，其提取方法仅提取了17α-羟孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇这五种类固醇激素，没有公开还能同时检测体液中其他多种类固醇。
7.专利cn111366671b公开了同时检测血清中18种类固醇激素的液液萃取方法，包括：取一定量待测血清样品，加入混合内标溶液，得到检测液，向检测液中加入900μl甲基叔丁基醚(mtbe)，涡旋3min后，在10000r/min、4℃下冷冻离心3min，取上层清液900μl，n2吹干之后通过衍生化处理，上机检测。
8.但是，上述现有技术鲜有能够一次萃取多种含量差异大、结构不同的包含整个类固醇激素代谢路径的类固醇激素的液液萃取方法。


技术实现要素：

9.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种生物体液样本中类固醇激素的液液萃取方法。采用本发明的萃取方法可以在少量原始样本的情况下，将包含整个类固醇激素代谢路径的29种类固醇激素经过一次简单的液液萃取处理全部提取，本发明的提取方法操作简单，试剂种类和使用量少，不仅节省成本而且减少对环境的影响；本发明的方法通量高，大批量样本分析时间短，不同基质的生物体液样本可同时进行前处理。
10.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供一种生物体液中多种类固醇激素的提取方法，所述方法包括：s1：生物体液中加入内标工作液，混匀，制得含有预处理样本；s2：向s1的预处理样本中加入萃取剂，得到混合溶剂，混匀后离心，使混合溶剂分层为水相与有机相；s3：转移有机相，氮吹至近干；s4：采用溶剂复溶，得到检测样品；所述内标工作液由碳代和/或氘代类固醇激素与体积比30~45%甲醇水溶液配制而成；比如，所述甲醇水溶液为体积比为30%、35%、40%、45%的甲醇水溶液；所述内标工作液与生物体液的体积比为1:20 ~ 1:10；比如，所述内标工作液与生物体液的体积比可以为1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10；所述萃取剂与生物体液的体积比为：3:1 ~ 8:1；比如，所述萃取剂与生物体液的体积比为：3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1；所述复溶采用如下溶剂：甲醇水混合溶液或乙腈水混合溶液。
11.所述类固醇激素包括：孕烯醇酮、孕酮、17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮、11-脱氧皮质酮、皮质酮、18-羟皮质酮、醛固酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质醇、18-羟皮质醇、18-氧皮质醇、可的松、脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄烯二酮、11-羟雄烯二酮、11-酮雄烯二酮、睾酮、双氢睾酮、11-羟睾酮、11-酮睾酮、表睾酮、雄酮、表雄酮、雌酮、雌二醇和雌三醇。
12.所述内标工作液与生物体液的体积比为1:10；和/或，所述萃取剂与生物体液的体积比为：5:1。
13.进一步的，所述萃取剂选自乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、正己烷中一种或多种的混合溶液，优选的，所述萃取剂为乙酸乙酯。
14.优选的，所述萃取剂用量为0.8~1.5ml。
15.优选的，所述萃取剂用量可以为0.8ml、0.9ml、1.0ml、1.1ml、1.2ml、1.3ml、1.4ml、1.5ml。
16.优选的，所述萃取剂用量为1ml。
17.进一步的，所述碳代和/或氘代类固醇激素内标包括：同位素内标为
13
c标记的类固醇激素、同位素内标为
13
c和氘共同标记的类固醇激素、同位素内标为氘代标记的类固醇激素、无同位素标记并的类固醇激素。
18.所述的无同位素标记的类固醇激素与同位素内标为
13
c标记的类固醇激素、同位素内标为
13
c和氘共同标记的类固醇激素或同位素内标为氘代标记的类固醇激素共用内标。
19.进一步的，所述体液包括：血浆、血清、尿液、唾液、乳汁、脑脊液、泪液。
20.优选的，所述体液选自：血浆、血清，更优选的，所述体液为血清或血浆。
21.进一步的，所述s1的混匀时间为1~30min；比如，所述s1的混匀时间可以为1min、1.5min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min、5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min、8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min、12min、12.5min、13.5min、14min、14.5min、15min、15.5min、16min、16.5min、17min、17.5min、18min、18.5min、19min、19.5min、10min、20.5min、21min、21.5min、22min、22.5min、23.5min、24min、24.5min、25min、25.5min、26min、26.5min、27min、27.5min、28min、28.5min、29min、29.5min或30min。
22.优选的，所述s1的混匀时间为2min。
23.进一步的，所述s2的混匀条件为：混匀时间为2.5min~30min，混匀的转速为1500rpm~3000rpm；比如，所述s2的混匀时间可以为2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min、5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min、8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min、12min、12.5min、13.5min、14min、14.5min、15min、15.5min、16min、16.5min、17min、17.5min、18min、18.5min、19min、19.5min、10min、20.5min、21min、21.5min、22min、22.5min、23.5min、24min、24.5min、25min、25.5min、26min、26.5min、27min、27.5min、28min、28.5min、29min、29.5min或30min。
24.优选的，所述s2的混匀时间为5min。
25.所述s2的混匀的转速为1500rpm~3000rpm；比如，所述s2的混匀的转速可以为：1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm、2000rpm、2100rpm、2200rpm、2300rpm、2400rpm、2500rpm、2600rpm、2700rpm、2800rpm、2900rpm、3000rpm。
26.优选的，所述s2的混匀的转速为：2000rpm。
27.所述s2的离心的条件为：离心温度为2~5℃；比如，所述s2的离心温度可以为：2℃、2.5℃、3℃、3.5℃、4℃、4.5℃、5℃；优选为4℃；所述s2的离心转速为12000rpm~13000rpm；比如，所述s2的离心转速为12000rpm、12100rpm、12200rpm、12300rpm、12400rpm、
12500rpm、12600rpm、12700rpm、12800rpm、12900rpm、13000rpm；优选的，所述s2的离心转速为12000rpm。
28.所述s2离心时间为5min~15min。
29.比如所述s2离心时间可以为：5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min、8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min、12min、12.5min、13.5min、14min、14.5min、15min或15.5min。
30.优选的，所述s2离心时间为5min。
31.进一步的，所述s2的混匀条件为：以2000rpm混匀5min；和/或，所述s2的离心的条件为：以4℃，转速为12000rpm，时间为5min。
32.进一步的，所述s3的氮吹的条件为：氮吹温度25~50℃；比如，氮吹温度可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选的，所述氮吹温度为40℃；所述氮吹时间5~30min；比如，氮吹时间可以为：5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min、8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min、12min、12.5min、13.5min、14min、14.5min、15min、15.5min、16min、16.5min、17min、17.5min、18min、18.5min、19min、19.5min、20min、20.5min、21min、21.5min、22min、22.5min、23.5min、24min、24.5min、25min、25.5min、26min、26.5min、27min、27.5min、28min、28.5min、29min、29.5min或30min。
33.优选的，氮吹时间为10min。
34.进一步的，所述s4的溶剂为：甲醇和水混合溶液、乙腈和水的混合溶液；优选的，所述s4的溶剂为体积比20%~50%甲醇水溶液或体积比20%~50%乙腈水溶液，比如体积比20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%的甲醇水混合溶液；比如体积比20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%的乙腈水混合溶液；更优选的，所述溶剂为体积比20~45%的甲醇水混合溶液；更优选为体积比30%的甲醇水混合溶液。
35.和/或，所述s4复溶时间为：1~5min，比如，所述s4复溶时间为：1min、2min、3min、4min、5min，优选为2min。
36.进一步的，本发明的生物体液为人体体液，优选为人体血清或血浆。
37.本发明另一方面提供一种生物体液多种类固醇激素的检测方法，包括如下步骤：取前述方法制备得到的检测样品；采用液相色谱-串联质谱法对检测样品进行检测；基于液相色谱-串联质谱法确定生物体液中多种类固醇激素的种类和/或浓度。
38.所述的液相色谱-串联质谱法为现有技术中采用的方法。
39.对于液液萃取而言，除了萃取剂种类的选择外，萃取剂体积的选择、萃取剂混匀时间的选择、氮吹温度的选择、复溶试剂比例的选择也尤为重要，液液萃取的目的是减少基质干扰，萃取目标待测物，改善分离效果，有利延长色谱柱的使用寿命和减少的仪器的污染。氮吹复溶的目的是浓缩微量的成分，提高检测的灵敏度及选择性。若萃取剂的选择不合适，会导致对待测物和内标的萃取效率低甚至无法萃取出来或者干扰杂质较多，不利于分离。若复溶溶剂的选择不当，会导致检测灵敏度低、选择性低和分离效果差。
40.本发明所要液液萃取的目标对象为生物体液中29种不同含量的类固醇激素，由于生物体液中目标对象的含量差别大，因此，对萃取剂和复溶溶剂的选择尤为困难。本发明尝
试了多种不同的萃取剂和复溶溶剂种类，例如：以正己烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、不同比例的正己烷与乙酸乙酯混合溶剂、不同比例的乙酸乙酯与甲基叔丁醚混合溶剂作为萃取剂，以不同浓度的甲醇水溶液和不同浓度的乙腈水溶液作为复溶剂。结果发现：以乙酸乙酯作为萃取剂，以30%甲醇作为复溶剂，对29种不同类固醇激素的萃取富集效果整体最优。
41.本发明的有益效果：(1)本发明采用液液萃取方法，在生物体液中，通过优选萃取剂、萃取时间、氮吹条件和复溶条件，液液萃取对待测物的富集和基质杂质净化，可以大大提高检测灵敏度，实现对多种不同含量(μg-pg级)的类固醇激素的检测要求。
42.(2)与现有技术中前处理方法相比，发明的方法操作简单，无需大型自动化设备或特殊装置，试剂种类和使用量少，不仅节省成本而且减少对环境的影响；通量高，大批量样本前处理时间短（最快45分钟之内即可完成），不同基质的生物体液样本可同时进行前处理，如血浆和唾液样本。
43.(3)本发明将内标工作液与待测物同步进行前处理，可减少前处理误差，改善基质效应的影响；采用本发明处理后的样品可用于肾上腺皮质和性腺相关疾病的检测。
附图说明
44.图1a、图1b、图1c所示为实施例1中的29种类固醇激素的tic图；其中，在图1a的tic图中，a为epi-andr的峰，b为 andr的峰；图2a、图2b、图2c所示为实施例2中的29种类固醇激素的tic图；其中，在图2a的tic图中，a为epi-andr的峰，b为andr的峰；图3a、图3b、图3c所示为实施例3中的29种类固醇激素的tic图；其中，在图3a的tic图中，a为epi-andr的峰，b为andr的峰；图4a、图4b、图4c所示为对比例1中的29种类固醇激素的tic图；其中，在图4a的tic图中，a为epi-andr的峰，b为andr的峰；图5a、图5b、图5c所示为对比例2中的29种类固醇激素的tic图；其中，在图5a的tic图中，a为epi-andr的峰，b为andr的峰；图6所示为血浆中的29种类固醇激素的待测物的萃取量比较图；图7所示为不同萃取剂体积比的29种类固醇激素的待测物峰面积比较图。
45.图8所示为不同内标体积比的29种类固醇激素的回收率比较图。
46.图9所示为实施例1和对比3提取方法提取的29种类固醇激素的峰面积比较图。
具体实施方式
47.除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
48.本发明中，术语“标准品”是指，由who或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法测定的定值材料。
49.本发明中，术语“氮吹”是指将氮气吹入加热样品的表面进行样品浓缩，具有省时、操作方便、容易控制等特点，可很快得到预期的结果。广泛应用于农残分析、商检、食品、环境、制药、生物制品等行业及用于液相、气相及质谱分析中的样品制备中。
50.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
51.实施例11、材料、试剂与仪器：材料：血浆样品（采集自捐献者）。
52.试剂：甲醇、乙酸乙酯、正己烷、四甲基叔丁醚、乙腈、纯净水，所述试剂均为色谱级。
53.仪器：离心机、涡旋混匀仪、水浴氮吹仪、超声清洗机、移液枪、ep管。
54.内标工作液的配制：取20μl内标储备液于180μl体积比30%甲醇水溶液，涡旋混匀备用，内标工作液浓度如表1所示：表1 内标工作液的浓度2、方法s1：取20μl内标工作液放于ep管内；加入血浆样品200μl；混匀2min，避光静置5min。
55.s2：加入1ml的乙酸乙酯，以2000rpm混匀5min，以4℃，12000rpm离心5min，使水相与有机相分层。
56.s3：取0.8ml有机相，用氮吹仪将有机相吹干，氮吹条件：40℃，10min。
57.s4：用100μl 体积比30%甲醇水复溶并混匀，复溶时间为2min，即萃取得到类固醇激素；所述30%甲醇是通过70ml水中加入30ml纯甲醇，超声15min制备而成。
58.实施例2：材料、试剂与仪器同实施例1；s1：取20μl内标工作液放于ep管内；加入血浆样品200μl；混匀2min，避光静置5min。
59.s2：加入1ml的甲基叔丁基醚，以2000rpm混匀5min，以4℃，12000rpm离心5min，使水相与有机相分层。
60.s3：取0.8ml有机相，用氮吹仪将有机相吹干，氮吹条件：40℃，10min。
61.s4：用100μl体积比30%甲醇水复溶并混匀，复溶时间为2min，即萃取得到类固醇激素；所述30%甲醇是通过70ml水中加入30ml纯甲醇，超声15min制备而成。
62.实施例3：材料、试剂与仪器同实施例1；s1：取20μl内标工作液放于ep管内；加入血浆样品200μl；混匀2min，避光静置5min。
63.s2：加入1ml的甲基叔丁基醚，以2000rpm混匀5min，以4℃，12000rpm离心5min，使水相与有机相分层。
64.s3：取0.8ml有机相，用氮吹仪将有机相吹干，氮吹条件：40℃，10min至吹干。
65.s4：用100μl体积比45%甲醇水复溶并混匀，复溶时间为2min，即萃取得到类固醇激素；所述45%甲醇是通过55ml水中加入45ml纯甲醇，超声15min制备而成。
66.对比例1：材料、试剂与仪器同实施例1；与实施例1的区别仅在于：将实施例1的s2的“加入1ml的乙酸乙酯”调整为“加入1ml的正己烷”，其余步骤同实施例1。
67.对比例2：材料、试剂与仪器同实施例1；与实施例1的区别仅在于：将实施例1的s4的“用100μl 体积比为30%甲醇水复溶”调整为“用100μl 体积比为10%甲醇水复溶”，其余步骤同实施例1。
68.对比例3：材料、仪器同实施例1；与实施例1的区别仅在于：将实施例1的s2调整为：“加入120ul的10%的碳酸钠溶液，再加入1ml的乙酸乙酯，以2000rpm混匀5min，以4℃，12000rpm离心5min，使水相与有机相分层”。（该方法参考“冉小蓉, 张之旭. 液相色谱与三重串联四极杆质谱联用技术用于动物源性食品中11种合成类固醇类激素的检测[c]// 中国有机质谱年会. 2009.”）实验例1血浆中29种类固醇激素的液相色谱串联质谱的检测1、检测过程：用本发明实施例1~3以及对比例1~3的方法对血浆样品和标曲进行处理，并用液相色谱串联质谱仪进行检测。
[0069]
2、检测结果本发明的实施例1的检测结果如图1a、图1b和图1c所示，实施例2的检测结果如图2a、图2b和图2c所示，实施例3的检测结果如图3a、图3b和图3c所示，对比例1的检测结果如图4a、图4b和图4c所示，对比例2的检测结果如图5a、图5b和图5c所示。
[0070]
其中各组分的简写和名称的对应关系为：孕烯醇酮：preg、孕酮：p、17-羟孕烯醇酮：17-oh-preg、17-羟孕酮：17-ohp、11-脱氧皮质酮：11-doc、皮质酮：cort、18-羟皮质酮：18-ohb、醛固酮：ald、11-脱氧皮质醇：11-dof、21-脱氧皮质醇：21-dof、皮质醇：f、18-羟皮质醇：18-ohf、18-氧皮质醇：18-of、可的松：e、脱氢表雄酮：dhea、硫酸脱氢表雄酮：dheas、雄烯二酮：ad、11-羟雄烯二酮：11-ohad、11-酮雄烯二酮：11-kad、睾酮：t、双氢睾酮：dht、11-羟睾酮：11-oht、11-酮睾酮：11-kt、表睾酮：epi-t、雄酮：andr、表雄酮：epi-andr、雌酮：e1、雌二醇：e2、雌三醇：e3。
[0071]
从图1a、图1b、图1c和图4a、图4b、图4c的比较中可以看出，实施例1和对比例1的萃
取方法不同，其提取的效果也不同，如图4a的11-kt、11-kad的谱图，图4a中的11-kt、11-kad的响应值低于图1a，说明对比例1中液液萃取方法提取的对应的物质的量远低于实施例1，又如图4b和图4c中的e、11-dof、cort、21-dof、11-oht、dheas、ald、e3、e2、e1、18-ohf、18-of、f、18-ohb的谱图与图1b和图1c的对应谱图相比，图4b和图4c中的对应物质响应太低或者没有出峰，导致无法定量，而图1b和图1c中的对应物质的谱图峰型对称，基线平滑，能够准确定量。说明对比例1的方法没有同时提取对应的类固醇激素。
[0072]
从图1a、图1b、图1c和图5a、图5b、图5c的比较中可以看出：与实施例1相比，对比例2中preg、p、17-oh-preg、17-ohp、dhea、dheas、e1、e2、e3、dht、andr响应太低，导致无法准确定量，而图1a、图1b、图1c、图2a、图2b、图2c、图3a、图3b和图3c中的对应物质的谱图峰型对称，基线平滑，能够准确定量，从上述图1a、图1b、图1c、图2a、图2b、图2c、图3a、图3b、图3c和图5a、图5b、图5c的对比可以看出，采用本发明的方法能够很好的提取出29种类固醇激素，而当萃取溶剂为1ml正己烷或复溶溶剂为100μl体积比为10%的甲醇水时，不能同时将29种类固醇激素有效地提取。
[0073]
综上所述，本发明的液液萃取方法能够同时有效提取血浆样本中不同含量(μg-pg级)的29种类固醇激素，并且满足检测要求。
[0074]
图1a、图2a、图3a、图4a、和图5a的tic图中，a为epi-andr的峰，b为andr的峰。
[0075]
实验例2萃取剂的比较采用本技术实施例1中的提取方法进行血浆样品的提取，按照实验例1的方法检测。
[0076]
各个萃取剂的萃取效果如图6所示，图6中，以乙酸乙酯作为100%，其他种类萃取剂与乙酸乙酯做比值以比较萃取效果，hex-正己烷，ea-乙酸乙酯，mtbe-四甲基叔丁醚，各个萃取剂的体积比为：hex:ea（3:7）-正己烷:乙酸乙酯=3:7，ea:mtbe（7:3）-乙酸乙酯:四甲基叔丁醚=7:3，ea:mtbe（5:5）-乙酸乙酯:四甲基叔丁醚=5:5，ea:mtbe（3:7）-乙酸乙酯:四甲基叔丁醚=3:7。
[0077]
由图6可知，hex、ea、mtbe、hex:ea（3:7）、ea:mtbe（7:3）、ea:mtbe（5:5）、ea:mtbe（3:7）作为萃取剂的提取效果不如乙酸乙酯，柱状图的各个萃取溶剂中大部分待测物的含量低于乙酸乙酯萃取的，如：cort、18-ohb、11-dof、21-dof、f、18-ohf、18-of、e、dheas、ad、11-ohad、e1、t、11-oht、11-kt、e2、e3、dht、mt等，可以看出，乙酸乙酯作为萃取剂的提取效果最好。
[0078]
实验例3不同萃取剂加入体积的比较采用本技术实施例1中的提取方法进行血浆样品的提取，按照实验例1的方法检测。
[0079]
萃取剂与血浆样品的不同体积比的萃取效果如图7所示，以萃取剂:血浆样品（v/v）=5:1作为100%进行比较，从萃取剂:血浆样品的体积比分别为3:1、5:1与8:1结果来看，萃取剂与血浆样品的体积比例对待测物的响应影响在
±
20%以内，故萃取剂:血浆样品的体积比在3:1~8:1范围内均可以作为合适的萃取剂的量。
[0080]
实验例4 不同内标工作液体积的比较采用本技术实施例1中的提取方法进行血浆样品的提取，内标工作液为实施例1内标工作液，按照实验例1的方法检测。
[0081]
内标工作液加入体积与血浆的体积比提取的后回收率如图8所示，以内标工作液体积:血浆体积=1:10作为100%进行比较，以1:10、1:15、1:20结果来看，内标工作液与血浆的体积比在1:10~1:20之间的回收率差异在
±
10%以内，故内标工作液加入的体积与血浆的体积比在1:10~1:20均可接受。
[0082]
实验例5 萃取方法的比较采用本技术实施例1中的提取方法进行血浆样品的提取，按照实验例1的方法检测；采用本技术对比例3中的提取方法进行血浆样品的提取，按照实验例1的方法检测；比较两次的检测结果的29种类固醇激素的色谱的响应值，结果如图9所示，从图9可以看出，在样品量、总的萃取剂的量、29种类固醇激素的内标工作液添加量相同的前提下，实施例1的方法（不添加10%碳酸钠水溶液）和对比例3的方法（添加120ul的10%碳酸钠水溶液）相比，实施例1的方法提取的类固醇激素响应整体上高于对比例3，证明我们的提取方法明显好于现有技术中的提取方法。
[0083]
综上所述，与其他前处理方法相比，本法操作简单，无需大型自动化设备或特殊装置，试剂使用量少，不仅节省成本而且减少对环境的影响；样本分析时间短，通量高，不同基质可同时进行前处理。
[0084]
本发明使用同位素内标法定量类固醇激素，内标与待测物同步进行前处理，减少了前处理误差，并通过全面的方法学验证，线性、准确度、精密度均满足要求，可用于肾上腺和性腺相关疾病的检测。但需要说明的是，本发明涉及的是样品前处理的过程，其目的并非直接用于疾病的诊断。本发明采用液液萃取方法，液液萃取对目标物的富集和杂质净化，可以大大提高检测灵敏度，实现对多种不同含量(μg-pg级)的类固醇激素的检测要求。
[0085]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。