抗IGFBP7抗体在治疗皮肤病中的应用

抗igfbp7抗体在治疗皮肤病中的应用
技术领域
1.本发明涉及银屑病治疗技术领域，尤其涉及抗igfbp7抗体在治疗皮肤病中的应用。


背景技术：

2.银屑病是一种常见的免疫介导的慢性炎症性皮肤病，其病情顽固，在身体、心理及经济方面对患者造成极大的负担。银屑病在临床和组织病理上有显著的血管异常，在临床上，刮除皮损表面的鳞屑和薄膜可出现点状出血；组织病理上，真皮乳头层毛细血管迂曲扩张，周围伴炎细胞浸润和红细胞外溢。尽管近年靶向银屑病免疫发病机制中关键细胞因子或分子的生物制剂或小分子药物在银屑病治疗上取得了令人满意的疗效，但是，目前尚不能彻底根治银屑病，无法防止其复发。
3.igfbp7，即胰岛素样生长因子结合蛋白7，是一种分子量在30kda左右的分泌型糖蛋白。虽然作为胰岛素生长因子结合蛋白家族的一员，igfbp7对胰岛素样生长因子的亲和力很低，是其他成员的1/1000-1/100，但igfbp7具有许多除胰岛素样生长因子外的功能。研究报道了igfbp7参与细胞衰老、心功能异常、肾功能衰竭以及血管发育等生物学过程，被认为是系统性硬化患者发生肺动脉高压的早期标志物，并且和timp2共同作为急性肾功能衰竭的诊断标志物。
4.利用公共数据库human protein atlas查询了单细胞转录组测序数据中igfbp7在正常皮肤组织各类型细胞的表达水平。在正常皮肤组织中，igfbp7主要在平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞中表达，而角质形成细胞几乎不表达igfbp7。利用组织免疫荧光也证实了这一现象，即igfbp7在表皮中的表达很低，且在正常人皮肤表皮和银屑病患者皮损表皮的表达水平没有明显差异。因此，针对icfbp7在银屑病治疗中的发病机理及研发一种新型的银屑病治疗方法是亟不可待的，寻找银屑病新的治疗靶点和策略显得尤为必要。


技术实现要素：

5.因此，本发明的目的是提供抗igfbp7抗体在治疗皮肤病中的应用，通过抑制银屑病患者皮肤血管中的igfbp7表达用于减轻和治疗银屑病样炎症。
6.本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
7.抗igfbp7抗体在制备用于治疗炎症性皮肤病药剂中的用途。
8.进一步，抗igfbp7抗体在制备用于治疗银屑病药剂中的用途。
9.进一步，抗igfbp7抗体在制备用于治疗红斑狼疮药剂中的用途。
10.进一步，所述抗igfbp7抗体为抗igfbp7单克隆抗体或抗igfbp7中和抗体。
11.进一步，所述银屑病治疗中尤其用于治疗寻常型银屑病。
12.进一步，所述抗igfbp7抗体与药学上可接受的辅料混合制成注射液用于治疗银屑病。
13.进一步，所述药剂用于减轻和治疗银屑病样炎症。
14.进一步，所述药剂通过抑制银屑病患者皮肤血管中的igfbp7表达用于减轻和治疗银屑病样炎症。
15.进一步，抗igfbp7抗体在治疗银屑病时，抗igfbp7抗体用药量为≥2.5μg/kg，优选使用≥5μg/kg的剂量。
16.有益效果：
17.本发明公开了抗igfbp7抗体在制备用于炎症性皮肤病的用于，尤其是针对治疗银屑病药剂或红斑狼疮药剂中的用途，且抗igfbp7抗体通过抑制银屑病患者皮肤血管中的igfbp7表达用于减轻和治疗寻常型银屑病样炎症，使用抗igfbp7抗体后银屑病患者的相关炎症因子表达降低，银屑病炎症减轻，同时降低银屑病患处的表皮厚度、抑制红斑形成，减少鳞屑的产生。在保护血管屏障功能和治疗银屑病上，具有良好的药用前景。
附图说明
18.图1：igfbp7在银屑病患者和健康对照皮肤血管内皮细胞中表达对照图；
19.图2：igfbp7在银屑病患者和健康对照外周血中的水平对照图；
20.图3：抗igfbp7抗体对小鼠银屑病样表型的影响图；
21.图4：抗igfbp7抗体治疗对小鼠皮肤银屑病相关炎症因子表达的影响图；
22.图5：抗igfbp7抗体治疗对人皮肤微血管内皮细胞系血管屏障分子表达的影响图；
23.图6：抗igfbp7抗体治疗对人皮肤微血管内皮细胞系黏附功能的影响图。
具体实施方式
24.以下将结合具体实施例对本发明进行详细说明：
25.实施例1：检测银屑病患者和健康对照皮肤血管内皮细胞中igfbp7的表达
26.(1)人皮肤组织和血液样本获取：
27.共收集了46例银屑病患者和51例健康受试者的皮肤或血液组织样本，进行单细胞转录组测序、组织学和免疫荧光检测、超微结构观察以及分子表达水平检测。该临床样本的采集和体外实验研究计划经空军军医大学西京医院伦理委员会批准(ky20183019-1)，并获得了临床组织捐赠者的知情同意。
28.纳入本实验的银屑病患者为寻常型银屑病，无其他自身免疫性疾病或系统性疾病，未曾使用过生物制剂治疗，采集皮肤或血液组织样本前1个月内无系统性传统治疗，皮肤采集部位及周围5cm2区域在2周内未使用外用药物治疗。银屑病患者的皮肤和血液组织样本在西京皮肤医院常规开展的病理活检和血液化验中获得。
29.纳入本实验的健康受试者与银屑病患者的性别和年龄匹配，其皮肤组织样本在西京医院整形外科、泌尿外科和西京皮肤医院外科中心常规开展的整形手术中获得，并分别由两位皮肤科医师独立判断采集的皮肤组织无明显病变。健康受试者的血液组织样本在体检或捐献中获得。
30.(2)咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型及样本获取：
31.于空军军医大学动物实验中心购买约12只雌性近交系balb/c小鼠，并在空军军医大学动物实验中心spf级实验室以恒温恒湿环境下饲养至6-8周龄后开始动物实验。对小鼠进行编号并随机分为银屑病组和对照组(n＝6只/组)。在实验开始前2天使用电动剃须刀、
剪刀和脱毛膏(veet公司)对小鼠背部备皮，形成约2
×
3cm大小的暴露区域。本研究动物实验已通过空军军医大学实验动物伦理委员会批准。
32.在银屑病组小鼠背部皮肤外涂5％咪喹莫特乳膏(50mg/cm2，1/日，inova pharmaceuticals公司)，持续5天。在造模第6天可观察到小鼠皮肤出现淡红斑和鳞屑，提示银屑病小鼠模型构建成功。其对照组小鼠予背部皮肤和双耳腹侧和背侧皮肤外涂等量的乳膏基质成分。在造模第6天收集两组小鼠背部皮肤组织。
33.(3)免疫荧光法检测igfbp7在银屑病患者和健康人皮肤中的表达：
34.将收集的人皮肤组织和小鼠皮肤组织用质量浓度为4％的多聚甲醛(索莱宝公司，cat.no.p1110)固定后进行石蜡包埋，利用石蜡切片机及染色机进行切片，石蜡切片厚度约为4μm。利用脱蜡机将石蜡切片浸入二甲苯中使石蜡切片自动脱蜡，随后分别浸入无水乙醇2次、95％乙醇1次、90％乙醇1次、75％乙醇1次，随后用蒸馏水清洗2次，每次浸入时间均3-5min。
35.将切片置于柠檬酸钠抗原修复液(1
×
)中高温(98℃)修复20min，静置至恢复室温。再用pbst洗涤切片5min，洗涤3次后，用山羊血清通过点滴法封闭切片。甩去多余的山羊血清后，用抗体稀释液(新赛美生物科技有限公司，cat.no.wb500d)稀释抗igfbp7抗体(体积比1:1000稀释，abcam公司，cat.no.ab74169)和抗cd31抗体(体积比1:1000稀释，abcam公司，cat.no.ab199012)，通过点滴法孵育切片过夜(4℃)。将切片恢复至室温后再次用pbst洗涤切片5min，洗涤3次后，用抗体稀释液(新赛美生物科技有限公司，cat.no.wb500d)稀释荧光标记二抗(体积比1:200稀释，abcam公司，cat.no.ab150077、ab97035)，通过点滴法孵育切片1h(室温，避光)。再次用pbst洗涤切片5min，洗涤3次后，用抗体稀释液(新赛美生物科技有限公司，cat.no.wb500d)稀释hoechst3342溶液(体积比1:1000稀释，thermo fisher scientific公司，cat.no.h3570)通过点滴法孵育切片10min(室温，避光)。再用pbst洗涤切片5min，洗涤3次后，用滤纸擦干切片上多余的液体，用甘油封片，4℃避光保存。使用共聚焦荧光显微镜采集皮肤组织荧光信号，通过image j软件和imaris软件(7.4.2版)分析不同荧光通道的荧光强度，得到的结果如图1所示。
36.(4)elisa法检测银屑病患者和健康人外周血中igfbp7的水平：
37.利用促凝采血管收集银屑病患者和健康受试者的外周血，静置后离心(3000rpm，5min)，吸取上层淡黄色血清。根据elisa试剂盒(elabscience公司，cat.no.e-el-h0447c)说明书配制蛋白标准品，稀释血清样本。每个标准品和样品设置2-3个复孔。
38.利用多道移液器在elisa试剂盒的96孔板中加入标准品和样品。根据试剂盒说明书推荐的条件孵育标准品和样品，依次加入一抗、hrp、底物工作液和终止液，完成elisa操作步骤。利用全自动酶联免疫分析仪(bio-rad公司)检测96孔板各孔的吸光度。根据标准品的浓度拟合线性工作曲线计算igfbp7在各样品中的浓度，得到的结果如图2所示。
39.分析图1可知：
40.通过组织免疫荧光法标记银屑病患者皮损和健康对照皮肤组织中igfbp7和cd31(a)，其中cd31标记皮肤血管内皮细胞。统计银屑病和正常人皮肤cd31阳性区域内igfbp7的免疫荧光强度。结果显示，银屑病患者皮肤血管内皮细胞中igfbp7表达量较健康对照显著升高(p《0.0001)(b)，而银屑病患者表皮细胞中igfbp7表达量与健康对照相比无显著差异(ns)(c)。
41.分析图2可知：
42.通过elisa法检测20例银屑病患者和健康对照外周血中igfbp7水平，结果显示银屑病患者外周血中igfbp7水平较健康对照显著升高(p＝0.0139)(a)，并且银屑病患者外周血igfbp7浓度与银屑病患者疾病严重程度评分(pasi)呈显著正相关(p《0.0001)(b)。
43.由此可知，igfbp7在银屑病患者的皮损血管内皮细胞中异常高表达，介导银屑病皮肤血管异常和皮肤免疫炎症紊乱，本发明通过抑制银屑病患者皮肤血管中的igfbp7表达用于减轻和治疗银屑病样炎症。
44.实施例2：抗igfbp7抗体治疗
45.给予咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠抗igfbp7抗体治疗
46.(1)小鼠分组：
47.于空军军医大学动物实验中心购买24只雌性近交系balb/c小鼠，并在空军军医大学动物实验中心spf级实验室以恒温恒湿环境下饲养至6-8周龄后开始动物实验。对小鼠进行编号并随机分为4组：抗igfbp7抗体2.5μg/kg组，抗igfbp7抗体5μg/kg组，抗igfbp7抗体7.5μg/kg组和igg对照组(n＝6只/组)。在实验开始前2天使用电动剃须刀、剪刀和脱毛膏对小鼠背部备皮，形成约2
×
3cm大小的暴露区域。本研究动物实验已通过空军军医大学实验动物伦理委员会批准。
48.(2)小鼠银屑病样模型构建及治疗干预：
49.在4组小鼠背部皮肤外涂5％咪喹莫特乳膏(50mg/cm2，1/日，inova pharmaceuticals公司)，持续5天。在造模第6天可观察到小鼠皮肤出现淡红斑和鳞屑，提示银屑病小鼠模型构建成功。
50.选用抗igfbp7抗体对银屑病小鼠进行治疗，将银屑病小鼠分成三组不同剂量的治疗方案，分别为：(1)抗igfbp7抗体2.5μg/kg组，(2)抗igfbp7抗体5μg/kg组和(3)抗igfbp7抗体7.5μg/kg组；igg对照组小鼠选用正常兔对照igg抗体(义翘神州公司，cat.no.cr1)。
51.其中，抗igfbp7抗体2.5μg/kg组，抗igfbp7抗体5μg/kg组和抗igfbp7抗体7.5μg/kg组小鼠选用兔抗igfbp7单克隆抗体(abclonal公司，cat.no.a4615)治疗以中和咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠体内的目的分子。
52.4组小鼠治疗干预的抗体均由生理盐水定容至100μl，自银屑病样模型前1日起腹腔注射，1/隔日(共3次)。在治疗第7天(即咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型造模第6天)通过相机和皮肤镜采集小鼠背部和耳部皮损大体表现，并收集小鼠背部皮肤组织，得到的结果如图3所示。
53.(3)小鼠银屑病严重程度评估：
54.收集小鼠背部皮肤置于4％多聚甲醛(索莱宝公司，cat.no.p1110)中固定、石蜡包埋、切片。用苏木精和伊红对小鼠背部皮肤组织切片进行染色。使用病理切片扫描成像仪扫描切片，并通过imagej软件测量表皮厚度。利用抗ki67抗体(abcam公司，cat.no.ab15580)通过组织免疫荧光法(方法同前)检测小鼠背部皮肤中ki67的表达，通过imagej分析ki67阳性细胞在皮肤表皮基底层细胞中的比例。通过trizol试剂(invitrogen公司，cat.no.15596026)提取小鼠背部皮肤标本总rna，利用逆转录试剂盒(takara公司，cat.no.rr047a)通过逆转录法获得cdna。利用荧光定量试剂盒(takara公司，cat.no.rr820a)通过qpcr法检测s100a8、s100a9、lcn2、il17a、il23、il36g、tnfa、vegfa的
表达，以actb水平为基线，采用2-δδct
方法计算相对mrna表达水平。得到的结果如图4所示。
55.分析图3可知：
56.1、用抗igfbp7单克隆抗体治疗后咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠与对照igg治疗的银屑病样小鼠相比，表皮厚度降低，从图片中也可以看出，对照组的小鼠皮肤鳞屑明显多于实验组且红斑症状明显、浸润增加，说明经过抗igfbp7抗体治疗可以显著的降低银屑病表皮厚度、抑制红斑形成，减少鳞屑的产生。
57.2、三种不同剂量2.5μg/kg、5μg/kg、7.5μg/kg抗igfbp7单克隆抗体治疗咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠，对照igg抗体作为对照组。结果显示，虽然2.5μg/kg的浓度下也可以减轻症状，但是5μg/kg、7.5μg/kg的浓度下治疗效果明显增加，可有效减轻银屑病样小鼠皮损鳞屑和红斑(a)。
58.3、抗igfbp7单克隆抗体5μg/kg、7.5μg/kg治疗可显著降低银屑病样小鼠表皮厚度和表皮中ki67细胞比例，进一步证明了抗igfbp7单克隆抗体可以减轻银屑病的症状，治疗银屑病。且7.5μg/kg剂量的抗igfbp7单克隆抗体治疗对银屑病样小鼠表型的改善结果与5μg/kg剂量无显著差异(b，c)。
59.分析图4可知：
60.1、已知s100a8、s100a9、lcn2、il17a、il23、il36g、tnfa、vegfa等与银屑病相关炎症因子在银屑病患者中高表达，经过抗igfbp7单克隆抗体治疗可有效降低小鼠皮肤中上述银屑病相关炎症因子的表达，说明抗igfbp7抗体治疗可以防止银屑病患者的炎症加重，进而减轻银屑病症状。
61.2、5μg/kg和7.5μg/kg剂量组中，上述相关炎症因子降低最显著，说明当使用剂量为5μg/kg和7.5μg/kg时对治疗寻常型银屑病均有效。5μg/kg和7.5μg/kg抗igfbp7单克隆抗体剂量组对银屑病相关炎症因子表达水平的影响无明显差异。
62.由此可知，抗igfbp7抗体可显著减轻小鼠银屑病样炎症，保护血管屏障功能降低银屑病发率，在治疗银屑病上，具有良好的药用前景。
63.实施例3：人体细胞实验
64.给予人皮肤微血管内皮细胞系(hmec-1细胞)抗igfbp7抗体干预
65.(1)体外培养hmec-1细胞：
66.于atcc购买hmec-1细胞(crl-3243)。利用mcdb131培养基在37℃，5％co2条件下培养hmec-1细胞。当细胞密度达70％～80％时，利用预热的0.25％胰蛋白酶-edta消化液(37℃)在室温消化hmec-1细胞，在显微镜下观察细胞状态，当70％细胞形态变圆时及时用2倍消化液体积的胎牛血清终止消化。室温离心5min(800rpm)后收集细胞沉淀，用hmec-1细胞培养基重悬细胞，按1:2～1:4传代。
67.(2)给予hmec-1细胞抗igfbp7抗体干预：
68.给予银屑病相关细胞因子重组人蛋白ifn-γ(100ng/ml，sigma公司，cat.no.srp3058)刺激hmec-1细胞，48h后收集细胞上清。将新的hmec-1细胞分为三组，第一组为对照组，加入正常hmec-1细胞的细胞上清和正常小鼠对照igg抗体(25μg/ml，abclonal公司，cat.no.ac011)；第二组为刺激组，加入银屑病相关细胞因子刺激后的hmec-1细胞的细胞上清和正常小鼠对照igg抗体(25μg/ml，abclonal公司，cat.no.ac011)；第三组为干预组，加入银屑病相关细胞因子刺激后的hmec-1细胞的细胞上清和小鼠抗igfbp7中和抗体
(25μg/ml，义翘神州公司，cat.no.13100-mm01)。
69.(3)hmec-1细胞屏障结构检测：
70.用4％多聚甲醛(索莱宝公司，cat.no.p1110)固定三组hmec-1细胞(室温，15min)。pbs洗涤3次后，用山羊血清(博士德生物公司，cat.no.ar0009)通过点滴法封闭1h(室温)。吸去多余的山羊血清后，用抗体稀释液(新赛美生物科技有限公司，cat.no.wb500d)稀释抗透明质酸抗体(体积比1:400稀释，abcam公司，cat.no.ab53842)和抗硫酸乙酰肝素抗体(体积比1:200稀释，abcam公司，cat.no.ab2501)通过点滴法孵育细胞过夜(4℃)。将细胞恢复至室温，pbs洗涤3次后，用抗体稀释液(新赛美生物科技有限公司，cat.no.wb500d)稀释荧光二抗(体积比1:200稀释)通过点滴法孵育细胞1h(室温，避光)。pbs洗涤3次后，用hoechst 3342溶液(1:1000)通过点滴法孵育细胞10min(室温，避光)。pbs洗涤3次后，使用共聚焦荧光显微镜(zeiss公司，lsm880)的z-stack模块采集细胞三维荧光信号，通过imagej和imaris软件分析不同荧光通道的荧光强度和体积等参数。得到的结果如图5所示。
71.(4)hmec-1细胞黏附功能评估：
72.首先，收集了3例健康人的外周血，分离人cd4

t细胞。其方法如下：
①
裂解红细胞：将抗凝血与红细胞裂解液(1
×
)按1:2比例混合，静置10min后离心(1300rpm，10min，室温)，弃上清后重复裂解；
②
免疫磁珠分选：用100μl磁珠抗体(miltenyi biotech公司，cat.no.130-045-101)孵育液重悬血细胞，加入适量cd4磁珠(20μl/107细胞，miltenyi biotech公司，cat.no.130-045-101)孵育15min(4℃，避光)，用磁珠抗体孵育液洗去未结合的磁珠，加入磁柱中，最后收集结合在磁柱中的细胞，即cd4

t细胞。
73.接着，用calcein-am(1μmol/l，invitrogen公司，cat.no.c1430)活细胞染料对cd4

t细胞染色15min(37℃)，加入两倍体积pbs后离心(300g，7min)以洗去多余染料，弃上清，用新rpmi-1640培养基(gibco公司，cat.no.31870082)重悬。
74.最后，将cd4

t细胞(1
×
105cd4

t细胞/孔)加入铺有三组hmec-1细胞的24孔板中，共培养5h。用pbs轻柔洗涤24孔板5次，以去除未黏附的cd4

t细胞。利用免疫荧光显微镜(nikon公司，eclipse ti-s)下观察24孔板中荧光标记的cd4

t细胞数量，每孔采集5个不同视野的照片。通过imagej软件统计cd4

t细胞数量。得到的结果如图6所示。
75.分析图5可知：
76.细胞免疫荧光和三维重建结果表明，用银屑病相关细胞因子刺激的细胞上清处理hmec-1细胞后，血管内皮屏障关键分子透明质酸和硫酸乙酰肝素表达水平降低、体积变小，提示血管内皮屏障受损，与对照组相比具有统计学差异(p《0.0001)。而给予抗igfbp7中和抗体干预后可显著上调hmec-1细胞的血管内皮屏障分子关键分子透明质酸和硫酸乙酰肝素的表达，说明抗igfbp7抗体干预可显著改善人皮肤微血管内皮屏障结构，具有保护作用。
77.分析图6可知：
78.细胞共培养实验结果显示，用银屑病相关细胞因子刺激的细胞上清处理hmec-1细胞后，hmec-1细胞对人cd4

t细胞的黏附数量显著增加，与对照组相比具有统计学差异(p《0.0001)。而给予抗igfbp7抗体干预后显著抑制了hmec-1细胞对人cd4

t细胞的黏附能力(p《0.0001)。
79.由此可知，抗igfbp7抗体在人细胞实验中具有改善血管屏障、减轻银屑病样免疫炎症的重要作用。
80.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。