癌症化疗药物促敏方法、其促敏剂组合物及其用途

using mammalian and human cells”发明专利申请仅揭示基因xaf1而已，其也完全无关于采用mir-1976抑制核酸与对应癌细胞抗凋亡能力技术。
10.另一现有基因xaf1的相关技术，美国专利公开第us-20180369303号的“oncolytic rhabdovirus”发明专利申请仅揭示基因xaf1而已，其也完全无关于采用mir-1976抑制核酸与对应癌细胞抗凋亡能力技术。
11.然而，前述美国专利第us-8969315号、美国专利公开第us-20140080894号、美国专利公开第us-20180237772号、美国专利第us-8021840号、美国专利公开第us-20070218493号、美国专利公开第us-20090215895号、美国专利公开第us-20170003277号及美国专利公开第us-20180369303号发明专利申请案的相关微核糖核酸mir-1976的应用技术或相关基因xaf1的应用技术仍存在进一步改良的需求。
12.显然，前述美国专利第us-8969315号、美国专利公开第us-20140080894号、美国专利公开第us-20180237772号、美国专利第us-8021840号、美国专利公开第us-20070218493号、美国专利公开第us-20090215895号、美国专利公开第us-20170003277号及美国专利公开第us-20180369303号的专利及专利申请仅为本发明技术背景的参考及说明目前技术发展状态而已，其并非用以限制本发明的范围。


技术实现要素：

13.本发明的主要目的在于提供一种癌症化疗药物促敏方法、其促敏剂组合物(或检验试剂)及其用途，其将一癌细胞进行转殖(cloning)反义寡核苷酸(例如：sirna-1976或antagomir-1976)，以形成一已转殖癌细胞，以便阻断mir-1976的后续作用，并将一癌症组合物施加于该已转殖癌细胞，此时该已转殖癌细胞已被阻断mir-1976的后续作用，且由于该已转殖癌细胞已被阻断mir-1976的后续作用而形成一已阻断mir-1976作用的癌细胞，因此该已转殖癌细胞对该癌症组合物产生一敏感度，以便达成提供癌症化疗药物或癌症检验试剂的促敏作用的功效。
14.为了达成上述目的，本发明较佳实施例的癌症化疗药物促敏方法包含：
15.将一癌细胞进行转殖反义寡核苷酸(例如：sirna-1976或antagomir-1976)，以形成一已转殖癌细胞，以便阻断mir-1976的后续作用；
16.将一癌症组合物施加于该已转殖癌细胞，此时该已转殖癌细胞已被阻断mir-1976的后续作用；及
17.由于该已转殖癌细胞已被阻断mir-1976的后续作用而形成一已阻断mir-1976作用的癌细胞，因此该已转殖癌细胞对该癌症组合物产生一敏感度。
18.本发明较佳实施例的癌症化疗药物促敏方法，另包含：
19.在该癌细胞内寻找至少一分子目标物；
20.在一预定细胞内筛选至少一微核糖核酸结合目标物；
21.利用一结合标的核酸片段进行复制该微核糖核酸结合目标物；
22.利用该结合标的核酸片段进行序列分析，并决定一目标物基因及其相对应位置，以获得数个mir-1976结合目标物；及
23.利用该数个mir-1976结合目标物寻找一基因xaf1，并利用一癌细胞转殖反义寡核苷酸程序(例如：癌细胞转殖sirna-1976程序或癌细胞转殖antagomir-1976程序)于该癌细
胞进行细胞转殖，以便于该癌细胞进行抑制mir-1976。
24.本发明较佳实施例的该微核糖核酸结合目标物由专一性基因选殖方式进行筛选。
25.本发明较佳实施例的该目标物基因及其相对应位置由blast分析决定而获得。
26.本发明较佳实施例的该mir-1976的表现量由微阵列分析或qpcr分析获得。
27.为了达成上述目的，本发明较佳实施例的癌症化疗药物促敏组合物包含：
28.一癌细胞转殖反义寡核苷酸(例如：sirna-1976或antagomir-1976)，其利用一癌细胞转殖反义寡核苷酸程序(例如：癌细胞转殖sirna-1976程序或癌细胞转殖antagomir-1976程序)于一癌细胞，以形成一已转殖癌细胞，以便于该癌细胞进行抑制mir-1976；及
29.一癌症组合物(例如：可抗癌组成物)，其组合该已转殖癌细胞，以形成一增加敏感性组合物；
30.其中该癌症组合物施加于该已转殖癌细胞，此时该已转殖癌细胞已被阻断mir-1976的后续作用，且由于该已转殖癌细胞已被阻断mir-1976的后续作用而形成一已阻断mir-1976作用的癌细胞，因此该已转殖癌细胞对该癌症组合物产生一敏感度。
31.本发明较佳实施例的该增加敏感性组合物导致一胞外渗囊泡中减少mir-1976。
32.本发明较佳实施例的该增加敏感性组合物导致增加一癌细胞凋亡标记。
33.本发明较佳实施例的该癌细胞凋亡标记为cleaved parp。
34.本发明较佳实施例的该癌细胞凋亡标记对应于一基因xaf1。
35.为了达成上述目的，本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法包含：
36.将一胰脏癌细胞进行转殖反义寡核苷酸(例如：sirna-1976或antagomir-1976)，以形成一已转殖胰脏癌细胞，以便阻断mir-1976的后续作用；
37.将一胰脏癌组合物施加于该已转殖胰脏癌细胞，此时该已转殖胰脏癌细胞已被阻断mir-1976的后续作用；及
38.由于该已转殖胰脏癌细胞已被阻断mir-1976的后续作用而形成一已阻断mir-1976作用的胰脏癌细胞，因此该已转殖胰脏癌细胞对该胰脏癌组合物产生一敏感度。
39.本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法另包含：
40.在该胰脏癌细胞内寻找至少一分子目标物；
41.在一预定细胞内筛选至少一微核糖核酸结合目标物；
42.利用一结合标的核酸片段进行复制该微核糖核酸结合目标物；
43.利用该结合标的核酸片段进行序列分析，并决定一目标物基因及其相对应位置，以获得数个mir-1976结合目标物；及
44.利用该数个mir-1976结合目标物寻找一基因xaf1，并利用一胰脏癌细胞转殖反义寡核苷酸程序(例如：胰脏癌细胞转殖sirna-1976程序或胰脏癌细胞转殖antagomir-1976程序)于该胰脏癌细胞进行细胞转殖，以便于该胰脏癌细胞进行抑制mir-1976。
45.本发明较佳实施例的该微核糖核酸结合目标物由专一性基因选殖方式进行筛选。
46.本发明较佳实施例的该目标物基因及其相对应位置由blast分析决定而获得。
47.本发明较佳实施例的该mir-1976的表现量由微阵列分析或qpcr分析获得。
48.为了达成上述目的，本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏剂组合物包含：
49.一胰脏癌细胞转殖反义寡核苷酸程序(例如：sirna-1976或antagomir-1976)，其利用一胰脏癌细胞转殖反义寡核苷酸程序2(例如：胰脏癌细胞转殖sirna-1976程序或胰脏
癌细胞转殖antagomir-1976程序)于一胰脏癌细胞，以形成一已转殖胰脏癌细胞，以便于该胰脏癌细胞进行抑制mir-1976；及
50.一胰脏癌组合物(例如：可抗胰脏癌组成物)，其组合该已转殖胰脏癌细胞，以形成一增加敏感性组合物；
51.其中该胰脏癌组合物施加于该已转殖胰脏癌细胞，此时该已转殖胰脏癌细胞已被阻断mir-1976的后续作用，且由于该已转殖胰脏癌细胞已被阻断mir-1976的后续作用而形成一已阻断mir-1976作用的胰脏癌细胞，因此该已转殖胰脏癌细胞对该胰脏癌组合物产生一敏感度。
52.本发明较佳实施例的该增加敏感性组合物导致一胞外渗囊泡中减少mir-1976。
53.本发明较佳实施例的该增加敏感性组合物导致增加一胰脏癌细胞凋亡标记。
54.本发明较佳实施例的该胰脏癌细胞凋亡标记为cleaved parp。
55.本发明较佳实施例的该胰脏癌细胞凋亡标记对应于一基因xaf1。
56.本发明的有益效果在于：
57.本发明提供一种癌症化疗药物促敏方法、其促敏剂组合物及其用途，可使已转殖癌细胞对该癌症组合物产生一敏感度，以便达成提供癌症化疗药物或癌症检验试剂的促敏作用的功效。
附图说明
58.图1为本发明较佳实施例的癌症化疗药物促敏方法的流程示意图。
59.图1a及图1b为本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法采用微阵列分析与qpcr分析受损癌细胞所释放的胞外渗囊泡中与细胞内微核糖核酸的表现量的示意图。
60.图2a及图2b为本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法采用专一性基因选殖技术来筛选出细胞内的mir-1976结合目标物，再与生物资讯资料交叉比对出xaf1为其与细胞凋亡相关的mir-1976潜在标的基因的示意图。
61.图3a至图3c为本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法采用qpcr分析癌细胞内大量表现mir-1976，与西方墨渍法分析癌细胞内大量表现mir-1976对xaf1蛋白表现与细胞凋亡的影响的示意图。
62.图4a及图4b为本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法采用西方墨渍法分析癌细胞内转殖antagomir-1976后，对细胞凋亡的影响，其分别为在胰脏癌bxpc-3与aspc-1细胞所做的结果的示意图。
63.图5a至图5d为本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法采用细胞存活分析癌细胞内转殖sirna-1976后，其对细胞存活的影响，其分别为胰脏癌细胞mia capa-2、bxpc-3及aspc-1细胞所产生结果的示意图。
具体实施方式
64.为了充分了解本发明，在下文将举例较佳实施例并配合所附图式作详细说明，且其并非用以限定本发明。
65.本发明较佳实施例的癌症化疗药物促敏方法、其促敏剂组合物及其用途适用于各种癌症，其包含脑癌、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、食道癌、胃癌、肝癌、大肠直肠癌、胰脏癌、肺癌、
乳癌、前列腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、生殖细胞癌、皮肤癌、骨肉瘤、血癌(包含淋巴癌、白血病、多发性骨髓瘤)。本发明另一较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法、其促敏剂组合物(或检验试剂)及其用途提供一化疗药物促敏剂，来增加胰脏癌细胞对药物的敏感性，则有可能在较低药物浓度下达到疗效以增加药物使用的疗效。
66.本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法、其促敏剂组合物(或检验试剂)及其用途利用阻断mir-1976生理作用，以达成促进癌细胞对药物治疗具有敏感效果及抑制癌细胞增长。除此之外，在运用上微核糖核酸分子应用于分子标的物的筛选。
67.本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法、其促敏剂组合物(或检验试剂)及其用途采用专一性基因选殖技术。此外，本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法、其促敏剂组合物及其用途在化疗药物注射后，以血液样品中mir-1976的表现量增加与否作为一检验试剂。
68.图1揭示本发明较佳实施例的癌症化疗药物促敏方法的流程示意图。请参照图1所示，举例而言，癌症化疗药物促敏方法包含：
69.将一癌细胞1(或胰脏癌细胞或其它种类癌细胞)选择利用一癌细胞转殖反义寡核苷酸程序2(例如：胰脏癌细胞转殖sirna-1976程序或胰脏癌细胞转殖antagomir-1976程序)适当进行转殖反义寡核苷酸(例如：sirna-1976或antagomir-1976)，以形成一已转殖癌细胞10，以便阻断mir-1976的后续作用；
70.将一癌症组合物3(例如：可抗癌组合物或其它癌症化疗组合物)适当施加于该已转殖癌细胞10，此时该已转殖癌细胞10已被阻断mir-1976的后续作用；及
71.由于该已转殖癌细胞10已被阻断mir-1976的后续作用而形成一已阻断mir-1976作用的癌细胞11，因此该已转殖癌细胞10明显对该癌症组合物3产生一敏感度。
72.请再参照图1所示，举例而言，本发明较佳实施例的癌症化疗药物促敏方法另包含：
73.在该癌细胞1内适当寻找至少一分子目标物；
74.在一预定细胞内适当筛选至少一微核糖核酸结合目标物；
75.利用一结合标的核酸片段适当进行复制该微核糖核酸结合目标物；
76.利用该结合标的核酸片段适当进行序列分析，并适当决定一目标物基因及其相对应位置，以获得数个mir-1976结合目标物；及
77.利用该数个mir-1976结合目标物适当寻找一基因xaf1，并利用该胰脏癌细胞转殖反义寡核苷酸程序2(例如：胰脏癌细胞转殖sirna-1976程序或胰脏癌细胞转殖antagomir-1976程序)于该癌细胞适当进行细胞转殖，以便于该癌细胞1适当进行抑制mir-1976。
78.请再参照图1所示，举例而言，本发明较佳实施例的该胰脏癌细胞转殖反义寡核苷酸程序2包含胰脏癌细胞转殖sirna-1976程序或胰脏癌细胞转殖antagomir-1976程序。
79.请再参照图1所示，举例而言，本发明较佳实施例的该癌症组合物3可选自一抗代谢药物(例如：methotrexate、pemetrexed、cytarabine、5-fluorouracil、capecitabine、gemcitabine、6-mercaptopurine、azathioprine、fludarabine、cladribine或hydroxyurea)。
80.请再参照图1所示，举例而言，本发明另一较佳实施例的该癌症组合物3也可选自一烷化剂(例如：cyclophosphamide、ifosfamide、chlorambucil、melphalan、
temozolomide、carmustine、lomustine、streptozocin、busulfan、procarbazine、cisplatin、carboplatin或oxaliplatin)。
81.请再参照图1所示，举例而言，本发明另一较佳实施例的该癌症组合物3也可选自一拓璞异构酵素抑制剂(例如：irinotecan、topotecan、etoposide或doxorubicin)。
82.请再参照图1所示，举例而言，本发明另一较佳实施例的该癌症组合物3也可选自一有丝分裂抑制剂(例如：vincristine、vinblastine、vinorelbine、docetaxel、paclitaxel、eribulin、ixabepilone或epothilone)。
83.请再参照图1所示，举例而言，本发明另一较佳实施例的该癌症组合物3也可选自一抗肿瘤抗生素(例如：bleomycin、actinomycin d、doxorubicin、daunorubicin、idarubicin或mitomycin)。
84.请再参照图1所示，举例而言，本发明另一较佳实施例的该癌症组合物3也可选自一酪氨酸激酶抑制剂(例如：imatinib、dasatinib、nilotinib、erlotinib、gefitinib、afatinib、osimertinib、alectinib、crizotinib、dabrafenib、encorafenib、vemurafenib、trametinib、ibrutinib、ruxolitinib或palbociclib)。
85.请再参照图1所示，举例而言，本发明另一较佳实施例的该癌症组合物3也可选自一抗肿瘤一抗肿瘤受体的抗体药或其他组合物(例如：l-asparaginase、bortezomib、carfilzomib、ixazomib或olaparib)。
86.图1a及图1b揭示本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法选择采用微阵列分析与qpcr分析受损癌细胞所释放的胞外渗囊泡中与细胞内微核糖核酸的表现量的示意图。请参照图1a及图1b所示，举例而言，mir-1976、mir-877-3p、与mir-4728-3p的含量增加最多，其可由qpcr加以确认，且以mir-1976的增加最明显。
87.请参照图1b所示，举例而言，胰脏癌细胞内的mir-1976含量也可通过gemcitabine造成细胞受损而诱导增加。
88.图2a及图2b揭示本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法选择采用专一性基因选殖技术来筛选出细胞内的mir-1976结合目标物，再与生物资讯资料交叉比对出xaf1为其与细胞凋亡相关的mir-1976潜在标的基因的示意图。请参照图2a及图2b所示，举例而言，本发明较佳实施例利用专一性基因选殖技术筛选出特定细胞内的微核糖核酸结合目标物，将其结合标的核酸片段复制后，进行序列分析，并可选择利用blast分析决定出目标物基因与相对应位置。本发明较佳实施例获得数个mir-1976结合目标物，再交叉比对与细胞死亡相关基因，并利用targetscan工具所预测的mir-1976目标物群，获得其与细胞凋亡相关的基因xaf1，即为mir-1976的调控目标物。
89.图3a至图3c揭示本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法选择采用西方墨渍法分析癌细胞内大量表现mir-1976对细胞凋亡的影响的示意图。请参照图3a至图3c所示，举例而言，本发明较佳实施例在癌细胞内大量表现mir-1976，以模拟细胞受损时的mir-1976增加，或是细胞受到含mir-1976的胞外渗囊泡作用后的效果。当细胞有大量表现mir-1976时，除了xaf1的含量会相对减少之外，胰脏癌细胞凋亡的标记cleaved parp也会明显减少。
90.图4a及图4b揭示本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法选择采用西方墨渍法分析癌细胞内转殖antagomir-1976后，对细胞凋亡的影响的示意图。请参照图4a所示，
举例而言，本发明较佳实施例在胰脏癌bxpc-3细胞所做的结果。请参照图4b所示，举例而言，本发明较佳实施例在胰脏癌aspc-1细胞所做的结果。
91.请参照图4a及图4b所示，举例而言，本发明较佳实施例将胰脏癌细胞先转殖antagomir-1976，以阻断mir-1976后续的作用，因此细胞凋亡的标记cleaved parp也会明显增加。
92.举例而言，本发明较佳实施例的癌症化疗药物促敏方法、其促敏剂组合物及其用途主要可选择以"抑制核酸-1976"来取代"antagomir-1976"。
93.举例而言，本发明较佳实施例的癌症化疗药物促敏方法、其促敏剂组合物及其用途可选择采用antagomir具有一特殊结构，且该特殊结构组合形成antagomir的干扰型核酸分子，且antagomir具有rna序列专一性，即“acagcaa”(seq id no.1)专一序列。
94.举例而言，本发明较佳实施例可选择采用antagomir-1976的20个核酸序列为：
95.seq id no.2：5
’‑
acagcaaggagggcaggagg-3’。
96.举例而言，本发明另一较佳实施例可选择采用antagomir-1976具有一关键区域，而该关键区域用以抑制核酸-1976，且该关键区域包含“acagcaa”专一序列，且其核酸长度为17至42个碱基长。
97.举例而言，本发明另一较佳实施例可选择采用antagomir-1976具有抑制核酸-1976的序列5'-(n)xacagcaa(n)y；碱基n为a或u或g或c；其中x＝0至5；y＝10至30。也可表示为seq id no.3：5
’‑
nacagcaan-3’；碱基n为a或u或g或c；其中5’端n的数量为0至5；3’端n的数量为10至30。
98.图5a至图5d揭示本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法采用细胞存活分析癌细胞内转殖sirna-1976后，其对细胞存活的影响，其分别为胰脏癌细胞mia capa-2、bxpc-3及aspc-1细胞所产生结果的示意图。请参照图5a至图5d所示，举例而言，本发明较佳实施例的胰脏癌化疗药物促敏方法必须采用促敏剂sirna-1976(或具其类似促敏功能的组合物)及化疗药物后，方能影响其癌细胞存活率。
99.请再参照图5a至图5d所示，举例而言，倘若仅单独选择采用促敏剂sirna-1976(或具其类似促敏功能的组合物)而不使用化疗药物，则促敏剂sirna-1976(或具其类似促敏功能的组合物)的使用并不会影响其癌细胞存活率。
100.上述实验数据为在特定条件之下所获得的初步实验结果，其仅用以易于了解或参考本发明的技术内容而已，其尚需进行其他相关实验。该实验数据及其结果并非用以限制本发明的权利范围。
101.前述较佳实施例仅举例说明本发明及其技术特征，该实施例的技术仍可适当进行各种实质等效修饰及/或替换方式予以实施；因此，本发明的权利范围须视权利要求书所界定的范围为准。