一种通过加强胞内辅因子代谢和糖代谢提高甾醇转化的方法

：
1.本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种通过加强胞内辅因子代谢和糖代谢来提高甾药前体生产能力的方法。


背景技术：

2.甾体药物在临床上广泛应用，是仅次于抗生素的第二大类药物，是制药工业中重要的生产产品。目前制药企业主要采用微生物发酵的方法，以植物甾醇为原料生产甾药的多种核心前体，如雄甾-4-烯-3,17-二酮(ad)、雄甾-1,4-二烯-3,17
‑ꢀ
二酮(add)、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-oh-ad)等。通过这些核心前体可以合成绝大部分甾药。
3.目前，用于甾药前体生产的主要是快速生长的分枝杆菌以及红球菌等微生物。在甾醇降解过程中，存在辅因子代谢失衡、电子传递效率低与丙酮酸积累的毒害作用等问题，导致菌体存在转化周期长、生产强度下降和副产物积累等缺点。对于ad的增产，主要是通过基因工程手段对代谢途径中关键基因的增强或减弱，以实现不同节点处甾药中间体的积累。然而无论是原始菌株还是工程菌株均具有较长的转化周期(≥120h)，且在转化中后期菌株的转化效率的急剧降低，这也是造成甾药前体生产成本高昂的原因之一。在甾醇侧链降解生产甾药核心前体过程中需要nad

和辅酶a等辅因子，并产生大量的nadh、乙酰辅酶a和丙酰辅酶a，nad

和辅酶a胞内水平的提高有助于侧链的降解。甾醇侧链降解和糖酵解产生的乙酰辅酶a会进入三羧酸循环，但甾醇转化过程中糖酵解途径受到抑制，使得丙酮酸转为乙酰辅酶a的反应成为限速反应，而甾醇侧链降解也会产生一分子的丙酮酸副产物。并且对新金分枝杆菌降解甾醇生成雄烯二酮的代谢研究主要集中在丙酰辅酶a的解毒途径，有研究报道2-甲基柠檬酸途径(mcc) 是丙酰coa的解毒途径，但加速丙酰coa进入mcc的同时会以1:1的比例生成丙酮酸，因此，加速丙酰-coa所在的mcc途径时，也会加速丙酮酸的生成，但生成的丙酮酸无法被及时分解代谢。大量的丙酮酸会对细胞产生毒害作用，而针对丙酮酸在新金分枝杆菌内的解毒途径，还未见报道。甾药前体生产菌株的生产能力越强所生产的丙酮酸也就越多，丙酮酸的积累是影响菌体活力、降低转化效率和延长转化周期的主要原因之一。
4.目前，提高甾药前体生产菌株生产能力的方法多是针对甾醇代谢途径中关键基因的强化或减弱，这些方法往往只关注单酶或少数几个酶的功能，忽视了对代谢通路全局的把控。这些方法的缺陷是引发甾醇代谢过程中辅因子的供应不足和有毒中间产物的积累。因此需要一种能够提高胞内辅因子水平、减少中间代谢产物的方法以提高甾药前体生产菌株的转化能力。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明将在甾药生产菌株体内引入丙酮酸脱氢酶(poxb)、 nadh氧化酶(poxa)，分别由poxa和poxb基因编码。
6.本发明将获取并利用poxa和poxb基因，构建poxa和poxb基因单一或组合加强的甾
药前体生产菌株，以实现对糖代谢和胞内辅因子水平的加强，提高甾醇转化率、产量和生产效率。该方法可有效用于其他工业生产菌株糖代谢和胞内辅因子水平的加强，具有广泛的应用价值，为甾药前体生产成本的降低提供了新方法。
7.为实现上述目的，本发明提供的技术方案之一，是一种甾药前体生产工程菌株，所述工程菌株是在甾药前体生产菌株中，过表达nadh氧化酶和丙酮酸脱氢酶中的至少一种获得的；
8.进一步地，所述的甾药前体，包括但并不限于雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-dione，ad)、add和9-ohad等；
9.优选地，宿主为快速生长型新金分枝杆菌(mycobacteriumneoaurum)mnrm3，该菌株已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号cicc21097；
10.进一步地，所述nadh氧化酶，氨基酸序列如seqidno:2所示；
11.更进一步地，所述nadh氧化酶的编码基因为poxa，核苷酸序列为seqidno:1所示；
12.进一步地，所述丙酮酸脱氢酶，氨基酸序列如seqidno:4所示；
13.更进一步地，所述丙酮酸脱氢酶的编码基因为poxb，核苷酸序列为seqidno:3所示；
14.更进一步地，所述nadh氧化酶和丙酮酸脱氢酶通过载体进行表达；
15.优选地，所述表达载体是pmv261。
16.优选地，所述甾药前体生产工程菌株，是在新金分枝杆菌(mycobacteriumneoaurum)mnrm3中，通过pmv261表达nadh氧化酶编码基因为poxa和丙酮酸脱氢酶编码基因为poxb获得的。
17.本发明提供的技术方案之二，是上述工程菌的应用，特别是在生产甾药前体中的应用；
18.进一步地，采用上述工程菌生产雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法如下；
19.将基因工程菌种子培养液以5％-15％的接种量转接于发酵培养基中，在25℃-35℃，150-220rpm条件下培养48-168h；雄甾-4-烯-3,17-二酮摩尔转化率可以达到51％-99％；
20.发酵培养基组成：k2hpo40.1-3g/l，mgso40.1-3g/l，柠檬酸铁铵0.01-0.2g/l，柠檬酸1-5g/l，磷酸氢二铵1-10g/l，葡萄糖5-50g/l，植物甾醇1-30g/l，环糊精25-40g/l，其余为水，ph6.0-7.5。
21.有益效果:
22.在甾醇降解过程中，存在辅因子代谢失衡、电子传递效率低与丙酮酸积累等问题，大量的丙酮酸积累会对细胞产生毒害作用，因此导致菌体存在转化周期长、生产强度下降和副产物积累等缺点。本发明找到了一种有效提高辅因子水平的nadh氧化酶，加强了胞内辅因子水平，提高了侧链降解的效率。本发明通过丙酮酸脱氢酶将胞内积累的副产物丙酮酸降解，并在胞内转化为乙酰辅酶a；在减少胞内副产物的同时，将副产物转化为中心代谢三羧酸循环的起始物质，解除丙酮酸对菌株毒害作用的同时，增加了三羧酸循环的通量。丙酮酸脱氢酶在解除丙酮酸积累带来的毒害作用同时，增加了中心代谢的起始通量，而中心代谢的加强需要提供更多的辅因子，因此构建了丙酮酸脱氢酶和nadh氧化酶串联菌株。
23.本发明通过单一或组合过表达poxa和poxb基因，构建用于甾药前体生产的基因工程重组菌株。单独表达poxa基因，m3
poxa
的nadh脱氢酶活性是原始菌株的2.82倍，菌株的电子传递效率和辅因子水平得到了提升；单独表达poxb基因，m3
poxb
胞内丙酮酸的含量为mnrm3的87.85％，减轻糖酵解反应被限速的同时减少了胞内副产物丙酮酸；同时表达poxa和poxb基因时，m3
pab
的丙酮酸含量是mnrm3的68.22％，较m3
poxb
丙酮酸含量降低了19.63％，表明同时过表达poxa与poxb有协同作用，能够进一步减少胞内丙酮酸的积累；m3
pab
雄甾-4-烯-3,17-二酮的摩尔转化率是97.06％，较原始菌m3的摩尔转化率63.67％，提高了33.39％，生产周期较原始菌缩短了2天，提高了生产率和生产强度。本发明为提升甾药前体生产菌株的生产能力、缩短菌株转化周期和减少侧链降解副产物丙酮酸提供了新方法。该方法也可用于其他工业生产菌株中糖酵解途径和辅因子水平的加强，具有广泛的应用价值。
24.具体实施方法：
25.为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利，并不用于限定本发明。
26.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南(第四版)》(科学出版社2017)中所述的条件进行。
27.实施例1poxa和poxb编码基因的获得，单过表达和串联过表达载体构建
28.本实施例仅以pcr方法为例，从分枝杆菌(mycobacteriumneoaurum)mnrm3中克隆poxa编码基因poxa(seqidno:1)。pcr引物为poxa-1和poxa-2(poxa-1：caattgcggatccagctgcaggtgaccctggctccggtact；poxa-2：acgctagttaactacgtcgactcatgcgccggcctccgc)；
29.以mycobacteriumneoaurummnrm3的基因组dna为模板进行pcr扩增以获得mnrm3的poxa基因(seqidno:1所示)。扩增产物经核酸电泳检测后测序。测序结果表明所获得的核苷酸片段即为poxa基因。
30.利用pmv261质粒构建用于poxa基因自身过表达基因工程表达载体，其过程包括：将上述获得的poxa基因切胶回收后，与经过psti和sali双酶切胶回收的pmv261质粒混合，利用minervasuperfusioncloningkit无缝克隆试剂盒进行连接，连接产物经化学转化的方法转入escherichiacolidh5α，经卡那霉素筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆中的质粒经测序后得到构建成功的用于poxa基因自身过表达基因工程表达载体pmv261-poxa。
31.以mycobacteriumneoaurummnrm3的基因组dna为模板进行pcr扩增以获得mnrm3的poxb基因。poxb编码基因的获得参照上述poxa编码基因的获取方法进行，所用引物如表1所示，获得的质粒根据其上含有的基因命名为pmv261-poxb。
32.串联菌株从分枝杆菌(mycobacteriumneoaurum)mnrm3中分别克隆poxa与poxb编码基因。扩增poxa基因的上、下游引物分别为poxa-1、pab-1；扩增poxb基因的上、下游引物分别为pab-2、poxb-2，利用上述引物获得poxa基因和poxb基因。扩增产物经核酸电泳检测后测序。测序结果表明所获得的目的片段分别含有poxa和poxb基因。
33.利用pmv261质粒构建用于poxa基因和poxb基因同时过表达基因工程表达载体，其过程包括：将上述获得的含有poxa和poxb基因切胶回收后，与经过psti和sali双酶切胶回
收的pmv261质粒混合，利用minervasuperfusioncloningkit无缝克隆试剂盒进行多片段与质粒连接，连接产物经化学转化的方法转入escherichiacolidh5α，经卡那霉素筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆中的质粒经测序后得到构建成功的用于poxa基因和poxb基因同时过表达基因工程表达载体pmv261-poxa-poxb。
34.表1poxa、poxb和poxa-poxb编码基因的获得所用引物
[0035][0036]
实施例2构建poxa、poxb和poxa-poxb编码基因加强菌株
[0037]
分枝杆菌mnrm3感受态细胞的制备：将mnrm3接种到lb培养基中，30℃培养至od
600
为1.0左右，按10％接种量转接到种子培养基中进行二级种子培养：24h后加入20％甘氨酸继续培养24h。离心收集菌体，先后用1倍、3/4倍、1/2倍和1/4倍发酵液体积的10％预冷甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入1/25倍的10％甘油悬浮菌体，并分装保存；
[0038]
poxa编码基因加强菌株构建：取l0μl实施例1获得的pmv261-poxa基因工程表达载体，加入到100μl感受态菌体中放置30分钟后转入电转杯进行电击。电击条件2kv/cm，25μf，720ω条件下电转3-6ms后冰上放置5min后转入新灭菌1.5ml离心管并加入500μl灭菌lb培养基，30℃，200r/min进行复苏2-4h。
[0039]
重组子筛选与验证:将复苏后的培养物，涂布于含有卡那霉素(50mg/l)lb培养基平板上，30℃静置培养4-7d，挑取单菌落至lb培养基培养2-3d后，提取质粒进行测序验证。验证正确的阳性转化子命名为重组菌m3
poxa
。
[0040]
poxb和poxa-poxb编码基因加强菌株的构建参照poxa加强菌株，将pmv261-poxb转化入mnrm3菌株获得的poxb编码基因单基因加强菌株命名为m3
poxb
，将pmv261
‑‑
poxa-poxb转化入mnrm3菌株获得的poxa基因和poxb基因多基因串联加强菌株命名为m3
pab
。
[0041]
实施例3新金分枝杆菌mnrm3和m3
poxa
在雄甾-4-烯-3,17-二酮生产中辅因子水平的变化
[0042]
1.菌株活化及种子制备
[0043]
将mnrm3和m3
poxa
分别转接于新鲜lb培养基上，30℃培养3d，用20ml0.5％的tween80无菌水溶液洗菌，吸取1ml洗脱液加入到50ml种子培养基中，在30℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子液；
[0044]
种子培养基组成：k2hpo
4 0.5g/l，mgso
4 0.5g/l，柠檬酸铁铵0.05g/l，柠檬酸2g/l，硝酸铵2g/l，甘油20g/l，葡萄糖5g/l，caco
3 1g/l，其余为水，ph7.2。
[0045]
2.雄甾-4-烯-3,17-二酮生产过程
[0046]
将步骤1中获得的种子培养液分别以5％的接种量转接于装有发酵培养基的 250ml挡板瓶中，在30℃，150r/min条件下摇床培养120h；
[0047]
发酵培养基组成:k2hpo
4 0.5g/l，mgso
4 0.5g/l，柠檬酸铁铵0.05g/l，柠檬酸2g/l，磷酸氢二铵3.5g/l，葡萄糖10g/l，羟丙基β-环糊精38g/l，植物甾醇 5g/l，其余为水，ph7.2。每隔24h取样一次。
[0048]
ad生成量的检测：用等体积的乙酸乙酯超声萃取取样液，10000r/min离心 10min，取乙酸乙酯0.1ml于1.5ml管中，自然风干后加入流动相溶解，过0.22μm 膜后进行高效液相色谱分析。色谱条件：c18柱，流动相为甲醇:水(4:1)流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长为254nm。摩尔转化率的计算公式为：摩尔产率％＝(cp
×
ms)/(cs
×
mp)
×
100％，其中cp为产物浓度(g/l)，cs为底物浓度 (g/l)，mp为产物摩尔质量，ms为底物摩尔质量(本发明均采用该方法进行测定和计算)。
[0049]
3.胞内nadh脱氢酶活性的检测
[0050]
nadh脱氢酶检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，定时取发酵液，离心收集0.1g菌体，用nadh脱氢酶活性试剂盒试剂重悬菌体，4℃ 600r/min 离心10min。将上清液移至另一离心管中，4℃11000r/min离心15min，分离上清和沉淀，上清按表2的试剂配比测定胞外泄露的nadh脱氢酶活性。在沉淀中加入400μl试剂盒提取试剂，超声波破碎，按表2的试剂配比用于胞内nadh 酶活测定。
[0051]
测定时，紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。将表2中的试剂分别加入比色皿中吹吸混匀，记录第10s的吸光值a1，迅速将比色皿连同反应液一起放入25℃水浴锅中准确反应2min，之后迅速取出比色皿并擦干，记录a2，a2为反应2min时吸光度。经折算后按照试剂盒提供的计算公式：酶活(u/g(菌体质量))＝1608
×
δa1
÷
w 643
×
δa2
÷
w(注：w为收集菌体的质量，δa＝a1-a2，δa1为上清测定值，δa2为沉淀测定值)
[0052]
表2试剂表(在1ml石英比色皿中依次加入)
[0053]
试剂名称(μl)测定管样本50试剂一770工作液100试剂四80
[0054]
4.结果比较
[0055]
如表3所示，菌株m3
poxa
nadh脱氢酶的活性始终大于mnr m3的nadh 脱氢酶活性。72h时，m3
poxa
胞内nadh脱氢酶活性为m3的2.82倍；96h时， m3
poxa
胞内nadh脱氢酶活性为m3的1.81倍；120h时，m3
poxa
胞内nadh 脱氢酶活性为m3的1.53倍。因此poxa的过表达有利于胞内辅因子水平的提高。
[0056]
表3菌株mnrm3和m3
poxa
nadh脱氢酶活性(u/g)
[0057][0058]
实施例4菌株mnr m3、m3
poxa
、m3
poxb
和m3
pab
生产雄甾-4-烯-3，17-二酮
[0059]
按照实施例3的方法利用原始菌株mnr m3、m3
poxa
、m3
poxb
和m3
pab
过表达菌株用于雄甾-4-烯-3,17-二酮的生产。
[0060]
2.结果比较
[0061]
生产结果如表4所示，菌株m3
poxa
和m3
poxb
的雄甾-4-烯-3,17-二酮摩尔转化率始终高于原始菌株mnr m3，因此丙酮酸脱氢酶和nadh氧化酶能够提高 ad的摩尔转化率；m3
pab
的摩尔转化率始终高于m3
poxa
和m3
poxb
，说明丙酮酸脱氢酶和nadh脱氢酶共表达有协同增效作用。
[0062]
表4摩尔转化率
[0063][0064]
实施例5 m3
pab
用于雄甾-4-烯-3,17-二酮的生产
[0065]
1.生产菌株为m3
pab
，种子培养同实施例3。
[0066]
2.雄甾-4-烯-3,17-二酮生产过程
[0067]
将步骤1中获得的种子培养液以5％的接种量转接于装有发酵培养基的 250ml挡板瓶中，在25℃，150r/min条件下摇床培养48h；
[0068]
发酵培养基组成：k2hpo
4 0.1g/l，mgso
4 0.1g/l，柠檬酸铁铵0.01g/l，柠檬酸1g/l，磷酸氢二铵1g/l，葡萄糖5g/l，羟丙基-β-环糊精25g/l，植物甾醇 1g/l，其余为水，ph7.2。
[0069]
3.液相结果
[0070]
在1g/l底物浓度下，48h改造菌株m3
pab
的摩尔转化率最高可达99％。
[0071]
实施例6 m3
pab
用于雄甾-4-烯-3,17-二酮的生产
[0072]
1.生产菌株为m3
pab
，种子培养同实施例3。
[0073]
2.雄甾-4-烯-3,17-二酮生产过程
[0074]
将步骤1中获得的种子培养液以8％的接种量转接于装有发酵培养基的 250ml挡板瓶中，在25℃，150r/min条件下摇床培养168h；
[0075]
发酵培养基组成：k2hpo
4 0.3g/l，mgso
4 0.1g/l，柠檬酸铁铵0.03g/l，柠檬酸3g/l，磷酸氢二铵5g/l，葡萄糖30g/l，羟丙基-β-环糊精30g/l，植物甾醇 10g/l，其余为水，ph7.2。
[0076]
3.液相结果
[0077]
在10g/l底物浓度下，168h改造菌株m3
pab
的摩尔转化率最高可达62.7％。
[0078]
实施例7 m3
pab
用于雄甾-4-烯-3,17-二酮的生产
[0079]
1.生产菌株为m3
pab
，种子培养同实施例3。
[0080]
2.雄甾-4-烯-3,17-二酮生产过程
[0081]
将步骤1中获得的种子培养液分别以15％的接种量转接于装有发酵培养基的250ml挡板瓶中，在35℃，220r/min条件下摇床培养168h；
[0082]
发酵培养基组成:k2hpo
4 3g/l，mgso
4 3g/l，柠檬酸铁铵0.2g/l，柠檬酸5g/l，磷酸氢二铵10g/l，葡萄糖50g/l，羟丙基-β-环糊精40g/l，植物甾醇30g/l，其余为水，ph7.2。
[0083]
3.结果比较
[0084]
在30g/l底物浓度下，168h时改造菌株m3
pab
的摩尔转化率最高可达51％。
[0085]
实施例8 mnr m3、m3
poxb
和m3
pab
在雄甾-4-烯-3,17-二酮生产中丙酮酸含量的变化
[0086]
1.胞内丙酮酸含量的检测
[0087]
按照实施例3的方法对菌株mnr m3和m3
poxb
、m3
pab
进行菌株的活化及雄甾-4-烯-3,17-二酮生产。发酵过程中定时取发酵液，进行丙酮酸含量的测定。
[0088]
丙酮酸含量检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，定时取发酵液，离心收集菌体，用丙酮酸含量检测试剂试剂盒重悬菌体，冰上静置30min，8000g离心10min，取上清待测，分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零，采用分光光度计的方法进行测定吸光值a，计算公式为丙酮酸含量(μg/g 菌体质量)＝(10a 1.655)/0.165。
[0089]
2.结果比较
[0090]
结果如表5所示。丙酮酸脱氢酶的表达有利于减少各途径生成的丙酮酸的积累，丙酮酸脱氢酶作用需要与电子传递途径的泛醌结合。48h时，m3
poxb
胞内丙酮酸含量为mnr m3的87.85％，m3
pab 48h胞内丙酮酸含量为mnr m3的 68.22％；72h时，m3
poxb
胞内丙酮酸含量为mnr m3的82.55％，m3
pab
72 h胞内丙酮酸含量为mnr m3的58.98％；96h时，m3
poxb
胞内丙酮酸含量为m3的 76.03％，m3
pab 96h胞内丙酮酸含量为mnr m3的56.90％。m3
poxb
胞内丙酮酸含量在各时期均低于原始菌mnr m3，将丙酮酸脱氢酶作用需要与电子传递途径的泛醌结合，各时期m3
pab
胞内丙酮酸含量均低于m3
poxb
。因此过表达丙酮酸脱氢酶能够减少胞内丙酮酸含量，而串联菌株m3
pab
能够更进一步的减少胞内丙酮酸含量。
[0091]
表5 mnr m3、m3
poxb
和m3
pab
丙酮酸含量(μg/g)
[0092][0093]
以上所述实施案例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属
于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。