一种体外培养老龄成纤维细胞的培养体系及培养方法和应用

1.本发明涉及生物与新医药技术领域，具体涉及一种体外培养老龄成纤维细胞的培养体系及培养方法和应用。


背景技术：

2.成纤维细胞的状态可以间接的反应个体相应年龄的身体状态，包括代谢能力和细胞增殖能力。处于衰老时期的成纤维细胞增殖能力弱，因此对于衰老的成纤维细胞的长期稳定培养比较困难，细胞资源使用次数有限，这一现象限制了对老龄人群在再生医学方面的研究。由于老龄成纤维细胞的培养有较大的技术难度，而现有技术中关于老龄成纤维细胞的培养尚未见报道。


技术实现要素：

3.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种体外培养老龄成纤维细胞的培养体系及培养方法和应用，解决了现有技术中处于衰老时期的成纤维细胞增殖能力弱及长期稳定培养困难的技术问题。
4.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：第一方面，本发明提供一种体外培养老龄成纤维细胞的培养体系，由如下组分构成：glycine（甘氨酸，0.1-1mm），choline chloride（胆碱，0.01-0.1mm），d-calcium pantothenate（泛酸钙，0.001-0.01mm），folic acid（叶酸，0.001-0.01mm），niacinamide（烟酰胺，0.01-0.1mm），pyridoxine hydrochloride（盐酸吡哆醇，0.01-0.1mm），riboflavin（维生素b2，0.001-0.01mm），thiamine hydrochloride（盐酸硫胺素，0.01-0.1mm），i-inositol（肌醇，0.01-0.1mm），l-arginine hydrochloride（对甲苯磺酰，0.1-1mm），l-cystine 2hcl（l
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胱氨酸二盐酸，0.1-1mm），l-glutamine（谷氨酰胺，1-10mm），l-histidine hydrochloride-h2o（组氨酸盐酸盐，0.1-1mm），l-isoleucine（异亮氨酸，0.01-10mm），l-leucine（亮氨酸，0.01-10mm），l-lysine hydrochloride（盐酸赖氨酸，0.01-10mm），l-methionine（甲硫氨酸，0.01-10mm），l-phenylalanine（苯丙胺酸，0.01-10mm），l-serine（丝氨酸，0.01-10mm），l-threonine（苏氨酸，0.01-10mm），l-tryptophan（左旋色氨酸，0.01-10mm），l-tyrosine disodium salt dihydrate（络氨酸二钠盐二水化合物，0.01-10mm），l-valine（缬氨酸，0.01-10mm），calcium chloride（乳化剂，1-10mm），ferric nitrat（硝酸铁，0.0001-0.001mm），magnesium sulfate（硫酸镁，0.1-1mm），potassium chloride（氯化钾，1-10mm），sodium bicarbonate（碳酸氢钠，10-100mm），sodium chloride（氯化钠，10-100mm），sodium phosphate monobasic（磷酸二氢钠，0.1-1mm），d-glucose（葡萄糖，1-100mm），hepes（羟乙基哌嗪乙硫磺酸，10-100mm），glutathione（谷胱甘肽，0.01-1mm），fbs（胎牛血清，5-20%）。
5.由于细胞生长是受细胞内非常复杂的网络调控，不同的氨基酸或化合物对细胞信
号通路具有不同的影响，通过大量的试验验证，本技术的培养体系，能够改变老龄成纤维细胞转录组水平和氧化磷酸化水平的变化；且培养体系中，每一个成分的添加都会对细胞产生很大影响。本技术在做前期研究中发现，类似dmem-f12培养基的成份或其它培养条件，并不能维持成纤维细胞生长，不能养活老龄成纤维细胞。
6.本发明专利的培养体系由无菌蒸溜水与15种氨基酸，8种维生素，7中无机盐和血清等组分组成，通过各组分间的协同作用，能够实现在体外抑制老龄/高代次的成纤维细胞的凋亡，提高老龄成纤维细胞的增殖速度，实现长期稳定培养。培养体系的配置：例如，取1l无菌蒸溜水，加入对应浓度或质量百分数的组分进行混匀即可，培养体系根据用量进行配制。
7.第二方面，本发明提供采用第一方面的体外培养老龄成纤维细胞的培养体系进行体外老龄成纤维细胞的培养方法，包括如下步骤：（1）用明胶包被多个培养皿并在培养箱中放置0.5h-96h，待包被完成后，将每个培养皿内的明胶吸出，获得多个包被后的培养皿a；（2）将老龄成纤维细胞用胰蛋白酶消化，待老龄成纤维细胞逐渐消化为单个老龄成纤维细胞后获得细胞液；将所述细胞液转入离心管中进行离心分离，待离心分离完毕，弃上清液，获得细胞沉淀；（3）将步骤（2）中的细胞沉淀用所述培养体系重悬，重悬结束后接种于步骤（1）中所述的一个培养皿a中，置于培养箱中培养；经培养3-4天后即可增殖出大量的老龄成纤维细胞。
8.本技术正是优化了整个培养体系及培养方法，通过培养体系各组分间的作用，及优化后的培养方法，能够实现在体外长期并稳定的维持老龄成纤维细胞增殖，抑制老龄成纤维细胞的凋亡，显著提高老龄成纤维细胞的增殖速度，实现长期稳定培养。
9.通过若干次设置不同培养条件及优化培养成份，从整体上考量培养体系的效果，筛选出能促进老龄成纤维细胞增殖，抑制其凋亡的一套培养体系及培养方法。本发明中的培养体系，使老龄成纤维细胞可以存活并大量增殖，如更改或替换培养体系中的组分或含量，则会使老龄成纤维细胞不能存活，更不可能增殖。本发明中的培养体系还可对人、猴、鼠、牛、猪等物种的老龄成纤维细胞进行培养应用。
10.优选地，步骤（1）中所述明胶的质量百分比为0.01-5%。
11.优选地，步骤（2）中所述离心分离的转速为400-3000 rpm，离心分离时间为2-10min。
12.优选地，步骤（1）和步骤（3）中所述培养箱中的温度均为37℃。
13.第三方面，使用第一方面所述的体外培养老龄成纤维细胞的培养体系或根据第二方面所述的体外培养老龄成纤维细胞的培养方法，在如下(a1)、(a2)至少一种中的应用：（a1）构建药物筛选平台，在延缓衰老药物中的应用；（a2）在制备促进伤口恢复药物中的应用。
14.综上所述，相比于现有技术，本发明的优点在于：1、本发明提供的老龄成纤维细胞的培养体系及培养方法，通过培养体系各组分间的协同作用，优化后的培养方法，能够实现在体外长期并稳定的维持老龄成纤维细胞增殖，抑制老龄成纤维细胞的凋亡，显著提高老龄成纤维细胞的增殖速度，实现长期稳定培养。
15.2、本发明通过体外培养老龄成纤维细胞，不仅有助于对皮肤抗衰的探索，还有助于针对老龄细胞体外进行药物筛选，减少研发成本；本发明还能在制备促进伤口恢复药物中进行应用。
16.附图说明
17.图1是本发明的成纤维细胞培养的明场图；图2是本发明成纤维细胞的数量图；图3是本发明的成纤维细胞培养的细胞凋亡检测图；图4是本发明的运用于药物筛选的实例；图5是本发明促进伤口恢复实例。
18.具体实施方式
19.下面对本发明作进一步说明。
20.实施例1本实施例提供的体外培养老龄成纤维细胞的方法，具体步骤为：（1）提前0.5h用5%的明胶对后续实验将要用到的多个培养皿进行包被（用移液枪将明胶液体吸入培养皿中），液体应覆盖皿底，并放入37℃培养箱，待包被完成后，将每个培养皿内的明胶吸出，获得多个包被后的培养皿。
21.（2）配制老龄成纤维细胞培养体系：在1l无菌蒸溜水中加入以下组分，glycine（甘氨酸，0.1mm），choline chloride（胆碱，0.01mm），d-calcium pantothenate（泛酸钙，0.001mm），folic acid（叶酸，0.001mm），niacinamide（烟酰胺，0.01mm），pyridoxine hydrochloride（盐酸吡哆醇，0.01mm），riboflavin（维生素b2，0.001mm），thiamine hydrochloride（盐酸硫胺素，0.01mm），i-inositol（肌醇，0.01mm），l-arginine hydrochloride（对甲苯磺酰，0.1mm），l-cystine 2hcl（l
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胱氨酸二盐酸，0.1mm），l-glutamine（谷氨酰胺，1mm），l-histidine hydrochloride-h2o（组氨酸盐酸盐，0.1mm），l-isoleucine（异亮氨酸，0.01mm），l-leucine（亮氨酸，0.01mm），l-lysine hydrochloride（盐酸赖氨酸，0.01mm），l-methionine（甲硫氨酸，0.01mm），l-phenylalanine（苯丙胺酸，0.01mm），l-serine（丝氨酸，0.01mm），l-threonine（苏氨酸，0.01mm），l-tryptophan（左旋色氨酸，0.01mm），l-tyrosine disodium salt dihydrate（络氨酸二钠盐二水化合物，0.01mm），l-valine（缬氨酸，0.01mm），calcium chloride（乳化剂，1mm），ferric nitrat（硝酸铁，0.0001mm），magnesium sulfate（硫酸镁，0.1mm），potassium chloride（氯化钾，1mm），sodium bicarbonate（碳酸氢钠，10mm），sodium chloride（氯化钠，10mm），sodium phosphate monobasic（磷酸二氢钠，0.1mm），d-glucose（葡萄糖，1mm），hepes（羟乙基哌嗪乙硫磺酸，10mm），glutathione（谷胱甘肽，0.01mm），fbs（胎牛血清，20%）。
22.（3）将老龄成纤维细胞用胰蛋白酶消化，待细胞逐渐消化为单个老龄成纤维细胞后，获得细胞液；将细胞液转入离心管中在3000 rpm下离心分离2min，待离心分离完毕，弃
上清液，获得细胞沉淀。
23.胰蛋白酶消化的步骤为：弃原培养皿中的培养液，pbs洗涤一次后弃掉pbs，将胰蛋白酶消化液用移液枪转移至培养皿中，放入37
˚
培养箱中。
24.（4）将细胞沉淀用步骤（2）的培养体系重悬，重悬结束后接种于步骤（1）中的一个包被后的培养皿中，置于37℃培养箱中培养；经培养3天后即可增殖出大量的老龄成纤维细胞。
25.重悬步骤为：用移液枪将培养液吸出，随后缓和的将移液枪中的液体打入沉淀中，利用移液枪将液体与沉淀反复混合。
26.实施例2本实施例提供的体外培养老龄成纤维细胞的方法，具体步骤为：（1）提前96h用0.01%的明胶对后续实验将要用到的多个培养皿进行包被，液体应覆盖皿底，并放入37℃培养箱，待包被完成后，将每个培养皿内的明胶吸出，获得多个包被后的培养皿。
27.（2）配制老龄成纤维细胞培养体系：在1l无菌蒸溜水中加入以下组分，glycine（甘氨酸，1mm），choline chloride（胆碱，0.1mm），d-calcium pantothenate（泛酸钙，0.01mm），folic acid（叶酸，0.01mm），niacinamide（烟酰胺，0.1mm），pyridoxine hydrochloride（盐酸吡哆醇， 0.1mm），riboflavin（维生素b2，0.01mm），thiamine hydrochloride（盐酸硫胺素，0.1mm），i-inositol（肌醇，0.1mm），l-arginine hydrochloride（对甲苯磺酰，1mm），l-cystine 2hcl（l
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胱氨酸二盐酸，1mm），l-glutamine（谷氨酰胺，10mm），l-histidine hydrochloride-h2o（组氨酸盐酸盐，1mm），l-isoleucine（异亮氨酸，10mm），l-leucine（亮氨酸，10mm），l-lysine hydrochloride（盐酸赖氨酸，10mm），l-methionine（甲硫氨酸，10mm），l-phenylalanine（苯丙胺酸，10mm），l-serine（丝氨酸，10mm），l-threonine（苏氨酸，10mm），l-tryptophan（左旋色氨酸，10mm），l-tyrosine disodium salt dihydrate（络氨酸二钠盐二水化合物，10mm），l-valine（缬氨酸，10mm），calcium chloride（乳化剂，10mm），ferric nitrat（硝酸铁，0.001mm），magnesium sulfate（硫酸镁，1mm），potassium chloride（氯化钾，10mm），sodium bicarbonate（碳酸氢钠，100mm），sodium chloride（氯化钠，100mm），sodium phosphate monobasic（磷酸二氢钠，1mm），d-glucose（葡萄糖，100mm），hepes（羟乙基哌嗪乙硫磺酸，100mm），glutathione（谷胱甘肽，1mm），fbs（胎牛血清，5%）（3）将老龄成纤维细胞用胰蛋白酶消化，待细胞逐渐消化为单个老龄成纤维细胞后，获得细胞液；将细胞液转入离心管中于400rpm进行离心分离10min，待离心完毕，弃上清液，获得细胞沉淀。
28.（4）将细胞沉淀用步骤（2）的培养体系重悬，重悬结束后接种于步骤（1）中的一个包被后的培养皿中，置于37℃培养箱中培养；经培养4天后即可增殖出大量的老龄成纤维细胞。
29.实施例3本实施例提供的体外培养老龄成纤维细胞的方法，如图1所示，具体步骤为：（1）提前96h用0.01%的明胶对后续实验将要用到的多个培养皿进行包被，液体应覆盖皿底，并放入37℃培养箱，待包被完成后，将每个培养皿内的明胶吸出，获得多个包被
后的培养皿；（2）配制老龄成纤维细胞培养体系：在1l无菌蒸溜水中加入以下组分，glycine（甘氨酸，0.5mm），choline chloride（胆碱，0.05mm），d-calcium pantothenate（泛酸钙，0.005mm），folic acid（叶酸，0.005mm），niacinamide（烟酰胺，0.05mm），pyridoxine hydrochloride（盐酸吡哆醇， 0.05mm），riboflavin（维生素b2，0.005mm），thiamine hydrochloride（盐酸硫胺素，0.05mm），i-inositol（肌醇，0.05mm），l-arginine hydrochloride（对甲苯磺酰，0. 5mm），l-cystine 2hcl（l
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胱氨酸二盐酸，0.5mm），l-glutamine（谷氨酰胺，5mm），l-histidine hydrochloride-h2o（组氨酸盐酸盐，0.5mm），l-isoleucine（异亮氨酸，5mm），l-leucine（亮氨酸，5mm），l-lysine hydrochloride（盐酸赖氨酸，5mm），l-methionine（甲硫氨酸，5mm），l-phenylalanine（苯丙胺酸，5mm），l-serine（丝氨酸，5mm），l-threonine（苏氨酸，5mm），l-tryptophan（左旋色氨酸，5mm），l-tyrosine disodium salt dihydrate（络氨酸二钠盐二水化合物，5mm），l-valine（缬氨酸，5mm），calcium chloride（乳化剂，5mm），ferric nitrat（硝酸铁，0.0005mm），magnesium sulfate（硫酸镁，0.5mm），potassium chloride（氯化钾，5mm），sodium bicarbonate（碳酸氢钠，50mm），sodium chloride（氯化钠，50mm），sodium phosphate monobasic（磷酸二氢钠，0.5mm），d-glucose（葡萄糖，50mm），hepes（羟乙基哌嗪乙硫磺酸，50mm），glutathione（谷胱甘肽，0.05mm），fbs（胎牛血清，12%）（3）将老龄成纤维细胞用胰蛋白酶消化，待细胞逐渐消化为单个老龄成纤维细胞后，获得细胞液；将细胞液转入离心管中于2000rpm进行离心分离5min，待离心完毕，弃上清液，获得细胞沉淀。
30.（4）将细胞沉淀用步骤（2）中的培养体系重悬，重悬后转移至步骤（1）的一个包被后的培养皿中，将培养皿放入37℃培养箱中培养，培养3后即可增殖出大量的老龄成纤维细胞。
31.对比例1本对比例提供改良前老龄成纤维细胞的培养体系及培养方法。
32.改良前老龄成纤维细胞的培养体系：商业化dulbecco 改良 eagle 培养基（dmem，90%），fbs（胎牛血清，10%）培养方法为：（1）将老龄成纤维细胞用胰蛋白酶消化，待细胞逐渐消化为单个老龄成纤维细胞后，获得细胞液；将细胞液转入离心管中在3000 rpm下离心分离2min，待离心分离完毕，弃上清液，获得细胞沉淀。
33.（2）将细胞沉淀用改良前的培养体系重悬，重悬结束后接种于培养皿中，置于37℃培养箱中培养。培养3天后即可增殖出老龄成纤维细胞。
34.实施例4 实施例3的验证实验将实施例3中增殖出的老龄成纤维细胞与对比例1中增殖出的老龄成纤维细胞进行对比验证。
35.4.1增殖能力验证实验：将实施例3中增殖出的大量老龄成纤维细胞的培养皿与对比例1中培养出的老龄成纤维细胞培养皿用显微镜记录实验现象。如图1所示，可以发现单位面积改良前与改良后
的培养体系对细胞形态和增殖能力影响较大，改良后的培养体系能显著提高老龄成纤维细胞的增殖能力。
36.将培养皿中的细胞消化后计数，实验结果如图2所示。由图2可看出，在起始细胞数量相同的情况下，改良后培养体系的培养皿中的成纤维细胞形态和增殖能力有较大改善。
37.4.2细胞凋亡验证实验：将实施例3中增殖出的老龄成纤维细胞与对比例1中培养出的老龄成纤维细胞进行sa-β-gal染色，用于验证细胞凋亡。
38.sa-β-gal染色染色步骤（以6孔板贴壁细胞为例）：a. 对于6孔板中培养的细胞，吸除细胞培养液，用pbs或hbss洗涤1次，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。对于其它类型的培养板，固定液及后续溶液的用量参照此比例进行操作。
39.b. 吸除细胞固定液，用pbs或hbss洗涤细胞3次，每次3分钟。
40.c. 吸除pbs或hbss，每孔加入1毫升染色工作液。
41.d. 37℃孵育过夜，可以用parafilm或保鲜膜封住6孔板防止蒸发。注意：37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。
42.e. 普通光学显微镜下观察。如不能及时观察计数，可以去除染色工作液，加入2毫升pbs，4℃可以保存数天；或者加上封片液封片后，4℃可以保存较长时间。
43.实验结果如图3所示，由图3的染色结果中看出，改良后的着色细胞数量更少（着色细胞代表凋亡的细胞），本发明的培养体系能够抑制细胞凋亡。
44.实施例5构建药物筛选平台、在延缓衰老药物中的应用实例改良后的培养体系能够维持老龄成纤维细胞的增殖，因此对生长在改良后体系中的老龄成纤维进行药物筛选，可以用于延缓衰老药物的开发。
45.具体筛选过程为：a. 提前将需要筛选的化合物或蛋白溶入本发明的老龄成纤维细胞培养体系中；b. 提前一天按照相同细胞数目接种于培养皿的细胞，弃上清，pbs洗涤一次后加入a中准备的含筛选化合物的培养液；c. 培养在37
˚
，5% co2的培养环境中，固定时间每天对细胞进行计数，最终评估化合物或药物对细胞的影响。
46.由图4可看出，基于本体系的生长环境下，可同时对不同药物进行筛选。
47.实施例6促进伤口恢复应用实例将实施例3中增殖出的老龄成纤维细胞涂抹于动物伤口，同时设对照组，对照组的动物伤口不进行任何处理。伤口愈合情况如图5所示，由图5可看出，用本体系增殖出的老龄成纤维细胞处理伤口，伤口愈合时间显著缩短。老龄成纤维细胞可有助于伤口愈合。
48.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
49.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例
性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。