微气泡凝胶的制备方法、微气泡凝胶基质胶制备方法及类器官的培养方法与流程

1.本发明属于类器官培养技术领域，具体涉及一种微气泡凝胶的制备方法、微气泡凝胶基质胶制备方法及类器官的培养方法。


背景技术：

2.类器官(patients derived organoids，pdo)是组织在体外经过3d培养获得的立体样细胞团。类器官在基因表型、蛋白表达、病理分型等组织生物学特性上非常接近来源的组织，尤其是肿瘤类器官药物敏感性的测试在80％的患者身上都取得明显效果。虽然类器官或者肿瘤类器官技术仍然在起步阶段，但是作为一种工具，类器官作为现有2d细胞培养和动物模型的互补，在多种学科如发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等领域发展潜力巨大。
3.经典的组织来源的类器官培养过程较2d细胞而言略复杂，除去单细胞悬液的获得外，维持3d结构的细胞外基质和类器官更为复杂的培养基构成了这两种培养方式的主要区别。细胞外基质是维持3d结构和提供细胞外微环境的重要成分，其支撑力和所含的各类蛋白有助于类器官的扩增和生存；类器官培养基的添加物多为细胞尤其是干细胞增殖所需，新鲜且营养均衡的培养基是类器官旺盛增殖的基础。
4.体外研究需要大量快速增殖的类器官，类器官的增殖速度直接影响了可用于研究的原材料提供。目前类器官培养的瓶颈之一是类器官的增殖速度受到下列原因的影响：1、组织来源干细胞的增殖能力；2、基质胶构建的微环境特征； 3、培养基成分的完整性和持续更新。
5.但是现有的类器官培养方法是基于干细胞来源结合基质胶和培养基来构建，整个过程较为复杂，所用的培养基中需要添加十几种的细胞因子、调控因子，均需要在使用时进行溶解配制，第一方面容易产生污染和配制误差；第二方面，随着细胞生物学技术的发展以及新的细胞生长调控信号通路的发现，需要对原有的培养基配方进行持续改进，并且一般的培养基培养成功率较低(低于70％)、培养时间长(10-21天时间)，操作步骤繁琐；第三方面，为了保证培养体系的营养成分持续供应，需要间隔3-5天进行培养基的更换，容易造成持续污染和营养因子始终处于达到峰值后持续降低再接受峰值冲击的过程，不能形成稳定持续的供给。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种微气泡凝胶的制备方法、微气泡凝胶基质胶制备方法及类器官的培养方法，旨在解决现有技术中类器官培养基生长速度慢的问题。
7.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
8.第一方面，本发明公开了一种微气泡凝胶的制备方法，包括：
9.s10、将pluronic f127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶，搅拌形成微球形的
凝胶；
10.s20、向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶。
11.进一步改进的方案：在步骤s10中，所述将pluronic f127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶的步骤具体包括：
12.将pluronic f127用超纯水溶解得到pluronic f127溶液；透明质酸用超纯水溶解得到透明质酸溶液；
13.将pluronic f127溶液加入到透明质酸溶液中，然后用聚乙二醇400将pluronic f127、透明质酸和聚乙二醇400的总质量分数补足至100％；
14.其中，所述pluronic f127的质量分数为5％-45％，所述透明质酸的质量分数为30％-60％；
15.所述质量分数为每100ml中所包含的克数。
16.进一步改进的方案：在步骤s10中，所述搅拌形成微球形的凝胶的步骤具体包括：300-1500g/min的搅拌速度磁力搅拌2小时，形成粒径大于100um的球形的凝胶。
17.进一步改进的方案：在步骤s20中，所述向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶的步骤具体包括：
18.通过鼓泡法向凝胶内以100-250ml/min的气流速度加入空气2-8小时，使凝胶内均匀布满微米级气泡，静置10h-24h使微米级气泡逐渐过度为10-100nm 的纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，形成空气饱和的微气泡凝胶。
19.进一步改进的方案：在步骤s20之后还包括步骤s30：
20.将微气泡凝胶导入搅拌池中以5000-10000g/min的速度搅拌，使微气泡凝胶中气泡稳定的步骤。
21.第二方面，本发明提供了一种用于快速扩增类器官的微气泡凝胶基质胶制备方法，包括：
22.s100、将pluronic f127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶，搅拌形成微球形的凝胶；
23.s200、向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶；
24.s300、将微气泡凝胶和基质胶按照体积比为1∶1-1∶10的比例混合得到微气泡凝胶基质胶。
25.进一步改进的方案：在步骤s100中，所述将pluronic f127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶的步骤具体包括：
26.将pluronic f127用超纯水溶解得到pluronic f127溶液；透明质酸用超纯水溶解得到透明质酸溶液；
27.将pluronic f127溶液加入到透明质酸溶液中，然后用聚乙二醇400将 pluronic f127、透明质酸和聚乙二醇400的总质量分数补足至100％；
28.其中，所述pluronic f127的质量分数为5％-45％，所述透明质酸的质量分数为30％-60％；
29.所述质量分数为每100ml中所包含的克数。
30.进一步改进的方案：在步骤s100中，所述搅拌形成微球形的凝胶的步骤具体包括：300-1500g/min的搅拌速度磁力搅拌2小时，形成粒径大于100um的球形的凝胶。
31.进一步改进的方案：在步骤s200中，所述向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶的步骤具体包括：
32.通过鼓泡法向凝胶内以100-250ml/min的气流速度加入空气2-8小时，使凝胶内均匀布满微米级气泡，静置10h-24h使微米级气泡逐渐过度为10-100nm 的纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，形成空气饱和的微气泡凝胶。
33.进一步改进的方案：在步骤s200和步骤s300之间，还包括将微气泡凝胶导入搅拌池中以5000-10000g/min的速度搅拌，使微气泡凝胶中气泡稳定的步骤。
34.进一步改进的方案：所述微气泡凝胶和基质胶混合的体积比例为：1∶1、1∶2、 1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9或1∶10。
35.第三方面，本发明提供了一种类器官的培养方法，包括以下步骤：
36.将肿瘤组织剪切成3-5mm大小的组织块，并采用细胞消化液进行消化，变成单细胞；
37.加入pbs并过滤掉未消化的部分并获得滤液，将滤液采用1000rpm离心 5min去除细胞消化酶；
38.将去除细胞消化酶的滤液混入第二方面任一方案所述的一种用于快速扩增类器官的微气泡凝胶基质胶制备方法制备的微气泡凝胶基质胶中，然后放入温度为37℃且co2含量为5％的培养箱中孵育。
39.本发明的有益效果为：
40.采用本发明制备的微气泡凝胶中均匀分散有大量的纳米级气泡，能够缓释微气泡凝胶中的气体，为细胞在体外的生长提供新鲜的气体，可以模拟毛细血管网络中的供氧功能，对细胞在体外的生长具有促进的作用。
41.本发明中的微气泡凝胶基质胶由基质胶和微气泡凝胶混合制备而成，将类器官分散在微气泡凝胶基质胶中，通过微气泡凝胶基质胶中的纳米级气泡的缓释作用，模拟毛细血管网络的氧气供应，促进细胞在体外的快速生长。
42.本发明pluronic f127、透明质酸和聚乙二醇的加入，制备的微气泡凝胶基质胶具有温敏性、缓释气泡和一定硬度的作用；在25度以下为固体粉末，在 25度以上转变为流体。
附图说明
43.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简要介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关附图。
44.图1是本发明中类器官在微气泡凝胶基质胶中的培养示意图。
45.图2为采用本发明微气泡凝胶基质胶培养类器官5天前后的对比图。
46.图3为采用普通基质胶培养类器官7天前后的对比图。
具体实施方式
47.下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整的描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
48.实体瘤早期可分泌肿瘤血管生成因子，诱导血管生成及促进血流供应，刺激宿主毛细血管增生。实体瘤形成后，以肿瘤被毛细血管穿通且肿瘤血液循环形成为界限，其发展可分为无血管期和血管期两个阶段。无血管期，微小肿瘤细胞的存在依靠周围组织细胞的外间隙弥散供血，肿瘤稳步生长，肿瘤细胞增长速度基本与细胞凋亡速度持平，肿瘤限制在1～2mm3之内，瘤细胞数不超过 105～106，迫使肿瘤处于“休眠状态”，此期长短不一。肿瘤细胞进入血管期后，肿瘤组织为灌注性供血，瘤体呈指数性生长，2周后可增大16000倍，肿瘤细胞疯长，组织浸润，血源性播散肿瘤细胞，而肿瘤细胞的增生速度并未改变，肿瘤增长的主要原因是肿瘤细胞的凋亡速度减缓。新生血管不仅可以提供肿瘤所需要的营养和氧气，排除代谢产物，而且是远处转移的途径。
49.与正常的血管生成相比，肿瘤血管生成有以下几个特点：(1)生长失控：肿瘤血管生长受到肿瘤组织分泌的过量生长因子刺激而生长失控，有10-20％的血管内皮细胞始终处于dna合成状态。(2)异型性：肿瘤血管管腔不规则，基底膜薄，无周细胞或平滑肌细胞包围，因而很少受神经内分泌因素调节舒缩。 (3)高渗透性：血管基底膜不完整和血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，vegf)通过管腔表面相互连接的囊泡的作用都增加了肿瘤血管的通透性。上述三个特点都使具有新生血管的肿瘤组织能持续得到输送的氧气和养分，达到快速、大量增殖的需求。
50.本发明制备的微气泡凝胶，通过微气泡凝胶中的纳米级气泡的缓释作用，产生模拟毛细血管网络的氧气供应，从而促进细胞在体外的快速增长；微气泡凝胶的具体的制备过程如实施例一所示。
51.实施例一：
52.本实施例公开了一种微气泡凝胶的制备方法，包括：
53.s10、将pluronic f127(聚氧乙烯聚丙乙烯三嵌段聚合物)、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶，搅拌形成微球形的凝胶；具体包括：
54.将pluronic f127用超纯水溶解得到pluronic f127溶液；透明质酸用超纯水溶解得到透明质酸溶液；
55.将pluronic f127溶液加入到透明质酸溶液中，然后用聚乙二醇400将pluronic f127、透明质酸和聚乙二醇400的总质量分数补足至100％；
56.以300-1500g/min的搅拌速度磁力搅拌2小时，形成粒径大于100um的球形的凝胶；所述球形凝胶的粒径小于1000um；
57.其中，所述pluronic f127的质量分数为5％-45％，所述透明质酸的质量分数为30％-60％；所述质量分数为每100ml中所包含的克数。
58.s20、向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶。具体包括：通过鼓泡法向凝胶内以100-250ml/min的气流速度加入空气2-8小时，使凝胶内均匀布满微米
含量为5％的培养箱中孵育。
78.图1为类器官培养在微气泡凝胶基质胶里的状态，类器官混合在微气泡凝胶基质胶中，温敏固定，形成凝胶液滴铺在培养孔底部，整个凝胶中混合大量微气泡，在培养过程中逐步释放，产生模拟毛细血管网络的氧气弥散和营养物质补充。
79.下面结合具体试验对本发明做进一步说明：
80.1.本发明实验：采用本发明制备的微气泡凝胶基质胶作为培养基培养类器官的步骤：
81.1.1标本预处理
82.在超净工作台中，75％酒精喷洒容器外部，干燥后弃去运输液(如冷冻的标本，则在温水浴中快速溶解)，用pbs清洗，弃去清洗液，根据标本污染情况重复5-10次。在培养皿中，用灭菌的手术器械，将标本修剪干净，去除多余的结缔组织和坏死的肿瘤组织，以及附着表面的血块等杂物，选取1cm3左右的完整组织块作为肿瘤标本进行后续操作。
83.1.2类器官培养
84.使用灭菌的手术器械，在培养皿中，仔细剪切肿瘤标本，使其成为3-5mm 小块。根据组织解离试剂盒说明书配置消化液，在管中根据标本大小加入一定体积消化液变成单细胞，然后根据肿瘤组织软硬程度调定进行消化。消化结束后，取出试管，加入pbs缓冲液，过滤器过滤去除未消化部分，取滤液放入15 ml离心管中，离心机1000rpm，5min离心酶去掉。移液枪混匀混入微气泡凝胶基质胶，放入37℃，5％co2的培养箱中孵育。
85.1.3.观察及换液
86.每2-3天更换新鲜培养液，在倒置显微镜下观察，摄片；该标本肿瘤类器官生长至5天，得到图2中所示的图片b；对比5天前刚开始孵育时的照片图2 中的图片a；可以看出孵育5天后，可见散在数个成圆形或类圆形的肿瘤类器官，大小在30-150um之间，呈透明圆球状；图2中右下角横线的长度代表100um。
87.2.对比例：
88.与本发明实验相比，区别在于在步骤1.2中将微气泡凝胶基质胶替换为普通基质胶(matrigel胶)。
89.如图3所示，图3中图片c为第0天时的图片，图片d为第7天时的图片；培养从0天长到7天，类器官的直径大约从10-20um到30-40um；图3中右下角横线的长度代表100um。
90.通过实验可以看出，采用本发明制备的微气泡凝胶基质胶相对普通基质胶，类器官的生长速度明显较快。
91.本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。